図１：１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ内のアミノ酸置換をコードするＤＮＡライブラリの構築 以下の実施例は、本発明を説明する。 実施例１：材料＆一般的な方法 組換えＤＮＡ技術 標準的な方法を使用し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の指示にしたがって使用した。 ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡ配列を、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス、バルガッハ）で実施された二本鎖配列決定によって決定した。 ＤＮＡおよびタンパク質配列分析および配列データ管理 Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅバージョン１１．５．０を、配列の作成、マッピング、分析、注釈および例示のために使用した。 タンパク質化学および標識技術 標準的なタンパク質化学および標識技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにおいて提供されている。 バイオインフォマティクス バイオインフォマティクス法は、例えば、Ｋｅｉｔｈ Ｊ．Ｍ．（編）’’Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ’’Ｖｏｌ．Ｉ ａｎｄ Ｖｏｌ．ＩＩ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５２５ ａｎｄ Ｖｏｌ．１５２６（２０１７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ａｎｄ ｉｎ Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．＆Ａｌｌｅｎ，Ｊ．’’Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’’ｉｎ：Ｄｕｂｅｌ Ｓ．＆Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．（編）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１４）に示されている。 電気化学発光イムノアッセイ イムノアッセイおよび関連する方法は、例えば、Ｗｉｌｄ Ｄ．（編）「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒにおいて提供されている。電気化学発光標識としてのルテニウム錯体は、例えば、Ｓｔａｆｆｉｌａｎｉ Ｍ．らＩｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２（２００３）７７８９－７７９８において提供されている。通常、電気化学発光（ＥＣＬ）系免疫検定法の性能について、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置または後継システムを使用し、例えば、Ｅ１７０、コーバスｅ６０１モジュール、コーバスｅ６０２モジュール、コーバスｅ８０１モジュールおよびコーバスｅ４１１などのＲｏｃｈｅ分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）、ならびにこれらの分析装置に指定されるＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイとし、特に明記されていない場合、標準条件下で各々使用した。 実施例２：ライブラリ構築 親抗体の可変重鎖はマウス起源である（配列番号３０）。変異ＨＣＣＤＲを含むライブラリを、それぞれＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２および／またはＨＣＣＤＲ３における単一アミノ酸ランダム化を目的として構築した。第１のステップでは、４つの異なる親抗体フレームワーク領域の１つをそれぞれコードする４つのＤＮＡ断片を生成した。フレームワーク領域１、３および４を社内のポリメラーゼ連鎖反応によって得て、フレームワーク領域２を表す短いフラグメント２（４２ ｂｐ＝配列番号５０）をＭｅｔａｂｉｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ（図１Ａを参照されたい。）に注文した。フラグメントをゲル精製し、定量した。これらのＤＮＡフラグメントの１つの１００ｎｇを、４つのアドオンＰＣＲ反応混合物のそれぞれにおけるポリヌクレオチド鋳型として使用した。親ＣＤＲと同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリを使用することによってＣＤＲ領域を追加し、前記ライブラリのメンバーは、それぞれのＨＣＣＤＲの各コドン位置のそれぞれについて１つのＮＮＫコドンを有するライブラリメンバーを含むように設計された。ＣＤＲライブラリ中のポリヌクレオチドは、さらに、それぞれのＣＤＲに隣接するフレームワーク領域にハイブリダイズすることができる配列を含んでいた。末端プライマーをネステッドＰＣＲ増幅に使用した。これにより（図１Ｂを参照されたい）、部分的に重複する配列を有する４つのＤＮＡフラグメントを生成した。ＦＷ１配列の３’末端およびＦＷ４配列の５’末端にハイブリダイズする末端プライマーを用いた重複ＰＣＲを実施し、４つのフラグメントを線状ＤＮＡライブラリコンストラクトに連結した（図１Ｃを参照されたい）。典型的なＰＣＲ反応物をＰＣＲグレードの水で満たし、ＭｇＳＯ４、２００μＭのｄＮＴＰ混合物、０．５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２５０ｎｇのＤＮＡ鋳型、５単位のＰｗｏＤＮＡポリメラーゼと共に１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液を含む１００μｌの反応混合物にした。典型的なＰＣＲは、９４℃で５分間の初期鋳型変性から開始し、３０サイクル（９４℃２分、６０℃４５秒、７２℃１分）を使用し、７２℃で５分間の最終伸長ステップを含んでいた。プライマー、鋳型およびフラグメント配列を表１に列挙する。ライブラリフラグメントは、無細胞系における転写および翻訳の成功に必要な全ての調節配列を含んでいた。当業者は、最新技術の方法に従ってそのようなライブラリを作製することができ、例えば、Ｈａｎｅｓ，Ｊ．＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７）、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，４９３７－４２を参照されたい。 抗ｃＴｎＴ Ｆａｂフラグメントライブラリの生成に使用される配列 JPEG 0007692892000001.jpg 131 156 JPEG 0007692892000002.jpg 230 148 JPEG 0007692892000003.jpg 234 142 JPEG 0007692892000004.jpg 83 131 実施例３：インビトロディスプレイ Ｆａｂディスプレイ用の緩衝液を調製し、４℃で一晩、転倒回転させてインキュベートした。洗浄緩衝液、ＷＢ（ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整した６０ｍＭトリス、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％ Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ、３３ｍＭ ＫＣｌ、２００μｇ ｔ－ＲＮＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、ビーズ洗浄緩衝液ＢＷＢ（１００ｍＭ ＰＢＳ、０、１％ Ｔｗｅｅｎ２０）、停止バッファＳＢ（ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整した５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％ Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）、３３ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、８．２ｍＭ ｏｘグルタチオン）、溶出緩衝液（ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整した５５ｍＭトリス、１６５ｍＭ ＮａＣｌ、２２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ ＢＳＡ、５０００Ｕ ｒＲＮＡ（５０００Ｕ）、５０μｇ ｔＲＮＡ）。 必要体積の磁気ビーズ（ストレプトアビジンコーティングビーズ）を、１０μＬの初期懸濁液あたり１００μＬの洗浄緩衝液（ＷＢ）で４℃で一晩転倒回転させながらブロッキングした。標的／バックグラウンド試料あたり２５μＬのビーズをプレパンニングステップに使用し、２０μＬをパンニングに使用した。ビーズ保存緩衝液のアジ化ナトリウムを除去するため、ビーズ洗浄緩衝液（ＢＷＢ）で４回、ＷＢで３回洗浄した。これらのステップは、ビーズを回収するための磁場を２分間印加し、続いて上清を廃棄することによって行った。最終洗浄ステップの後、ビーズをその初期体積になるようにＷＢに再懸濁した。 無細胞インビトロ転写および翻訳系を、製造者の指示（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（商標）ＤＳ２．０）にしたがって組み立てた。標的（Ｔ）用および１つはバックグラウンド（ＢＧ）用の１．５ｍＬ反応管を準備した。 発現鋳型（ＬＣ）およびディスプレイ鋳型（ＨＣ）のＤＮＡインプットを２：１の分子比で適用した。ディスプレイをコードするＤＮＡおよび発現鋳型の量を、全てのＦａｂディスプレイサイクルにおいて一定に保った。インビトロ転写／翻訳反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、５００μＬの停止緩衝液を添加することによって反応を停止させ、続いて１℃で１５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離ステップを行った。特段の記載がない限り、後続のステップは４℃で実施した。停止した翻訳混合物の上清（３００μＬ）を調製したビーズ懸濁液に添加し、揺動プラットフォーム上で３０分間インキュベートした。その後、懸濁液を１３０００ｒｐｍおよび１℃で１０分間遠心分離して、非特異的結合分子を有するビーズを、残りの三元複合体を有する上清から分離した。プレパンニングした上清（３００μＬ）を新しい２ｍＬ反応管に移し、予めＷＢでブロッキングし、さらに使用するまで氷上に保った。標的（組換えビオチン化ｃＴｎＴ）を、２ｎＭ～５０ｎＭの範囲の最終濃度で３００μＬのプレパンニングした上清に添加した。選択圧を上げるために、ビオチン化ｃＴｎＴ濃度をサイクルごとに低下させた。懸濁液を揺動プラットフォーム上で３０分間インキュベートした。溶液パンニングステップによって、ビオチン化ｃＴｎＴと三元複合体との間の特異的結合が可能になった。標的ｃＴｎＴに結合した三次複合体を、２０分間のインキュベートステップにおいてストレプトアビジンビーズによって捕捉した。サイクルＩＩでは、非特異的結合を防ぐために、ストレプトアビジンビーズの代わりにアビジンビーズを使用した。 洗浄ステップは、結合した標的三元複合体を有するビーズを磁場中で捕捉し、続いて上清を除去することを含む。ビーズを５００μＬの氷冷ＷＢで洗浄した。洗浄ステップの時間を５分から１時間に延長することによって、その後のディススプレイサイクルにおける選択圧を上昇させた。最終洗浄ステップを使用して、ビーズを新しいブロックされた２ｍＬ反応管に移した。続いて、ビーズを磁場で捕捉し、上清を除去した。ＥＤＴＡを含有する１×ＥＢ１００μＬを添加し、振盪しながら１０分間インキュベートすることによって、以下の溶出ステップを実施した。ｍＲＮＡは三元複合体から放出された。その後、溶出混合物を１℃で１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示にしたがって使用して、濃縮ＲＮＡを単離および精製した。ＲＮＡを、１６μＬのＲＮａｓｅを含まない水を用いて溶出させた。選択ステップからの残存ＤＮＡを消化するために、Ａｍｂｉｏｎ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）キットを製造者の指示にしたがって使用した。残存しているＤＮＡは、その後のＰＣＲ反応で増幅することができない。ＤＮａｓｅ不活性化後、懸濁液を１３０００ｒｐｍおよび室温で２分間遠心分離した。上清（５０μＬ）を氷上の新しい１．５ｍＬ反応管に移した。精製ＲＮＡを直ちに逆転写（ＲＴ）に使用した。残存している上清を－８０℃で保存した。 溶出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。パンニングステップにおいて標的を含む２つの反応を試料Ｔに対して設定した。試料ＢＧおよび水を含む陰性対照についてさらに２つの反応を調製した。試料の数に応じてマスター混合物を調製し、プレミックスを氷上の０．２ｍＬ反応管に分配した。各反応液に１２μＬの溶出ＲＮＡおよび０．５μＬの逆転写酵素を接種した。陰性対照は、ＲＮＡの代わりに１２μＬのＲＮａｓｅ非含有水を用いて実施した。ＰＣＲサーモサイクラーにおいてて６５℃で４５分間逆転写を行った。次いで、ｃＤＮＡ試料を氷上で５分間インキュベートし、以下のステップで増幅した。コントロール試料は－２０℃で保存した。２つのＰＣＲ反応を実施した：プライマーＦｒｔおよびＲｒｔを用いて第１のＰＣＲ「ＲＴでのＰＣＲ」を行い、選択プールのｃＤＮＡを増幅した。インビトロ転写／翻訳のための調節エレメントを再付着させるために、プライマーＦ１ＡおよびＲ１Ａを使用した第２のＰＣＲ「ＲＴ－ＰＣＲでのＰＣＲ」を適用した。両方の反応をＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。 十分な選択プールのＤＮＡ濃度を提供するために、試料ＴおよびＢＧのそれぞれについて４つの反応を設定した。 さらに、４つの対照試料を設定した。最初の２つの試料は、試料ＴおよびＢＧのｍＲＮＡ単離後のＤＮＡ消化物に由来し、潜在的に残存しているＤＮＡを増幅するためにＰＣＲによって検証した。第３および第４は、ＲＴの陰性対照およびＰＣＲグレードの水を使用した「ＲＴでのＰＣＲ」の陰性対照であった。 ＴのＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて分取１％アガロースゲルから精製し、続いて定量し、「ＲＴ－ＰＣＲでのＰＣＲ」の鋳型として使用した。選択プールの３つの反応物およびＤＮＡ鋳型の代わりにＰＣＲグレードの水を用いた１つの陰性対照を調製した。各反応について、２５０ｎｇの予め精製した「ＲＴでのＰＣＲ」を使用した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて１％分取アガロースゲルから精製し、その後のディスプレイサイクルに使用するか、または適切な発現系へのサブクローニングのためにさらに改変した。 実施例４：濃縮結合剤のペリプラズム発現 濃縮されたＦａｂ結合剤を単離するために、変異マウス可変ＨＣを、ＦａｂのマウスＣＨ１ドメイン、マウスＶＬドメインおよびマウスＣＬドメインを含むｐ６０ｒｃ＿ＴｎＴ Ｍ－１１－７発現ベクター（図２参照）にクローニングした。鋳型ＤＮＡは、フォワードプライマー５’－ＧＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ－３’（配列（ＳＥＤ ＩＤ）番号９４）とリバースプライマーＲｒｔ ５’－ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣ－３’（配列番号８７）を用いてＰＣＲにより増幅した。選択プールをＢｓｉＷＩおよびＫｐｎＩ制限部位を介して発現ベクターにクローニングした。ペリプラズム発現を９６ウェルディープウェルブロック（ＤＷＢ）で行った。Ｉｎｔｅｇｒａ ＶＩＡＦｌｏ９６を使用して、前培養（「マスター」）ＤＷＢに１ウェルあたり１ｍＬ ＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）を充填し、先に実施したサブクローニングおよび形質転換の単離クローンを接種した。選択プールあたり約２００コロニー（サイクルＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ）を選んだ。１ウェルを陰性対照として接種せずに残し、他のウェルに、陽性対照としてＴｎＴ Ｍ－１１－７（野生型）Ｆａｂ発現ベクターを形質転換したＸＬ１ ｂｌｕｅを接種した。ＤＷＢを空気透過性膜で密封し、オービタルシェーカーインキュベーター（７５０ｒｐｍ）中、３０℃で一晩インキュベートした。続いて、マスターＤＷＢの各ウェルからの５０μＬを、１１５０ｍＬのＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）／ウェルで調製された、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．，Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｓｉｍｓ，Ｐ．，Ｈｏｎｇ，Ｋ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．，Ｒａｎｃａｔｏｒｅ，Ｐ．＆Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．（２００２）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３－４７によって記載された新しい「発現」ＤＷＢに移した。ＤＷＢを空気透過性膜で密封し、オービタルシェーカーインキュベーター中、３０℃で一晩インキュベートした。Ｆａｂ発現の誘導は、リン酸制限Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地を用いたｐｈｏＡプロモーターに基づく。２４時間後、発現したＦａｂを有する細胞を４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって回収し、さらなる使用まで－２０℃で保存した。 ４０％グリセロール９５０μＬを添加し、－８０℃で保存することにより、「グリセロールストック」に前培養マスターＤＷＢを使用した。密封したＤＷＢを５分間激しくボルテックスし、室温でさらに１０分間振盪することによって、細胞ペレットを５０μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁した。細胞溶解物を９５０μＬのトリス緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈し、１０分間インキュベートした後、遠心分離した（１０分、４０００ｒｐｍ）。粗製細胞抽出物を含有する発現ブロックを、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲ動態研究でさらに使用するまで４℃に保った。 実施例５：ＥＬＩＳＡスクリーニング 詳細なＢｉａｃｏｒｅ分析のための最良の変異体Ｆａｂ結合剤を明らかにするために、以前の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。ＥＬＩＳＡ設定を図３に示す。ビオチン化組換え心筋トロポニンＴ（１００ｎＭ）を、オービタルシェーカーで振盪することによって室温で１時間、ストレプトアビジン９６ウェルプレート中で捕捉した。抗原トロポニンＴを１００μＬのＩＰ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．３、１％ ＢＳＡ）に希釈した。続いて、マイクロプレートウォッシャーＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ ４０５ Ｓｅｌｅｃｔを使用して、ウェルを３００μＬの１×洗浄緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ）で３回洗浄した。洗浄後、変異抗ｃＴｎＴ Ｆａｂ結合剤を含む粗製大腸菌細胞抽出物をＩＰ緩衝液で１：４に希釈し、トロポニンＴ捕捉ウェルに移した。再び、ウェルを３００μＬの１×洗浄緩衝液で３回洗浄した。ヤギで産生された抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）ペルオキシダーゼ標識抗体（検出抗体）を１：４０ ０００希釈（ＩＰ緩衝液中）で使用して、トロポニンＴに結合した変異Ｆａｂフラグメントを検出した。ウェルを３００μＬの１×洗浄緩衝液で再び３回洗浄して、非結合検出抗体を除去した。マイクロプレートをウェルあたり１００μＬのＡＢＴＳと共に室温で３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーＢｉｏＴｅｋ Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ ＸＳを４０５ｎｍに設定して光学密度を測定した。親抗ｃＴｎＴ抗体の野生型Ｆａｂを陽性対照として使用した。最初のヒットを同定し、その粗製細胞抽出物を動態分析に供した。 実施例６：ＳＰＲに基づく機能分析 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ８ｋ機器で３７℃において詳細な動態調査を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ－５シリーズＳセンサーを機器に取り付け、製造者の指示にしたがってプレコンディショニングした。系緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｆｌｕｋａ）を追加した系緩衝液であった。一実施形態において、ＣＭ５バイオセンサー上に抗マウスＦａｂフラグメント捕捉系を確立した。ウサギポリクローナルｐＡｂ抗Ｍ－ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（カタログ番号３１５－００５－０４７、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用して製造者の指示にしたがって固定化した。５μｌ／分で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中３０μｇ／ｍｌのＲＡＭＦ（ａｂ’）２を各フローセル上に１０．０００ＲＵで固定化した。その後、センサーを１ＭのエタノールアミンｐＨ８．５で飽和させた。マウス抗ＴｎＴ抗体Ｆａｂ’フラグメントを、記載されるように大腸菌細胞でペリプラズム的に発現させ、公知の方法によって溶解した（技術的詳細については、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｃ．＆Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｅ．（２００４）；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５、４５６～６２参照）。溶解物を試料緩衝液で１：２０に希釈した。Ｆａｂ’フラグメントをバイオセンサー測定セル上の発現溶解物から５μｌ／分の流速で２分間捕捉し、続いて２０μｌ／分の１０倍濃縮ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で１５秒間の洗浄ステップを行った。応答単位（ＲＵ）におけるＦａｂフラグメント捕捉レベル（ＣＬ）をモニターした。組換えヒトＴｎＴ（Ｒｏｃｈｅ、３７ｋＤａ）を試料緩衝液で３０ｎＭに希釈し、０ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．３７ｎＭのＴｎＴ濃度で濃度系列を作成した。分析物濃度系列を８０μｌ／分で３分間の会合相に注入し、解離相を５分間モニターした。分析物会合相の終わりに、応答単位（ＲＵ）中の「結合遅延」（ＢＬ）という報告点をモニターした。動態速度決定の各サイクルの後、１０倍濃縮ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液の１５秒間の注入、続いて２０μｌ／分での１００ｍＭ ＨＣｌの２回の１分間の注入によって、捕捉系を再生した。ｃＴｎＴ分析物の動態パラメータｋａ［１／Ｍｓ］、ｋｄ［１／ｓ］、ｔ１／２ ｄｉｓｓ［分］、ＫＤ［Ｍ］および結合化学量論（モル比）（詳細については、Ｓｃｈｒａｅｍｌ，Ｍ．＆Ｂｉｅｈｌ，Ｍ．（２０１２）Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９０１，１７１－８１を参照されたい）を、製造者の指示にしたがって、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて各Ｆａｂフラグメント変異体について決定した。動態パラメータは、ＨＣ ＣＤＲ３変異と相関していた。 JPEG 0007692892000005.jpg 104 168 表２中の略語：ｋａ：会合速度定数［Ｍ－１ ｓ－１］、ｋｄ：解離速度定数［ｓ－１］、ＫＤ：解離平衡定数ＫＤ［Ｍ］、ｔ／２－ｄｉｓｓ：複合体半減期、ｌｎ（２）／ｋｄ＊６０［分］、ＷＴ＝親（野生型）、Ｆａｂ＝所与のアミノ酸置換を伴わない（ＷＴ）または伴うＨＣ ＣＤＲ３を含むＦａｂフラグメント Ｆａｂフラグメント誘導体内で、ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７ Ｆａｂ Ａ１０２Ｗは、最も高い分析物複合体安定性および野生型アナログ会合速度を示す（表２参照）。の表２からも分かるように、驚くべきことに、Ａ１０２Ｗ（アラニン（Ａ）のトリプトファン（Ｗ）への置換を有するアミノ酸位置１０２）の置換のみが、親和性の強い増加をもたらす。この変異体Ｆａｂフラグメントの野生型または他の変異体と比較して改善された特性は、それぞれ図４および図５からも容易に明らかになる。 実施例７：ＨＥＫ細胞における抗体Ｆａｂフラグメントの発現 ＳＰＲスクリーニング後、マウスＦａｂフラグメントリード候補抗体を標準的な細胞培養手順にしたがって産生させた。対応するベクターおよびクローニングプロセスは、Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７ Ｍａｙ１２；２０４（１）：７７－８７に記載されている。 重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター領域の下流で、ＢＧＨポリアデニル化シグナルを続けて、別々のベクターにクローニングした。 懸濁液適合ヒト胎児由来腎臓ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗体の一過性遺伝子発現（ＴＧＥ）に使用した：製造者のガイドラインにしたがって、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－トランスフェクションＳＡ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）トランスフェクション試薬によって複合体化された等量の両発現プラスミド（合計０．７ｍｇ／Ｌ細胞培養物）を用いて、細胞を約２×１０Ｅ６生存細胞／ｍｌでトランスフェクションした。トランスフェクションの３時間後、発現を増強するために、ＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸を添加した（最終濃度：４ｍＭ）。毎日、培養物に６％（ｖ／ｖ）のダイズペプトン加水分解物ベースの飼料を添加した。トランスフェクションの７日後、培養上清を遠心分離によって回収し、抗体を標準的な手順にしたがってそこから精製した。ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉフラグメントを公知の方法によって細胞培養上清から精製し、記載されているようにＫｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａトランスグルタミナーゼを使用してビオチンに部位特異的にコンジュゲートした（Ｓｔｅｆｆｅｎら、ＪＢＣ，Ｓｅｐｔ．２２，２９２，１５６２２－１５６３５，２０１７）。 実施例８：ＥＣＬ測定 抗体ＦａｂフラグメントｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇをビオチン化Ｆａｂフラグメント、すなわち実施例７によるｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉとして産生し、サンドイッチイムノアッセイで試験した（図６参照）。ＦａｂフラグメントｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉを、市販のＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に含まれるようなＭＡＢ１１－７のビオチン化野生型Ｆａｂフラグメント（すなわち、配列番号１６のＣＤＲ３を含む）と比較した。これらのビオチン化試薬を、対応するアッセイプロトコルの試薬１（Ｒ１）として使用した。ルテニウム化検出抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に含まれるものであった。ルテニウム化検出抗体は、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ｒ２試薬に対応する。 トロポニンＴ ｈｓアッセイプロトコルを使用した、ブランク対照（Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，Ｉｄ．１１７３２２７７１２２，Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｍｕｌｔｉ Ａｓｓａｙ，Ｉｄ．０３６０９９８７１７０，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）、トロポニンＴ ｈｓ ＣａｌＳｅｔ（Ｉｄ．０５０９２７５２１９０，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）からのＣａｌ１およびＣａｌ２と共に、トロポニンＴ ｈｓアッセイプロトコルを使用して、コーバスＥ１７０モジュールで測定を実施した。 アッセイは、コーバスｅ分析装置のアッセイプロトコル２に従い、試料、Ｒ１およびＲ２を第１のステップで９分間のインキュベートのために混合した後、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを第２のステップでさらに９分間のインキュベートのために添加する。これに続いて、予備洗浄ステップが行われ、ここで、結合した免疫複合体を有するビーズは、反応キュベットの底部に磁気によって集束され、上清がＰｒｅｃｌｅａｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０３００４８９９１９０）によって２回置換された後、混合物全体が測定セルに運ばれて、ビーズ上に構築された免疫複合体のＥＣＬシグナルが測定される。実行に使用したＲ１試薬（Ｂｉコンジュゲート）は、それぞれ、元の市販のＴＮＴ－ＨＳアッセイのもの、または２．５μｇ／ｍｌでＴＮＴ Ｒ１緩衝液中のｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉを含むＲ１試薬のいずれかであった。 ルテニウム化（検出）抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に含まれるものであった。ルテニウム化検出抗体は、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ｒ２試薬に対応する。 Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを常にＲ１およびＲ２試薬ボトルの１つと組み合わせて使用した。測定された試料には、試料希釈剤（Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＝緩衝液ブランク）およびＴｎＴ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイの市販のキャリブレータ（Ｃａｌ１（約１８ｐｇ／ｍｌ ｒｅｃＴｎＴ）およびＣａｌ２（約４２００ｐｇ／ｍｌ ｒｅｃＴｎＴ））が含まれていた。 例示的な結果を図７に示す。図７から分かるように、変異抗体ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）を使用すると、ブランク値は９５４カウント（親）から７７７カウント（Ａ１０２Ｗ）に減少した。Ｃａｌ－１シグナルレベルは、１４３２カウント（親）から２４６０カウント（Ａ１０２Ｗ）に１．７倍増加した。Ｃａｌ－２カウントレベルは、５４６６０２（親）から９８０４３２（Ａ１０２Ｗ）カウントに１．８倍増加する。シグナル対ノイズ比はアッセイ動態および感度の増加を判断するための最も重要なパラメータであるため、驚くべきことに、新規（変異体）抗体全体が約２倍の感度の増加をもたらすことが示され得る。