【図1】 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＡＤＲ誘発性腎症での、化合物の最適用量を試験するための実験設計。３０匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスに、１２ｍｇ／ｋｇの用量で、ドキソルビシン（ＡＤＲ、アドリアマイシン）を尾静脈注射により注射した。ベースライン群の５匹のマウスは、食塩水を受けた。次に、ＡＤＲ注射したマウスを、それぞれが５匹の動物となる６つの群に分け、合計で７つの実験群を得た。翌日に開始し、化合物を１日１回、５週間経口摂食により投与した。尿を毎週収集し、体重を毎週記録した。血液と腎臓の毛皮質を、ＡＤＲ注射の３５日後に犠牲にして収集した。

【図2】 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＡＤＲ誘発性腎症での、化合物を試験するための実験設計。メスＢａｌｂ／ｃマウスに、１２ｍｇ／ｋｇの用量で、ドキソルビシン（ＡＤＲ、アドリアマイシン）を尾静脈注射により注射した。対照群の５匹のマウスは、食塩水を受けた。ＡＤＲを注射したメスを、６匹の５つの群に分けた。翌日に開始し、ビヒクル又は化合物を１日１回、示すように４週間経口摂食により投与した。尿を毎週収集し、体重を毎週記録した。血液と腎臓の毛皮質を、ＡＤＲ注射の２８日後に犠牲にして収集した。

【図3】 分化したヒト糸球体上皮細胞における化合物の細胞傷害性。分化したヒト糸球体上皮細胞を、０μＭ（ビヒクル）、１μＭ、５μＭ、及び１０μＭのＣｐｄ Ａ、Ｃｐｄ Ｃ、Ｃｐｄ Ｄ、Ｃｐｄ Ｅ、Ｃｐｄ Ｆ、及びＣｐｄ Ｇで１８時間処理した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｙｔｏＴｏｘ Ａｓｓａｙキットを使用して、細胞傷害性を評価した。プレーンな培地（無地の棒）をベースラインとして使用した。細胞傷害性シグナルを生存能シグナルに対して正規化し、細胞数の差による偏りを排除した。全ての処理を、ビヒクル処理した細胞と比較した。有意な毒性は、１０μＭを上回るＣｐｄ Ａ及びＣｐｄ Ｃのみで見いだされた。一元ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３、独立実験、ダネット検定、＊ｐ＜０．５、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図4】 Ｃｐｄ Ｃ、Ｃｐｄ Ａ、及びＣｐｄ Ｇでの処理では、分化した糸球体上皮細胞におけるＡＢＣＡ１の発現と、コレステロール流出が増加する。 分化したヒト糸球体上皮細胞を、ビヒクル（０．１％ ＤＭＳＯ）又は記載した化合物で１８時間処理し、ＡＢＣＡ１発現、局在化、及びコレステロール流出への関与を測定した。（ａ）ＬＸＲアゴニスト（Ｃｐｄ Ｃ、Ｅ及びＤ）によるＡＢＣＡ１発現の強力な誘発、並びに、１０μＭのＡＢＣＡ１誘導因子Ｃｐｄ Ａ及びＧによる中程度の誘発を示す、全細胞可溶化物におけるＡＢＣＡ１及びＧＡＰＤＨウェスタンブロット。（ｂ～ｅ）Ｃｐｄ Ｃ、Ｃｐｄ Ａ、及びＣｐｄ Ｇは、原形質膜におけるＡＢＣＡ１の発現を増加させる。ビヒクル又は化合物Ｃ、Ａ、及びＧで、示したとおりに１８時間処理した、分化したヒト糸球体上皮細胞を、細胞分画に通した。（ｂ）Ｃｐｄ Ａ（５μＭ）及びＣｐｄ Ｇ（１０μＭ）で処理した後の、ＡＢＣＡ１発現の中程度の増加を示す、全細胞可溶化物におけるＡＢＣＡ１及びＧＡＰＤＨウェスタンブロット。（ｃ～ｅ）ＡＢＣＡ１、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプ、及びＭＥＫでブロット及びプローブ処理した、原形質膜、ミクロソーム、及びサイトゾル収集分画。（ｆ～ｈ）Ｃｐｄ Ｃ、Ａ、及びＧは、分化した糸球体上皮細胞にて、ＡｐｏＡ１が媒介するコレステロール流出を増加させる。［３－Ｈ］コレステロールでロードした、分化した糸球体上皮細胞を、示した化合物で１８時間インキュベートした。ＡｐｏＡ１が媒介するコレステロール流出を、ＡｐｏＡ１有り又は無しで１８時間、細胞をインキュベートした後に計算した。データを、少なくとも３つの独立実験の平均（標準偏差含む）として報告した。一元ＡＮＯＶＡ、ダネット検定、＊Ｐ＜０．０５％、＊＊Ｐ＜０．０１％

【図5】 ＡＤＲにより誘発される腎損傷を軽減するための、化合物の最適用量の選択。（ａ～ｅ）指示用量での、化合物による５週間の処理の間の、ＡＤＲ注射したマウスにおけるアルブミン尿。マウスは、ＡＤＲの注射から２～３週間後に多量のタンパク尿を生み出し、これは、３０ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ Ａの用量（ｂ）、及び、１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ Ｇの用量（ｅ）で処理したマウスにおいて軽減された。（ｆ～ｊ）ＡＤＲを注射したマウスは、ＡＤＲ注射の２～３週間後に体重の有意な低下を特徴とし、これは、３０ｍｇ／ｋｇのＣｐｄ Ａ、又は１００ｍｇのＣｐｄ Ｇを受けたマウスにおいて特に軽減される表現型である。結果は、各群の平均及びＳＥを示す。一元ＡＮＯＶＡ、ｎ＝５、ダネット検定、＊Ｐ＜０．０５％。

【図6】 ＡＢＣＡ１誘導因子Ｃｐｄ Ａ及びＣｐｄ Ｇは、ＡＤＲを注射したマウスにおいて、アルブミン尿と体重減少を有意に減少／低下させる。ＡＤＲ（１２ｍｇ／Ｋｇ）を注射したマウスは、ビヒクル、ＬＸＲアゴニストＣｐｄ Ｃ、又は最適用量のＡＢＣＡ１誘導因子Ｃｐｄ Ａ及びＣｐｄ Ｇを２８日間、１日１回受けた。アルブミン尿及び体重は、週に１回測定した。（ａ）４週間の処置後のアルブミン尿。（ｂ）各マウスに、処置の４週間後、及び、ＡＤＲ注射の１日前に行った、体重の差として表す体重減少。ＡＤＲを注射していないマウスであるベースライン群（左に示す）は、腎損傷のない表現型を反映する。棒は中央値、及び、各処置群の範囲を表す。全ての群を、マン・ホイットニーの検定を使用して、ビヒクルを受けたものと比較した（ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５％、＊＊Ｐ＜ ０．０１％、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１％）。

【図7】 ＡＤＲを注射し、ビヒクル、又は１００ｍｇ／Ｋｇ／日のＣｐｄ Ｇで４週間処理した動物の腎臓からの、ＰＡＳ及びＨＥ分泌物の病理学的試験。病理学者は、全節性硬化症の割合（Ａ）；分節状硬化症の割合（Ｂ）；糸球体上皮細胞の肥大（Ｃ）；糸球体上皮細胞の過形成（Ｄ）；管状小嚢腫（Ｅ）、及び間質炎（Ｆ）を評価した。尺度値は以下を表す：０：０ ％；０．５＋：１～１０ ％；１＋：１１～２５％；２＋：２６～５０ ％；３＋：５１～７５ ％；４＋＞７５％。マン・ホイットニーの検定を使用して、Ｃｐｄ Ｇ処理群のサンプルを、ビヒクル処理と比較した（ｎ＝７；＊Ｐ＜０．０５％）

【図8】 食塩水又はＡＤＲを注射したマウスを、ビヒクル又は１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ Ｇのいずれかで２８日間処理した。腎皮質の断面をＯＲＯで染色して、脂肪滴の沈着を検出した。健常なベースライン群（Ａ）、ＡＤＲを注射し、ビヒクル（Ｂ）、及び１００ｍｇ／Ｋｇ／日のＣｐｄ Ｇ（Ｃ）で処理した群からの分泌物の、代表的な写真。

【図9】 Ｃｐｄ Ｇは、ＡＤＲを注射したマウスの腎組織で、エステル化したコレステロールの蓄積を低減する。ビヒクル又はＣｐｄ Ｇで２８日間処理した、ＡＤＲを注射したマウスの腎皮質から抽出した脂質の、コレステロールエステル、総コレステロール、及びトリグリセリドを評価した。各脂質種の量を、試料に存在する全タンパク質に対して正規化した。腎組織中で見いだされる、（ａ）エステル化したコレステロール、（ｂ）総コレステロールの含量、及び（ｃ）トリグリセリドの含量。ＡＤＲ注射を受けなかった動物が左に示され、腎損傷が誘発されないときのベースライン値を表す。Ｃｐｄ Ｇ及びビヒクルで処理した群を、マン・ホイットニー両側検定を使用して比較した（ｎ＝８；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１％）。（ｄ～ｆ）。各マウスのアルブミン尿と、腎皮質に存在する脂質種の量との相関関係。コレステロールエステル（ｄ）とは強力な相関関係が見いだされたが、総コレステロール（ｅ）及びトリグリセリド（ｆ）とは見いだされなかった。ピアソン検定、ｎ＝１０

【図10】 １２ｍｇ／ＫｇのＡＤＲを注射した動物を、ＡＤＲ注射の１日後に、ビヒクル又は１００ｍｇ／Ｋｇで処理した。ビヒクル（Ａ～Ｂ）、及び１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ Ｇ（Ｃ～Ｄ）で２０日間処理した後に撮影した写真。

【図11】 Ｃｐｄ Ｇにより、Ｃｏｌ４Ａ３ ＫＯマウスを処理することで、末期腎疾患の進行が遅延される。４週齢の１２９－Ｃｏｌ４Ａ３ ＫＯマウスを、ビヒクル又は１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ Ｇで４週間処理した。実験の終わり（５６日目）に、体重を測定して、随時尿及び血液を採取して、腎臓での脂質の蓄積を分析した。ビヒクル又はＣｐｄ Ｇで処理したＫＯマウスの、（ａ）アルブミン尿、（ｂ）血清クレアチニン、（ｃ）血中尿素窒素、及び（ｄ）体重。（ｅ）各群からのＰＡＳ染色した腎臓断面の代表的な写真、（ｆ）ｅで言及した、ＰＡＳ染色した肝臓断面の、盲検病理学分析後の、メサンギウム拡大の定量化。同じ年齢のＣｏｌ４ａ３＋／＋マウス（ｗｔ）を左に含めて、慢性腎疾患を有しない表現型を反映した。（ｇ）６週齢の時点で開始した、４週間ビヒクル又はＣｐｄ Ｇ（１００ｍｇ／Ｋｇ／日）を受けた、１２９－Ｃｏｌ４ａ３ ＫＯマウスの生存曲線。水平の棒は、各基の中央値を表す。群間での統計学的差異を、両側マン・ホイットニー検定を使用して計算した（ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５％、＊＊Ｐ＜０．０１％）。

【図12】 Ｄｂ／＋、ｄｂ／ｄｂビヒクルで処理した、及び、ｄｂ／ｄｂ ＡＢＣＡ１誘導因子（化合物Ａ）で処理したマウスを利用して、以下について分析した：（Ａ）における、処理の開始時（１４週間）、処理の２週間後（１６週間）、及び、４週間の処理の後に犠牲にした時点（１８週間）にて測定した、クレアチニンに対するアルブミンの比率；マウス血清から測定し、ｍｇ／ｄＬで表した、血液尿素窒素（ＢＵＮ）（Ｂ）；総コレステロール（ＴＣ）、遊離コレステロール（ＦＣ）、及びコレステロールエステル（ＣＥ）の形態での、腎皮質コレステロール顔料（タンパク質１ｍｇ当たりでの、コレステロールｎｍｏｌの倍率変化）（Ｃ）；ＢＵＮとＣＥとの相関関係（Ｄ）；ＷＴ１抗体（Ｅ）により測定し、定量化した（Ｆ）、糸球体性断面積当たりの糸球体上皮細胞の数；ＰＡＳ染色した腎皮質断面（Ｇ）を使用して定量化（Ｈ）した、メサンギウム拡大スコア；ＴＥＭ画像から測定し（Ｉ）定量化（Ｊ）した、糸球体上皮細胞足突起の消滅。テューキー検定の後の一元ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図13】 Ｃｐｄ Ｇは、腎皮質中でのエステル化コレステロールの蓄積を低下させ、（ａ）エステル化コレステロール（ＣＥ）、（ｂ）総コレステロール（ＴＣ）、及び（ｃ）トリグリセリド含量（ＴＧ）を、４週齢の時点で開始した、ビヒクル又はＣｐｄ Ｇを２８日間受けた、８週齢のＣｏｌ４Ａ３ＫＯの腎皮質にて測定した。各脂質の含量を、総タンパク質含量に対して正規化した。野生型同腹子の群もまた、この研究に含めた（白円）。水平の棒は、各基の中央値を表す。両側マン・ホイットニー検定を使用して、統計学的差異を測定した（ｎ＝８）：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。