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ピロリシルtRNA合成酵素を使用した非天然型アミノ酸含有ポリペプチドの生産方法等

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

非特許文献4には、N末端ドメインを有さないMaPylRSを用いた場合であっても非天然型アミノ酸の導入ができたことが記載されているが、非特許文献4の大腸菌タンパク質合成系では、非天然型アミノ酸の導入効率が十分に高いとはいえなかった。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本願発明者は、後述の実施例に記載の通り、MaPylRSを初めて単離精製した。さらに、MaPylRS溶液を濃縮したところ、MaPylRSは濃縮限界が顕著に高く、高濃度のMaPylRS溶液を調製できることを発見した（実施例1、3）。このMaPylRSの濃縮限界は、MmPylRSの濃縮限界の5倍以上であり、予想外の結果であった。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 図1は、Methanomethylophilus属又はMethanomassiliicoccus属の生物を含む、系統樹の例を示した図である。
【図2】 図2は、M. alvus、M. barkeri、M. mazeiのPylRSのアミノ酸配列について、Clustal Omegaを使用してアライメントした結果を示した図である。
【図3】 図3は、タンパク質に導入可能なリシン誘導体の例を示した図である。
【図4】 図4は、無細胞タンパク質合成法におけるMaPylRS及びMmPylRSを用いた非天然型アミノ酸導入タンパク質合成量の比較実験結果を示した図である。
【図5】 図5は、無細胞タンパク質合成法におけるMaPylRSの濃度依存性を調べた結果を示した図である。
【図6】 図6は、結晶構造解析の結果を示した図である。
【図7】 図7は、MaPylRS変異体の活性を調べた結果を示した図である。
【図8】 図8は、TCO*-Lys導入のPylRS濃度依存性を調べた結果を示した図である。
【図9】 図9は、pEtZLys又はpAzZLys導入のPylRS濃度依存性を調べた結果を示した図である。
【図10】 図10は、ZLys導入タンパク質の合成量を調べた結果を示した図である。
【図11】 図11は、mAzZLys導入タンパク質の合成量を調べた結果を示した図である。
【図12】 図12は、TCO*-Lys導入Fab抗体の合成量を示した図である。
【図13】 図13は、Fab抗体に導入したTCO*-Lysにクリックケミストリーで蛍光基質を結合させた結果を示した図である。
【図14】 図14は、TCO*-Lysに結合した蛍光基質の蛍光強度を示した図である。
【図15】 図15は、大腸菌発現系でのM.mazei、M.alvus、D.hafniense PylRSによる非天然型アミノ酸の導入効率の比較実験結果を示した図である。
【図16】 図16は、野生型GST-GFP融合タンパク質（3Ser）とアンバー変異GST-GFP融合タンパク質の解析結果を示した図である。a：SDS-PAGE後にCBB染色。b：産物をトリプシン消化後にMALDI-TOF MS解析。実測値と理論値はTableに示した。
【図17】 図17は、大腸菌発現系におけるMaPylRSを用いた非天然型アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入の実験結果を示した図である。
【図18】 図18は、大腸菌発現系におけるMaPylRS変異体を用いたZLys系非天然型アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入の実験結果を示した図である。
【図19】 図19は、小麦胚芽系無細胞タンパク質合成法におけるPylRS濃度依存性を調べた結果を示した図である。
【図20】 図20は、ヒト系無細胞タンパク質合成法におけるPylRS濃度依存性を示した図である。
【図21】 図21は、AcLysの導入を調べた結果を示した図である。
【図22】 図22は、Phe誘導体の導入を調べた結果を示した図である。
【図23】 図23は、Tyr誘導体の導入を調べた結果を示した図である。
【図24】 図24は、無細胞タンパク質合成法におけるG1PylRSの活性を調べた結果を示した図である。
【図25】 図25は、G1PylRS 、MaPylRS及びMaPylRSを使用時のタンパク質合成量を比較した結果を示した図である。
【図26】 図26は、無細胞タンパク質合成法におけるG1PylRS変異体の活性を調べた結果を示した図である。
【図27】 図27は、G1PylRS及びMaPylRSの変異体を使用時のタンパク質合成量を比較した結果を示した図である。
【図28】 図28は、無細胞タンパク質合成法におけるG1PylRS濃度依存性を示した図である。
【図29】 図29は、動物細胞におけるmAzZLysのタンパク質への導入結果を示した図である。

代表図 図1本件の代表的な図

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