特許7824653IP Force 特許公報全文掲載

ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人　新潟大学 > 特許7824653

技術分野

アンチセンス核酸及びその使用に関する。具体的には、本発明は、アンチセンス核酸、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシング亢進剤、医薬組成物、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシング亢進剤のスクリーニング方法、及びＴＤＰ－４３プロテイノパチーの予防又は治療の候補化合物のスクリーニング方法に関する。 本願は、２０２０年１１月３０日に、日本に出願された特願２０２０－１９８５９５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明は、事情に鑑みてなされたものであって、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシングを亢進する新規のアンチセンス核酸を提供する。また、前記アンチセンス核酸を用いた、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシング亢進剤、及び医薬組成物を提供する。また、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシング亢進剤のスクリーニング方法、及びＴＤＰ－４３プロテイノパチーの予防又は治療の候補化合物のスクリーニング方法を提供する。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明者らは、目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのアイソフォームに着目し、イントロン６の選択的スプライシングを特異的に亢進するアンチセンス核酸を用いて、これらのアイソフォームの発現の比率を調製することで、ＴＤＰ－４３プロテイノパチーの病態を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

態様のアンチセンス核酸によれば、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシングを亢進することができる。態様の選択的スプライシング亢進剤は、前記アンチセンス核酸を含み、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシングを亢進することができる。態様の医薬組成物は、前記アンチセンス核酸を含み、ＴＤＰ－４３プロテイノパチーを予防又は治療することができる。態様のスクリーニング方法によれば、ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのイントロン６の選択的スプライシング亢進剤をスクリーニングすることができる。態様のスクリーニング方法によれば、ＴＤＰ－４３プロテイノパチーの予防又は治療の候補化合物をスクリーニングすることができる。

この特許の権利範囲[特許請求の範囲]

知財ポータルサイト IP Force にログインして確認する (無料)

この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡのアイソフォーム（４種類）を示す概略構成図である。
【図2】 ＴＤＰ－４３タンパク質の凝集性及び機能性を説明する図である。
【図3A】 実施例１におけるＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの配列内の各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ１、ＡＳ２．１、ＡＳ２、ＡＳ３、ＡＳ４、ＡＳ５、ＡＳ５．１、ＡＳ５．２、ＡＳ６、ＡＳ６．１、及びＡＳ７）の標的位置、並びに、Ｕ２ＡＦ１及びＨＮＲＮＰＡ１の結合位置を模式的に示した図である。
【図3B】 実施例１における各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出されたＲＮＡを用いた逆転写ＰＣＲ法によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像である。
【図3C】 実施例１における各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのイントロン６が保持されているｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン６が選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの発現量の比を示すグラフである。（グラフ中、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（コントロール群との比較、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。）
【図3D】 実施例１における各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、シクロヘキシミド処理したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出されたＲＮＡを用いた逆転写ＰＣＲ法によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像である。
【図3E】 実施例１における各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、シクロヘキシミド処理したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのイントロン６が保持されているｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン６が選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの発現量の比を示すグラフである。（グラフ中、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（コントロール群との比較、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。）
【図3F】 実施例１におけるＣＳＥ１ＬをノックダウンしたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の核画分と細胞質画分におけるウエスタンブロッティングである。
【図3G】 実施例１におけるＣＳＥ１Ｌをノックダウンした後、各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、シクロヘキシミド処理したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出されたＲＮＡを用いた逆転写ＰＣＲ法によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像である。
【図3H】 実施例１におけるＣＳＥ１Ｌをノックダウンした後、各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、シクロヘキシミド処理したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのイントロン６が保持されているｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン６が選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの発現量の比を示すグラフである。（グラフ中、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｓｉＣＳＥ１Ｌ群におけるコントロール群との比較、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。）
【図3I】 実施例１におけるＣＳＥ１Ｌをノックダウンした後、各モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、シクロヘキシミド処理したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのイントロン６とイントロン７が保持されているｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン６のみが選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの発現量の比を示すグラフである。（グラフ中、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（ｓｉＣＳＥ１Ｌ群におけるコントロール群との比較、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。）
【図4A】 実施例２におけるＡＳ５を導入したマウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞から抽出されたＲＮＡを用いた逆転写ＰＣＲ法によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像である。
【図4B】 実施例２におけるＡＳ５を導入したマウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞での全ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン６が保持されているｍＲＮＡの発現量の割合を示すグラフである。（グラフ中、＊＊＊：ｐ＜０．００１（両側ｔ検定）。）
【図4C】 実施例２におけるＡＳ５を導入したマウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞での全ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン７が保持されているｍＲＮＡの発現量の割合を示すグラフである。
【図4D】 実施例２におけるＡＳ５を導入したマウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞でのＴＤＰ－４３タンパク質のＮ末端側を抗原とするポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。
【図5A】 実施例３における新生児マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌ）を用いたＡＳ５の脳室内投与試験のプロトコールを示す図である。
【図5B】 実施例３におけるＡＳ５を脳室内投与したマウス脳の各部位から抽出されたＲＮＡを用いた逆転写ＰＣＲ法によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像である。
【図5C】 実施例３におけるＡＳ５を脳室内投与したマウス脳の各部位でのＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを参照遺伝子とした逆転写リアルタイムＰＣＲ法におけるイントロン６が保持されているｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。（グラフ中、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（両側ｔ検定）。）
【図5D】 実施例３におけるＡＳ５を脳室内投与したマウス脳の各部位での全ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン６が保持されているｍＲＮＡの発現量の割合を示すグラフである。（グラフ中、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１（両側ｔ検定）。）
【図5E】 実施例３におけるＡＳ５を脳室内投与したマウス脳の各部位での全ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン７が保持されているｍＲＮＡの発現量の割合を示すグラフである。（グラフ中、＊：ｐ＜０．０５（両側ｔ検定）。）
【図5F】 実施例３におけるＡＳ５を脳室内投与したマウス脳の各部位でのＴＤＰ－４３タンパク質のＣ末端側を抗原とするポリクローナル抗体及びコントロールとして抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いたウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。
【図5G】 図５Ｆの結果から定量されたＧＡＰＤＨの発現量に対するＴＤＰ－４３タンパク質の発現量の割合を示すグラフである。（グラフ中、＊＊：ｐ＜０．０１（両側ｔ検定）。）
【図5H】 実施例３におけるＡＳ５の脳室内投与後の大脳、脳幹、及び脊髄でのＡｉｆ１ ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。
【図6A】 実施例４における成体マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌ）を用いたＡＳ５の髄腔内投与試験のプロトコールを示す図である。
【図6B】 実施例４におけるＡＳ５を髄腔内投与したマウスの頸髄及び腰髄から抽出されたＲＮＡを用いた逆転写ＰＣＲ法によるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像である。
【図6C】 実施例４におけるＡＳ５を髄腔内投与したマウスの頸部及び腰椎でのイントロン６が選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの発現量に対する、イントロン６が保持されているｍＲＮＡの発現量の比を示すグラフである。（グラフ中、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（両側ｔ検定）。）
【図6D】 実施例４におけるＡＳ５の髄腔内投与から８週間後の雌雄マウスの体重を示すグラフである。
【図6E】 実施例４におけるＡＳ５の髄腔内投与から８週間後の雌雄マウスの握力を示すグラフである。
【図6F】 実施例４におけるＡＳ５の髄腔内投与から８週間後の腰髄でのＡｉｆ１ ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。
【図7A】 実施例５における運動ニューロン特異的Ｒｐｔ３コンディショナル・ノックアウトマウス（Ｒｐｔ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＶＡＣｈＴ－Ｃｒｅ＋／－）の新生児を用いたＡＳ５の脳室内及び髄腔内投与試験のプロトコールを示す図である。
【図7B】 実施例５におけるＡＳ５を投与したマウスでの経時的な体重の変化と死亡までの期間を示すグラフである。
【図8A】 実施例６における運動ニューロン特異的Ｒｐｔ３コンディショナル・ノックアウトマウス（Ｒｐｔ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＶＡＣｈＴ－Ｃｒｅ＋／－）の成体マウスの脊髄運動ニューロンでの抗ＴＤＰ－４３抗体、４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）及び抗ＴＵＪ１抗体による（免疫）染色像である。スケールバーは４０μｍを示す。画像中、ａ～ｃはヒト患者におけるＴＤＰ－４３プロテイノパチーでみられるパターンをそれぞれ表す。具体的には、ａは核内ＴＤＰ－４３が減少し、細胞質にびまん性にＴＤＰ－４３が誤局在している運動ニューロンの染色像である。ｂは細胞質にＴＤＰ－４３の凝集体が見られる運動ニューロンの染色像である。ｃ：核内ＴＤＰ－４３がほぼ消失している運動ニューロンの染色像である。
【図8B】 実施例６における運動ニューロン特異的Ｒｐｔ３コンディショナル・ノックアウトマウス（Ｒｐｔ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＶＡＣｈＴ－Ｃｒｅ＋／－）の成体マウスを用いたＡＳ５の髄腔内投与試験のプロトコールを示す図である。
【図8C】 実施例６におけるＡＳ５を投与したマウスでの経時的な体重の変化を示すグラフである。
【図8D】 実施例６におけるＡＳ５を投与したマウスでの経時的な握力の変化を示すグラフである。
【図8E】 実施例６における２４～２８週齢のマウスでの体重と握力の関係を示すグラフである。

代表図 図1本件の代表的な図

全ての図面はログインすると無料で閲覧できます。ログイン・ユーザー登録

［広告欄］

ログインすれば広告は減ります

ログインすれば広告は減ります

Copyright © Science Impact Inc. All Rights Reserved.