【図1】 神経芽細胞腫におけるGPC2発現のドライバーの特定。高リスク神経芽細胞腫において高発現しており、かつ異なって発現している推定細胞表面遺伝子を特定するための優先順位付けパイプライン。

【図2】 GPC2は神経芽細胞腫対正常組織において異なって発現している。高リスク神経芽細胞腫(n=126; TARGET, ocg.cancer.gov/programs/target)と、GTExコンソーシアムによってプロファイリングされた正常組織RNA配列決定データ(31種類の固有の正常組織全体にわたるn=7859個の試料。1種類の組織につきn=5～1152個の試料;GTEx, gtexportal.org)において、優先順位が付けられた候補GPC2発現を示すプロット。

【図3】 GPC2は推定細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンである。GPC2は、細胞外細胞表面との推定グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)連結を有するヘパラン硫酸プロテオグリカンシグナル伝達コレセプターである。グリピカンは、いくつかの増殖促進シグナル伝達経路の内在性促進物質であり、癌細胞移動、浸潤、および転移においても重要な役割を果たしている。GPC2はミッドカインおよびソニックヘッジホッグに結合することが知られている。GAG=グリコサミノグリカン。

【図4】 図4A～H：GPC2は、ほとんどの神経芽細胞腫において発現している細胞表面分子である。(図4A～D)GPC2は、天然型(62kDa)と、ヘパラン硫酸修飾のある形(約80kDa)で存在する。GPC2ウエスタンブロットは、神経芽細胞腫原発性腫瘍(図4A)、患者由来異種移植片(PDX;図4B)、および細胞株(図4C)における発現を示す。GPC2は、膜抽出後のウエスタンブロットによって細胞株(図4D)で、IHCによって原発性腫瘍、PDX(図4E)、および細胞株(図4F)で、免疫蛍光によって細胞株(図4G)で示されるように原形質膜に関連する。(図4H)髄芽細胞腫もIHCによって高レベルのGPC2を発現する。IR=中リスク、HR=高リスク、S=可溶性画分、M=膜画分、Na/K=ナトリウム/カリウム輸送体=膜対照、TMA=腫瘍マイクロアレイ。

【図5】 GPC2は、公知の神経芽細胞腫細胞外細胞表面タンパク質と共存している。GPC2は、公知の神経芽細胞腫細胞表面タンパク質であるカドヘリンと共存している。

【図6】 GPC2は髄芽細胞腫において有意に発現している。小児髄芽細胞腫の50％超でもIHCによってGPC2が陽性染色され、これにより他の小児癌での高レベル発現が示唆される。

【図7】 GPC2は他の小児新生物において有意に発現している。示したように、複数の小児癌においてGPC2 mRNAが高レベルで見出される。

【図8A】 図8A～B：GPC2の正常組織発現は制限され、神経芽細胞腫と正常組織との間には差次的なGPC2エキソン発現がある。37種類の小児正常組織のTMAから、IHCによって小児正常組織におけるGPC2発現は少ないことが分かる。小児食道は、有意な原形質膜関連GPC2発現がある唯一の組織である。2=弱いIHC染色、3=強いIHC染色。5つの小児食道標本および5つの代表的な原発性神経芽細胞腫からのSashimiプロットは差次的なGPC2エキソン3発現を示す。

【図8B】 図8Aの説明を参照のこと。

【図9】 図9A～F：GPC2枯渇によって神経芽細胞腫細胞のアポトーシスが生じる。(図9A～E)RNAiを介したGPC2(GPC2-2、GPC2-4)ノックダウンによってアポトーシスが誘導され、神経芽細胞腫細胞の増殖が減少する。アポトーシス誘導は、ウエスタンブロットによって切断型PARPまたは切断型カスパーゼ-3の上昇(図9A、図9D)、またはルミネセンスアッセイによってカスパーゼ3/7の上昇で示された(図9B)。細胞株パネルからの代表的な神経芽細胞腫細胞株の例であるNb-ebc1(n=12)を図9A～Cに示し、さらなる例を図9D～Eに示した。(図9F)神経芽細胞腫細胞株Kelly(GPC2遺伝子座にヘテロ接合性欠失がある)におけるGPC2過剰発現によって細胞増殖の増加が誘導される。NTC=非標的対照shRNA、*p<0.001、**p<0.0001。

【図10A】 図10A～B：GPC2 CAR操作の進歩:結合剤の開発。神経芽細胞腫細胞上にあるGPC2に特異的に結合する複数の断片-抗原結合(Fab)タンパク質が特定されている。

【図10B】 図10Aの説明を参照のこと。

【図11】 神経芽細胞腫対正常組織において差次的なGPC2 mRNA変種発現がある。正常組織のGPC2発現が概して低いだけでなく、差次的なGPC2 mRNA変種(従って)エピトープ発現もある。精巣は、神経芽細胞腫において発現しているものと同じGPC2変種を主として発現する唯一の正常組織である。従って、免疫療法を用いて、N末端に由来するGPC2エピトープを標的化すると、神経芽細胞腫と正常組織との間で共通するGPC2エピトープを標的化するのと比べて、治療指数はさらに大きくなる可能性がある。

【図12】 GPC2枯渇によって、ほとんどの神経芽細胞腫においてアポトーシスが誘導される。GPC2機能喪失インビトロアッセイを12の神経芽細胞腫細胞株のパネルに拡大した。これから、GPC2は神経芽細胞腫細胞において広く細胞増殖を動かすことが明らかになった。

【図13】 GPC2過剰発現によって神経芽細胞腫細胞の増殖増加が誘導される。GPC2低発現の神経芽細胞腫細胞株(Kelly;GPC2遺伝子座にヘテロ接合性欠失がある)において強制GPC2過剰発現すると、これらの細胞は、空のベクターでトランスフェクトされた細胞よりも有意に速く増殖するように誘導される。これらの結果から、GPC2は神経芽細胞腫細胞の増殖において重要な役割を果たしていることがさらに裏付けられる。

【図14】 統合されたRNA配列決定に基づくスクリーニングによって、高リスク神経芽細胞腫における異なって発現している細胞表面分子および推定免疫療法標的としてGPC2が特定された。プロットは、高リスク神経芽細胞腫において296個の異なって発現している遺伝子が特定されたことを示す。

【図15】 図15A～E：神経芽細胞腫におけるGPC2発現のドライバーの特定。(図15A)染色体7q/GPC2遺伝子座増加およびMYCN増幅によって層別化された、Huex(左)およびNRC(右)神経芽細胞腫腫瘍におけるGPC2発現。Aにある神経芽細胞腫データセットはTARGETコンソーシアム(n=seqおよびmRNAアレイ)から得られた。P値は、GraphPad Prismバージョン5.01を用いて独立t検定によって導き出された。(図15B)MYCN ChIPプロットから、MYCNが、MYCNで増幅された神経芽細胞腫細胞株KellyおよびNGPにおいてGPC2プロモーターの上流にあるEboxモチーフに結合することが分かる。矢印はEbox(CACGTGモチーフ)を示す。(図15C)SHEP神経芽細胞腫および293T細胞における、MYCN強制過剰発現のあるGPC2レポーターアッセイと、MYCN強制過剰発現のないGPC2レポーターアッセイ。ウエスタンブロットのある挿入図は、SHEPおよび293T細胞におけるMYCN過剰発現を示している。(図15D)2種類の固有のshRNAを用いたMYCN枯渇後の、MYCNで増幅された神経芽細胞腫細胞株KellyにおけるMYCN/GPC2定量PCR。(図15E)4種類の固有のshRNAの拡大セットを用いたMYCN枯渇後の、MYCNで増幅された神経芽細胞腫細胞株KellyおよびNGPにおけるMYCNおよびGPC2のウエスタンブロット。shNTC、非標的shRNA対照。図24A～Eも参照されたい。

【図16】 図16A～I：GPC2は、ほとんどの神経芽細胞腫において発現しており、原形質膜に局在している。(図16A～C)神経芽細胞腫原発性腫瘍(n=11;図16A)、PDX(n=12; 図16B)、および細胞株(n=24; 図16C)のパネルにおけるGPC2のウエスタンブロット。図25Aも参照されたい。(図16D)神経芽細胞腫細胞株のGPC2 IHC染色(高いGPC2発現-SMS-SAN、中程度-NBLS、および低-RPE1)。図25Bも参照されたい。(図16E)多様なGPC2発現のある神経芽細胞腫細胞株のGPC2フローサイトメトリー分析。(図16F)神経芽細胞腫細胞株のパネル(n=7)における差次的な膜抽出実験後のGPC2のウエスタンブロット。NaKは、ウエスタンブロット原形質膜タンパク質の正の対照を示す。(図16G)神経芽細胞腫細胞株NB-Ebc1およびSMS-SANにおけるGPC2免疫蛍光染色。(図16H)PDXおよび原発性腫瘍TMA(それぞれ、n=32およびn=98の腫瘍)のGPC2 IHCの膜染色Hスコアの概要。(図16I)PDXおよび原発性腫瘍TMAからの代表的な膜染色Hスコアの例(Hスコアを右下隅に示した)。スケールバーは、30μM(図16D)、10μM(図16G)、60μM(図16I)を示す。HR、高リスク;IR、中程度のリスク;S、可溶性(非膜)タンパク質抽出物;M、膜タンパク質抽出物。PDX(図16B)ならびに細胞株(図16Cおよび図16F)の特定については表S1も参照されたい。

【図17】 図17A～B：GPC2発現は正常組織において制限されている。(図17A)大きな小児正常組織アレイ(n=36の固有の正常組織)のGPC2 IHC染色から得られた膜Hスコアの概要。比較のために、図3Hおよび図3Iからの、神経芽細胞腫原発性腫瘍およびPDXに由来するGPC2 IHC染色膜Hスコアを示した。P値はGraphPad Prismバージョン5.01を用いて独立t検定によって導き出された。(図17B)原発性神経芽細胞腫ならびに低レベルGPC2を発現する正常組織である皮膚および食道におけるGPC2発現のmRNA転写物特異的分析(n=126のHR神経芽細胞腫、TARGET; n=201の食道試料、およびn=684の皮膚試料、GTEx)。図26A～Cおよび図27A～Cならびに表S2も参照されたい。

【図18】 図18A～I：GPC2は神経芽細胞腫細胞の増殖に必要とされる。(図18A～B、上)神経芽細胞腫細胞株NB-EBC1において、GPC2エキソン4およびGPC2 3'UTRを標的とする2種類の固有のshRNA構築物のレンチウイルス形質導入を行った後の、GPC2定量PCRおよびGPC2ウエスタンブロット分析。(図18B、下)NB-EBC1における、このGPC2枯渇後の切断型PARPおよびカスパーゼ3のウエスタンブロット。Bに示したGPC2ウエスタンブロットの正の対照を、120時間および168時間のNB-EBC1時点と同じブロット上で移動させた。(図18C)NB-EBC1におけるGPC2枯渇後に測定したカスパーゼ3/7活性。(図18D～F)shRNAによって誘導されたGPC2枯渇後のNB-EBC1細胞増殖を、(図18D)CellTiter-Gloルミネセンスアッセイ、(図18E)RT-CES、および(図18F)コロニー形成アッセイによって示した。(図18G)神経芽細胞腫細胞株の拡大したパネル全体にわたる(n=11)、GPC2エキソン4(図18G、上)およびGPC2 3'UTR(図18G、下)を標的とする2種類の固有のshRNA構築物を用いたGPC2枯渇後の、CellTiter-Gloルミネセンスアッセイおよびカスパーゼ3/7上昇によって測定した細胞増殖のプロット。r、ピアソン相関係数およびスチューデントt検定によるp値を、それぞれのGPC2 shRNAについて示した。(図18H)Kellyにおける強制GPC2過剰発現後の神経芽細胞腫細胞の増殖。図18I)SKNDZ(右)。Kellyには、GPC2遺伝子座を含む染色体腕7qのヘテロ接合性欠失がある。GraphPadPrismバージョン5.01によって計算した時のスチューデントt検定による、*=p<0.0001、**=p<0.001。NTC、非標的shRNA対照。空、空のpLenti CMV puro ベクター対照。

【図19】 図19A～E：GPC2は他の高リスク小児癌において発現している。(図19A)臨床グループ分けと、染色体7q/GPC2遺伝子座ならびにMYCおよびMYCN遺伝子座での増幅状態によって層別化した、さらなる髄芽細胞腫腫瘍(n=91)のGPC2 RNA配列決定データ。(図19B)髄芽細胞腫TMA(n=63)のGPC2 IHC染色からの膜Hスコアの概要。(図19C)髄芽細胞腫TMAからの代表的な膜染色Hスコアの例(Hスコアを右下に示した)。(図19Dおよび図19E)中枢神経系転移(図19Dおよび図19E)、脊髄転移(図19D)、ならびに肝臓転移(図19D)の評価を含む、GPC2のあるヒト転移性髄芽細胞腫異種移植片マウスモデルにおけるGPC2 IHC染色。図19C、図19D(上および右)、ならびに図19E(右)にあるスケールバーは60μMを示し、図19D(左)にあるスケールバーは5μMを示し、図19E(左)にあるスケールバーは4μMを示し、図19D(上の真ん中; 脊髄)にあるスケールバーは500μMを示し、図19D(下の真ん中; 肝臓)にあるスケールバーは300μMを示す。(図19F)原発性髄芽細胞腫(n=91)におけるGPC2発現のmRNA転写物特異的分析。図29A～Cおよび表S3も参照されたい。

【図20】 GPC2を標的とするADCであるD3-GPC2-PBDは、GPC2を発現する神経芽細胞腫細胞に対して細胞毒性である。IC50曲線。

【図21】 GPC2は、神経芽細胞腫と正常組織との間で異なって発現している唯一のグリピカンである。高リスク神経芽細胞腫(n=126; TARGET、ocg.cancer.gov/programs/target)におけるGPC1-6 FPKMと、GTExコンソーシアムによってプロファイリングされたRNA配列決定データからの、対になった(paired)正常組織GPC1-6 FPKM(31種類の固有の正常組織全体にわたるn=7859の試料。1種類の組織につきn=5～1152の試料; GTEx、gtexportal.org)を示すプロット。図1～2および図14も参照されたい。

【図22】 図22A～C：GPC2は、神経芽細胞腫において発現している最も優勢なグリピカンであり、GPC2発現は、GPC3発現ならびに神経芽細胞腫腫瘍ストローマ細胞および免疫細胞の含有量と逆相関する。(図22A)GPC1-6 FPKMを、神経芽細胞腫原発性腫瘍(左、n=126の高リスク腫瘍、TARGET; 右、全てのリスク群全体にわたるn=498の腫瘍、seqC)からプロットした。(図22B)GPC3 FPKMに対してGPC2 FPKMをプロットした(左、n=126、TARGET; 右、n=498、seqC)。r、ピアソン相関係数およびp値を、それぞれのデータセットについて示した。(図22C)ストローマ細胞および免疫細胞の含有量に対してGPC2 FPKMをプロットした(左、n=126、TARGET; 右、n=498、seqC)。r、ピアソン相関係数およびp値を、それぞれのデータセットについて示した。

【図23】 図23A～C：高いGPC2発現は神経芽細胞腫において全生存期間が悪いことと関係する。(図23A～C、左)Genomics Analysis and Visualization Platformによって分析した、3種類の神経芽細胞腫データセットの全生存期間曲線(R2; r2.amc.nl; (図23A)Kocak; n=649、(図23B)seqC; n=498、および(図23C)Versteeg; n=88)。58-60 (図23A～C、右)MYCN増幅のない腫瘍をもつ患者に限定した3種類の同じ神経芽細胞腫データセットの全生存期間曲線。

【図24】 図24A～C：MYCNはGPC3-6に有意に結合しない。 (図24A～C)GPC1(図24A)、GPC3およびGPC4(図24B)、GPC5およびGPC6(図24C)を対象とした、MYCNで増幅された神経芽細胞腫細胞株NGPおよびKellyからのMYCN ChIP配列決定。図15A～Eも参照されたい。

【図25】 図25A～C：GPC2は神経芽細胞腫では細胞表面に局在している。(図25A)抗体検証のための、GPC2モノクローナルマウス抗体(sc-393824)を用いたGPC2を対象としたウエスタンブロット。CHP134、NBSD、およびSMS-SANはGPC2を高発現する3種類の代表的な野生型神経芽細胞腫細胞株である。抗体検証を完了するために、レンチウイルスshRNAによって形質導入した細胞(NBSDおよびSMS-SAN)ならびにGPC2 plenti puro CMVを過剰発現する細胞(Kelly)も示した。(図25B)神経芽細胞腫細胞株のパネルからのGPC2 IHC(n=8)。(図25C)神経芽細胞腫細胞株NBEBC1およびSMS-SANからのGPC2免疫蛍光研究。Ex4およびUTRは、それぞれ、GPC2エキソン4およびGPC2 3'UTRを標的とするshRNA構築物であった。NTC、非標的shRNA対照。空、空のpLenti CMV puroベクター対照。スケールバー、60μM(B)、10μM(図25C)。図16A～Iも参照されたい。

【図26】 図26A～C：IHCによって、GPC2の正常組織発現は制限されている。(図26Aおよび図26B)食道(図26A)および皮膚(図26B)における代表的なGPC2 IHC。膜染色Hスコアを示した。(図26C)主なヒト臓器からの代表的なGPC2 IHC。スケールバー、60μM。

【図27】 図27A～C：高分解能質量分析法によって、GPC2の正常組織発現は制限されている。(図27A～C)GPC2(図27A)、L1CAM(図27B)、およびCD19(図27C)のスペクトルカウントを正常組織パネル(n=30)全体にわって示した。

【図28】 図28A～J：GPC2は、ほとんどの神経芽細胞腫において細胞増殖に必要とされる。(図28A～G)細胞株パネル(n=10)における、GPC2エキソン4(Ex4)およびGPC2 3'UTR(UTR)を標的とする2種類の固有のshRNA構築物を用いた、レンチウイルスshRNAによって誘導されたGPC2枯渇。各パネルは、指示されたshRNAを用いたGPC2 Wb(左)、RT-CES細胞増殖プロット(右上)、およびコロニー形成アッセイ(右下;NLFについては利用できない、E)を示す。(図28H～J)RT-CES増殖アッセイの利用を妨げる、単に単層として増殖しなかった神経芽細胞腫細胞株については、コロニー形成アッセイのみを行った。コロニー形成アッセイを左に示し、GPC2ウエスタンブロットを右に示した。*=p<0.0001、**=p<0.001、***=p<0.01。NTC、非標的対照shRNA。図18A～Iも参照されたい。

【図29】 図29A～C：他の小児新生物全体にわたるGPC2発現プロファイリングによって、髄芽細胞腫および網膜芽細胞腫において高いGPC2レベルが特定された。 (図29A)Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments プロジェクト(TARGET; ocg.cancer.gov/programs/target)プロジェクトおよびSt. Jude Children's Research Hospital Pediatric Cancer Data Portal(PeCan; pecan.stjude.org)からのデータを含む、小児新生物アレイ全体にわたるGPC2 RNA配列決定データ(合計n=1608、個々のnを図のx軸に示した)。*TARGETプロジェクトからのRNA配列決定データを示す。**比較のために、GTEx portalからの正常組織を含めた(各組織の平均FPMKを示した。31種類の固有の正常組織全体にわたる合計n=7859の試料。1種類の組織につきn=5～1152の試料; GTEx、gtexportal.org)。(図29B)Genomics Analysis and Visualization Platform(R2; http://r2.amc.nl; 個々のnを図のx軸に示した)からの、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、および網膜芽細胞腫を対象にした検証的GPC2 mRNAアレイデータ。(図29C)ヒト原発性および転移性の対になった髄芽細胞腫試料からのlog2 GPC2発現。p値は独立t検定によって導き出された。NB、神経芽細胞腫;RB、網膜芽細胞腫;MB、髄芽細胞腫;ALL、急性リンパ球性白血病;HGG、高悪性度神経膠腫;RHB、横紋筋肉腫;MLL、混合型白血病;CPC、脈絡叢癌;WT、ウィルムス腫瘍;LGG、低悪性度神経膠腫;AML、急性骨髄性白血病;OS、骨肉腫;EPD、上衣腫;MEL、メラノーマ;ACT、副腎皮質癌;悪性ラブドイド腫瘍;正常、正常組織。図19A～Eも参照されたい。

【図30】 ヒト抗体m201の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。CDRを太字のイタリック体で示した。

【図31】 ヒト抗体m202の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。CDRを太字のイタリック体で示した。

【図32】 ヒト抗体m203の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。CDRを太字のイタリック体で示した。