【図1A】 （スキューバリアントおよびＰＩバリアントを含む）Ｆｃヘテロ二量体化バリアントのセットの有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントがあり、これらはいずれのモノマーでも単独で使用できるｐＩバリアントである。

【図1B】 （スキューバリアントおよびＰＩバリアントを含む）Ｆｃヘテロ二量体化バリアントのセットの有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントがあり、これらはいずれのモノマーでも単独で使用できるｐＩバリアントである。

【図1C】 （スキューバリアントおよびＰＩバリアントを含む）Ｆｃヘテロ二量体化バリアントのセットの有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントがあり、これらはいずれのモノマーでも単独で使用できるｐＩバリアントである。

【図1D】 （スキューバリアントおよびＰＩバリアントを含む）Ｆｃヘテロ二量体化バリアントのセットの有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントがあり、これらはいずれのモノマーでも単独で使用できるｐＩバリアントである。

【図1E】 （スキューバリアントおよびＰＩバリアントを含む）Ｆｃヘテロ二量体化バリアントのセットの有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントがあり、これらはいずれのモノマーでも単独で使用できるｐＩバリアントである。

【図2】 等価バリアント型抗体定常領域とそれらのそれぞれの置換の一覧を示す。ｐＩ＿（－）は低ｐＩバリアントを示し、ｐＩ＿（＋）は高ｐＩバリアントを示す。これらは、本明細書に記載の抗体の他のヘテロ二量体化バリアントと任意選択的にかつ独立して組み合わせることができる（本明細書に概説されるように、他のバリアント型も同様である）。

【図3】 ＦｃγＲ結合を除去した有用な除去バリアントを示す（しばしば「ノックアウト」または「ＫＯ」バリアントと呼ばれる）。一般に、除去バリアントは両方のモノマーに見出されるが、場合によっては、それらは一方のモノマーのみにあってもよい。

【図4】 本明細書に記載の抗体の「非Ｆｖ」構成要素の特に有用な実施形態を示す。

【図5】 本明細書に記載されるように、構成要素として、１つ以上のｓｃＦｖを利用する主題のヘテロ二量体ｂｓＡｂのｐＩを増加または減少することにおいて使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは本明細書で、特に本明細書で示される抗ＣＤ３ＶＬおよびＶＨ配列で、特に使用される。単一電荷を有する単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８）：９８９－９９５（１９９３）から「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を低減させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。そのような荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを含む本明細書に開示される主題の抗体フォーマットのいずれかで使用することができる（例えば、１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット）。

【図6】 いくつかの例示的なドメインリンカーを示す。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、単鎖ＦｖをＦｃ鎖に連結する用途を見出す。いくつかの実施形態では、これらのリンカーを組み合わせることができる。例えば、ＧＧＧＧＳリンカーは、「ハーフヒンジ」リンカーと組み合わせることができる。

【図7A】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのＶＨ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体フォーマット重鎖骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｄ４０１Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖状のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、ならびに両方の鎖状のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、ならびに当該技術分野において既知であるように、Ｆａｂアーム交換を除去する両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。骨格９はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントを含む。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントならびに両方の鎖状のＳ２６７Ｋバリアントを含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ突然変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、およびＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、ならびに両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

【図7B】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのＶＨ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体フォーマット重鎖骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｄ４０１Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖状のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、ならびに両方の鎖状のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、ならびに当該技術分野において既知であるように、Ｆａｂアーム交換を除去する両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。骨格９はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントを含む。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントならびに両方の鎖状のＳ２６７Ｋバリアントを含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ突然変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、およびＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、ならびに両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

【図7C】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのＶＨ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体フォーマット重鎖骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｄ４０１Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖状のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、ならびに両方の鎖状のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、ならびに当該技術分野において既知であるように、Ｆａｂアーム交換を除去する両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。骨格９はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントを含む。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントならびに両方の鎖状のＳ２６７Ｋバリアントを含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ突然変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、およびＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、ならびに両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

【図7D】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのＶＨ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体フォーマット重鎖骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｄ４０１Ｋスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖状のＣ２２０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、ならびに両方の鎖状のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、ならびに当該技術分野において既知であるように、Ｆａｂアーム交換を除去する両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。骨格９はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントを含む。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントならびに両方の鎖状のＳ２６７Ｋバリアントを含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ突然変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、およびＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、ならびに両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

【図8A】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのＶＨ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な２＋Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体フォーマット重鎖骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、ならびに両方の鎖上のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格８は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格９はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

【図8B】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのＶＨ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な２＋Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体フォーマット重鎖骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、ならびに両方の鎖上のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格８は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格９はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

【図8C】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのＶＨ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な２＋Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異性抗体フォーマット重鎖骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、ならびに両方の鎖上のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格８は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格９はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

【図9】 Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）を含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用な定常軽鎖ドメイン骨格の配列を示す。列挙された配列と（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８および９９％同一であり、かつ／または１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の追加のアミノ酸修飾を含有する定常軽鎖骨格配列が本明細書に含まれる。

【図10A】 本明細書に記載の二重特異性抗体での使用に好適な例示的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号ＸＸＸ）であるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図５に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうｓｃＦｖの方向を示している。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図10B】 本明細書に記載の二重特異性抗体での使用に好適な例示的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号ＸＸＸ）であるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図５に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうｓｃＦｖの方向を示している。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図10C】 本明細書に記載の二重特異性抗体での使用に好適な例示的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号ＸＸＸ）であるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図５に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうｓｃＦｖの方向を示している。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図10D】 本明細書に記載の二重特異性抗体での使用に好適な例示的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号ＸＸＸ）であるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図５に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうｓｃＦｖの方向を示している。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図10E】 本明細書に記載の二重特異性抗体での使用に好適な例示的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号ＸＸＸ）であるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図５に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうｓｃＦｖの方向を示している。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図10F】 本明細書に記載の二重特異性抗体での使用に好適な例示的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号ＸＸＸ）であるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図５に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端へ向かうｓｃＦｖの方向を示している。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図11A】 臨床開発しやすいように両方に結合する抗原結合ドメインの開発を促進するための、ヒトおよびカニクイザルの両方を含む、本明細書に記載の抗体で使用するいくつかの抗原の抗原配列を示す。

【図11B】 臨床開発しやすいように両方に結合する抗原結合ドメインの開発を促進するための、ヒトおよびカニクイザルの両方を含む、本明細書に記載の抗体で使用するいくつかの抗原の抗原配列を示す。

【図12】 本明細書でＡＮ１と呼ばれる例示的なヒト化ＥＮＰＰ３結合ドメインの可変重鎖および可変軽鎖配列、ならびにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有するＡＮ１およびＩｇＧ１骨格に基づく抗ＥＮＰＰ３ ｍＡｂのＸＥＮＰ２８２７８の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図13A】 ＥＮＰＰ３結合親和性および／または効力の改善された精製および／または調節のために設計されたＡＮ１バリアントの可変重鎖および可変軽鎖配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。さらに、本明細書に示される可変重鎖ドメインのそれぞれは、他の任意のαＥＮＰＰ３可変軽鎖ドメインと対にすることができ、本明細書に示される可変軽鎖ドメインのそれぞれは、他の任意のαＥＮＰＰ３可変重鎖ドメインと対にすることができる。

【図13B】 ＥＮＰＰ３結合親和性および／または効力の改善された精製および／または調節のために設計されたＡＮ１バリアントの可変重鎖および可変軽鎖配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。さらに、本明細書に示される可変重鎖ドメインのそれぞれは、他の任意のαＥＮＰＰ３可変軽鎖ドメインと対にすることができ、本明細書に示される可変軽鎖ドメインのそれぞれは、他の任意のαＥＮＰＰ３可変重鎖ドメインと対にすることができる。

【図14A】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14B】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14C】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14D】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14E】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14F】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14G】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14H】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図14I】 αＥＮＰＰ３×αＣＤ３抗体で使用され得る追加のＥＮＰＰ３抗原結合ドメインの可変領域を示している。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は図１２に示されるように用いられる番号付けによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の番号付けシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。

【図15A】 本明細書に記載の抗体の数個のフォーマットを示す。図１５Ａは、「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットを示しており、第１のアームにはＥＮＰＰ３結合Ｆａｂが含まれ、第２のアームにはＣＤ３結合ｓｃＦｖが含まれている。図３０Ｂは、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットを示し、第１のアームには、ＥＮＰＰ３結合Ｆａｂが含まれ、第２のアームには、ＦａｂおよびｓｃＦｖが含まれ、ここで、Ｆａｂは、ＥＮＰＰ３に結合し、ｓｃＦｖは、ＣＤ３に結合する。

【図15B】 本明細書に記載の抗体の数個のフォーマットを示す。図１５Ａは、「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットを示しており、第１のアームにはＥＮＰＰ３結合Ｆａｂが含まれ、第２のアームにはＣＤ３結合ｓｃＦｖが含まれている。図３０Ｂは、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットを示し、第１のアームには、ＥＮＰＰ３結合Ｆａｂが含まれ、第２のアームには、ＦａｂおよびｓｃＦｖが含まれ、ここで、Ｆａｂは、ＥＮＰＰ３に結合し、ｓｃＦｖは、ＣＤ３に結合する。

【図16】 ボトルオープナーフォーマット（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の対照抗ＲＳＶ×高ＣＤ３二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１およびｓｃＦｖ可変領域第２を用いて命名される。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。ｓｃＦｖドメインはＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬの方向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図17A】 １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメイン配列を利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図17B】 １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメイン配列を利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図17C】 １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメイン配列を利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図18A】 １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図18B】 １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図18C】 １＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図19A】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図19B】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図19C】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図20A】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図20B】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図20C】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図20D】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＨＶＬ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図21】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで示し、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３０抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＬＶＨ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図22A】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＬＶＨ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図22B】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＬＶＨ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図22C】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．３２抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＬＶＨ］）を含む、例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図23A】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬＶＨ］）を含む例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図23B】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬＶＨ］）を含む例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図23C】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬＶＨ］）を含む例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図23D】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬＶＨ］）を含む例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図23E】 ２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットで、Ｌ１．４７＿Ｈ１．８９抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（別名ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬＶＨ］）を含む例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と他の鎖構成要素（例えば、定常領域およびドメインリンカー）との間の境界を示す。αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、９０、９５、９８、および９９％同一であり（本明細書で定義されるように）、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含有する、可変領域、Ｆｃ領域、および定常ドメインを利用できることに留意されたい。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。

【図24A】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、Ａ）ＣＦＳＥ＋ＫＵ８１２細胞の数の減少によって示され、およびＢ）ＣＦＳＥ＋ＫＵ８１２細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。まとめると、データは、プロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂがＫＵ８１２細胞上で用量依存的にリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を誘導したこと、ＣＤ３結合親和性がＲＴＣＣ効力と相関していること（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したこと）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂがＨ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したことを示している。

【図24B】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、Ａ）ＣＦＳＥ＋ＫＵ８１２細胞の数の減少によって示され、およびＢ）ＣＦＳＥ＋ＫＵ８１２細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。まとめると、データは、プロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂがＫＵ８１２細胞上で用量依存的にリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を誘導したこと、ＣＤ３結合親和性がＲＴＣＣ効力と相関していること（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したこと）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂがＨ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したことを示している。

【図25A】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるようなＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図25B】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるようなＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図25C】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるようなＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図26A】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるような活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図26B】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるような活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図26C】 ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるような活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図27A】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、Ａ）ＣＦＳＥ＋ＲＸＦ３９３細胞の数の減少によって示され、およびＢ）ＣＦＳＥ＋ＲＸＦ３９３細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＫＵ８１２細胞についてのデータと一致して、データは、プロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂがＲＸＦ３９３細胞上で用量依存的にリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を誘導したこと、ＣＤ３結合親和性がＲＴＣＣ効力と相関していること（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したこと）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂがＨ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したことを示している。

【図27B】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、Ａ）ＣＦＳＥ＋ＲＸＦ３９３細胞の数の減少によって示され、およびＢ）ＣＦＳＥ＋ＲＸＦ３９３細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＫＵ８１２細胞についてのデータと一致して、データは、プロトタイプαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂがＲＸＦ３９３細胞上で用量依存的にリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を誘導したこと、ＣＤ３結合親和性がＲＴＣＣ効力と相関していること（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂｓが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したこと）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂがＨ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＲＴＣＣを誘導したことを示している。

【図28A】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるようなＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図28B】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるようなＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図28C】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるようなＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３ Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂが、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図29A】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるような活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂが、ＣＤ３Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図29B】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるような活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂが、ＣＤ３Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図29C】 ＣＦＳＥ標識ＲＸＦ３９３のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２６８２０、ＸＥＮＰ２６８２１、ＸＥＮＰ２８２８７、およびＸＥＮＰ２８３９０）との２４時間のインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩ、およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９ ＭＦＩによって示されるような活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。使用した対照は、αＲＳＶ×αＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）、エフェクターおよび標的細胞のみ、および標的細胞のみであった。ＲＴＣＣデータと一致して、αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ｂｓＡｂが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を用量依存的に誘導し、ＣＤ３結合親和性が活性化効力と相関し（すなわち、ＣＤ３Ｈｉｇｈを含むｂｓＡｂが、ＣＤ３Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１を含むｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導し）、およびＡＮ１結合ドメインを有するｂｓＡｂが、Ｈ１６－７．８結合ドメインを有するｂｓＡｂよりも強力にＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘導した。

【図30】 Ａ）ＸＥＮＰ２８２８７の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）、および図３０Ａに示すカチオン交換分離から単離されたピークＢとＢＣの純度と均一性を示すクロマトグラム（ならびに前精製された材料）、Ｂ）多角度光散乱を用いた分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）およびＣ）分析用カチオン交換クロマトグラフィー（ａＣＩＥＸ）によるクロマトグラムを示す。図３０Ｂは、多角度光散乱によって決定されるピークのタンパク質種の分子量も示す。

【図31】 Ａ）ＸＥＮＰ２８９２５の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）、および図３１Ａに示すカチオン交換分離から単離されたピークＢの純度と均一性を示すクロマトグラム（ならびに前精製された材料）、Ｂ）多角度光散乱を用いた分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）およびＣ）分析用カチオン交換クロマトグラフィー（ａＣＩＥＸ）によるクロマトグラムを示す。図３１Ｂは、多角度光散乱によって決定されるピークのタンパク質種の分子量も示す。

【図32】 Ａ）ＸＥＮＰ３１１４９の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラム、およびＢ）図ＸＡに示すカチオン交換分離から単離されたピークＡとＢの同一性を示すクロマトグラム（ならびに多角度光散乱を用いた分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により前精製された材料）を示す。

【図33】 Ａ）ＸＥＮＰ３１４１９の精製パート２（プロテインＡクロマトグラフィーに続くカチオン交換クロマトグラフィー）を示すクロマトグラム、およびＢ）図ＸＡに示すカチオン交換分離から単離されたピークＡとＢの同一性を示すクロマトグラム（ならびに多角度光散乱を用いた分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により前精製された材料）を示す。

【図34】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５との１８時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２（実線、ＥＮＰＰ３高）またはＣＦＳＥ標識ＲＣＣ４（破線、ＥＮＰＰ３低）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。

【図35】 親和性操作されたαＥＮＰＰ３×αＣＤ３１＋１ｂｓＡｂのＥＮＰＰ３高ＫＵ８１２細胞への結合を示す。

【図36】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＷＴ、高いＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９５１６（中間のＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ３０２６２（低いＥＮＰＰ３結合）との４２時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２（実線、ＥＮＰＰ３高）またはＣＦＳＥ標識ＲＣＣ４（破線、ＥＮＰＰ３低）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ２９５１６およびＸＥＮＰ３０２６２の両方が、ＸＥＮＰ２８９２５と比較して、ＥＮＰＰ３低ＲＣＣ４細胞でのＲＴＣＣの誘導が実質的に効力が弱く、ＲＴＣＣ効力がのように結合効力と相関していることを示している。ＸＥＮＰ２９５１６およびＸＥＮＰ３０２６２はまた、ＥＮＰＰ３高細胞でのＲＴＣＣの誘導がそれほど強力ではないことも示した。

【図37A】 ＫＵ８１２細胞（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）またはＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）と１８時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣによる、Ａ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＩＬ－６、およびＣ）ＴＮＦαの放出の誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ２９４３６がＸＥＮＰ２８９２５と比較してサイトカイン放出の誘導の抗力が実質的に弱いことを示している。

【図37B】 ＫＵ８１２細胞（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）またはＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）と１８時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣによる、Ａ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＩＬ－６、およびＣ）ＴＮＦαの放出の誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ２９４３６がＸＥＮＰ２８９２５と比較してサイトカイン放出の誘導の抗力が実質的に弱いことを示している。

【図37C】 ＫＵ８１２細胞（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）またはＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）と１８時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣによる、Ａ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＩＬ－６、およびＣ）ＴＮＦαの放出の誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ２９４３６がＸＥＮＰ２８９２５と比較してサイトカイン放出の誘導の抗力が実質的に弱いことを示している。

【図38】 ＲＣＣ４細胞（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）またはＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）と１８時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣによる、ＩＦＮγの放出の誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ２９４３６が、ＥＮＰＰ３低ＲＣＣ４細胞の存在下で、ＸＥＮＰ２８９２５と比較してサイトカイン放出のごくわずかな誘導を実証したことを示している。

【図39】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）またはＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）との４２時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２（実線、ＥＮＰＰ３高）またはＣＦＳＥ標識ＲＣＣ４（破線、ＲＣＣ４低）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ２９４３６をＸＥＮＰ２８９２５と比較して、ＥＮＰＰ３低細胞でのＲＴＣＣの誘導の効力が実質的に弱いことを実証しているが、ＸＥＮＰ２９４３６がまた、ＥＮＰＰ３高細胞でのＲＴＣＣの誘導における効力の低下も実証したことを示している。

【図40】 ＫＵ８１２細胞（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＥＮＰＰ３ Ｈｉｇｈ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）、ＸＥＮＰ２９４３６（ＥＮＰＰ３ Ｈｉｇｈ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）、ＸＥＮＰ２９５１８（ＥＮＰＰ３ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）、ＸＥＮＰ２９４６３（ＥＮＰＰ３ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）、ＸＥＮＰ３０２６２（ＥＮＰＰ３ Ｌｏｗ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ）、またはＸＥＮＰ３０２６３（ＥＮＰＰ３ Ｌｏｗ；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１）とインキュベートしたヒトＰＢＭＣによる、ＩＦＮγの放出の誘導を示す。データは、ＣＤ３またはＥＮＰＰ３の結合力を低下させると、サイトカイン放出の誘導が低下することを示している。特に、ＣＤ３およびＥＮＰＰ３の結合力を低下させると、サイトカイン放出の誘導がさらに低下する。

【図41】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＷＴ、高いＥＮＰＰ３結合；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；一価のＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９５１６（中間のＥＮＰＰ３結合；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；一価のＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ２９５２０（中間のＥＮＰＰ３結合；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；二価のＥＮＰＰ３結合）との４２時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２（実線、ＥＮＰＰ３高）またはＣＦＳＥ標識ＲＣＣ４（破線、ＥＮＰＰ３低）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。データは、二価結合（中間ＥＮＰＰ３結合を伴う）がＥＮＰＰ３低細胞でのＲＴＣＣ効力の低下を維持したが、ＸＥＮＰ２８９２５によって示されたものに近いＥＮＰＰ３高細胞でのＲＴＣＣ効力を回復したことを示している。

【図42】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＷＴ、高いＥＮＰＰ３結合；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；一価のＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ３０２６２（低いＥＮＰＰ３結合；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；一価のＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ３０２６４（低いＥＮＰＰ３結合；ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；二価のＥＮＰＰ３結合）との４２時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２（実線、ＥＮＰＰ３高）またはＣＦＳＥ標識ＲＣＣ４（破線、ＥＮＰＰ３低）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。データは、二価結合（低いＥＮＰＰ３結合を伴う）がＥＮＰＰ３低細胞でのＲＴＣＣ効力をさらに低下させ、ＥＮＰＰ３高細胞でのいくらかのＲＴＣＣ効力を回復したことを示している。

【図43】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２８９２５（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；一価のＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９４３７（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ；二価のＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９４３６（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１；一価のＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ２９４３８（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１；二価のＥＮＰＰ３結合）との４４時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示されるＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２でのＲＴＣＣの誘導を示す。予期せぬことに、ＸＥＮＰ２９４３８はＫＵ８１２細胞でＲＴＣＣを誘導することができなかった。

【図44】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２９４３７７（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ ＶＨ／ＶＬ；二価ＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ３０４６９（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ ＶＬ／ＶＨ；二価のＥＮＰＰ３結合）、ＸＥＮＰ２９４２８（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ ＶＨ／ＶＬ；二価のＥＮＰＰ３結合）、またはＸＥＮＰ３０４７０（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２ ＶＬ／ＶＨ；二価のＥＮＰＰ３結合）との２４時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２（実線、ＥＮＰＰ３高）またはＣＦＳＥ標識ＲＣＣ４（破線、ＥＮＰＰ３低）でのＲＴＣＣの誘導を示す。データは、ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１ｓｃＦｖの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの方向を交換すると、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂフォーマット（ＸＥＮＰ２９４３８対ＸＥＮＰ３０４７０）との関連でその活性が復元されることを示した。ＣＤ３ Ｈｉｇｈ ｓｃＦｖの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの方向を交換することで、２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ ｂｓＡｂフォーマット（ＸＥＮＰ２９４３７対ＸＥＮＰ３０４６９）との関連でＲＴＣＣ効力におけるはるかに軽度の改善を可能にした。

【図45】 ＣＦＳＥ標識標的細胞のヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクターと標的細胞の比）およびαＥＮＰＰ３×αＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ２９５２０（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨ／ＶＬ］；二価のＥＮＰＰ３中間結合）、ＸＥＮＰ３０８１９（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３中間結合）、ＸＥＮＰ３１１４９（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３中間結合）、ＸＥＮＰ３０２６４（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ［ＶＨ／ＶＬ］二価のＥＮＰＰ３低結合）、ＸＥＮＰ３０８２１（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃１［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３低結合）、またはＸＥＮＰ３１１５０（ＣＤ３ Ｈｉｇｈ－Ｉｎｔ＃２［ＶＬ／ＶＨＬ］；二価のＥＮＰＰ３低結合）との４０時間のインキュベーション後に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色された、ＣＦＳＥ＋細胞の割合によって示される、ＣＦＳＥ標識ＫＵ８１２（実線、ＥＮＰＰ３高）またはＣＦＳＥ標識ＲＣＣ４（破線、ＥＮＰＰ３低）でのＲＴＣＣの誘導を示す。

【図46】 ＸＥＮＰ１６４３２、ニボルマブに基づく抗ＰＤ－１ ｍＡｂおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有するＩｇＧ１骨格、およびＸＥＮＰ２１４６１（ペムブロリズマブ）の配列を示す。

【図47】 ＰＢＳ、ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与したＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図48A】 ＰＢＳ、ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与したＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスの血液中の１４日目までのＡ）ＣＤ４５＋リンパ球、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す。すべての場合において、ＰＤ－１遮断薬と組み合わせるとリンパ球の増殖が促進された。

【図48B】 ＰＢＳ、ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与したＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスの血液中の１４日目までのＡ）ＣＤ４５＋リンパ球、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す。すべての場合において、ＰＤ－１遮断薬と組み合わせるとリンパ球の増殖が促進された。

【図48C】 ＰＢＳ、ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与したＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスの血液中の１４日目までのＡ）ＣＤ４５＋リンパ球、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す。すべての場合において、ＰＤ－１遮断薬と組み合わせるとリンパ球の増殖が促進された。

【図49】 ＰＢＳ、ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与したＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50A】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50B】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50C】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50D】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50E】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50F】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50G】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50H】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50I】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50J】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50K】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50L】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50M】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図50N】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、ＸＥＮＰ３０８２１、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＫＵ８１２およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51A】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51B】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51C】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51D】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51E】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51F】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51G】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51H】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51I】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51J】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51K】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図51L】 Ａ）ＰＢＳ、Ｂ）ＸＥＮＰ１６４３２（二価の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を投与し、または例示的なαＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ２＋１ｂｓＡｂ（ＸＥＮＰ３０８１９、またはＸＥＮＰ３１４１９）単独で、またはＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせて投与した個々のＲＸＦ－３９３およびｈｕＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおける腫瘍体積の経時変化（キャリパー測定により決定）を示す。各αＥＮＰＰ３×αＣＤ３ ｂｓＡｂは、低用量、中間用量および／または高用量の治療で、ＫＵ８１２細胞に対するＴ細胞の同種異系抗腫瘍効果を増強することができ、ＰＤ－１遮断薬とうまく組み合わされた。

【図52A】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52B】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52C】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52D】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52E】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52F】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52G】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52H】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52I】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52J】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図52K】 本明細書に開示される抗ＥＮＰＰ３×抗ＣＤ３二重特異性抗体で使用するためのいくつかのフォーマットを示す。１つ目は「１＋１Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット（「ボトルオープナー」または「トリプルＦ」フォーマットとも呼ばれる）であり、Ｆａｂドメインである第１の抗原結合ドメインと、ｓｃＦｖドメインである第２の抗光源結合ドメインとを有する（図１Ａ）。さらに、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「２＋１Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」（「セントラルｓｃＦｖ」または「セントラル－ｓｃＦｖ」フォーマットとも呼ばれる）、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームセントラル－ｓｃＦｖ」、「ワンｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、「トライデント」、および非ヘテロ二量体の二重特異性フォーマットがすべて示されている。図４９に示されているｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に向かって、可変重鎖－（任意のリンカー）－可変軽鎖、または可変軽鎖－（任意のリンカー）－可変重鎖のいずれかであり得る。さらに、ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。ある特定の実施形態では、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、図５２の「抗抗原１」は、ＣＤ３結合ドメインを指し、図５２の「抗抗原２」は、ＥＮＰＰ３結合ドメインを指す。開示されているＥＮＰＰ３結合ドメインおよびＣＤ３結合ドメインのいずれも、図５２の二重特異性フォーマットに含めることができる。

【図53】 ２：１のＦａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、１：１のＦａｂ＝ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｙ／Ｚ－Ｆｃ（例えば、非標的インターロイキン－Ｆｃ）、抗Ｘ×Ｙ／Ｚ－Ｆ（例えば、標的インターロイキン－Ｆｃ）ｃ、およびワンアームＦｃタンパク質を含む本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の概略図を提供する。

【図54】 タンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）のエントリ３ＡＶＥに基づいて、ＭＯＥを使用して構築されたＣＨ３－ＣＨ３インターフェイスの構造モデルを提供する。Ｆｃ置換の新しいセットは、熱安定性をほとんど変化させることなく、９５％を超えるヘテロ二量体収率を達成することができる。

【図55】 三次構造への影響を最小限に抑えるために使用される等配電子置換（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を示す。Ｆｃ領域の等電点の違いにより、Ｆｃヘテロ二量体の直接的な精製が可能または促進される。

【図56】 ヒンジおよびＣＨ２置換がＦｃγＲ結合を無効にすることを示す。

【図57A】 図５７Ａ－Ｃは、２：１のＦａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットが、正常細胞上の低密度を有する腫瘍抗原の標的化を可能にすることを示す。ＴＡＡの原子価およびＴＡＡ／ＣＤ３の親和性を調整することで、癌組織および正常組織を模倣した細胞株の選択的な細胞傷害性が可能になる（高／低抗原密度）。調整された２：１の二重特異性抗体は、可溶性抗原による干渉を減らし、サイトカイン放出も減らす。図５７Ａは、ＦＡＰの原子価およびＦＡＰ／ＣＤ３の親和性を調整することで、癌組織および正常組織を模倣した細胞株の選択的な細胞傷害性が可能になる（高／低抗原密度）ことを示す。ＸＥＮＰ２３５３５は、ＦＡＰを標的化する調整済み１：１フォーマットを表す。ＸＥＮＰ２５９６７は、ＦＡＰを標的化する調整済み２：１フォーマットを表す。

【図57B】 ＳＳＴＲ２の原子価およびＳＳＴＲ２／ＣＤ３の親和性を調整することで、癌組織および正常組織を模倣した細胞株の選択的な細胞傷害性が可能になる（高／低抗原密度）ことを示す。ＸＥＮＰ１８０８７は、ＳＳＴＲ２を標的化する調整済み１：１フォーマットを表す。ＸＥＮＰ３０４５８は、ＳＳＴＲ２を標的化する調整済み２：１フォーマットを表す。

【図57C】 ＥＮＰＰ３の原子価およびＥＮＰＰ３／ＣＤ３の親和性を調整することで、癌組織および正常組織を模倣した細胞株の選択的な細胞傷害性が可能になる（高／低抗原密度）ことを示す。ＸＥＮＰ２８９２５は、ＥＮＰＰ３を標的化する調整済み１：１フォーマットを表す。ＸＥＮＰ３１１４９は、ＥＮＰＰ３を標的化する調整済み２：１フォーマットを表す。

【図58】 本明細書に記載の方法を使用したヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の研究規模の生産の利点を示す。この方法は、ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の直接的な生産に有用である。

【図59】 安定した細胞株の樹立が、力価が高く、ヘテロ二量体を保因する割合が高いクローンをもたらすことを示す。上位のクローンは、１～２ｇ／Ｌの振盪フラスコの収量を有し、ヘテロ二量体含有量は約９０％である。データは、標準的なプロテインＡ精製工程のみの後に得られた。

【図60】 Ａ）ＸＥＮＰ１８０８７またはＢ）ＸＥＮＰ３０４５８によるＳＳＴＲ２（高密度、中密度、低密度）でトランスフェクトされたＡ５４９細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。

【図61】 ＣＦＳＥ標識ＳＳＴＲ２＋］ＣＯＲ－Ｌ２７９標的細胞のヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター：標的比）との、ＸＥＮＰ１８０８７またはＸＥＮＰ３０４５８の存在下での４８時間のインキュベーション後の、Ａ）標的細胞数の減少およびエフェクター細胞によるＢ）ＩＬ－６、Ｃ）ＴＮＦα、Ｄ）ＩＦＮγ、ならびにＥ）ＩＬ－１βの放出を示す。

【図62A】 本明細書に記載の例示的な１：１調整フォーマットおよび２：１調整フォーマットＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性の配列。可変領域などの抗ＴＴＡ（例えば、抗ＦＡＰ、抗ＳＳＴＲ２、および抗ＥＮＰＰ３）成分、例えば、可変領域、抗ＣＤ３成分（可変領域、定常／Ｆｃ領域）、およびリンカーが示されている。リンカーには二重下線が引かれ（当業者によって理解されるように、リンカーは他のリンカーで置き換えることができるが）、スラッシュ（／）は、可変領域、定数／Ｆｃ領域、およびリンカーの間の境界を示す。ＣＤＲには下線が付されている。いくつかの実施形態では、１：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２３５３５、ＸＥＮＰ１８０８７、またはＸＥＮＰ２８９２５である。いくつかの実施形態では、２：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２５９６７、ＸＥＮＰ３０４５８、ＸＥＮＰ３１１４９である。

【図62B】 本明細書に記載の例示的な１：１調整フォーマットおよび２：１調整フォーマットＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性の配列。可変領域などの抗ＴＴＡ（例えば、抗ＦＡＰ、抗ＳＳＴＲ２、および抗ＥＮＰＰ３）成分、例えば、可変領域、抗ＣＤ３成分（可変領域、定常／Ｆｃ領域）、およびリンカーが示されている。リンカーには二重下線が引かれ（当業者によって理解されるように、リンカーは他のリンカーで置き換えることができるが）、スラッシュ（／）は、可変領域、定数／Ｆｃ領域、およびリンカーの間の境界を示す。ＣＤＲには下線が付されている。いくつかの実施形態では、１：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２３５３５、ＸＥＮＰ１８０８７、またはＸＥＮＰ２８９２５である。いくつかの実施形態では、２：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２５９６７、ＸＥＮＰ３０４５８、ＸＥＮＰ３１１４９である。

【図62C】 本明細書に記載の例示的な１：１調整フォーマットおよび２：１調整フォーマットＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性の配列。可変領域などの抗ＴＴＡ（例えば、抗ＦＡＰ、抗ＳＳＴＲ２、および抗ＥＮＰＰ３）成分、例えば、可変領域、抗ＣＤ３成分（可変領域、定常／Ｆｃ領域）、およびリンカーが示されている。リンカーには二重下線が引かれ（当業者によって理解されるように、リンカーは他のリンカーで置き換えることができるが）、スラッシュ（／）は、可変領域、定数／Ｆｃ領域、およびリンカーの間の境界を示す。ＣＤＲには下線が付されている。いくつかの実施形態では、１：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２３５３５、ＸＥＮＰ１８０８７、またはＸＥＮＰ２８９２５である。いくつかの実施形態では、２：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２５９６７、ＸＥＮＰ３０４５８、ＸＥＮＰ３１１４９である。

【図62D】 本明細書に記載の例示的な１：１調整フォーマットおよび２：１調整フォーマットＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性の配列。可変領域などの抗ＴＴＡ（例えば、抗ＦＡＰ、抗ＳＳＴＲ２、および抗ＥＮＰＰ３）成分、例えば、可変領域、抗ＣＤ３成分（可変領域、定常／Ｆｃ領域）、およびリンカーが示されている。リンカーには二重下線が引かれ（当業者によって理解されるように、リンカーは他のリンカーで置き換えることができるが）、スラッシュ（／）は、可変領域、定数／Ｆｃ領域、およびリンカーの間の境界を示す。ＣＤＲには下線が付されている。いくつかの実施形態では、１：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２３５３５、ＸＥＮＰ１８０８７、またはＸＥＮＰ２８９２５である。いくつかの実施形態では、２：１フォーマットのＴＡＡ×ＣＤ３二重特異性は、ＸＥＮＰ２５９６７、ＸＥＮＰ３０４５８、ＸＥＮＰ３１１４９である。

【図63】 ＳＳＴＲ２結合ドメイン［αＳＳＴＲ２］＿Ｈ１．２４＿Ｌ１．３０についての配列を示す。