【図1】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株のコレステロール生合成経路を示すものである。

【図2a-b】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の製造過程を示すものである。（ａ）組換え酵母菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）と＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）製作および追加的にＤＨＣＲ２４が多重挿入された組換え酵母菌株製作の模式図である。（ｂ）組換え酵母菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）と＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）に追加的にＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７の多重挿入あるいは過発現およびＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７－２ ｆｕｓｉｏｎ、ＵＰＣ２－１の追加導入の組換え酵母菌株製作の模式図である。

【図3a-b】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の製造過程を示すものである。（ａ）サッカロマイセスセレビシエ野生型菌株にＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７多重挿入導入した組換え酵母菌株製作および追加的なＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７－２ ｆｕｓｉｏｎ、ＵＰＣ２－１導入した組換え酵母菌株の製作およびｅｒｇ６欠失と同時にＤＨＣＲ２４、多重挿入導入した組換え酵母菌株製作の模式図である。（ｂ）コドンコンテクスト（ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）方式でコドン最適化されたＤＨＣＲ２４（ｃｃ）、ＤＨＣＲ７（ｃｃ）を用いた組換え酵母菌株＃ｃｃ１９（ｅｒｇ５：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ６：：ｃｃＤ７）と＃ｃｃＳ１（ｅｒｇ６：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ５：：ｃｃＤ７）製作および追加的にＮ－末端が一部除去されたｔＨＭＧ１が多重挿入された組換え酵母菌株製作の模式図である。

【図4a-j】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の製作時に使用されたベクターを示すものである。

【図5】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）と＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）のコレステロールおよびその前駆体の生産量をＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラムで分析した結果である。（＊：未知ピーク（ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ）、ＤＤ：デヒドロデスモステロール（ｄｅｈｙｄｒｏｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）、Ｄ：デスモステロール（ｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）、Ｚ：ジモステロール（ｚｙｍｏｓｔｅｒｏｌ）、Ｃ：コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ））

【図6】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株ＮＴＳＤ２４／＃１９（ＮＴＳＤ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）およびＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１（ＮＴＳＤ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）のコレステロールおよびその前駆体の生産量をＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラムで分析した結果である（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。

【図7a-c】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）組換え菌株ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９（ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）の挿入カセット数による結果分析（ｑＰＣＲ分析）。（ｂ）組換え菌株＃１９とＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。（ｃ）組換え菌株２ｕＤ２４Ｄ７／＃Ｓ１菌株のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）、（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。

【図8】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株Ｅ３Ｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９、Ｅ３Ｅ２７－２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９、ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９のコレステロールおよびその前駆体生産量をＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラムで分析した結果である（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。

【図9】 新規構築したＨＰＬＣ－ＣＡＤ基盤ＬＣクロマトグラム分析結果であって、本発明の一実施例による組換え酵母菌株のコレステロールおよびその前駆体の生産量を分析したものである。（Ａ）標準品３種（１：ジモステロール、２：エルゴステロール、３：コレステロール）に対するＬＣクロマトグラム、（Ｂ）標準品４種（４：７－デヒドロデスモステロール、５：デスモステロール、６：７－デヒドロコレステロール、７：ラトステロール）に対するＬＣクロマトグラム（Ｃ）野生型菌株（ＣＥＮ．ＰＫ）、（Ｄ）組換え菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）。

【図10a-c】 本発明の一実施例によって製造されたＡＲＥ２欠失菌株のステロールプロファイルを分析した結果である。（ａ）相同組換え技法基盤のＡＲＥ２欠失菌株製作の模式図（ｂ）ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析基盤の他のステロール抽出方法で確保された総ステロール（ｔｏｔａｌ ｓｔｅｒｏｌ）（ＫＯＨ／ＥｔＯＨ）と遊離ステロール（ｆｒｅｅ ｓｔｅｒｏｌ）（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ＭｅＯＨ）クロマトグラム、（ｃ）ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析基盤ａｒｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株の総ステロール（ｔｏｔａｌ ｓｔｅｒｏｌ）クロマトグラム（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。

【図11a-d】 本発明の一実施例によって製造された組換え酵母菌株のコピー数とステロール生産量の関係を分析したものである。図１１ｄは、ｅｒｇ６：：Ｄ７／ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７菌株のステロールプロファイルをＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓで分析した結果である。＊：未知ピーク（ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ）、ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール。

【図12a-c】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）組換え菌株ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１の製作に使用されたカセットを含むベクター。（ｂ）組換え菌株ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１の挿入カセット数による結果分析（ｑＰＣＲ分析）。（ｃ）組換え菌株ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。

【図13a-e】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）～（ｄ）組換え菌株＃ｃｃ１９、＃ｃｃＳ１の製作に使用されたカセットを含むベクター。（ｅ）組換え菌株＃ｃｃ１９、＃ｃｃＳ１のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。

【図14a-c】 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）組換え菌株ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１の製作に使用されたｔＨＭＧ１多重挿入カセットを含むベクター。（ｂ）組換え菌株ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１の多重挿入されたｔＨＭＧ１カセット数による結果分析（ｑＰＣＲ分析）。（Ｃ）組換え菌株ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。