【図1A】 図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。

【図1B-1】 図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。

【図1B-2】 図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。

【図1B-3】 図１ａは、４Ｄ５の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けスキームを示す。図１ｂは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム（中央列）及びＥＵ番号付け（右列）と比較した４Ｄ５抗体の連続番号付けスキーム（左列）をＮ末端から示す。

【図2A】 抗体におけるシステイン変異生成及び薬物コンジュゲーションの例示的な部位を示す。太字かつ下線の残基は、システイン変異生成の例示的な部位である。下線の残基は、システイン変異生成の更なる例示的な部位である。図２Ａは、重鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。図２Ｂは、軽鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。システイン変異生成の好ましい部位は、灰色の網掛けで示されており、ＥＵ番号付けによるＨＣ－Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ－Ａ１４０Ｃ、ＨＣ－Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ－Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ－Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ－Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ－Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ－Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ－Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ－Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ－Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ－Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ－Ｑ４３８Ｃ（図２Ａ）ならびにＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ－Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ－Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ－Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ－Ｋ１４９Ｃ（図２Ｂ）が含まれる。好ましいＥＵ番号付けによるＨＣ－Ａ１４０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ－Ａ１３６Ｃ）及びＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ－Ｋ１４９Ｃが四角で囲まれており、大きなフォントで強調されている。

【図2B】 抗体におけるシステイン変異生成及び薬物コンジュゲーションの例示的な部位を示す。太字かつ下線の残基は、システイン変異生成の例示的な部位である。下線の残基は、システイン変異生成の更なる例示的な部位である。図２Ａは、重鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。図２Ｂは、軽鎖におけるシステイン変異生成の例示的な残基及び更なる例示的な残基を示す。システイン変異生成の好ましい部位は、灰色の網掛けで示されており、ＥＵ番号付けによるＨＣ－Ｔ１１４Ｃ、ＨＣ－Ａ１４０Ｃ、ＨＣ－Ｌ１７４Ｃ、ＨＣ－Ｌ１７９Ｃ、ＨＣ－Ｔ１８７Ｃ、ＨＣ－Ｔ２０９Ｃ、ＨＣ－Ｖ２６２Ｃ、ＨＣ－Ｇ３７１Ｃ、ＨＣ－Ｙ３７３Ｃ、ＨＣ－Ｅ３８２Ｃ、ＨＣ－Ｓ４２４Ｃ、ＨＣ－Ｎ４３４Ｃ、及びＨＣ－Ｑ４３８Ｃ（図２Ａ）ならびにＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ－Ｉ１０６Ｃ、ＬＣ－Ｒ１０８Ｃ、ＬＣ－Ｒ１４２Ｃ、及びＬＣ－Ｋ１４９Ｃ（図２Ｂ）が含まれる。好ましいＥＵ番号付けによるＨＣ－Ａ１４０Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付けによるＨＣ－Ａ１３６Ｃ）及びＫａｂａｔ番号付けによるＬＣ－Ｋ１４９Ｃが四角で囲まれており、大きなフォントで強調されている。

【図3】 凝集の分析及び計算に使用した凝集体とモノマーのピークを表すプロットを示す。８～１０分の大きなピークはモノマーノピ＝クであり、８分の小さなピークは凝集体のピークである。

【図4A】 ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳを示す。図４ａは、ＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳによって検出されたコンジュゲーションのピークを示す。図４ｂは、ＤＡＲ０（ネイキッド抗体）、ＤＡＲ１、及びＤＡＲ２のコンジュゲーションピークを示す。

【図4B】 ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳを示す。図４ａは、ＵＶ２８０ ＬＣ／ＭＳによって検出されたコンジュゲーションのピークを示す。図４ｂは、ＤＡＲ０（ネイキッド抗体）、ＤＡＲ１、及びＤＡＲ２のコンジュゲーションピークを示す。

【図5】 全抗体システインスクリーニングを行うためのプロトコルを示す。全抗体スクリーニングを、ＰＤＳ－ＭＭＡＥ及びＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥコンジュゲートに行った。そのため、６４８個のＰＤＳ－ＭＭＡＥ及び６４８個のＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（合計１２９６個）のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製し、試験した。

【図6A】 ＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥ及びＰＤＳ－ＭＭＡＥコンジュゲートの代表的な安定性グラフを示す。図６ａは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＰＤＳ－ＭＭＡＥ ＬＣ－Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。図６ｂは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥ ＬＣ－Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。

【図6B】 ＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥ及びＰＤＳ－ＭＭＡＥコンジュゲートの代表的な安定性グラフを示す。図６ａは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＰＤＳ－ＭＭＡＥ ＬＣ－Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。図６ｂは、０時間、４８時間、及び９６時間におけるＬＣ／ＭＳ分析を用いたＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥ ＬＣ－Ｒ１４２Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の代表的な安定性グラフを示す。

【図7】 薬物負荷パーセントにより評価した場合の異なるＰＤＳ－ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）の安定性のグラフを示す。

【図8】 薬物負荷パーセントにより評価した場合の異なるＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）の安定性のグラフを示す。

【図9】 ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ、ＬＣ－Ｖ２０５Ｃ、及びＨＣ－Ａ１１４Ｃ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗ＨＥＲ２及び抗ＣＤ３３抗体の経時的な平均ＤＡＲのグラフを示す。

【図10A】 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＣＢＩ－ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－マレイミド－ＰＮＵ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－マレイミド－ＰＮＵの構造を示す。

【図10B】 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＣＢＩ－ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－マレイミド－ＰＮＵ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－マレイミド－ＰＮＵの構造を示す。

【図10C】 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＣＢＩ－ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－マレイミド－ＰＮＵ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－マレイミド－ＰＮＵの構造を示す。

【図10D】 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＣＢＩ－ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－マレイミド－ＰＮＵ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－マレイミド－ＰＮＵの構造を示す。

【図10E】 例示的なＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ａは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＢＤ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の構造を示す。図１０ｂは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ＣＢＩ二量体の構造を示す。図１０ｃは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＣＢＩ－ＰＢＤの構造を示す。図１０ｄは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－ジスルフィド－ＰＮＵの構造を示す。図１０ｅは、チオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＨＣ－Ａ１１８Ｃ－マレイミド－ＰＮＵ及びチオ－Ｈｅｒ２－ｈｕ７Ｃ２－ＬＣ－Ｋ１４９Ｃ－マレイミド－ＰＮＵの構造を示す。

【図11】 ＭＣ－ｖｃ－ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の図（正確な縮尺ではない）を示す。

【図12】 ＰＤＳ－ＭＭＡＥ ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の図（正確な縮尺ではない）を示す。

【図13】 ＬＣ－Ｋ１４９Ｃシステイン操作抗体にコンジュゲートしたある特定の薬物の酵素修飾の図を示す。修飾は次の通りである：クリプトフィシンはアミド切断を受け、チューブリシン（Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）はアセチル除去（すなわち、脱アセチル化）を受け、ＣＢＩ－ＰＢＤヘテロ二量体リンカー－薬物中間体はカルバメート除去を受け、タキソイドは不安定であり複数の酵素切断を示した。

【図14A】 図１４ａは、ＨＣ－Ａ１４０ＣがＬＣ－Ｋ１４９Ｃと比較してチューブリシンのアセチル基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１４ｂ及び１４ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図14B】 図１４ａは、ＨＣ－Ａ１４０ＣがＬＣ－Ｋ１４９Ｃと比較してチューブリシンのアセチル基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１４ｂ及び１４ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図14C】 図１４ａは、ＨＣ－Ａ１４０ＣがＬＣ－Ｋ１４９Ｃと比較してチューブリシンのアセチル基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１４ｂ及び１４ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図15】 複数回のＷＢアッセイを用いて、ＨＣ－Ａ１４０Ｃではアセチル除去がＬＣ－Ｋ１４９Ｃと比較して劇的に減少したことを示す。ＨＣ－Ａ１４０Ｃがアセチル除去修飾を救済することが確認された。

【図16A】 図１６ａは、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが、ＣＢＩ－ＰＢＤヘテロ二量体リンカー－薬物中間体のカルバメート基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１６ａ）。図１６ｂ及び１６ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図16B】 図１６ａは、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが、ＣＢＩ－ＰＢＤヘテロ二量体リンカー－薬物中間体のカルバメート基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１６ａ）。図１６ｂ及び１６ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図16C】 図１６ａは、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが、ＣＢＩ－ＰＢＤヘテロ二量体リンカー－薬物中間体のカルバメート基の保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された（図１６ａ）。図１６ｂ及び１６ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図17】 ＨＣ－Ａ１４０Ｃが、本明細書に記載される新たな全血アッセイを用いて、ＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図18A】 図１８ａは、ＨＣ－Ａ１４０Ｃがタキソイド修飾からの保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１８ｂ及び１８ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図18B】 図１８ａは、ＨＣ－Ａ１４０Ｃがタキソイド修飾からの保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１８ｂ及び１８ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図18C】 図１８ａは、ＨＣ－Ａ１４０Ｃがタキソイド修飾からの保護を提供することを示す。具体的には、ＨＣ－Ａ１４０Ｃを結合の部位として使用した場合には、２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも分解が少ないことがＬＣＭＳを用いて示された。図１８ｂ及び１８ｃは、新たな全血アッセイを使用して、ＨＣ－Ａ１４０Ｃが２４時間のインキュベーション後にＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも安定していたことを示す。

【図19】 新たな全血アッセイを用いて、ＨＣ－Ａ１４０ＣがＬＣ－Ｋ１４９Ｃよりも（例えば、タキソイド薬物除去を保護するという点で）安定していたことを示す。

【図20】 ＨＣ－Ａ１４０Ｃ が、ＬＣ－Ｋ１４９Ｃと比較して、アミド及びエステル切断からクリプトフィシンを保護することを示す。

【図21】 抗体の図にマッピングされた、ＰＤＳ及び－ｖｃリンカーにとって好ましいＨＣ及びＬＣシステイン変異を示す。