【図1】 試薬に依存しない標的化２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法の全体的なワークフローを示す。

【図2】 高ｐＨ ＲＰＬＣ－ＭＳ／ＭＤサーベイ・スキャン分析による分析物の移行に関する保持時間ウィンドウを決定するための設定を示す。保持時間ウィンドウは、Ｔａｐｅｘ＋／－０．３分として定義され、ここで、Ｔａｐｅｘは、分析物のピーク頂点における保持時間を表す。

【図3】 希釈を伴う標的化２Ｄ構成を有する超標的化２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの概略ワークフローを示す。図中、単純破線は高ｐＨ移動相の流路を示し、実線は低ｐＨ移動相の流路を示し、点線及び破線の複合は高ｐＨ移動相及び低ｐＨ移動相の混合物の流路を示し、矢印は分析物の位置を示す。この方法は、以下の５つの工程からなる：（工程１）試料をロードし、カラムを平衡化する；（工程２）試料を注入し、線形高ｐＨ ＲＰＬＣ勾配を使用して分析物をマトリックス分子から分離する；（工程３）０．６分の保持時間ウィンドウ（Ｔａｐｅｘ＋／－０．３分）内の分析物の画分／部分をトラップカラムに移し、その画分／部分を第二次元の低ｐＨ移動相Ａで希釈する；（工程４）ＭＳ分析のために線形低ｐＨ ＲＰＬＣ勾配を使用して分析カラムを通して分析物を溶出し、その間に高ｐＨ ＲＰＬＣカラムからマトリックス分子を溶出して廃棄する；（工程５）高有機移動相を使用してトラップバルブ、管及びカラムを洗浄する。

【図4】 分析フローとマイクロフローＬＣ－ＭＳ／ＭＳとの間の感度を比較する。図４Ａは、サル血清にスパイクした抗ＣＤ２２を用いた測定を示す。図４Ｂは、マウス血清にスパイクしたハーセプチンを用いた測定を示す。分析フロー及びマイクロフローＬＣ－ＭＳ／ＭＳのＬＣ流量は、それぞれ３００μＬ／分及び８μＬ／分であった。ＩＳは内部標準を表す。

【図5】 サル血清にスパイクした抗ＣＤ２２を分析することによって、マイクロフロー１Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳと２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとの間の感度を比較する。抗ＣＤ２２モノクローナル抗体を、４００から０．７８ｎｇ／ｍＬまでの２倍段階希釈でサル血清にスパイクした。５０マイクロリットルの各血清試料をプロテインＡ親和性捕捉及びオンビーズ・トリプシン消化に供した。同じ試料を、同じＬＣ流量８μＬ／分で１Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（図５Ａ）及び２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（図５Ｂ）の両方によって分析した。イオン遷移ｍ／ｚ６９３．８→５５５．７をペプチドＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫについてモニターした。ＩＳは内部標準を表す。

【図6】 ０．７８ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの異なる濃度の抗ＣＤ２２をスパイクしたサル血清からのペプチドＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫの検出を示す。ＩＳは内部標準を示す。二重ブランクは、分析物及びＩＳを含まないサル血清を示し；血清ブランクは、ＩＳをスパイクしたが分析物をスパイクしていないサル血清を示す。

【図7】 ０．７８ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの異なる濃度の抗ＣＤ２２をスパイクしたヒト血清からのペプチドＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫの検出を示す。ＩＳは内部標準を示す。二重ブランクは、分析物又はＩＳを含まないサル血清を示し；血清ブランクは、ＩＳをスパイクしたが分析物をスパイクしていないサル血清を示す。ＩＳは内部標準を表す。

【図8】 ペプチドＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫの検量線を示す。図８Ａは、抗ＣＤ２２をスパイクしたサル血清試料からのペプチドＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫの曲線を示す。図８Ｂは、抗ＣＤ２２をスパイクしたペプチドＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫヒト血清試料の曲線を示す。分析物対内部標準ピーク面積比（すなわち、軽重ピーク面積比）を分析物濃度に対してプロットした。品質管理も含めた。

【図9】 ペプチドＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＳＧＫを使用した高ｐＨ ＲＰＬＣ分離中の分析物保持時間再現性の評価を示す。４００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２２をスパイクした５０マイクロリットルのサル血清を、プロテインＡ親和性捕捉及びオンビーズ・トリプシン消化に供した。この試料を、高ｐＨ ＲＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３２０個の試料を含む実行において３つの異なる日に３回（すなわち、注入１（１日目）、１８０（３日目）及び３２０（５日目））分析した。ＩＳは内部標準を表す。

【図10】 ２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイ感度に対する試料体積の影響の評価を示す。抗ＣＤ２２モノクローナル抗体を４００ｎｇ／ｍＬでサル血清にスパイクした後、２倍段階希釈を行い、４００～０．７８ｎｇ／ｍＬの濃度を得て、各血清試料を異なる出発体積（すなわち、２５μＬ対５０μＬ）で２回分析した。ＩＳは内部標準を表す。

【図11】 ペプチドＬＳＣＡＡＳＧＹＥＦＳＲの検量線を示す。図１１Ａは、抗ＣＤ２２をスパイクしたサル血清試料からのペプチドＬＳＣＡＡＳＧＹＥＦＳＲの検量線を示す。図１１Ｂは、抗ＣＤ２２をスパイクしたヒト血清試料からのペプチドＬＳＣＡＡＳＧＹＥＦＳＲの検量線を示す。分析物対内部標準ピーク面積比（すなわち、軽重ピーク面積比）を分析物濃度に対してプロットした。品質管理も含めた。

【図12】 抗ＣＤ２２をスパイクした５０μＬのサル血清からのペプチドＦＴＦＳＬＤＴＳＫの検量線を示す。分析物対内部標準ピーク面積比（すなわち、軽重ピーク面積比）を分析物濃度に対してプロットした。

【図13】 アテゾリズマブによるＰＤ－Ｌ１結合の評価を示す。０．１４５μＭのＰＤ－Ｌ１を２．９μＭのアテゾリズマブ（モル比１：２０）と共に室温で２時間インキュベートし、次いで試料をプロテインＡ親和性捕捉（ＡＣ１）に供した。ＡＣ１に続いて、アテゾリズマブを同じ濃度（２．９μＭ）で上清に添加し、室温でさらに２時間インキュベートし、次いで２回目のプロテインＡ親和性捕捉（ＡＣ２）に供した。ＡＣ１及びＡＣ２の両方によって捕捉された分子を消化し、２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。図１３Ａは、ＡＣ１捕捉に供されたＰＤ－Ｌ１試料の２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。図１３Ｂは、ＡＣ１捕捉及びその後のＡＣ２捕捉に供されたＰＤ－Ｌ１試料の２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を示す。ＡＣ２からＰＤ－Ｌ１は検出されず、ＡＣ１中にＰＤ－Ｌ１がアテゾリズマブによって完全に結合されたことを示した。

【図14】 可溶性ＰＤ－Ｌ１の定量のためのマイクロフロー１Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳと２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとの間の感度を比較する。アテゾリズマブ－ＰＤ－Ｌ１複合体を、ＰＤ－Ｌ１の濃度が５００～２ｎｇ／ｍＬ（又は１８～０．０７ｎＭ）の範囲である２倍段階希釈で正常ヒト血清中にスパイクした。図１４Ａは、スパイクイン試料をマイクロフロー１Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析したことを示す。図１４Ｂは、スパイクイン試料を２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析したことを示す。血清ブランク及びＬＬＯＱ試料をここに示す。

【図15】 処置後血清試料中のアテゾリズマブに結合する可溶性ＰＤ－Ｌ１バリアントの総濃度を測定するための標的化２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法の適用を示す。図１５Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＶドメイン由来のペプチドＬＱＤＡＧＶＹＲの検量線を示す。図１５Ｂは、１２個の処置後血清試料中の総可溶性ＰＤ－Ｌ１のモル濃度を示す。図１５Ｃは、野生型ＰＤ－Ｌ１の分子量に基づいて計算された可溶性ＰＤ－Ｌ１の質量濃度を示す。図１５Ｄは、２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳとＥＬＩＳＡデータとの間の相関を示す。