(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-516152(P2015-516152A)

(43)【公表日】2015年6月11日

(54)【発明の名称】微細藻類により産生されるスクアレンを精製する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/64 20060101AFI20150515BHJP

   A61K 36/02 20060101ALI20150515BHJP

   A61K 8/97 20060101ALI20150515BHJP

   A61K 8/31 20060101ALI20150515BHJP

   A61K 31/01 20060101ALI20150515BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20150515BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20150515BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20150515BHJP

   C07C 11/21 20060101ALI20150515BHJP

   C07C 7/04 20060101ALI20150515BHJP

   C07C 7/10 20060101ALI20150515BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/64

   A61K35/80 Z

   A61K8/97

   A61K8/31

   A61K31/01

   A61P39/06

   A61Q19/00

   A61K39/39

   C07C11/21

   C07C7/04

   C07C7/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2015-506284(P2015-506284)

(86)(22)【出願日】2013年4月15日

(85)【翻訳文提出日】2014年12月12日

(86)【国際出願番号】FR2013050812

(87)【国際公開番号】WO2013156720

(87)【国際公開日】20131024

(31)【優先権主張番号】1253496

(32)【優先日】2012年4月16日

(33)【優先権主張国】FR

(31)【優先権主張番号】1253614

(32)【優先日】2012年4月19日

(33)【優先権主張国】FR

(71)【出願人】

【識別番号】591169401

【氏名又は名称】ロケット フレール

【氏名又は名称原語表記】ＲＯＱＵＥＴＴＥ ＦＲＥＲＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(72)【発明者】

【氏名】ローテン，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】パティニール，サミュエル

(72)【発明者】

【氏名】ペリュ，ミシェル

(72)【発明者】

【氏名】ペリュ，ヴァンサン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C083

4C085

4C088

4C206

4H006

【Ｆターム（参考）】

4B064AD85

4B064CA08

4B064CC30

4B064CE08

4B064CE20

4B064DA01

4B064DA16

4B064DA20

4C083AA031

4C083AC011

4C083AC021

4C083CC02

4C083FF01

4C085AA38

4C085CC40

4C085FF18

4C088AA12

4C088AC15

4C088BA08

4C088BA23

4C088BA32

4C088CA10

4C088CA15

4C088NA20

4C088ZB09

4C088ZC37

4C206AA01

4C206AA02

4C206AA04

4C206BA02

4C206KA18

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA20

4C206ZB09

4C206ZC37

4H006AA02

4H006AD11

4H006AD16

4H006BB30

4H006BB49

4H006BC51

4H006BC52

4H006BD60

4H006BD82

(57)【要約】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内での超臨界ＣＯ_２を用いた抽出、およびいわゆる「短経路」分子蒸留からなる群から選択される精製ステップを含むことを特徴とする、微生物の発酵により産生される高スクアレン含量を有する組成物を調製する方法。

【請求項2】

前記微生物が、スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ ｓｐ．）に属する微細藻類であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ ｓｐ．）に属する微細藻類が、スキゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）、オーランチオキトリウム種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）およびスラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）の微細藻類であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

下記のステップ：
１）スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類のバイオマスを調製するステップ、
２）少なくとも１０重量％のスクアレン、好ましくは少なくとも１５重量％のスクアレンを含有する粗製油を得るために、前記バイオマスを処理するステップ、
３）７０〜７５％のスクアレン含量を有する抽出物および１．５％未満のスクアレンを有するラフィネートを製造するために、このようにして得られる前記粗製油を、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で超臨界圧の流体と接触させることにより分画するステップ、
４）９５〜９９重量％のスクアレン含量を得るために、このようにして得られる前記抽出物を、ステップ３）におけるものと同様の、抽出物還流と向流で動作する多段分画カラム内で超臨界圧の流体と接触させるステップ、
５）このようにして得られる前記スクアレン組成物を回収するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記向流で動作する多段分画カラムが、構造化パッキングを備えたカラムであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ステップ３）で使用される前記超臨界圧の流体を、圧力１０〜５０ＭＰａ、好ましくは１５〜２５ＭＰａ、および温度４０〜８０℃に上昇させることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

ステップ４）で使用される前記超臨界圧の流体を、圧力１０〜３０ＭＰａ、好ましくは１０〜２０ＭＰａ、および温度４０〜８０℃に上昇させることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記超臨界圧の流体が純二酸化炭素であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

下記のステップ：
１）スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科に属する微細藻類のバイオマスを調製するステップ、
２）少なくとも１０重量％のスクワレン、好ましくは少なくとも１５重量％のスクワレンを含有する粗製油を得るために、前記バイオマスを処理するステップ、
３）このようにして得られる前記粗製油を、脱ガム、脱酸、脱色および脱臭という一連のステップによって、任意選択的に精製するステップ、
４）６０重量％超、好ましくは８０重量％超のスクアレン含量を有する軽質画分を得るために、いわゆる「短経路」分子蒸留によって前記スクアレンを抽出するステップ、
５）スクアレン含量９５〜１００％を有するラフィネートを得るために、鹸化、２相分離、洗浄、脱色および脱臭という一連のステップによってこの軽質画分を精製するステップ、
６）このようにして得られる前記スクアレン組成物を回収するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

分子蒸留のステップ４）が、０．１ｍｂａｒ未満の値の、高真空で実施されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

「短経路」が１分未満の期間、接触することを意味することを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか１項により得られるスクアレン組成物の、化粧品分野、製薬分野および医学分野における使用。

【請求項13】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を実施することによって得られる前記高純度スクアレン組成物の水素化により、スクアランを多く含む組成物を調製する方法。

【請求項14】

請求項１３に記載のスクアラン組成物の、化粧品分野における使用。

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物、より詳細には微細藻類、さらに詳細にはスラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ ｓｐ．）のものから出発して、発酵により産生されるスクアレンを精製する方法

本発明の意味で、「スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ ｓｐ．）の微細藻類」は、スキゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）、オーランチオキトリウム種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）およびスラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）に属する微細藻類を意味する。 スクアレンは、全ての高等生物に存在する脂質であり、動物および植物両者のステロイドホルモン類、および一部のビタミン、たとえばビタミンＤ類の、共通の前駆体である。 スクアレンは多くの細胞膜に存在して、それらに流動性を与える。 この不飽和線状炭化水素は、式：２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン、Ｃ_３０Ｈ_５０という、３０個の炭素原子および５０個の水素原子を有するイソプレノイドである、すなわち、６つのイソプレン単位から成り、全てトランス立体配座である。 全てのテルペン類と同様、スクアレンはイソペンチルピロリン酸から形成され、イソペンチルピロリン酸はジメチルアリルピロリン酸とカップリングして、ゲラニルピロリン酸を、次いで、ファルネシルピロリン酸を、連続的に供給し、その２分子をＮＡＤＰＨで還元後に縮合し、スクアレンシンターゼの作用下でスクアレンを形成する。 植物および多数の微生物において、この経路は、クロロフィル、カロテノイド色素、およびラテックス中のテルペンの前駆体である、フィトエンにつながる他の代謝経路と共存する。 スクアレン、および末端二重結合上でエポキシ化されたその誘導体は、特化された酵素（シクラーゼ）のために、注目すべきは位置選択的および立体選択的に、構造的にかなり多様な多環トリテルペン類に、変換される特性を有する：真核生物におけるホペンおよびジプロプテロールならびに原生動物におけるテトラヒマノール（ペンタサイクリックトリペルペン類）；酵母、真菌および哺乳動物におけるラノステロール、植物におけるシクロアルテノール（テトラサイクリックトリペルペン類）。 スクアレンの用途
スクアレンは、特に日本では、栄養補助食品として、長期にわたって使用されてきた。 さらに、スクアレンを１９０６年に発見して１９１６年にその構造を決定したのは、日本人化学者、辻本満丸であった。 スクアレンは、天然薬物における多くの有益な特性を有する、有効な抗酸化剤であると考えられる。 その従来の用途は化粧品を含むが、そこでは、その水素化誘導体、スクアラン（酸化しないので、悪臭がするようにならない）を使用することがより一般的である。 高純度のものであるとき、スクアレンは、免疫系を刺激するアジュバントと組み合わせてある種ワクチンに使用されてきており、依然として使用されている：「水中油」エマルジョンの形で、界面活性剤の役割を果たし、したがってワクチンの応答を高める。 これは、Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１等の、出現ウイルスを標的とする実験的ワクチンで使用されるが、特に季節性インフルエンザの抗原と組合せて、１９９７年以来投与された２２００万回量の組成物中で（ＦＬＵＡＤ（登録商標）１回量当たり１０ｍｇの率の、ＭＦ５９）、重大なワクチン後反応なしに使用されている。 ある種ワクチンは、不活化ワクチンであるかまたはサブユニットワクチンであるため、免疫系が適切な防御機構を使用することを可能にするシグナルを含まず、アジュバント、スクアレンまたはアルミニウム塩類（１９２６年以来使用されている）の添加が目下必要である。 スクアレンは、良好な防護を確実にするために反復注射する必要をなくす。 スクアレンのこうした用途は、高純度のスクアレンを製造する方法を確保しようとする当業者の決意を強固にする。 さらに、この品質は、医学分野における他の活用ルートを開拓し得る。 スクアレンとヌクレオシド類似体との化学的カップリングは、したがって、将来的に、ある種の癌の治療またはＨＩＶタイプのウイルス疾患においてかなりの進歩を生じさせ得る。 様々なスクアレン源
スクアレンは、従来、深海のサメ肝臓から抽出される。 しかし肝臓は、重金属（水銀を含む）や他の脂溶性毒素等の、多数の毒性化合物を蓄積する。 化粧品で使用される濃度で、スクアレンおよびその水素化形スクアランは有毒ではなく、またヒト皮膚に対して刺激性または感作性ではないことが、毒性学的研究で証明されている。 しかし、医学分野で、特にワクチン用アジュバントとして使用されるとき、スクアレンの純度レベルは非常に重要である。 不純物（微量の金属類、特に水銀、および他の毒素）を含まない、高品質のスクアレンを所有することが絶対必要である。 サメ肝臓からの抽出以外の、幾つかのスクアレン製造経路が文献で提案されている。 第１の代替法として、オリーブ油、パーム油、および他の穀物油、またはアマランサス、種子類、米ぬか、および小麦胚芽に由来する油類から、スクアレンを分離することができる。 しかし、ここで主要な欠点は、スクアレンが、およそ０．１〜０．７重量％という、非常に少量でこれらから抽出されること、そして非常に多くの骨が折れて高価な精製工程を必要とすることである。 第２の代替法として、微生物、より詳細には、特にサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）タイプの、天然酵母または組み換え酵母からの、第１のスクアレン製造方法が提案されてきた。 このように、サカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、スクアレンを産生できることが知られているが、非常に少量であり：およそ０．０４１ｍｇ／ｇバイオマスである（ＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＪＥＥ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，ｐｐ ８１１−８１６）。 そこで、遺伝子組換えにより、これらの製造能力の最適化が試みられてきた。 しかし、医学分野（ワクチン用アジュバントとして、純度９７％超のスクアレン製造）の特許出願国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットに示されている通り、この第１の代替法は、スクアレンを過剰生産（乾燥細胞の１５重量％超）する組み換え酵母を利用できる場合に工業的に応用できるにすぎない。 ここで、こうした組み換え細胞の入手には、スクアレン生合成経路の刺激およびスクアレン異化経路の阻害に導く、分子生物学の道具を使用することにより、多数の骨の折れる、長く複雑な代謝工学の工程を適用することが必要である。 事実、前記特許出願国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットでさらに想起される通り、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸脱炭素酵素、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ＨＭＧＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ）、およびスクアレンシンセターゼを含む、多数の遺伝子がスクアレンの生合成に関与している。 異化経路に関して、スクアレンのエルゴステロールへの変換に関与する多数の酵素をコード化する遺伝子としては、スクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧ１）、ラノステロールシンセターゼ、Ｃ１４−ジメチラーゼ、ｄ１４−レダクターゼ、Ｃ４−メチルオキシダーゼ、Ｃ４−脱炭素酵素（ＥＲＧ２６）、３−ケトレダクターゼ、Ｃ２４−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ８−イソメラーゼ、Ｃ５−デサチュラーゼ、ｄ２２−デサチュラーゼおよびｄ２４−レダクターゼなどが挙げられる。 さらに、他の分解酵素も考慮しなければならない：ＬＥＵ２（［β］−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）、オキシドスクアレンシクラーゼ、チモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよびエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−デヒドロゲナーゼ。 サメの肝臓から抽出する方法の第３の代替法として、特にスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科（スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属を含む）、より詳細にはスキゾキトリウム マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）またはスキゾキトリウム リマシヌム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）の微細藻類からスクアレンを産生するための有望な方法が提案されている。 さらに、こうした微細藻類は、従属栄養条件（光の欠如；炭素含有源としてのグルコースの供給）でスクアレンを産生し、したがって、微生物の発酵技術における当業者により容易に操作され得る。 しかし、こうしたスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）科の微細藻類では、スクアレンは、関心事の他の脂質化合物、たとえばω３ファミリーの多価不飽和脂肪酸である、ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）等の、副産物である。 したがって、スクアレンは、ＤＨＡの工業用油の非鹸化性画分の構成要素の１つ（カロテノイド類およびステロール類に加えて）として特記されていると考えられる。 比較のために、スキゾキトリウム マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のＦＢ１株は、スクアレンの０．０１７％まで、細胞の乾燥重量の６．２％の率でＤＨＡを産生する。 したがって、自然にスクアレンを産生するこうした微生物は、少量で産生する：
− スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ ６０６３では、およそ０．１ｍｇ／ｇバイオマス（ＬＥＷＩＳ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，ｐｐ ４３９−４４７参照）、
− スキゾキトリウム マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１では、およそ０．１６２ｍｇ／ｇバイオマス（ＪＩＡＮＧ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，２００４，５２，ｐｐ １１９６−１２００参照）。 しかし、発酵による産生の最適化によって、この分野における専門家は、下記の水準の製造に成功した：
− スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ ６０６３のバイオマス１ｇ当たり１ｍｇ〜１．２ｍｇのスクアレン（ＱＩＡＮ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，２００９，５７，４２６７−４２７２またはＭａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，３，４３９−４４７のＬＥＷＩＳ ｅｔ ａｌ．参照）。
− スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のバイオマス１ｇ当たり０．７２ｍｇのスクアレン（Ｇ．ＣＨＥＮ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２７−４，ｐｐ ３８２−３８９参照）。
− オーランチオキトリウム マングロベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ３１のバイオマス１ｇ当たり０．５３ｍｇのスクアレン（Ｋ．Ｗ．ＦＡＮ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，２６−３，ｐｐ １３０３−１３０９参照）。
− スキゾキトリウム マングロベイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマス１ｇ当たり１．１７±０．６ｍｇのスクアレン（Ｃ−Ｊ ＹＵＥ ａｎｄ Ｙ．ＪＩＡＮＧ，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，４４，９２３−９２７参照）。 本出願人はまた、この分野の文献でこれまで決して到達したことのないレベルで、すなわち、バイオマス１００ｇ当たり少なくとも８ｇのスクアレンで、スクアレンを産生する方法を提供し（そのフランスの特許出願が審査中）、スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ ｓｐ．）の微細藻類によるスクアレン産生のさらなる向上にも貢献した。 このように、スラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ ｓｐ．）の微細藻類により、今や相当量のスクアレン産生が可能であるが、食物、化粧品および特に医学的な要件を満たすために、それを精製することが依然として必要である。 幾つかのスクアレン精製法が文献に提案されているが、これらの方法は、当業者により、従来のスクアレン産生源（動物、植物または酵母タイプの微生物）に合うように改変されている。 ４つの主要なテクノロジーが、単独でまたは組み合わせて、一般に使用される：
− 結晶化、
− クロマトグラフィ、
− 蒸留または
− 超臨界流体（超臨界ＣＯ_２等）を使用した抽出。 以下で説明する通り、最後に述べた２つのテクノロジーは、最も頻繁に遭遇するものである。 植物起源のスクアレンの精製の場合、たとえば米国特許出願公開第２００３／１３０５３２号明細書では、植物油から非鹸化性物質を抽出する方法であって、少なくとも１つの鹸化ステップ（それによって前記油が水性アルコール溶液に変換される）、クロロ−１−ブタン等の有機溶媒を用いた水性アルコール溶液の向流抽出ステップ、ステロール類および／または併産されるトリテルペンアルコール類の結晶化ステップおよび最終的に蒸留によるスクアレンの分離を含む、抽出方法が主張されている。 好ましくは、処理される植物油はアボカド油または大豆油である。 やはり植物から出発する、国際特許出願国際公開第２０１０／００４１９３号パンフレットでは、有機溶媒の使用を回避するために、たとえば、植物油の脱臭からの蒸留液から、ステロール類、ビタミンＥ、スクアレンおよび他の炭化水素類を抽出するための総括的な方法が記述されている。 遊離脂肪酸のエステル化、およびその後の複合脂肪酸（グリセリド類およびステライド類（ｓｔｅｒｉｄｅｓ））と同一「短」アルコールとのエステル交換後、連続３つの蒸留により連続回収（炭化水素、次いで、アルキルエステル類、および最後にスクアレンを含む最も重いアルキルエステル）が可能である。 このように第３蒸留液は、スクアレン（残留炭化水素の第２画分と共に、第１画分から分離される）の製造に役立つ。 第３蒸留の残留物は、ステロール類およびビタミンＥの製造に役立つであろう。 したがって本方法では、石油起源の溶媒を使用せずに４つの非鹸化性物質のそれぞれを抽出することが可能であり、自然の物理的および化学的方法で得られる製品ラベルを請求することが可能である。 しかし、の通り、こうした植物スクアレンの抽出方法は、毒性溶媒の使用のため、また魅力のない価格のため、工業規模にあてはめることがまだ難しい方法である。 Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）タイプの微生物により産生されるスクアレンの精製方法に関して、従来、溶媒抽出法が使用される。 第１抽出ステップは一般に、細胞溶解後に回収される脂質に対してメタノール／クロロホルム（２：１）で実施され、クロマトグラフィステップが後続する。 それに関して、たとえばＷｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，１９−６，ｐｐ ６０５−６０８のＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＪＥＥ ａｎｄ ＳＩＮＧＨＡＬという論文に記述されている通り、有機溶媒の使用を最小限に抑えるために、多くの場合、超臨界ＣＯ_２を用いた抽出が好ましい。 特に植物起源のスクアレンを抽出するための、このテクノロジーの応用について記述している文献または特許も多数ある（たとえば、パーム油からの、特許出願特開２００５／０８７９９８号公報、またはオリーブ油からの、特許出願米国特許出願公開２００４／００１５０３３号明細書等）。 国際特許出願国際公開第９４／０２６６８３号パンフレットは、オリーブ油残留物からスクアレンを製造するための方法および装置を示している。 この方法は、下記の４ステップを含む：鹸化、クラッキング、脂肪酸のエステル化および超臨界流体を用いた抽出。 しかし、超臨界流体を用いた抽出には、事前に金属触媒でエステル化された生成物が使用され、その後、多様な温度帯のある高圧抽出塔内に噴霧される。 こうした方法および装置では、純度９０％超の、市場性あるスクアレンを得ることが可能であるが、魅力的な価格で工業規模にあてはめることは困難である。 微細藻類により産生されるスクアレンを精製する好ましい方法を記述した文献は非常に少ない。 本発明者らは、たとえば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２００３，９９４，３７−４３に発表された、ＬＵらの科学論文（スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ ２６１８５により産生されるスクアレンの調製的分離および精製のための高速向流クロマトグラフィのメリットを賞賛している）を見つけることができる。 これらの著者によれば、このテクノロジーは、固体支持体を使用しない（したがって、前記固体支持体上への不可逆的吸着による材料の損失がない）、１回の液体／液体クロマトグラフィ分配を提案するため、より従来型のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）よりはるかに効率的な方法を提案するというメリットを有する。 しかし、この論文に詳述されている通り、この方法は、実験室規模で想定され得るにすぎず、さらにメタノール／クロロホルムによる予備的抽出ステップを必要とする。 最高水準の技術で、ボツリオコッカス ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、セネデスムス オブリカス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）またはトルラスポラ デルブルッキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に関して、超臨界流体を用いた抽出について幾つかの予備研究が開始されている。 しかし、推奨される操作条件を工業規模に移すことも困難である。 出願人の知る限り、超臨界流体または分子蒸留タイプのテクノロジーを使用して、微細藻類から産生されるスクアレンを精製するための、産業応用に好適な、当業者に実際に利用できる効率的な方法は皆無である。

【国際調査報告】