【図1】 図１Ａ～１Ｂは、ｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が確立された実験的ＯＭ動物モデルにおいて細菌クリアランスを促進することを示す。希釈剤、５μｇ ｒＨＭＧＢ１、または５μｇ ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を、ＮＴＨＩに感染して４日後および５日後のチンチラの中耳に直接送達した。動物を２４時間後に屠殺し、彼らの中耳を画像化し（図１Ａ）、図１Ａの下に記載される基準に基づいて盲検的にスコア付けした（図１Ｂ）。バーは、ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。画像およびスコア付けは、ＨＭＧＢ１が、予め形成されたＮＴＨＩバイオフィルムをインビボで一掃し得たことを示す。

【図2-1】 図２Ａ～２Ｄは、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が細菌クリアランスを促進し、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａに感染したマウスの気道において炎症応答を増大させないことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０７ ＣＦＵ（ｉ．ｔ．）を感染させ、同時に、ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を与えた。１８時間後、（図２Ａ） Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＣＦＵをＢＡＬにおいて定量し、（図２Ｂ）肺へと浸潤する全宿主細胞を、ＢＡＬにおいて計数し、（図２Ｃ）ＢＡＬ細胞を、抗ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ－６Ｇで染色して、好中球移動を測定した。バーは標準偏差を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５。（図２Ｄ）７２ ｈｐｉで肺を集めた。組織を固定し、パラフィン中に包埋し、切片にし、Ｈ＆Ｅで染色した。すべてのパネルは、１０×倍率を示す。ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）処置は、ｒＨＭＧＢ１と比較して、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＣＦＵおよびインビボでの炎症性細胞浸潤において有意な減少を生じたことに注意のこと。

【図2-2】 図２Ａ～２Ｄは、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が細菌クリアランスを促進し、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａに感染したマウスの気道において炎症応答を増大させないことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０７ ＣＦＵ（ｉ．ｔ．）を感染させ、同時に、ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を与えた。１８時間後、（図２Ａ） Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＣＦＵをＢＡＬにおいて定量し、（図２Ｂ）肺へと浸潤する全宿主細胞を、ＢＡＬにおいて計数し、（図２Ｃ）ＢＡＬ細胞を、抗ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ－６Ｇで染色して、好中球移動を測定した。バーは標準偏差を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５。（図２Ｄ）７２ ｈｐｉで肺を集めた。組織を固定し、パラフィン中に包埋し、切片にし、Ｈ＆Ｅで染色した。すべてのパネルは、１０×倍率を示す。ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）処置は、ｒＨＭＧＢ１と比較して、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＣＦＵおよびインビボでの炎症性細胞浸潤において有意な減少を生じたことに注意のこと。

【図3】 図３は、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が腹腔において好中球移動を促進しないことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔に、４％ チオグリコレート、ｒＨＭＧＢ１、またはｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を注射した。その腹膜滲出物内の細胞を、抗ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ－６Ｇで染色して、腹腔（ＰＣ）中の全好中球数を決定した。バーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）は、ｒＨＭＧＢ１の炎症性活性を欠くことに注意のこと。

【図4】 図４は、細菌性病原体に対するＨＭＧＢ１改変体の抗バイオフィルム効果を示す。示したＨＭＧＢ１アイソフォーム（２００ｎＭ）を、２４時間でそれぞれのインビトロで形成した細菌バイオフィルムに添加した。接種して１６時間後に、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、次いで、ＣＬＳＭを介して可視化した。画像をＣｏｍｓｔａｔによって分析して、平均厚およびバイオマスを計算した。ＵＰＥＣの代表画像を（図４Ａ）に示す。コントロールと比較した平均厚のパーセント変化を、（図４Ｃ）に示す。８００ｎＭ ｒＨＭＧＢ１および２００ｎＭ ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＥＳＫＡＰＥ）バイオフィルム処理に使用した。８００ｎＭ ｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（ＥＳＫＡＰＥ）バイオフィルムの処理に使用した。これらを、１６時間のものとは対照的に、それぞれのタンパク質とともに１時間インキュベートした。バイオマス（示さず）は、同一の傾向を示した。バーはＳＥＭを表す。コントロールと比較した統計的有意差は、対応のないｔ検定で評価した（＊Ｐ＜０．０５）。ＨＭＧＢ１およびその改変体は、確立されたバイオフィルムを有意に破壊できた。

【図5-1】 図５は、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が、抗生物質媒介性殺滅を強化することを示す。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを２４時間にわたって予め形成し、次いで、ミノサイクリン（１ｍｇ／ｍｌ）、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）（２００ｎＭ）、またはｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）（２００ｎＭ）＋ミノサイクリン（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１６時間にわたってインキュベートした。バイオフィルムを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭを介して画像化した。生細胞は、各画像の上半分に示され、死細胞は、各画像の下半分に示される。ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）およびミノサイクリンの両方の存在下でのみ死細胞が増大することに注意のこと。

【図5-2】 図５は、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が、抗生物質媒介性殺滅を強化することを示す。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを２４時間にわたって予め形成し、次いで、ミノサイクリン（１ｍｇ／ｍｌ）、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）（２００ｎＭ）、またはｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）（２００ｎＭ）＋ミノサイクリン（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１６時間にわたってインキュベートした。バイオフィルムを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭを介して画像化した。生細胞は、各画像の上半分に示され、死細胞は、各画像の下半分に示される。ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）およびミノサイクリンの両方の存在下でのみ死細胞が増大することに注意のこと。

【図6】 図６は、ｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が、実験的ＯＭ動物モデルにおいてバイオフィルム消散を促進することを示す。希釈剤または５μｇ ｒＨＭＧＢ１もしくはｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を、ＮＴＨＩに感染して４日後および５日後のチンチラの中耳に直接送達した。動物を２４時間後に屠殺し、彼らの中耳を画像化し（図６Ａ）、（図６Ａ）の下に記載される基準に基づいて盲検的にスコア付けした（図６Ｂ）。バーはＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。画像およびスコア付けは、ＨＭＧＢ１が予め形成したＮＴＨＩバイオフィルムのクリアランスをインビボで促進したことを示す。

【図7】 図７は、ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）が細菌クリアランスを促進するが、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａに感染したマウスにおいて気道炎症を増大させないことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０７ ＣＦＵ（ｉ．ｔ．）を感染させ、同時に、５ｍｇ ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）を与えた。（図７Ａ）Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａの凝集物がα－Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ抗体でプローブした切片において蛍光顕微鏡によって見えた。１８時間後、（図７Ｂ）ＣＦＵをＢＡＬにおいて定量し、（図７Ｃ）ＢＡＬ細胞を、α－ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、およびＬｙ－６Ｇで染色して、好中球移動を測定した。バーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５。（図７Ｄ）７２ｈｐｉで集めた肺組織を固定し、パラフィン中に包埋し、切片にし、Ｈ＆Ｅで染色した。１０×倍率。ｍＨＭＧＢ１（Ｃ４５Ｓ）処理は、ｒＨＭＧＢ１と比較して、インビボで、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＣＦＵおよび炎症性細胞浸潤における有意な減少を生じた。