【図1A】 ３ｐ１０Ｌ ＲＮＡヘアピン骨格（配列番号３７）に沿ったグアノシンの挿入は、ＲＩＧ－Ｉ酵素活性および細胞活性を様々に変化させた。（Ａ）ＲＮＡのステム領域に沿ってバルジ（ｂｕｌｇｅ）／キンクが導入されているヘアピンＲＮＡの設計。

【図1B】 ３ｐ１０Ｌ ＲＮＡヘアピン骨格（配列番号３７）に沿ったグアノシンの挿入は、ＲＩＧ－Ｉ酵素活性および細胞活性を様々に変化させた。（Ｂ）ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌでの、様々なＲＮＡの細胞ベースアッセイ。ＲＮＡを１００ｎＭの一定濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、ＲＬＵとして表されている。

【図1C】 ３ｐ１０Ｌ ＲＮＡヘアピン骨格（配列番号３７）に沿ったグアノシンの挿入は、ＲＩＧ－Ｉ酵素活性および細胞活性を様々に変化させた。（Ｃ）親鎖のＲＮＡ（３ｐ１０Ｌ；配列番号３７）と比較して、最も高い細胞ベースアッセイ活性（３ｐ１０ＬＧ９；配列番号２６）および最も低い活性（３ｐ１０ＬＧ５；配列番号３０）を有するＲＮＡのＡＴＰａｓｅ活性。データをミカエリス－メンテン式にフィッティングし、Ｋｍ，ＡＴＰおよびＫｃａｔ，ＡＴＰを、ｈｓＲＩＧ－Ｉに対する飽和量のＲＮＡで決定した。

【図2A】 ヘアピンＲＮＡに沿った９位でのプリン塩基の挿入は、ｉｍｍＲＮＡ３ｐ１０Ｌの効力を向上させる。（Ａ）ＲＮＡのステム領域に沿って９位に様々な塩基が導入されているヘアピンＲＮＡの設計。

【図2B】 ヘアピンＲＮＡに沿った９位でのプリン塩基の挿入は、ｉｍｍＲＮＡ３ｐ１０Ｌの効力を向上させる。（Ｂ）ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌでの、様々なＲＮＡの細胞ベースアッセイ。ＲＮＡを１００ｎＭの一定濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、ＲＬＵとして表されている。

【図2C】 ヘアピンＲＮＡに沿った９位でのプリン塩基の挿入は、ｉｍｍＲＮＡ３ｐ１０Ｌの効力を向上させる。（Ｃ）９位に様々な塩基挿入を有するＲＮＡのＡＴＰａｓｅ活性。データをミカエリス－メンテン式にフィッティングし、Ｋｍ，ＡＴＰおよびＫｃａｔ，ＡＴＰを、ｈｓＲＩＧ－Ｉに対する飽和量のＲＮＡで決定した。

【図3A】 ３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。（Ａ）ＲＮＡを、異なる濃度範囲のＲＮＡでＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉへとトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、最大活性の正規化パーセンテージ対ｌｏｇ濃度として表した。３ｐ１０Ｌ Ｇ９のＥＣ５０は１３３ｎＭだった。３ｐ１０ＬＡ９は１９９ｎＭだった。３ｐ１０Ｌは１０８ｎＭだった。

【図3B】 ３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。Ｂ）ＲＮＡを、１００ｎＭの一定濃度でＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉにトランスフェクトし、トランスフェクションの４、６、８、１０、１２、２４、４８、および７２時間後にルミネセンスを測定した。

【図3C】 ３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。（Ｃ）ＲＮＡを、異なる濃度範囲のＲＮＡでＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にルミネセンスを測定した。結果を三重重複で測定し、最大活性のパーセンテージ対ｌｏｇ濃度として表した。３ｐ１０Ｌ Ｇ９のＥＣ５０は９１ｎＭだった。３ｐ１０ＬＡ９は５１ｎＭだった。３ｐ１０Ｌは２２６ｎＭだった。

【図3D】 ３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。Ｄ）ＲＮＡを、１００ｎＭの一定濃度でＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）にトランスフェクトし、トランスフェクションの４、６、８、１０、１２、２４、４８、および７２時間後にルミネセンスを測定した。

【図4】 様々なＲＮＡ分子に対するハツカネズミ（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＩＧ－Ｉ（ｍｍＲＩＧ－Ｉ）およびｍｍＲＩＧ－ＩΔＣＡＲＤ結合のＡＴＰａｓｅ活性を示すミカエリス－メンテンプロット。（Ａ）様々なステム修飾を有する短鎖ＲＮＡヘアピンにより刺激されたｍｍＲＩＧ－Ｉの、０から５ｍＭまでの範囲のＡＴＰ濃度にわたる触媒作用の速度。（Ｂ）様々な塩基組成のＲＮＡヘアピンにより刺激されたｍｍＲＩＧ－Ｉの、０から５ｍＭまでの範囲のＡＴＰ濃度にわたる触媒作用の速度。（Ｃ）様々な長さのＲＮＡヘアピンにより刺激されたｍｍＲＩＧ－Ｉの、０から５ｍＭまでの範囲のＡＴＰ濃度にわたる触媒作用の速度。

【図5】 Ｉ型ＩＦＮを誘導するそれらの能力についてのｉｍｍＲＮＡ構築物のスクリーニング。Ａ）ＲＩＧ－Ｉリガンド免疫調節性ＲＮＡ（ｉｍｍＲＮＡ）を、ＭＸ１プロモーターにより駆動される安定的に組み込まれたルシフェラーゼレポーター（ＭＸ１Ｐ－ｌｕｃ）を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。ＲＮＡを、系列希釈（２×）により達成された種々の濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は、ＯＨＹｒ２３（親構築物；配列番号３７）の３１２ｎＭ処置で測定されたＲＬＵのパーセンテージとして表わされている。Ｂ）ＭＸ１プロモーター駆動性ルシフェラーゼを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＯＨＹｒ２３を１０ｎＭでトランスフェクトした。こうした細胞を、一連の濃度（０ｎＭ～３１２ｎＭ）のＯＨＹｒ１０（配列番号３０）またはＯＨＹｒ０９（配列番号３４）のいずれかで共トランスフェクトした。細胞をＢｒｉｇｈｔｇｌｏで溶解し、ルミネセンスを読み取った。エラーバーは、１条件当たり三重重複のトランスフェクションのものである。

【図6】 Ｉ型ＩＦＮを誘導するそれらの能力についてのｉｍｍＲＮＡ構築物のスクリーニング。ＩｍｍＲＮＡを、ＩＳＧ５４により駆動されるｌｕｃｉａルシフェラーゼレポーターの安定組込みによりヒトＴＨＰ－１単球細胞株に由来するＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞へとトランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーター応答を、１００％に対して正規化し、ＲＮＡのｌｏｇ濃度に対してプロットした。ＯＨＹｒ０５（配列番号２６）のＥＣ５０値は、ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）のＥＣ５０が１４ｎＭだったことと比較して、３．４７ｎＭであると決定された。

【図7】 ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－ＩおよびＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ｎｕｌｌでの、様々なＩｍｍＲＮＡによる細胞ベースアッセイ。Ａ）様々な長さのＩｍｍＲＮＡ、Ｂ）様々なグアノシン挿入を有するＩｍｍＲＮＡ。Ｃ）９位に様々なヌクレオチドを有するＩｍｍＲＮＡ。様々な長さのＲＮＡを１００ｎＭの一定濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、ＲＬＵとして表されている。

【図8】 Ａ）ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞およびＢ）ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉにおける、市販ＲＮＡおよびＩｍｍＲＮＡ ＯＨＹｒ１６（３ｐ１０ＬＡ９；配列番号２５）の活性間の比較。様々な濃度のＲＮＡを両細胞へとトランスフェクトし、２×系列希釈した。トランスフェクションの２４時間後にルミネセンス値を記録した。

【図9】 ）ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞およびＢ）ＨＥＫ－Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ－Ｉにおける、ＩｍｍＲＮＡ ＯＨＹｒ１６（３ｐ１０ＬＡ９；配列番号２５）および市販ＲＮＡの安定性試験。ＲＮＡを、細胞へのトランスフェクション前に無血清培地で２４、４８、７２、および９６時間インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後にルミネセンス値を記録した。

【図10A】 ｉｍｍＲＮＡのキンク位置は、生物学的活性に影響を及ぼす。Ａ）ヌクレオチド５位（ＯＨＹｒ１０）、１９位（ＯＨＹｒ１１）、および２１位（ＯＨＹｒ０１）のキンクは、ＩＦＮ産生を無効にする。ルシフェラーセ（ｌｕｃｉｆｅｒａｃｅ）活性％を、３１２ｎＭで使用したＯＨＹｒ２３で検出された値に対して正規化した。

【図10B】 ｉｍｍＲＮＡのキンク位置は、生物学的活性に影響を及ぼす。Ｂ）ステムから９位のｉｍｍＲＮＡの５’側のキンク（ＯＨＹｒ０５）は、キンク無し（ＯＨＹｒ２３）と比較して生物学的活性を向上させたが、ステムから９位のｉｍｍＲＮＡの３’側のキンク（ＯＨＹｒ０２）は、生物学的活性を無効にした。ルシフェラーセ活性％を、１００ｎＭで使用したＯＨＹｒ２３で検出された値に対して正規化した。

【図10C】 ｉｍｍＲＮＡのキンク位置は、生物学的活性に影響を及ぼす。Ｃ）９位キンクのプリン（ＯＨＹｒ０５ではグアニンおよびＯＨＹｒ１６ではアデニン）は、９位キンクのピリミジン（ＯＨＹｒ１７ではウラシルおよびＯＨＹｒ１８ではシトシン）よりも高い生物学的活性を有する。直接トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ ＭＸ１Ｐ－ｌｕｃレポーター細胞を、Ａ～Ｃでの読出しとして使用した。

【図11】 ステムの長さは、ｉｍｍＲＮＡの生物学的活性に影響を及ぼす。ＯＨＹｒ２３（１０ヌクレオチド長）およびＯＨＹｒ０８（３０ヌクレオチド長）は、ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＸ１Ｐ－ｌｕｃレポーターアッセイにて高い活性を示す。対照的に、ＯＨＹｒ１２（６ヌクレオチド長）、ＯＨＹｒ２０（９ヌクレオチド長）、ＯＨＹｒ０３（１１ヌクレオチド長）、ＯＨＹｒ０７（１２ヌクレオチド）、およびＯＨＹｒ１３（１４ヌクレオチド長）は、生物学的活性が低いかまたは生物学的活性を示さなかった。ルシフェラーセ活性％を、１００ｎＭで使用したＯＨＹｒ２３で検出された値に対して正規化した。直接トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ ＭＸ１Ｐ－ｌｕｃレポーター細胞を、Ａ～Ｃでの読出しとして使用した。

【図12】 ３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）は、インターフェロン応答を誘導し、Ｕ９３７－ＤＣ－ＳＩＧＮ細胞およびＡ５４９細胞の両方においてＤＥＮＶ－２感染に対する予防に効果的である。（Ａ）３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）および３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）の構造および配列は、表に示されている通りである。（Ｂ）３ｐ１０Ｌ、３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）、またはＧ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）を、Ｕ９３７－ＤＣ－ＳＩＧＮまたはＡ５４９細胞へとトランスフェクトした。上清を回収し、ＩＳＲＥ－ｌｕｃ ＨＥＫ－２９３Ｔレポーター細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。表には、３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）および３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）のＥＣ５０値（ｎＭ）が示されている。（Ｃ）トランスフェクトした細胞を、ＤＥＮＶ－２（ＴＳＶ０１）にＭＯＩ－１で感染させ、感染の２４時間後に、ＮＳ１に結合する抗体およびＥ－タンパク質に結合する抗体（４Ｇ２）で染色した。表には、３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）および３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）のＥＣ５０値（ｎＭ）が示されている。（Ｄ）感染させたＵ９３７－ＤＣ－ＳＩＧＮ細胞（左）またはＡ５４９細胞（右）の代表的なフローサイトメトリーグラフが示されている。Ｕ９３７－ＤＣ実験の場合、記号は、２つの独立実験の平均±ＳＥＭ、ｎ＝６である。Ａ５４９実験の場合、記号は、２つの独立実験の平均±ＳＥＭ、ｎ＝４である。（Ｂ）および（Ｃ）におけるルシフェラーゼアッセイおよび感染アッセイの統計的有意差は、通常の二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、それぞれＵ９３７－ＤＣ（ｐ＝０．０１３、ｐ＜０．０００１）およびＡ５４９（ｐ＝０．００５８、ｐ＜０．０００１）と算出された。

【図13】 ３ｐ１０ＬＧ９／ＯＨＹｒ０５（配列番号２６）は、一次ヒト皮膚ＤＣにおいて、３ｐ１０Ｌ／ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）と比較して、ＤＥＮＶ－２感染に対する予防剤としてより高い効力を有する。（Ａ）ヒト皮膚ＤＣを、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、および６２ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）または３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）でトランスフェクトし、２４時間インキュベートした。上清を、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ－ｌｕｃ）を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞でインキュベートし、６時間後にルミネセンスを測定した（右パネル）。結果は、Ｇ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）と比較した倍数変化として示されている。各記号は、１人のドナーに由来する試料を表わす。統計的有意差（ｐ＜０．０５）を、ダネットの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（ｎｓ：有意でない）。（Ｂ）２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、および６２ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）または３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）を２４時間トランスフェクトしたヒト皮膚ＤＣを、ＤＥＮＶ－２にＭＯＩ ５で４８時間感染させた。４Ｇ２抗体で細胞内染色することにより、フローサイトメトリーを使用して、皮膚ＤＣの各部分集団中のＤＥＮＶ－２感染細胞のパーセンテージを定量化した。各条件の感染細胞のパーセンテージを、Ｇ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）に対して正規化した。（Ｃ～Ｅ）６２ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）または３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）でトランスフェクションした後の（Ｂ）にプロットされているデータから取った皮膚ＤＣの各部分集団の感染細胞のパーセンテージ（左）および代表的なフローサイトメトリー（右）。（Ｃ）ＣＤ１１ｃ ＤＤＣ、（Ｄ）ランゲルハンス細胞、（Ｅ）ＣＤ１４ ＤＤＣ。各記号は、１人のドナーを表わす。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差（ｐ＜０．０５）を、ダネットの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）。

【図14】 ＩｍｍＲＮＡ ３ｐ１０ＬＧ９は、一次ヒト皮膚ＤＣにおいてＤＥＮＶ－２感染に対する治療効果を有する。（Ａ～Ｃ）ヒト皮膚ＤＣを、ＤＥＮＶ２にＭＯＩ ５で感染させ、感染後のそれぞれの時点で、６２ｎＭの３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）、３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）、またはＧ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）を導入した。皮膚ＤＣの各部分集団内の感染細胞のパーセンテージを示すグラフ（左）は、ＦＡＣＳプロット（右）により表わされているように、４Ｇ２抗体による細胞内染色により反映されている。各条件の感染細胞のパーセンテージを、その特定のドナーのＧ９ｎｅｇ対照に対して正規化した。（Ａ）ＣＤ１１ｃ皮膚ＤＣ、（Ｂ）ランゲルハンス細胞、（Ｃ）ＣＤ１４皮膚ＤＣ。各ドットは、１人のドナーに由来する試料を表わす。統計的有意差を、多重比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）。

【図15】 ＩｍｍＲＮＡは、ＤＥＮＶ－２ ＶＬＰワクチンと共にアジュバントとして使用した場合、抗体産生を増強し、保護を増加させた。１０ｕｇのＤＥＮＶ－２ ＶＬＰを、ｉｎ ｖｉｖｏＪＥＴ－ＰＥＩまたはポリＩ：Ｃと混合された２５ｕｇのｉｍｍＲＮＡと共に注射し、ＣＤ１１ｃ－ｃｒｅ－ＩＦＮＡＲｆｌ／ｆｌマウス（ツストら（Ｚｕｓｔ ｅｔ ａｌ．）（２０１４），Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８８（１３）：７２７６－８５）に筋肉内注射した。（Ａ）ワクチン接種実験の免疫化および負荷スケジュール。（Ｂ）ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を、１０６ｐｆｕのＤＥＮＶ－２で感染させたＤＥＮＶ－２ ＶＬＰワクチン接種マウス（ｎ＝５～９）の血漿から抽出した。Ｔａｑｍａｎアッセイを行って、血漿中のｖＲＮＡ濃度を決定した。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、スチューデントｔ－検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎｓ：有意ではない）。（Ｃ）ワクチン接種後の２１および２８日目に出血させたＤＥＮＶ－２ ＶＬＰワクチン接種マウスに由来する血漿でのエンドポイント力価ＤＥＮＶ－２ ＥＬＩＳＡ。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、スチューデントＴ－検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、ｎｓ：有意ではない）。（Ｄ）カプラン－マイヤー方法を使用して生存曲線を生成し、有意差をログランク検定を使用することにより算出した（ｎｓ：有意ではない）。（Ｅ）感染後６日間の期間にわたって体重を測定し、初期体重の％としてプロットした。２０％を超える体重減少を有するマウスは瀕死であるとみなし、安楽死させた。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差を、多重比較を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（Ｐ＝０．０００７）。

【図16】 ３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）は、一次ヒト皮膚ＤＣサブセットにおいてＣＤ８０発現を増加させた。一次ヒト皮膚細胞を、２５０ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９またはＧ９ｎｅｇでトランスフェクトしたか、または陽性対照としての１０００Ｕの組換えヒトＩＦＮβで処置した。７２時間後、皮膚抗原提示細胞の各部分集団でのＣＤ８０発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。個々のドナー（ｎ＝４）に由来するデータポイントは直線で接続されている。統計的有意差を、対応スチューデントＴ－検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５）。

【図17】 ｉｍｍＲＮＡは、ヒト抗原提示細胞において自然免疫遺伝子上方制御を誘導した。ｒＮＥＧ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）で処置された同じバッチの細胞と比べて、ｒ０５（配列番号２６）で処置されたヒト皮膚に由来する抗原提示細胞において発現が異なる遺伝子を分析した。データポイントは、ヒトＣＤ１１ｃ＋ ＤＤＣ、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４１＋ ＤＤＣ、およびランゲルハンス細胞からのものである。各記号は、１つの単離細胞を表わす。単離細胞ＲＮＡｓｅｑ ＳＭＡＲＴ－ｓｅｑ ｖ２技術を使用して、細胞のトランスクリプトームを配列決定した。データは、ｒ０５をｒＮＥＧ処置細胞と比較した場合の上位６つのＤＥＧを示す。ｙ軸は、遺伝子発現の倍数変化をｌｏｇ２スケールで示す。

【図18】 ３ｐ１０ＬＧ９により誘導されたインターフェロンシグナルは、ＲＩＧ－Ｉ依存性である。（Ａ）ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、５０ｎｇのｐＵＮＯ－ｈＲＩＧ－ＩまたはｐＵＮＯ－ｈＭＤＡ５でトランスフェクトした。その後、こうした細胞を、１０ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９、３ｐ１０Ｌ、またはＧ９ｎｅｇのいずれかでトランスフェクトした。こうしたトランスフェクトＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来する上清を、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ－ｌｕｃ）を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差を、多重比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）。（Ｂ）３ｐ１０ＬＧ９、３ｐ１０Ｌ、Ｇ９ｎｅｇ、またはＬＭＷポリＩ：Ｃを、ＲＩＧ－ＩノックアウトＵ９３７－ＤＣ細胞（ＫＯ）または親Ｕ９３７－ＤＣ細胞（ＷＴ）のいずれかへとトランスフェクトした。ＩＦＮＢ、ＤＤＸ５８（ＲＩＧ－Ｉ）、ＭＤＡ５、およびＲＳＡＤ２（Ｖｉｐｅｒｉｎ）に関する、トランスフェクトＵ９３７－ＤＣ細胞から抽出されたｍＲＮＡの遺伝子発現分析：データは、Ｇ９ｎｅｇ処置ＲＩＧ－Ｉ ＷＴ試料の平均と比較した倍数変化として表わされている。バーは、三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示し、データは、２つの独立実験を代表するものである。統計的有意差は、両側スチューデントｔ－検定を使用して決定した（＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。

【図19】 ３ｐ１０ＬＧ９の抗ウイルス効果は、ＲＩＧ－ＩおよびＩＦＮＡＲシグナル依存性である。（Ａ）ｉｍｍＲＮＡまたはポリＩ：ＣのいずれかでトランスフェクトしたＵ９３７－ＤＣ細胞に由来する上清を、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ－ｌｕｃ）を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。バーは、三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示し、データは、２つの独立実験を代表するものである。統計的有意差は、両側スチューデントｔ－検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。（Ｂ）ｉｍｍＲＮＡまたはポリＩ：Ｃのいずれかで事前に２４時間処置したＵ９３７－ＤＣ細胞を、ＤＥＮＶ－２ ＴＳＶ０１（ＭＯＩ－１）に感染させた。感染の２４時間後に、ＮＳ１を標的とする抗体およびＥ－タンパク質融合ループを標的とする抗体（４Ｇ２）によるフローサイトメトリーを使用して感染生存細胞を定量化した。バーは、三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示し、データは、２つの独立実験を代表するものである。各細胞タイプ内の処置方法間の統計的有意差は、両側スチューデントｔ－検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。（Ｃ）ＮＳ１を標的とする抗体およびＥ－タンパク質を標的とする抗体（４Ｇ２）で染色された生存Ｕ９３７－ＤＣ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。ＨＭＷ：高分子量、ＬＭＷ：低分子量。（Ｄ）３ｐ１０ＬＧ９の抗ウイルス効果は、Ｉ型インターフェロン依存性である。１０ｕｇ／ｍＬの抗ＩＦＮＡＲ阻止抗体またはアイソタイプ対照のいずれかを添加する前に６時間にわたって、Ｕ９３７－ＤＣ ＳＩＧＮ細胞を、ｉｍｍＲＮＡ、ポリＩ：Ｃでトランスフェクトしたか、またはＩＦＮβで処置した。一晩インキュベーションした後、上清を収集し、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ－ｌｕｃ）を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。バーは、２つの独立実験の三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、両側スチューデントｔ－検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。（Ｅ）Ｕ９３７－ＤＣ細胞を、ＤＥＮＶ－２ ＴＳＶ０１（ＭＯＩ－１）に感染させた。感染の２４時間後に、ＮＳ１を標的とする抗体およびＥ－タンパク質を標的とする抗体（抗体４Ｇ２）によるフローサイトメトリーを使用して感染生存細胞を定量化した。バーは、２つの独立実験の三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、両側スチューデントｔ－検定を使用して決定した（＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。

【図20】 一次ヒト皮膚細胞による３ｐ１０ＬＧ９取込み。皮膚細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７で標識された種々の濃度の３ｐ１０ＬＧ９でトランスフェクトした。細胞を、感染の２４時間後にフローサイトメトリーを使用して分析した。様々な濃度の３ｐ１０ＬＧ９－ｒｅｄを有する様々な細胞タイプ間の統計的有意差は、反復測定の二元配置ＡＮＯＶＡを使用して算出した（ｐ＝０．００２６）。記号は、平均±ＳＤ、ｎ＝３を示す。

【図21】 ｉｍｍＲＮＡによる処置後のＡ５４９細胞生存率アッセイ。様々な濃度の３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）、３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）または５’三リン酸を有していない３ｐ１０ＬＧ９でトランスフェクションした２４時間後の生存細胞の定量化。Ｄｏｘ（ドキソルビシン）を、細胞死の陽性対照として使用した。