【図1-1】 SMN2-onカセットの生成および評価。（図1A）SMN2-onカセットおよびその作用機序を示す模式図。エクソン7（e7）の非存在下では、エクソン6/8転写産物（e6/8）における未成熟終止コドンが、ルシフェラーゼcDNA配列の翻訳を遮断するが、LMI070またはRG7800による選択的スプライシングエクソン7の包含（矢印により図示されている）は、e6/7/8:ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質の翻訳を可能にする。（図1B）そのネイティブ配列におけるSMN2エクソン7（SEQ ID NO: 1の1196～1206位および1254～1262位参照）、または構成的包含のために導入されたスプライス部位改変を有するSMN2エクソン7（5'ドナースプライス部位、actSMN2）（SEQ ID NO: 3の1196～1206位および1254～1262位参照）、または低減したバックグラウンドレベルのエクソン7包含のためのSMN2エクソン7（3'アクセプタースプライス部位、indSMN2）（SEQ ID NO: 2の1196～1206位および1254～1262位参照）を示す模式図。（図1C）LMI070の非存在下でのSMN2-onカセットによるエクソン7包含を示す、代表的なRT-PCR反応。エクソン7スプライスイン転写産物またはエクソン7スプライスアウト転写産物の定量を図示し、6つの生物学的反復の平均値±SEMである。（図1D）異なる濃度のLMI070に応答したindSMN2カセットのエクソン7包含を示す、代表的なRT-PCR反応。エクソン7スプライスイン転写産物またはエクソン7スプライスアウト転写産物の定量は、9つの生物学的反復の相対的転写産物レベル（平均値±SEM）である。（図1E）対照DMSO処理細胞と比べた、LMI070（100 nM）に応答したSMN2カセットおよびindSMN2カセットのホタルルシフェラーゼ誘導。DMSO処理対照細胞に対するLMI070処理試料におけるルシフェラーゼ活性の倍率変化を示す。すべての試料は、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ活性に対して正規化されている。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。（図1F）LMI070用量に応答したSMN2カセットのエクソン7スプライシング。LMI070用量の関数としての、エクソン7含有の代表的なRT-PCR反応。エクソン7スプライスイン転写産物またはエクソン7スプライスアウト転写産物の定量は、9つの生物学的反復の平均値±SEMとして提示される相対的転写産物レベルである。（図1G）RG7800用量に応答したindSMN2カセットのエクソン7スプライシング。RG7800用量の関数としてエクソン7包含を示す、代表的なRT-PCR反応。e7スプライスイン転写産物またはe7スプライスアウト転写産物の定量は、8つの生物学的反復の平均値±SEMとして提示される相対的転写産物レベルである。（図1H）LMI070に応答したSMN2カセットおよびindSMN2カセットのルシフェラーゼ活性。グラフは、DMSOまたはLMI070（100 nM）で処理した細胞における、SMN2-onカセットまたはindSMN2-onカセットから発現されたホタルルシフェラーゼの相対的発現を示す。トランスフェクション対照のウミシイタケルシフェラーゼカセットの活性を、棒グラフの上の線として表す。データは、9つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図1-2】 図1-1の説明を参照のこと。

【図1-3】 図1-1の説明を参照のこと。

【図2A】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2A）25 nM LMI070で処理したHEK293細胞におけるRNA-Seqによって特定された、イベントにおいてスプライシングされた上位候補を示す表。遺伝子ID、LMI070誘導性エクソンおよび隣接イントロンの位置、平均イントロンカウント、およびU1 LMI070標的結合配列を示す（SEQ ID NO: 24～31参照）。

【図2B】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2B）25 nM LMI070の非存在下の（赤色）または25 nM LMI070に応答した（青色）、SF3B3スプライシングイベントを図示するSashimiプロット。SF3B3についてのLMI070スプライスインエクソンのゲノム位置を示し（黄色のバー）、イントロンカウントの数字を示す。

【図2C】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2C）RNA-Seqによって特定された45個のスプライスインエクソンからの、LMI070が標的とするU1 RNA結合配列の配列ロゴ。

【図2D】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2D）DMSOまたはLMI070で処理したHEK293細胞から増幅されたcDNAは、SF3B3、BENC1、GXYLT1、C12orf4、およびPDXDC2についてスプライスインイベントを示し、これを、サンガーシーケンシングによって確認した。アスタリスクは、PCR反応から増幅された非特異的なバンドに印をつける。

【図2E】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2E）DMSO処理細胞とLMI070処理細胞との間で差次的に発現される遺伝子を図解する、Volcanoプロット。y軸から延びる水平のバーは、-log10スケールでプロットした0.05の有意性を表す。-0.1および0.1の倍率変化の閾値を、赤色の垂直バーによって示す。有意性および最小倍率変化の要求について閾値を満たす遺伝子を標識する。

【図2F】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2F）BENC1。

【図2G】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2G）GXYLT1。

【図2H】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2H）C12ORF4。

【図2I】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2I）PDXDC2。

【図2J】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2J）RARS。

【図2K】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2K）WNK1。

【図2L】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2L）WDR27。

【図2M】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2M）CIP2A。

【図2N】 LMI070応答性シュードエクソンの発見のためのRNA-Seq。（図2F～2N）RNA-Seqによって特定された上位ランクの遺伝子について、新規LMI070スプライスインエクソンを図示するSashimiプロット。LMI070スプライスインエクソンのゲノム上の場所および位置を示す。（図2N）IFT57。

【図3A】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3A）RNA-Seq解析からの、すべての場合にLMI070誘導性シュードエクソンの5'のエクソンを指すe1を伴う、ホタルルシフェラーゼの翻訳を制御するための候補ミニ遺伝子の構成を示す模式図（図2Bおよび図2F～2N参照）。薬物に応答してだけ翻訳を開始するように、KozakおよびATG開始コドンは、LMI070スプライスインエクソン内に位置付けられた。

【図3B】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3B）SF3B3、BENC1、C12ORF4、およびPDXDC2についてのミニ遺伝子カセットのルシフェラーゼ誘導。LMI070処理試料（＋と図示されている）におけるルシフェラーゼ活性の倍率変化は、DMSO処理細胞（－と図示されている）に相対的であり、データはウミシイタケルシフェラーゼに対して正規化されている。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図3C】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3C）eGFP発現を制御するミニ遺伝子カセットを示す模式図。薬物での処理後にだけ翻訳を開始するように、KozakおよびATG開始コドンは、LMI070誘導性エクソン内に位置付けられた。

【図3D】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3D）SF3B3ミニ遺伝子カセット（Xon-eGFP）をトランスフェクトし、24時間後にDMSO（左）またはLMI070（右）で処理したHEK293細胞におけるeGFP発現。

【図3E】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3E）SF3B3、BENC1、C12ORF4、およびPDXDC2についてのミニ遺伝子カセットのルシフェラーゼ活性。データは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性と比べた、DMSO（－と図示されている）またはLMI070（＋と図示されている）での処理に応答したミニ遺伝子からのホタルルシフェラーゼの発現を示す。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図3F-1】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3F）非AUG開始コドン（CITE）の使用頻度、ならびにSF3B3（SEQ ID NO: 16および17参照）、BENC1（SEQ ID NO: 18および19参照）、C12orf4（SEQ ID NO: 20および21参照）、またはPDXDC2（SEQ ID NO: 22および23参照）のミニ遺伝子に由来する転写産物におけるルシフェラーゼcDNA配列とインフレームのものの図示。

【図3F-2】 図3F-1の続きの図。

【図3G】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3G）DMSO処理またはLMI070処理に応答した、LMI070誘導性SF3B3エクソンの包含を示す、代表的なRT-PCR反応。LMI070スプライスインエクソンの包含は、LMI070誘導性エクソンに隣接するエクソンに結合するプライマーを用いて（左）、または新規エクソン配列内に結合するプライマーを用いて（右）検出した。

【図3H】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3H）SF3B3イントロン内の予測エンハンサーおよびサイレンサーイントロン配列の位置を図示するグラフ。要素は、Human splicing finderウェブサイト（world wide webのumd.be/HSF3/index.htmlで利用可能）によって特定した。LMI070誘導性エクソン（PSEx）および高密度のサイレンサー配列を有するイントロン領域の位置を示す。灰色および赤色の網掛けの丸は、SF3B3 Xonミニ遺伝子、ならびにSF3B3int、SF3B3i1、SF3B3i2、およびSF3B3i3カセットに含有される高密度のサイレンサー配列を有するイントロン領域を示す。

【図3I】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3I）元のミニ遺伝子カセット（SF3B3）、完全イントロン配列（SF3B3int）、高密度のイントロンサイレンサー配列を有するバージョン（赤丸；SF3B3i1、SF3B3i2、SF3B3i3）、またはこれらの同じサイレンサー配列を欠いた対照配列（SF3B3i4）を含有するSF3B3ミニ遺伝子カセットを示す模式図。

【図3J】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3J）追加のSF3B3イントロン領域を含有するさまざまなSF3B3ミニ遺伝子コンストラクトのルシフェラーゼ活性。HEK293細胞に、等モル量のプラスミドをトランスフェクトして、トランスフェクションの24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。グラフは、DMSO処理（左）またはLMI070処理（右）の後の新しいSF3B3カセットのルシフェラーゼ活性を示し、元のSF3B3ミニ遺伝子スイッチに相対的である（それぞれ、DMSOまたはLMI070について青色および桃色）。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図3K】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3K）SF3B3ミニ遺伝子コンストラクトのルシフェラーゼの誘導倍率。LMI070処理試料におけるルシフェラーゼ活性の倍率変化は、DMSO処理細胞に相対的である。すべての試料は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化されている。元のSF3B3ミニ遺伝子スイッチを表示する（桃色）。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図3L】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3L～3M）LMI070誘導性シュードエクソンについてのPCRアッセイを示す代表的なゲル。プライミングは、シュードエクソンに隣接するエクソン（図3L）であった。

【図3M】 LMI070に対する候補ミニ遺伝子カセットの応答。（図3L～3M）LMI070誘導性シュードエクソンについてのPCRアッセイを示す代表的なゲル。プライミングは、シュードエクソン配列内（図3M）であった。

【図4A】 さまざまなプロモーターで発現された場合のSF3B3-Xonカセットの活性およびLMI070の用量に対するその応答性。（図4A）示されたSF3B3-Xon-ルシフェラーゼ発現カセットを含有するプラスミドのHEK293細胞中へのトランスフェクション、その後のLMI070での処理（100 nM、＋と表示されている）またはDMSOでの処理（－と表示されている）の後のルシフェラーゼ誘導。すべての試料は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化されており、DMSO処理細胞に相対的である。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図4B】 さまざまなプロモーターで発現された場合のSF3B3-Xonカセットの活性およびLMI070の用量に対するその応答性。（図4B）示されたSF3B3-Xonカセットを含有するプラスミドをトランスフェクトし、さまざまな用量のLMI070で処理したHEK293細胞におけるルシフェラーゼ誘導。すべての試料は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化されており、DMSO処理細胞（0 nM）に相対的である。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図4C】 さまざまなプロモーターで発現された場合のSF3B3-Xonカセットの活性およびLMI070の用量に対するその応答性。（図4C）さまざまな用量のLMI070に応答した、示されたプロモーターから発現されたLMI070誘導性シュードエクソンの評価のための、RT-PCR解析からの代表的なゲル。シュードエクソンの包含を、シュードエクソンに隣接するプライマーを用いて検出した。スプライシングを定量し、転写産物レベルを、8つの生物学的反復の平均値±SEMとして提示した。

【図4D】 さまざまなプロモーターで発現された場合のSF3B3-Xonカセットの活性およびLMI070の用量に対するその応答性。（図4D）ウミシイタケルシフェラーゼ（灰色の線）と比べた、DMSO処理またはLMI070処理（それぞれ、－、＋）に応答したXonカセットからのホタルルシフェラーゼ。

【図4E】 さまざまなプロモーターで発現された場合のSF3B3-Xonカセットの活性およびLMI070の用量に対するその応答性。（図4E）ウミシイタケルシフェラーゼ（灰色の線）と比べた、さまざまな用量のLMI070に応答したXonカセットからのホタルルシフェラーゼ。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図4F】 さまざまなプロモーターで発現された場合のSF3B3-Xonカセットの活性およびLMI070の用量に対するその応答性。（図4F）さまざまな用量のLMI070に応答した、示されたプロモーターから発現されたLMI070誘導性シュードエクソンの評価のための、RT-PCR解析からの代表的なゲル。シュードエクソンの包含を、LMI070誘導性シュードエクソンおよび下流エクソン内に結合するプライマーを用いて検出した。スプライシングを定量し、転写産物レベルを、8つの生物学的反復の平均値±SEMとして提示した。

【図5-1】 Xonのインビボ活性。（図5A）AAV9.Xon.eGFPまたはAAVPHPeB.Xon.eGFPのいずれかを用いたインビボ研究の模式図。マウスにiv注射し、4週間後に、5または50 mg/kg LMI070の単回投与で処置し、24時間後に組織を採取して、スプライシング、転写産物レベル、およびタンパク質発現を評価した。（図5B）5または50 mg/KgのLMI070での処置の24時間後の肝臓におけるeGFPを示す、肝臓組織切片の代表的な顕微鏡写真（スケールバー100μm）。（図5C）eGFPタンパク質レベルの代表的なウエスタン解析（2試料を示す；4マウス/群）。β-カテニンをローディング対照として示す。（図5D）AAV9.Xon.eGFP遺伝子移入後のXonカセットからのLMI070誘導性転写産物およびeGFPの発現レベルを定量するために設計された、Xonアッセイを示す模式図。（図5E）PCRアッセイからの代表的なゲルは、LMI070に応答したスプライシング活性の包含を実証する。データは、図5Dに図示されるXon遺伝子発現アッセイを用いた、eGFP発現またはLMI070誘導性発現についての平均Ct値を示す。スプライシングされた発現カセットの倍率変化を、AAV9.Xon.eGFPを注射し、媒体で処置したマウスにおけるベースレベルと比べて示す。（図5F）図5Cからのウエスタンブロットの長期露光。（図5G）4週間前にAAVPHBeB.Xon.eGFPでiv処置したマウス由来の脳における、5または50 mg/kgのLMI070での処置の24時間後のeGFP発現を示す、組織切片の顕微鏡写真。海馬および皮質におけるeGFPを示す（スケールバー100μm）。（図5H）PCRアッセイからの代表的なゲルは、LMI070に応答した、AAVPHBeB.Xon.eGFP遺伝子送達後のスプライシング活性の包含を実証する。データは、図5Dに図示されるXon遺伝子発現アッセイを用いた、eGFP発現またはLMI070誘導性発現についての平均Ct値を示す。スプライシングされた発現カセットの倍率変化を、AAVPHBeB.Xon.eGFPを注射し、媒体で処置したマウスにおけるベースレベルと比べて示す。（図5I）AAV9.Xon.eGFPを用いた再投与インビボ研究の模式図。マウスにiv注射し、4週間後に、50 mg/kg LMI070の単回投与で処置した。LMI070で処置したマウスの群を、1週間放置して薬物をウォッシュアウトし、その後再投与した。組織を、24時間後に採取して、スプライシング、転写産物レベル、およびタンパク質発現を評価した。予測eGFPタンパク質レベルもまた示す。（図5J）LMI070または媒体の各投与の24時間後の肝臓から採取した切片におけるeGFP発現を示す、肝臓組織切片の代表的な顕微鏡写真（スケールバー100μm）。（図5K）LMI070または媒体の投与の24時間後の肝臓におけるeGFP誘導を実証する、eGFPの代表的なウエスタンブロット。β-カテニンをローディング対照として示す。（図5L）PCRアッセイからの代表的なゲルは、各投与後にLMI070に応答したスプライシング活性の包含を実証する。（図5M）スプライシングされた発現カセットの肝臓組織におけるベースライン（媒体処置）を上回る倍率変化を、AAV9.Xon.eGFPを注射し、媒体または薬物で処置したマウスにおいて各投与後に示す。（図5N）LMI070（50 mg/Kg）の単回投与の24時間後の心臓におけるeGFP発現を示す、心臓組織切片の代表的な顕微鏡写真（スケールバー200μm、挿入画50μm）。（図5O）スプライシングされた発現カセットの倍率変化を、心臓および骨格筋組織の両方において、AAV9.Xon.eGFPを注射し、媒体で処置したマウスにおけるベースレベルと比べて示す。（図5P）PCRアッセイからの代表的なゲルは、LMI070に応答した心臓および骨格筋におけるAAV9.Xon.eGFP遺伝子送達後の新規エクソンの包含を実証する。（図5Q）各々のLMI070または媒体の投与の24時間後の肝臓におけるeGFPタンパク質レベルの、図5Kに示したウエスタンブロットの長期露光。（図5R）脳においてXonシステムを発現するためにAAVPHPeB.Xon.eGFPを用いたインビボ研究の模式図。マウスにiv注射し、4週間後に、5または50 mg/kg LMI070の単回投与で処置し、24時間後に脳を採取して、スプライシング、転写産物レベル、およびタンパク質発現を評価した。（図5S）4週間前にAAVPHPeB.Xon.eGFPでiv処置したマウス由来の、媒体または5もしくは50 mg/kgのLMI070での処置の24時間後のeGFP発現を示す、顕微鏡写真。40μm厚の矢状切片の代表的な顕微鏡写真において、eGFP蛍光が明らかである。（図5T）4週間前にAAVPHPeB.Xon.eGFPをiv注射したマウス由来の、媒体または5もしくは50 mg/kgのLMI070での処置の24時間後の、視床（Th）、海馬（Hc）、小脳（Cb）、および顔面神経運動核（VII）の切片からの、より高倍率の顕微鏡写真（スケールバー＝100μm、挿入画：スケールバー25μm）。海馬において、*および**は、特定の海馬領域における発現の証拠である。小脳において、*は、深部小脳核における陽性である細胞を意味する。（図5U）経口摂取したLMI070に応答した、AAVPHPeB.Xon.eGFP遺伝子送達後の新規エクソンの包含を実証するPCR増幅を示す、代表的なアガロースゲルの写真。データは、皮質および海馬から採取した組織由来である。（図5V）データは、Xonカセットを用いたeGFP発現またはLMI070誘導性発現についての平均Ct値を示す。スプライシングされた発現カセットの皮質および海馬における倍率変化を、AAVPHPeB.Xon.eGFPを注射し、媒体で処置したマウスにおけるベースレベルと比べて示す。（図5W）AAVPHPeB.Xon.eGFPを注射し、媒体または5もしくは50 mg/KgのLMIで処置したマウス由来の皮質および海馬の試料における、eGFPタンパク質レベルの代表的なウエスタン解析。β-カテニンをローディング対照として示す。（図5X）4週間前にAAVPHPeB.Xon.eGFPでiv処置したマウス由来の、媒体または5もしくは50 mg/kgのLMI070での処置の24時間後のeGFP発現を示す、顕微鏡写真。皮質（Cx）、線条体（Str）、黒質（SN）、および前庭神経内側核（MV）におけるeGFPを示す（スケールバー100μm、挿入画：スケールバー25μm）。

【図5-2】 図5-1の説明を参照のこと。

【図5-3】 図5-1の説明を参照のこと。

【図5-4】 図5-1の説明を参照のこと。

【図5-5】 図5-1の説明を参照のこと。

【図5-6】 図5-1の説明を参照のこと。

【図5-7】 図5-1の説明を参照のこと。

【図5-8】 図5-1の説明を参照のこと。

【図5-9】 図5-1の説明を参照のこと。

【図6-1】 ハンチントン病のための調節されたSaCas9編集。（図6A）変異型HTT発現を排除するためのアレル特異的編集戦略を示す模式図。HTTエクソン1の上流のPAM配列内のSNPは、ヘテロ接合性で存在する場合の変異型アレルの標的欠失を可能にする。DNA修復後に、変異型HTTエクソン1は、エクソン1の上流および下流に結合する一対のsgRNA/Cas9複合体によって欠失される。（図6B）sgRNA配列、SaCas9（構成的にまたはXonスイッチと共に）、および選択的レポーターeGFP/ピューロマイシン発現カセットを同時発現させるために用いられるプラスミドを示す模式図。（図6C）CBh.Xon.SaCas9、またはCBhpSaCas9発現カセットをCMVeGFP発現カセットと共に含有するバイシストロニックプラスミドを、HEK293細胞にトランスフェクトして、さまざまな用量のLMI070で処理し、SaCas9レベルを、24時間後にウエスタンブロットによって測定した。eGFPタンパク質レベルが、トランスフェクション対照として機能した。ブロットは、4つの技術的反復のうちの2つを表す。（図6D）HTT編集を評価するための調節されたCRISPRの模式図。HEK293細胞に、sgRNA配列、SaCas9（構成的にまたはXonスイッチを介して）、および選択的レポーターeGFP/ピューロマイシン発現カセットを発現するプラスミドをトランスフェクトした。4時間後に、細胞を100 nM LMI070で処理し、24時間後に3μMピューロマイシンで処理した。細胞選択の24時間後に、ピューロマイシンを除去し、細胞を4日間拡大増殖させ、その後、ゲノムDNA、タンパク質、およびRNAの単離のために細胞を収集した。（図6E）対照（Ctl）sgRNAまたは935/i3 sgRNA配列を用いた、構成的SaCas9 CRISPRプラスミドまたはXon-SaCas9 CRISPRプラスミド、および選択的レポーターeGFP/ピューロマイシン発現カセットのトランスフェクション後のPCRアッセイによって評価した、HTTエクソン1標的欠失を図示する代表的なゲル（5つの生物学的反復のうちの2つ）。（図6F）構成的SaCas9 CRISPRカセットまたはXon-SaCas9 CRISPRカセットをトランスフェクトしたHEK293細胞からのHTT mRNAレベルの、RT-qPCR解析で評価した転写産物レベル。試料は、ヒトGAPDHに対して正規化されており、データは、対照sgRNA配列を発現する構成的SaCas9 CRISPRカセットを含有するプラスミドをトランスフェクトした細胞と比べた、平均値±SEMである（n＝8生物学的反復；*p＜0.0001、ボンフェローニ（Bonferroni）の事後検定がその後続く一元配置分散分析（one-way ANOVA））。（図6G）構成的SaCas9 CRISPRカセットまたはXon-SaCas9 CRISPRカセットをトランスフェクトしたHEK293細胞のピューロマイシン選択および拡大増殖後のHTT、SaCas9、およびeGFPのタンパク質レベルについての代表的なウエスタンブロット（4つの生物学的反復のうちの2つ）。sgRNA発現カセットを含有する構成的カセットをトランスフェクトした細胞を、対照として用いた。β-カテニンが、ローディング対照として機能した。（図6H）変異型HTTエクソン1の標的欠失のためのアレル特異的編集戦略を示す模式図。HTTエクソン1の上流のSaCas9 PAM配列内のSNPは、ヘテロ接合性で存在する場合の変異型アレルの選択的編集を可能にする。DNA修復後に、変異型HTTエクソン1は、エクソン1の上流および下流に結合する一対のsgRNA/SaCas9複合体によって除去される。SNP（935と呼ばれる）に注釈がつけられている。（図6I）HTTエクソン1隣接配列を標的とする構成的SaCas9 CRISPRカセットをトランスフェクトしたHEK293細胞における、RT-qPCRによって評価したHTT mRNAレベル。試料は、ヒトGAPDHに対して正規化されており、データは、対照sgRNA配列と一緒にSaCas9 CRISPR発現プラスミドをトランスフェクトした細胞と比べた、平均値±SEMである（n＝8生物学的反復；*p＜0.0001、ボンフェローニの事後検定がその後続く一元配置分散分析）。（図6J）対照sgRNA配列またはHTTエクソン1の隣接配列を標的とするsgRNA配列と一緒のSaCas9 CRISPR発現プラスミド、および選択的レポーターeGFP/ピューロマイシン発現カセットをトランスフェクトした細胞における、HTTエクソン1標的欠失を示す代表的なゲル。小さなPCR産物のサンガーシーケンシングの結果により、DNA切断部位でのHTTエクソン1の欠失が確認された。（図6K）SaCas9 CRISPRプラスミドおよび示されたsgRNAをトランスフェクトした細胞における、HTTエクソン1レベルを示す代表的なウエスタンブロット。SaCas9およびbカテニンを、それぞれ、タンパク質ローディング対照として用いた。（図6L）図6Bからのブロットの長期露光。（図6M）図6GからのSaCas9発現の長期露光。

【図6-2】 図6-1の説明を参照のこと。

【図6-3】 図6-1の説明を参照のこと。

【図6-4】 図6-1の説明を参照のこと。

【図7A】 AAV8.Xon.mEpoを用いたインビボ研究の模式図。マウスにiv注射し、4週間後に、LMI070の3回の連続投与で処置した。示したように、マウスEpoおよびヘマトクリットパーセンテージを、LMI070または媒体での処置の前後のさまざまな時点で測定した。

【図7B】 マウスEpo（pg/ml）（左）およびヘマトクリットレベル（右）を、LMI070処置または媒体処置の前（ベース）または後に測定した。

【図7C】 AAV8.Xon.SaCas9ベクターおよびAAV8sgAi9.eGFPベクターを用いたインビボ研究の模式図。Ai14マウスにiv注射し、4週間後に、LMI070（25 mg/ml）の単回投与で処置した。LMI070でのSaCas9誘導の1週間後にマウスを安楽死させて、マウスゲノムにおけるAi14レポーター配列の編集の程度を測定した。

【図7D】 AAV8.Xon.SaCas9ベクター＋AAV8.sgAi9 eGFPベクターを注射したAi14レポーターマウス由来の肝臓溶解物のPCRを介した、ゲノムDNA編集の実証。編集は、LMI070に応答して明らかである。

【図7E】 媒体または25 mg/kgのLMI070での処置後の、AAV8.Xon.SaCas9ベクター＋AAV8.sgAi9 eGFPベクターでiv処置したマウスからの、eGFPおよびtdTomatoの発現を示す顕微鏡写真。

【図7F】 AAV8.Xon.mEpoを用いたインビボ再投与研究の模式図。LMI070再投与は、ヘマトクリットレベルがベースレベルに戻った後に再投与した。

【図7G】 最初の処置後のLMI070に応答したEpoレベル（pg/ml）。

【図7H】 LMI070または媒体での処置後のマウスヘマトクリットレベルの経時変化。

【図8A】 SF3B3.XonカセットおよびSF3B3.Xon100カセットの構造およびサイズを示す模式図。イントロン配列に隣接する新規エクソンのサイズを示す。

【図8B】 ウミシイタケルシフェラーゼと比べた、LMI070に応答したSF3B3.XonカセットおよびSF3B3.Xon100カセットのホタルルシフェラーゼ誘導。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図8C】 SF3B3.Xon.100カセットおよびSF3B3.Xonカセットのルシフェラーゼ活性。データは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性と比べた、DMSO処理またはLMI070処理に応答したミニ遺伝子からのホタルルシフェラーゼの発現を示す。データは、8つの生物学的反復の平均値±SEMである。

【図8D】 SF3B3.Xonの発現と比べた、SF3B3.Xon.100カセットからのルシフェラーゼ発現。データは、SF3B3.Xon100の発現が、オフ状態およびオン状態でSF3B3.Xonの発現に匹敵していることを示す。

【図8E】 SF3B3.Xon100およびSF3B3.XonにおけるDMSO処理またはLMI070処理に応答したLMI070誘導性SF3B3エクソンの包含を示す、代表的なRT-PCRデータ。LMI070スプライスインエクソンを、LMI070誘導性エクソンに隣接するプライマーを用いて検出した。

【図8F】 SF3B3.Xon100およびSF3B3.XonにおけるDMSO処理またはLMI070処理に応答したLMI070誘導性SF3B3エクソンの包含を示す、代表的なRT-PCRデータ。LMI070スプライスインエクソンの包含を、新規エクソン配列内の1つのプライマーと隣接エクソン中の1つのプライマーとを用いて検出した。

【図9A】 AAVPHPeB.Xon.SaCas9ベクターおよびAAVPHPeB sgAi9.eGFPベクターを用いたインビボ研究の模式図。Ai14マウスにiv注射し、4週間後に、LMI070（25 mg/ml）の3回投与で処置した。LMI070でのSaCas9誘導の1週間後にマウスを安楽死させて、マウスゲノムにおけるAi14レポーター配列の編集を測定した。

【図9B】 媒体または25 mg/kgのLMI070の3回投与での処置後の、AAVPHPeB.Xon.SaCas9ベクター＋AAVPHPeB.sgAi9 eGFPベクターでiv処置したマウス由来の皮質および海馬における、tdTomato発現を示す顕微鏡写真。

【図9C】 AAVPHPeB.Xon.SaCas9ベクターおよびAAVPHPeB sg4/i3.eGFPベクターを用いたインビボ研究の模式図。BacHDマウスにiv注射し、3週間後に、LMI070（25 mg/ml）の3回投与で処置した。LMI070でのSaCas9誘導の3週間後にマウスを安楽死させて、ハンチントン遺伝子座の編集を測定した。

【図9D】 媒体処置した動物と比べた、最後の処置の24時間後のBacHDマウスにおけるLMI070処置に応答したLMI070誘導性SF3B3エクソンの包含を示す、代表的なRT-PCRデータ。

【図10】 分泌タンパク質のための最適化されたミニ遺伝子カセット - LMI070に対する応答。（図10A）最適化されたSF3B3ミニ遺伝子カセットをトランスフェクトし、24時間後にDMSO（左）またはLMI070（右）で処理したHEK293細胞におけるeGFP発現。（図10B）最適化されたミニ遺伝子におけるDMSO処理またはLMI070処理に応答したLMI070誘導性SF3B3エクソンの包含を示す、代表的なRT-PCR反応。LMI070スプライスインエクソンの包含を、LMI070誘導性エクソンに隣接するエクソンに結合するプライマーを用いて（左）、または新規エクソン配列内に結合する1つのプライマーと隣接エクソンに結合する1つのプライマーとを用いて（右）検出した。

【図11A】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11A）SMN2ミニ遺伝子配列。

【図11B】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11B）SMN2indミニ遺伝子配列。

【図11C】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11C）SMN2actミニ遺伝子配列。

【図11D】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11D）SF3B3ミニ遺伝子配列。

【図11E】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11E）SF3B3intミニ遺伝子配列。

【図11F】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11F）SF3B3int1ミニ遺伝子配列。

【図11G】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11G）SF3B3int2ミニ遺伝子配列。

【図11H】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11H）SF3B3i3ミニ遺伝子配列。

【図11I】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11I）SF3B3i4ミニ遺伝子配列。

【図11J】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11J）Benc1ミニ遺伝子配列。

【図11K】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11K）C12orf4ミニ遺伝子配列。

【図11L】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11L）PDXDC2ミニ遺伝子配列。

【図11M】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11M）SF3B3.OPTXONNGSミニ遺伝子配列。図11M～Oにおいて、シグナルペプチドのN末端部分をコードする最初のコーディング配列を四角で囲み、それぞれN、K、またはRをコードするコドンに、二重下線が引いてある。

【図11N】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11N）SF3B3.OPTXONKGSミニ遺伝子配列。図11M～Oにおいて、シグナルペプチドのN末端部分をコードする最初のコーディング配列を四角で囲み、それぞれN、K、またはRをコードするコドンに、二重下線が引いてある。

【図11O】 ミニ遺伝子配列。上流エクソン（エクソン1またはe1）、新規エクソン（エクソン2またはe2）、および下流エクソン（エクソン3またはe3）を、太文字で示す。上流エクソンと新規エクソンとの間の配列は、イントロン1であり、新規エクソンと下流エクソンとの間の配列は、イントロン2である。開始コドンに、実線で下線が引いてある。Kozak配列に、破線で下線が引いてある。（図11O）SF3B3.OPTXONRGSミニ遺伝子配列。図11M～Oにおいて、シグナルペプチドのN末端部分をコードする最初のコーディング配列を四角で囲み、それぞれN、K、またはRをコードするコドンに、二重下線が引いてある。