【技術分野】

【0001】

【背景技術】

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【0003】

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【0015】

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【0018】

【0019】

【先行技術文献】

【発明の概要】

本発明は、機械的強度に対する要求に耐え、広いｐＨ域内において高い選択性をもたらす、多孔質炭水化物粒子に基づくＲＰＣ材料の製造方法を提供する。

したがって、第１の態様において、本発明は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）材料の製造方法であって、多孔質炭水化物粒子上に不飽和基を導入する工程及び不飽和基を含む粒子にスチレンモノマーをグラフトする工程を含む方法を提供する。

多孔質炭水化物粒子は、好ましくは多糖類材料、最も好ましくはアガロースからなる。

アガロースは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に使用されすでに成功しており、多数の市販の製品、例えばＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が利用可能である。ＨＩＣのための製品は穏やかな疎水性なだけであり、アガロースは、その固有の親水性及び十分に疎水性にすることの難しさのため、高度に疎水性担体が必要とされる逆相クロマトグラフィー用には考えられてこなかった。

本発明者らは、架橋アガロース粒子にスチレンをグラフトすると、全ｐＨ域での良好な選択性と併せて、十分な疎水性を呈するという、シリカ又はポリスチレン担体のいずれでも見出すことのできない性状を呈するという予想外の知見を得た。

好ましくは、不飽和基は本製造方法においてアリル基である。

本方法の一実施形態では、アリル化はアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）により実施される。

スチレンモノマーは、例えば、スチレン、ｔｅｒｔブチルスチレン又はペンタフルオロスチレンから選択することができる。

グラフト溶液中のスチレンモノマーｖ／ｖは、５〜９５％（ｖ／ｖ）、好ましくは２５〜７５％の量で存在することが好ましい。

好ましい実施形態では、アリル化はＡＧＥによるものであり、スチレンモノマーはスチレン又はｔｅｒｔブチルスチレンであり、グラフト溶液中に５０％ ｖ／ｖで存在する。

第２の態様において、本発明は、の方法に従って製造されるＲＰＣ材料

第３の態様において、本発明は、逆相クロマトグラフィーを実施するための、上で製造されたＲＰＣ材料の使用

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２５９７（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図2】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２５９７（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図3】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２５９７（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図4】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２９８０（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図5】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２９８０（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図6】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２９８０（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図7】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２８８９（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図8】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２８８９（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図9】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００２８８９（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図10】ｐＨ７におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００３１４７Ａ（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図11】ｐＨ３におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００３１４７Ａ（表６参照）に対する、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図12】ｐＨ１２におけるＲＰＣプロトタイプＬＳ００３１４７Ａ（表６参照）による、４種の被験ペプチド（表３参照）の分離のクロマトグラムを示す図である。

【図13】ｐＨ７におけるシリカカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。

【図14】ｐＨ３におけるシリカカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。

【図15】ｐＨ７におけるポリスチレンカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。

【図16】ｐＨ３におけるポリスチレンカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。

【図17】ｐＨ１２におけるポリスチレンカラム（先行技術）による、同じ４種の被験ペプチド（表３）の比較研究のクロマトグラムを示す図である。

【発明を実施するための形態】

本発明を、いくつかの限定されない実施例及び添付の図面と関連させて、これ以下により詳細に記載する。

材料
平均粒径８．３５μｍの多孔質架橋アガロース粒子を、すべての実験に使用した。 カップリング剤を表１に列挙する。 実施例１：ＬＳ００２５９７；アガロース粒子のアリル化及びポリスチレンのグラフト
アリル化
５０ｍＬのアガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で５００ｍＬの蒸留水で洗浄した。蒸留水中５０％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム溶液を調製し、粒子を、３００ｍＬの該５０％水酸化ナトリウム溶液で洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した２５０ｍＬの丸底フラスコに移した。４０ｍＬの５０％水酸化ナトリウムを加え、温度を５０℃に上げた。撹拌速度を２５０ｒｐｍに設定した。温度が安定したら、５０ｍＬのアリルグリシジルエーテルを加えた。反応を一晩進行させた。 粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を５００ｍＬの蒸留水、５００ｍＬのエタノール及び５００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。 結合されたアリル基の量を滴定法で決定し、６２５μｍｏｌ／ｍＬ粒子であることが見出された。 ポリ（スチレン）のグラフト
のように調製された１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１５ｍＬのトルエン、１５ｍＬのスチレン及び２７０ｍｇのＡＭＢＮ（トルエン及びスチレンがグラフト溶液を構成する）を加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させた。 粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのトルエン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。 実施例２：ＬＳ００２９８０；アリル化アガロース粒子のポリスチレンでのグラフト（ポリスチレンの増量）
実験１のように調製された１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１０ｍＬのトルエン、２０ｍＬのスチレン及び３６０ｍｇのＡＭＢＮを加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させた。 粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのトルエン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。 実施例３：ＬＳ００２５９７；アガロース粒子のアリル化及びポリ（ペンタフルオロスチレン）のグラフト
アリル化
２００ｍＬのアガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で２０００ｍＬの蒸留水で洗浄した。蒸留水中５０％（ｗ／ｗ）の水酸化ナトリウム溶液を調製し、粒子を、１２００ｍＬの該５０％水酸化ナトリウム溶液で洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した１０００ｍＬの丸底フラスコに移した。１６０ｍＬの５０％水酸化ナトリウム及び１．２ｇの水酸化ホウ素ナトリウムを加え、温度を５０℃に上げた。撹拌速度を６００ｒｐｍに設定した。温度が安定したら、２００ｍＬのアリルグリシジルエーテルを加えた。反応を一晩進行させた。 粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を５００ｍＬの蒸留水、５００ｍＬのエタノール及び５００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。 結合されたアリル基の量を滴定法で決定し、５０１μｍｏｌ／ｍＬ粒子であることが見出された。 ポリ（ペンタフルオロスチレン）のグラフト
１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１５ｍＬのトルエン、１５ｍＬのペンタフルオロスチレン及び２７０ｍｇのＡＭＢＮを加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させた。 粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのアセトン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％エタノールで洗浄した。 実施例４：ＬＳ００３１４７Ａ；アガロース粒子のアリル化及びポリ（ｔｅｒｔ−ブチルスチレン）のグラフト
アリル化
２００ｍＬのアガロース粒子を、実験３のようにアリル化した。結合されたアリル基の量を滴定法で決定し、５０１μｍｏｌ／ｍＬ粒子であることが見出された。 ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルスチレン）グラフト
１０ｍＬのアリル化アガロース粒子を、焼結ガラスフィルター上で１００ｍＬのトルエンで洗浄した。粒子を吸引乾燥し、機械的スターラーを装備した５０ｍＬのファルコンチューブに移した。１５ｍＬのトルエン、１５ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルスチレン及び２７０ｍｇのＡＭＢＮを加えた。窒素ガスを、粒子懸濁液の間に５分間フラッシュした。ファルコンチューブをキャップで密閉し、７０℃に設定された加熱振とうテーブル上に置いた。反応を１８時間進行させる。 粒子の懸濁液を焼結ガラスフィルターに移し、該粒子を３００ｍＬのトルエン、３００ｍＬのエタノール及び１００ｍＬの２０％ エタノールで洗浄した。 実施例５：プロトタイプ及び参照製品に対するペプチドの分離
異なるｐＨ値において４種のペプチドを、クロマトグラフィー評価方法のための被験ペプチドとして使用した。ペプチドのいくつかの特性を表に列挙する。 プロトタイプ及びカラム
本発明に係るＲＰＣプロトタイプ材料（実験１〜４参照）をＴｒｉｃｏｒｎ５／５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）の０．９８ｍＬカラムに充填した。さらに比較のためで、ＳＯＵＲＣＥ１５ ＲＰＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）及びＫｒｏｍａｓｉｌ １００−１３−Ｃ４（Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ）を、Ｔｒｉｃｏｒｎ５／５０カラムＡＫＴＡ（商標）に充填した。Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を使用して、分離方法を行った。 分離方法に使用した材料を、表３に列挙する。 緩衝液の調製
１５ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ３．０緩衝液：
０．１７６ｍＬのリン酸及び１．７１ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物を、最終体積が１ＬになるようにＭｉｌｌｉ Ｑ ｗａｔｅｒに溶解した。 １５ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．０緩衝液：
１．０３２ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物及び１．０６８ｇのリン酸水素二ナトリウムを最終体積が１Ｌになるように溶解した。 １０ｍＭ 水酸化ナトリウムを、ｐＨ１２溶液として使用した。溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒで最終体積１Ｌに希釈したＴｉｔｒｉｓｏｌアンプルを使用して調整した。 ペプチド分離法
被験ペプチド：アンジオテンシンＩ、Ｉｌｅ７−アンジオテンシンＩＩＩ、Ｖａｌ４−アンジオテンシンＩＩＩ及びアンジオテンシンＩＩＩを、各ペプチドの最終濃度が０．１２５ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒに溶解した。 分離は、ｐＨ３．０並びにｐＨ７．０及び１２．０において実施する。 Ａ 緩衝液は、１５ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ３．０もしくはｐＨ７．０又は１０ｍＭ ＮａＯＨ ｐＨ１２である。Ｂ 緩衝液はアセトニトリルである。 本方法の概要を下記に示す。 検出波長としてＵＶ ２１５ｎｍを使用した。 ｐＨに依存して、ペプチドは正に荷電（ｐＨ３）、ほぼ非荷電（ｐＨ７）又は負に荷電（ｐＨ１２）していると思われる。ペプチドの電荷は分離に影響を与え得る。例えば負に荷電した基が粒子上に存在する場合、正に荷電したペプチドがイオン性及び疎水性両方の相互作用により保持されるので、低ｐＨにおけるピークの広がりがもたらされ得る。 図１〜図３は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００２５９７の分離のクロマトグラムを示す。 ＬＳ００２５９７はすべてのｐＨ値において全体に非常に優れた性能を有し、鋭いピークを有する。ペプチドのうちの１種は、ペプチドが強力に負に荷電するｐＨ１２において結合していない。 図４〜図６は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００２９８０の分離のクロマトグラムを示す。ＬＳ００２９８０は全体に非常に優れた性能を有し、ｐＨ１２において４種すべてのペプチドを保持するために十分な疎水性を有し、極めて優れた分離が得られるいくつかのプロトタイプのうちの１つである。ｐＨ３における分離は、例えばＬＳ００２５９７よりわずかに広いピークをもたらすが、ｐＨ７における分離はＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ４・１００Åとの比較が十分可能である。 図７〜図９は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００２８８９の分離のクロマトグラムを示す。 ポリ（ペンタフルオロスチレン）をグラフトしたプロトタイプ（ＬＳ００２８８９）はすべてのｐＨ値において優れた分離をもたらし、分離パターンはＬＳ００２５９７と似ている。 図１０〜図１２は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるプロトタイプＬＳ００３１４７Ａの分離のクロマトグラムを示す。Ｔｅｒｔブチルスチレン（ＬＳ００３１４７Ａ）は全体に優れた性能をもたらす。 図１３〜図１４は、それぞれｐＨ７及びｐＨ３におけるＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ４・１００Åのクロマトグラムを示す比較図である。 ＫｒｏｍａｓｉｌカラムはｐＨ７において優れた分離を示すが、ｐＨ３ではペプチドを分離できず、わずか３つのピークが観察されるだけである。すべてのペプチドの保持時間は、アガロース系プロトタイプより非常に長い。このことは、この事例においてペプチドの溶出に使用しなければならない有機溶媒がより多いことを意味する。シリカ系製品は約ｐＨ８を超えると安定ではないので、ＫｒｏｍａｓｉｌカラムにはｐＨ１２における分離は行わなかった。 図１５〜図１７は、それぞれｐＨ７、ｐＨ３及びｐＨ１２におけるＳｏｕｒｃｅ１５ ＲＰＣのクロマトグラムを示す比較図面である。ＳＯＵＲＣＥ１５ ＲＰＣカラムはｐＨ３において優れた分離を示すが、ｐＨ７及び１２の両方では分離が劣り、広いピークを示す。