特開 2015-145431 ホスホジエステラーゼ３阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-145431(P2015-145431A)

(43)【公開日】2015年8月13日

(54)【発明の名称】ホスホジエステラーゼ３阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/352 20060101AFI20150717BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20150717BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20150717BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20150717BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150717BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150717BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20150717BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150717BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150717BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/352

   A61P9/04

   A61P9/10

   A61P3/10

   A61P19/02

   A61P35/00

   A61K31/7048

   A61P29/00 101

   A61P43/00 111

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2015-101230(P2015-101230)

(22)【出願日】2015年5月18日

(62)【分割の表示】特願2012-18693(P2012-18693)の分割

【原出願日】2012年1月31日

(71)【出願人】

【識別番号】398028503

【氏名又は名称】株式会社東洋新薬

(72)【発明者】

【氏名】神谷 智康

(72)【発明者】

【氏名】高野 晃

(72)【発明者】

【氏名】松塚 裕樹

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA08

4C086EA11

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA08

4C086ZA20

4C086ZA36

4C086ZA37

4C086ZA96

4C086ZB15

4C086ZB26

4C086ZC35

(57)【要約】

【課題】ホスホジエステラーゼ３を阻害する効果に優れた新たな有効成分を提供し、これを含有するホスホジエステラーゼ３阻害剤を提供する。
【解決手段】葛花処理物又は葛花に含有されるイソフラボンをホスホジエステラーゼ３阻害剤の有効成分として用いる。その葛花処理物は、葛花から得られたイソフラボン含有組成物からなることが好ましい。このホスホジエステラーゼ３阻害剤は、ホスホジエステラーゼ３Ｂの阻害のために好適に用いられる。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）：

【化1】

又は、下記式（２）：

【化2】

で表わされる化合物又はその配糖体を有効成分とすることを特徴とするホスホジエステラーゼ３阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、葛花処理物を有効成分として含有するホスホジエステラーゼ３阻害剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、細胞内シグナル分子であるサイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)やサイクリックＧＭＰ(ｃＧＭＰ)の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素であり、それらの細胞内濃度をコントロールしている。哺乳類ではＰＤＥ１〜１１の１１種類のアイソザイムがあり、更にそれぞれのサブタイプが存在し、細胞内シグナル伝達の様々な場面に関与している。また、アイソザイムやそれぞれのサブタイプによって組織局在に特異性がみられることが知られている。このホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の活性を阻害する阻害剤は、ｃＡＭＰやｃＧＭＰの細胞内濃度を直接的に制御でき、アイソザイムやそれぞれのサブタイプに応じた選択性をともなうことから、副作用の少ない治療薬等として、医薬や保健健康分野への応用が期待されている。

【0003】

このうちホスホジエステラーゼ３（ＰＤＥ３）は、主に血小板・心臓・血管平滑筋に存在し、その阻害剤として、急性心不全治療薬であるミルリノンや、慢性動脈閉塞症に基づく潰瘍、疼痛及び冷感等の虚血性諸症状の改善薬であるシロスタゾールなどが知られている。

【0004】

また、下記特許文献１には、非インスリン依存性糖尿病に罹患した又は罹患する危険状態にある患者に相乗作用量の（１）スルホニル尿素、非スルホニル尿素Ｋ+ＡＴＰチャンネルブロッカー、又はスルホニル尿素及び非スルホニル尿素Ｋ+ＡＴＰチャンネルブロッカーと、（２）ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ３型阻害剤とを投与する段階を含む非インスリン依存性真性糖尿病の治療方法の発明が開示され、スルホニル尿素薬であるグリブリドとＰＤＥ３阻害剤であるミルリノンとの併用により、ラットインスリン産生細胞からのインスリンの分泌を相乗的に亢進できることが記載されている。

【0005】

また、下記特許文献２には、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）又はその他の抗リウマチ薬又は抗関節炎薬で治療することのできる疾患の有効な治療における、ＰＤＥ４又はＰＤＥ３／４阻害剤及び疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）又はその他の抗リウマチ又は抗関節炎薬の複合使用の発明が開示され、抗リウマチ薬であるメトトレキサートとＰＤＥ３／４阻害剤であるプーマフェントリン（Pumafentrine）との併用により、マウスのコラーゲン誘発関節炎の症状を相乗的に改善できることが記載されている。

【0006】

更に、下記特許文献３には、ホスホジエステラーゼIII B（PDE3B）阻害剤を有効成分とするシスプラチン効果増強剤の発明が開示され、抗癌剤であるシスプラチンとＰＤＥ３阻害剤であるシロスタゾールとの併用により、担癌マウスの腫瘍体積の増大を相乗的に抑制できることが記載されている。

【0007】

一方、葛はマメ科の大形蔓性の植物であり、その根から採取される葛澱粉は、古くから和菓子の原料として用いられている。また、その根および花は、それぞれ葛根および葛花と称し、解熱薬、鎮痛薬、鎮痙薬、発汗などの症状に対する漢方薬の原料として用いられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００１−３５４５６８号公報

【特許文献2】特表２００５−５０８９８３号公報

【特許文献3】特開２００９−２４２３７８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

ホスホジエステラーゼ阻害剤（ＰＤＥ阻害剤）の医薬や保健健康分野への応用を更に広げるためには、副作用の恐れの少ない新たな有効成分の開発が望まれる。そこで本発明の目的は、ホスホジエステラーゼ３を阻害する効果に優れた新たな有効成分を提供し、これを含有するホスホジエステラーゼ３阻害剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、葛の花部、特にその熱水抽出画分やイソフラボン画分に高いホスホジエステラーゼ３阻害活性を見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

即ち、本発明は以下の構成を有するホスホジエステラーゼ３阻害剤を提供する。
［１］葛花処理物を有効成分として含有することを特徴とするホスホジエステラーゼ３阻害剤。
［２］前記葛花処理物は、葛花から得られたイソフラボン含有組成物からなる前記［１］記載のホスホジエステラーゼ３阻害剤。
［３］ホスホジエステラーゼ３Ｂの阻害のために用いられる前記［１］又は［２］記載のホスホジエステラーゼ３阻害剤。
［４］下記式（１）：

【化1】

又は、下記式（２）：

【化2】

で表わされる化合物又はその配糖体を有効成分として含有することを特徴とするホスホジエステラーゼ３阻害剤。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、葛花処理物又は葛花に含有されるイソフラボンを有効成分とすることにより、副作用の恐れの少ないホスホジエステラーゼ３阻害剤を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明のホスホジエステラーゼ３阻害剤（以下「ＰＤＥ３阻害剤」とする）の好ましい実施形態を説明する。まず、本発明のＰＤＥ３阻害剤の有効成分である葛花処理物について説明する。

【0014】

葛の花部である葛花は、フラボノイド類、特にイソフラボン類を豊富に含有している。本発明においては、蕾から全開した花までのいずれの段階で採取した葛花を用いてもよく、各段階で採取した葛花を混合して用いてもよい。葛の種類としては、特に制限はないが、プエラリア・トムソニイ（Pueraria thomsonii）、プエラリア・ロバータ（Pueraria lobata）、プエラリア・スンバーギアナ（Pueraria thunbergiana）等を例示でき、プエラリア・トムソニイ（Pueraria thomsonii）を用いることが好ましい。

【0015】

本明細書において「葛花処理物」とは、上記葛花の処理物であって、例えば、乾燥処理、粉砕処理、抽出処理などの処理を施して得られたものを含む。また、イソフラボン類等の特定の成分の含有量を高めるように、抽出、濃縮、分画、分離、精製などの処理を施して得られた処理物を含む。

【0016】

以下、葛花処理物として葛花乾燥物、葛花粉末（乾燥粉末および抽出物粉末）、及び葛花抽出物の調製方法について説明する。

【0017】

葛花乾燥物は、葛花、好ましくは蕾の段階の葛花を、日干し、熱風乾燥などの方法により乾燥することで得ることができる。水分含有量としては、１０質量％またはそれ以下となるまで乾燥させることが好ましい。

【0018】

葛花粉末（乾燥粉末）は、上記葛花乾燥物を粉砕して得ることができる。粉末化は、当業者が通常用いる方法、例えば、ボールミル、ハンマーミル、ローラーミルなどを用いて行うことができる。あるいは、葛花粉末（乾燥粉末）は、採取した葛花を、マスコロイダー、スライサー、コミトロールなどを用いて破砕して葛花破砕物を得、この葛花破砕物を乾燥することによっても得ることができる。

【0019】

葛花抽出物は、例えば、葛花、葛花破砕物、葛花乾燥物、または葛花粉末（乾燥粉末）、好ましくは葛花乾燥粉末などの葛花乾燥物に溶媒を添加し、必要に応じて加温して、抽出を行い、遠心分離または濾過により抽出液を回収することによって得ることができる。

【0020】

葛花抽出物を得るために用い得る溶媒としては、水、有機溶媒、含水有機溶媒などが挙げられる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、プロピレングリコール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロエテンなどが挙げられる。これらの中で好ましくは極性有機溶媒、より好ましくはエタノール、ｎ−ブタノール、メタノール、アセトン、プロピレングリコール、および酢酸エチルであり、最も好ましくはエタノールである。

【0021】

抽出方法としては、加温抽出法、超臨界抽出法などが挙げられる。これらの抽出方法において、必要に応じて加圧して加温を行ってもよい。加温する場合、葛花に添加した溶媒が揮発するのを防ぐ必要がある。加温する場合、抽出温度は、好ましくは５０℃以上、より好ましくは７０℃以上、最も好ましくは９０℃以上であり、好ましくは１３０℃以下、より好ましくは１００℃以下である。

【0022】

抽出時間は、抽出原料から十分に可溶性成分が抽出される時間であればよく、抽出温度などに応じて適宜設定すればよい。好ましくは３０分〜４８時間である。例えば、抽出温度が５０℃未満の場合は、６時間〜４８時間であり得、５０℃以上の場合は、３０分〜２４時間であり得る。

【0023】

得られた抽出液は、必要に応じて、減圧濃縮、凍結乾燥などの方法により濃縮または乾燥して、液状、ペースト状、または粉末（抽出物粉末）としてもよい。

【0024】

更に具体的に好ましい態様を挙げれば、葛花、葛花破砕物、葛花乾燥物、または葛花粉末（乾燥粉末）の１００質量部（乾燥物換算）に対して、１〜１００００質量部の熱水を添加して、熱水の温度を５０〜１３０℃に維持しつつ０．５〜４８時間加熱しながら可溶性成分の抽出を行い、遠心分離にて濾別した後、噴霧乾燥で乾燥して、粉末状の葛花抽出物を得ることが好ましい。

【0025】

このようにして得られた葛花処理物は、通常、イソフラボン類を乾燥物換算で０．０１〜５０質量％、好ましくは０．１〜５０質量％含有する組成物である。

【0026】

本発明においては、葛花処理物として、イソフラボン類の含有量を高める処理を施して得られたイソフラボン含有組成物を用いることもできる。その処理としては、含水有機溶媒等による抽出、カラムクロマト等による分画などで行えばよいが、上記葛花抽出物を、メタノール又は含水メタノール、好ましくは０．１〜９９．９％メタノール含有の含水メタノールで抽出する処理を施すことにより、イソフラボン類の含有量を高めることが好ましい。このようにして、典型的には、イソフラボン類を乾燥物換算で２０〜１００質量％、好ましくは４０〜１００質量％含有するイソフラボン含有組成物を得ることができる。

【0027】

葛花には他の植物にあまり含まれない独特のイソフラボン類が多く含まれることが知られている。具体的はテクトリゲニン（Tectorigenin）、テクトリゲニン7‐O‐キシロシルグルコサイド（Tectorigenin 7-O-xylosylglucoside）、6-hydroxygenistein、6-hydroxygenistein-6,7-di-O-glucoside、テクトリジン（Tectoridin）等である。一方、大豆などの植物に多く含まれるゲニステインやダイゼインまたはそれらの配糖体については、葛花にはほとんど含まれないことが分かっている。なお、上述のイソフラボン類については、これらを標品に用いたＨＰＬＣ分析などにより、定量的または定性的に確認することができる。

【0028】

また、葛花に含有されるイソフラボンである、下記式（１）で表わされる6-hydroxygenistein、又は、下記式（２）で表わされるテクトリゲニン（Tectorigenin）は、後述する実施例で示すように、それ自体でホスホジエステラーゼ３を阻害する活性を有することが確認されているので、本発明においては、有効成分としてこれらのイソフラボン又はその配糖体を用いてもよい。

【0029】

【化3】

【0030】

【化4】

【0031】

本発明のＰＤＥ３阻害剤は、上記に説明した葛花処理物又は葛花に含有されるイソフラボンを、ホスホジエステラーゼ３阻害（ＰＤＥ３阻害）のための有効成分として含有するものである。

【0032】

本発明のＰＤＥ３阻害剤においては、上記有効成分以外に、他の素材を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤等の形態にして、これを経口剤として利用することができる。また、軟膏剤、クリーム剤、ジェル、ローション等の形態にして、これを皮膚外用剤として利用することができる。更に、葛花処理物をティーバッグ状に分包し、お湯に成分を浸出させてから飲むようにしてもよい。また、その服用形態としては、水、お湯、牛乳などに溶いて飲むようにしてもよい。

【0033】

本発明のＰＤＥ３阻害剤においては、上記有効成分以外に、他の素材として、食品原料を配合することもできる。食品原料としては、例えば、ローヤルゼリー、プロポリス、ビタミン類（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、葉酸、パントテン酸、ビオチン、これらの誘導体など）、ミネラル（鉄、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、セレンなど）、α−リポ酸、レシチン、ポリフェノール（フラボノイド類、これらの誘導体など）、カロテノイド（リコピン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテインなど）、キサンチン誘導体（カフェインなど）、脂肪酸、タンパク質（コラーゲン、エラスチンなど）、ムコ多糖類（ヒアルロン酸など）、アミノ糖（グルコサミン、アセチルグルコサミン、ガラクトサミン、アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、アセチルノイラミン酸、ヘキソサミン、それらの塩など）、オリゴ糖（イソマルトオリゴ糖、環状オリゴ糖など）、リン脂質およびその誘導体（フォスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミドなど）、含硫化合物（アリイン、セパエン、タウリン、グルタチオン、メチルスルホニルメタンなど）、糖アルコール、リグナン類（セサミンなど）、これらを含有する動植物抽出物、根菜類（ウコン、ショウガなど）などが挙げられる。また、本発明のＰＤＥ３阻害剤を食品等に添加して摂取してもよい。

【0034】

本発明のＰＤＥ３阻害剤において、上記葛花処理物又は葛花に含有されるイソフラボンの含有量は、各種の形態とした場合に、それが使用される量と有効投与量との関係を勘案して適宜定めればよく、特に制限されるものではないが、通常、固形状の形態の場合には、上記葛花処理物の乾燥物換算で０．０１〜１００質量％であり、また、イソフラボン量換算で０．０００００１〜１００質量％である。また、液状又はゼリー状の形態の場合には、上記葛花処理物の乾燥物換算で０．００１〜１００質量％であり、また、イソフラボン量換算で０．００００００１〜１００質量％である。

【0035】

本発明のＰＤＥ３阻害剤の投与形態としては、体の中から作用させるため経口的に摂取してもよく、あるいは皮膚に塗布して用いてもよい。また吸引して呼吸器系に適用してもよく、その投与形態が特に制限されるものではない。

【0036】

本発明のＰＤＥ３阻害剤の投与量は、特に制限はないが、典型的に経口的に摂取する場合には、上記葛花処理物の乾燥物換算で、成人１日当りおよそ０．００１〜１００ｇである。また、イソフラボン量換算で、成人１日当りおよそ０．００００１〜５０ｇである。

【0037】

本発明のＰＤＥ３阻害剤は、前述した従来技術に示されるＰＤＥ３阻害剤と同様な作用を有しているので、例えば、急性心不全治療薬、慢性動脈閉塞症に基づく潰瘍、疼痛及び冷感等の虚血性諸症状の改善薬、非インスリン依存性糖尿病の治療剤、抗リウマチ薬、抗関節炎薬、抗癌剤などに利用することが期待される。

【0038】

また、本発明のＰＤＥ３阻害剤は、後述する実施例で示すように、ＰＤＥ３のアイソザイムであるホスホジエステラーゼ３Ｂ（ＰＤＥ３Ｂ）に対する阻害活性が高いので、ホスホジエステラーゼ３Ｂの阻害剤として特に好適に用いることができる。

【実施例】

【0039】

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【0040】

＜調製例１＞（葛花抽出物）
葛（Pueraria thomsonii）の花部を熱水で抽出して抽出液を得、それを乾燥して粉末状の葛花抽出物を得た。この抽出物は、下記試験例１に同定したイソフラボン類を組成物中に１０質量％含有し、その他の炭水化物約３８質量％、タンパク質約１９質量％、灰分約１４質量％、水分約６質量％、脂質約５質量％を含有する組成物であった。

【0041】

＜調製例２＞（イソフラボン含有組成物）
上記葛花抽出物を含水メタノールを用いたカラムクロマトグラフィーにより分離し、それを乾燥して粉末状のイソフラボン含有組成物を得た。この組成物は、組成物中のイソフラボン類含量が約６１質量％にまで高められていた。

【0042】

＜試験例１＞（イソフラボンの同定・定量）
常法に従い、上記葛花抽出物及びイソフラボン含有組成物に含まれるイソフラボン類を、各イソフラボン標準品を濃度標準としたＨＰＬＣ法等により、同定・定量した。

【0043】

その結果、葛花にはイソフラボンとしてテクトリゲニン（Tectorigenin）、テクトリゲニン7‐O‐キシロシルグルコサイド（Tectorigenin 7-O-xylosylglucoside）、6-hydroxygenistein、6-hydroxygenistein-6,7-di-O-glucoside、テクトリジン（Tectoridin）等が含まれることが確認された。また、熱水で抽出した葛花抽出物と、更に含水メタノールを用いたカラムクロマトグラフィーにより分離したイソフラボン含有組成物とで、イソフラボン類の組成比は、ほとんど相違がみられなかった。

【0044】

＜試験例２＞（ＰＤＥ３Ｂ阻害実験）
上記葛花抽出物及びイソフラボン含有組成物について、それらを用いたＰＤＥ３Ｂ阻害実験を行った。また、下記に示す化合物についても、これらを用いたＰＤＥ３Ｂ阻害実験を行った。
・シロスタゾール（ＰＤＥ３選択的阻害剤）
・6-hydroxygenistein（葛花イソフラボン）
・ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）（ＰＤＥ阻害剤）
・ケルセチン（Quercetin）（植物フラボノイド；ＰＤＥ阻害剤）
・テクトリゲニン（Tectorigenin）（葛花イソフラボン）
・ゲニステイン（Genistein）（大豆イソフラボン）
・ダイゼイン（Daidzein）（大豆イソフラボン）
・カフェイン

【0045】

ＰＤＥ３Ｂ阻害実験は、PBS Bioscience社製キット「PDE3B Assay Kit」を使用して行った。まず上記各サンプルの10ｍＭストック試料（葛花抽出物の場合は2ｍＭストック試料）をキット付属のバッファーを使用して段階希釈して希釈サンプルを作成した。具体的には、葛花抽出物、イソフラボン含有組成物、シロスタゾール、6-hydroxygenisteinの場合には、0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250μＭの希釈シリーズを作成し、ＩＢＭＸ、ケルセチンの場合には、1, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 600μＭの希釈シリーズを作成し、テクトリゲニン、ゲニステインの場合には、10, 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, 6000μＭの希釈シリーズを作成し、ダイゼインの場合には、500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000μＭの希釈シリーズを作成し、カフェインの場合には、10, 33, 66, 100, 333, 666, 1000, 3333, 6666μＭの希釈シリーズを作成した。

【0046】

次に、酵素液として4ｐｇ／μＬのホスホジエステラーゼ３Ｂ（ＰＤＥ３Ｂ）を20μＬと、基質液として200ｎＭのFAM-Cyclic-3’,5’-AMP（蛍光標識cAMP）を25μＬと、上記希釈シリーズ各5μＬとを、９６穴マイクロプレートの各ウェルに入れ混合し１時間室温でインキュベートした。その後キット付属の結合試薬（「Binding Agent」）を100倍に希釈した溶液100μＬを添加し、１時間振とうさせながらインキュベートした。

【0047】

蛍光偏光度測定装置（「Flex Station3」Molecular Devices社製）を使用し、上記反応後の各ウェル中のサンプルに、励起波長 485ｎｍの偏光をあて、それによる蛍光波長538ｎｍの蛍光を測定して、下記式（１）に示す偏光度Ｐを求めた。

【0048】

【数1】

【0049】

ここでＰＤＥ３Ｂにより酵素分解されたFAM-Cyclic-3’,5’-AMP（蛍光標識cAMP）の酵素分解産物は、上記結合試薬に結合して、蛍光の偏光度が増加する。一方、ＰＤＥ３Ｂの活性が阻害剤により低下すれば、その酵素分解産物の量も少なくなる。そのため、上記結合試薬に結合する酵素分解産物の量も少なくなり、結果として、蛍光の偏光度は阻害剤を入れない場合に比較して低下することになる。したがって、このキットでは偏光度を反応進行の指標とでき、その低下を反応阻害の指標とできる。そこで縦軸にこの偏光度をとり、横軸に阻害物質濃度をとり、上記被検物質ごとの希釈シリーズの結果をプロットして、常法に従いＩＣ５０値を求めた。その結果を表１にまとめて示す。

【0050】

【表1】

【0051】

表１に示すように、葛の花部から熱水抽出して得られた葛花抽出物は、ＰＤＥ３の選択的阻害剤であるシロスタゾールよりも高いＰＤＥ３Ｂ阻害活性を示した。また、葛花抽出物からイソフラボン画分を抽出したイソフラボン含有組成物も、シロスタゾールに匹敵するＰＤＥ３Ｂ阻害活性を示した。その阻害活性は、一般的なＰＤＥ阻害剤として知られているＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）やケルセチン（Quercetin）よりも高かった。更に、葛花に含有されるイソフラボンである、6-hydroxygenistein やテクトリゲニン（Tectorigenin）は、それ自体でＰＤＥ３Ｂ阻害活性を示すことが明らかとなった。特に、6-hydroxygenistein のＰＤＥ３Ｂ阻害活性は、顕著に高かった。

【0052】

一方、大豆イソフラボンであるゲニステイン（Genistein）やダイゼイン（Daidzein）は、ＰＤＥ３Ｂ阻害活性を検出できなかった。よって、上記葛花抽出物やイソフラボン含有組成物によるＰＤＥ３Ｂ阻害活性には、葛花に特有のイソフラボンが寄与していることが示唆された。

【0053】

＜製造例１＞
下記表２の配合にて、調製例１で得られた葛花抽出物を含有する粉末飲料を製造した。

【0054】

【表2】

【0055】

＜製造例２＞
下記表３の配合にて、調製例２で得られたイソフラボン含有組成物を含有する粉末飲料を製造した。

【0056】

【表3】

【0057】

＜製造例３＞
下記表４の配合にて、調製例１で得られた葛花抽出物を含有するソフトカプセルを製造した。

【0058】

【表4】

【0059】

＜製造例４＞
下記表５の配合にて、調製例２で得られたイソフラボン含有組成物を含有するソフトカプセルを製造した。

【0060】

【表5】

【0061】

＜製造例５＞
下記表６の配合にて、調製例１で得られた葛花抽出物を含有する錠剤を製造した。

【0062】

【表6】

【0063】

＜製造例６＞
下記表７の配合にて、調製例２で得られたイソフラボン含有組成物を含有する錠剤を製造した。

【0064】

【表7】

【0065】

＜製造例７＞
下記表８の配合にて、調製例１で得られた葛花抽出物を含有するドリンク剤を製造した。

【0066】

【表8】

【0067】

＜製造例８＞
下記表９の配合にて、調製例２で得られたイソフラボン含有組成物を含有するドリンク剤を製造した。

【0068】

【表9】

【0069】

＜製造例９＞
下記表１０の配合にて、6-hydroxygenistein（葛花イソフラボン；アグリコン）を含有する粉末飲料を製造した。なお、6-hydroxygenisteinとしては、葛花抽出物からカラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製することにより得られたものを用いた。

【0070】

【表10】

【0071】

＜製造例１０＞
下記表１１の配合にて、テクトリゲニン（Tectorigenin）（葛花イソフラボン；アグリコン）を含有するソフトカプセルを製造した。なお、テクトリゲニンとしては、葛花抽出物からカラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製することにより得られたものを用いた。

【0072】

【表11】

【0073】

＜製造例１１＞
下記表１２の配合にて、6-hydroxygenistein-6,7-di-O-glucoside（葛花イソフラボン；配糖体）を含有する錠剤を製造した。なお、6-hydroxygenistein-6,7-di-O-glucosideとしては、葛花抽出物からカラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製することにより得られたものを用いた。

【0074】

【表12】

【0075】

＜製造例１２＞
下記表１３の配合にて、テクトリゲニン7‐O‐キシロシルグルコサイド（Tectorigenin 7-O-xylosylglucoside）（葛花イソフラボン；配糖体）を含有するドリンク剤を製造した。なお、テクトリゲニン7‐O‐キシロシルグルコサイドとしては、葛花抽出物からカラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製することにより得られたものを用いた。

【0076】

【表13】