特開 2015-159787 コンブの原産国判別方法並びにプライマー及びプライマーを含むキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-159787(P2015-159787A)

(43)【公開日】2015年9月7日

(54)【発明の名称】コンブの原産国判別方法並びにプライマー及びプライマーを含むキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20150811BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150811BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2014-38204(P2014-38204)

(22)【出願日】2014年2月28日

(71)【出願人】

【識別番号】000173511

【氏名又は名称】公益財団法人函館地域産業振興財団

(71)【出願人】

【識別番号】310010575

【氏名又は名称】地方独立行政法人北海道立総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100093296

【弁理士】

【氏名又は名称】小越 勇

(74)【代理人】

【識別番号】100173901

【弁理士】

【氏名又は名称】小越 一輝

(72)【発明者】

【氏名】清水 健志

(72)【発明者】

【氏名】八十川 大輔

【テーマコード（参考）】

4B024

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B024AA11

4B024CA01

4B024CA09

4B024CA11

4B024CA20

4B024HA11

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ01

4B063QQ04

4B063QQ09

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS16

4B063QS25

4B063QS32

4B063QX01

(57)【要約】      （修正有）

【課題】流通している食用コンブの原産国が、日本産、中国産、韓国産のいずれであるかを正確かつ迅速に行うことができる方法の提供。
【解決手段】Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻のＮＡＤ５遺伝子の部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）について、ＳａｃｃｈａｒｉｎａＪａｐｏｎｉｃａの塩基配列の１１６６番目〜１５９０番目（４２５ｂｐ）との比較解析により、９９％以上の一致率からマコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブを含む）であるか否かを判別する方法。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コンブの原産国を判別する際に、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻のＮＡＤ５遺伝子の部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）について、配列番号１の塩基配列の１１６６番目〜１５９０番目（４２５ｂｐ）との比較解析により、９９％以上の一致率からマコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブを含む）であるか否かを判別することを特徴とするコンブの原産国判別方法。

【請求項2】

Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻が、マコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ含む）、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブであることを特徴とする請求項１に記載のコンブの原産国判別方法。

【請求項3】

マコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ含む）の各原産国に特異的な４か所の一塩基多型（ＳＮＰ）を指標に判別する際に、ＳＮＰの内、配列番号１に示した塩基配列の１１８２番目のシトシンが、チミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１３５５番目のシトシンが、チミンに置換されたＳＮＰの少なくとも１種を有するマコンブを中国産、１２９４番目のグアニンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１５４４番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰの少なくとも１種を有するマコンブを韓国産と判別することにより、中国産と韓国産のマコンブを判別することを特徴とするコンブの原産国判別方法。

【請求項4】

請求項１及び２に記載のコンブの原産国判別方法を実施するため、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻のＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）について、それぞれの塩基配列の違いを検出することを特徴とするプライマー及びプライマーを含むキット。

【請求項5】

請求項３に記載のコンブの原産国判別方法を実施するため、マコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ含む）の各原産国に特異的な４か所の一塩基多型（ＳＮＰ）の内、配列番号１に示した塩基配列の１１８２番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰ、１２９４番目のグアニンがチミンに置換されたＳＮＰ、１３５５番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１５４４番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰの内の少なくとも１箇所を検出することを特徴とするプライマー及びプライマーを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、食用コンブの原産国を高精度に判別できる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、分子生物学的解析や交雑実験を基とした褐藻類の分類に関する再構築が行なわれており、食用とされるコンブのほとんどは、新たに設けられたＳａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれることとなった（非特許文献１）。

【0003】

さらに、これまで独立した種として扱われていたマコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブについては、それぞれが種としての分化まで至っておらず、マコンブ及びその変種とすることが妥当と報告されており（非特許文献２）、国立生物工学情報センターが運営する公共データベースのＴａｘｏｎｏｍｙ ｄａｔａｂａｓｅにも反映されている。

【0004】

Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属の内、食用コンブとして流通している主な種に、マコンブ（Ｓ.ｊａｐｏｎｉｃａ （Ａｒｅｓｃｈｏｕｇ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、ホソメコンブ（Ｓ. ｊａｐｏｎｉｃａ （Ａｒｅｓｃｈｏｕｇ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｖａｒ. ｒｅｌｉｇｉｏｓａ （Ｍｉｙａｂｅ） Ｙｏｔｓｕｋｕｒａ、 Ｋａｗａｓｈｉｍａ、 Ｈ. Ｋａｗａｉ、 Ｔ. Ａｂｅ ｅｔ Ｄｒｕｅｈｌ）、リシリコンブ（Ｓ. ｊａｐｏｎｉｃａ （Ａｒｅｓｃｈｏｕｇ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｖａｒ. ｏｃｈｏｔｅｎｓｉｓ （Ｍｉｙａｂｅ） Ｙｏｔｓｕｋｕｒａ、 Ｋａｗａｓｈｉｍａ、 Ｈ. Ｋａｗａｉ、Ｔ. Ａｂｅ ｅｔ Ｄｒｕｅｈｌ）、オニコンブ（Ｓ. ｊａｐｏｎｉｃａ （Ａｒｅｓｃｈｏｕｇ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｖａｒ. ｄｉａｂｏｌｉｃａ （Ｍｉｙａｂｅ） Ｙｏｔｓｕｋｕｒａ、 Ｋａｗａｓｈｉｍａ、 Ｈ. Ｋａｗａｉ、 Ｔ. Ａｂｅ ｅｔ Ｄｒｕｅｈｌ）、ミツイシコンブ（Ｓ. ａｎｇｕｓｔａｔａ （Ｋｊｅｌｌｍａｎ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、ナガコンブ（Ｓ. ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ （Ｍｉｙａｂｅ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、ガッガラコンブ（Ｓ. ｃｏｒｉａｃｅａ （Ｍｉｙａｂｅ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ）及びガゴメ（Ｓ. ｓｃｕｌｐｅｒａ （Ｍｉｙａｂｅ） Ｃ. Ｌａｎｅ、 Ｃ. Ｍａｙｅｓ、 Ｄｒｕｅｈｌ ｅｔ Ｇ.Ｗ. Ｓａｕｎｄｅｒｓ）が挙げられる．

【0005】

流通している食用コンブは日本産の他に中国産と韓国産があり、どちらもマコンブであるが、日本産のコンブに比べ安価に取引されている。このような生産地の違いによる価格差は、他の食品原料でも多く見られ、特にブランド力の高い日本産の農水畜産物は高値で取引されている。

【0006】

しかしながら、多くの農水畜産物は外観形状から原産国を識別することは困難である。そのため、近年、ブランド力を有する産地を他地域産の農水畜産物に表示して販売する、いわゆる表示偽装が社会的な問題となっている。このような背景から食品原料の産地表示の真偽を科学的に判別できる技術の開発は、ブランドの信頼性を確保するために重要となっている。

【0007】

近年、様々な食品原料で原産国を判別するための技術が開発されており（非特許文献３〜５）、コンブについても藻体内に含まれる無機元素組成を指標とした原産国判別技術が開発されている（非特許文献６）。
また、判別技術としてよく用いられるＤＮＡ分析に関しては、コンブ類の種判別が報告されているが（特許文献１）、原産国判別技術に関する報告はこれまでに知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特許公開２００６−００００９４、清水ら、２００６年

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｌａｎｅ、Ｃ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．、第４２巻、第４９３−５１２頁、２００６年

【非特許文献2】Ｎ.Ｙｏｔｓｕｋｕｒａら、Ｊ．Ｊｐｎ．Ｂｏｔ. 、第８３巻、第１６５−１７６頁、２００８年

【非特許文献3】水産学シリーズ１４９ 水産物の原料・産地判別、恒星社厚生閣社、２００６年

【非特許文献4】食品鑑定技術ハンドブック、サイエンスフォーラム社、第６６−１３５頁、２００５年

【非特許文献5】新・食品分析法II、光琳社、第２３１−４１３頁、１９９６年

【非特許文献6】服部賢志ら、日水誌、第７５巻、第７７−８２頁、２００９年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

多くの農水畜産物は外観形状から原産国を識別することは困難である。そのため、近年、ブランド力を有する産地を他地域産の農水畜産物に表示して販売する、いわゆる表示偽装が社会的な問題となっている。このような背景から食品原料の産地表示の真偽を科学的に判別できる技術の開発は、ブランドの信頼性を確保するために重要となっている。

【0011】

流通している食用コンブは日本産の他に中国産と韓国産があり、どちらもマコンブであるが、日本産のコンブに比べ安価に取引されている。このような生産地の違いによる価格差は、他の食品原料でも多く見られ、特にブランド力の高い日本産の農水畜産物は高値で取引されている。しかしながら、日本産の食用コンブについての判別技術がなく、コンブが混乱して流通しているのが現状である。本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻のミトコンドリアＤＮＡ上にあるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ５（ＮＡＤ５）遺伝子の塩基配列の多型を用いて食用コンブの原産国判別を正確かつ迅速に行う手法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

１）コンブの原産国を判別する際に、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻のＮＡＤ５遺伝子の部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）について、配列番号１の塩基配列の１１６６番目〜１５９０番目（４２５ｂｐ）との比較解析により、９９％以上の一致率からマコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ含む）であるか否かを判別することを特徴とするコンブの原産国判別方法。

【0013】

２）Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻が、マコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブを含む）、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブであることを特徴とする上記１）に記載のコンブの原産国判別方法。

【0014】

３）マコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ含む）の各原産国に特異的な４か所の一塩基多型（ＳＮＰ）を指標に判別する際に、ＳＮＰの内、配列番号１に示した塩基配列の１１８２番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１３５５番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰの少なくとも１種を有するマコンブを中国産、１２９４番目のグアニンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１５４４番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰの少なくとも１種を有するマコンブを韓国産と判別することにより、中国産と韓国産のマコンブを判別することを特徴とするコンブの原産国判別方法。

【0015】

４）上記１）及び２）に記載のコンブの原産国判別方法を実施するため、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に含まれる海藻のＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）について、それぞれの塩基配列の違いを検出することを特徴とするプライマー及びプライマーを含むキット。

【0016】

５）上記３）に記載のコンブの原産国判別方法を実施するため、マコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ含む）の各原産国に特異的な４か所の一塩基多型（ＳＮＰ）の内、配列番号１に示した塩基配列の１１８２番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰ、１２９４番目のグアニンがチミンに置換されたＳＮＰ、１３５５番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１５４４番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰの内の少なくとも１箇所を検出することを特徴とするプライマー及びプライマーを含むキット。

【発明の効果】

【0017】

本願のコンブの原産国判別方法により、ミトコンドリアＤＮＡ上に存在するＮＡＤ５遺伝子（１９８６ｂｐ）の部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）を用いて食用コンブを判別することが可能となり、これによって、流通している食用コンブの日本産、中国産、韓国産の区別が容易となる著しい効果を有する。従来は、日本産の食用コンブについての判別技術がなく、コンブが混乱して流通しているのが現状であったが、本発明により、コンブの判別を正確かつ迅速に行うことができる大きな効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ＰＣＲに用いたプライマーペアの位置と増幅ＤＮＡ断片のサイズを示す図である。

【図2】比較解析に用いたＮＡＤ５遺伝子部分配列の位置とサイズを示す図である。

【図3】食用コンブのそれぞれのＤＮＡを鋳型として、ＮＡＤ５遺伝子部分配列をＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を検出した図である。

【図4】ＮＪ法により食用コンブのそれぞれのＮＡＤ５遺伝子部分配列（４２５ｂｐ）を比較解析した図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
（食用コンブの原産国判別方法について）
原産国の判別に良く用いられる科学的手法として、元素分析、ＤＮＡ分析、安定同位体比分析が挙げられるが、これまでに食用コンブの原産国を判別できる技術は元素分析以外には報告されていない（非特許文献６参照）。
しかしながら、非特許文献６に開示されているコンブの原産国判別技術は、マコンブ、リシリコンブ（マコンブ変種）及びミツイシコンブの元素組成データから判別関数を構築しているため、３種以外のコンブを分析対象とすることができないという問題がある。

【0020】

また、別の問題点として、判別の指標である無機元素は生育環境中から藻体内に取り込まれるため、判別精度は環境変化により影響を受けることが挙げられる。これらの問題点を解決できる原産国判別手法の開発が課題となる。
そこで本発明者らは、食用コンブの原産国判別手法の開発について研究を重ねた結果、ミトコンドリアＤＮＡ上に存在するＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット５（ＮＡＤ５）遺伝子（１９８６ｂｐ）の塩基配列が、食用コンブのそれぞれの種に特異的であることを確認した。

【0021】

さらに、日本、中国、韓国のそれぞれの地域のマコンブに特異的な一塩基多型（ＳＮＰ）が存在することを見出した。本配列の種及び原産国に対する特異性を用いることで、食用コンブの原産国を高精度に判別可能なことを確認し、本発明を完成するに至った。

【0022】

（ＤＮＡ分析による食用コンブの原産国判別方法）
函館市で採取された１個体のマコンブのＮＡＤ５遺伝子を参照配列として設定し、参照配列と乾燥コンブ７種（マコンブ（マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブを含む）、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブ）の１１６６番目から１５９０番目までの部分配列（４２５ｂｐ）について比較解析を行い、原産国を判別した。

【0023】

その結果、参照配列と９９％以上の一致率を示したのはマコンブだけであり、その他の６種のコンブ（ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブ）は９８％以下の一致率であった。
すなわち、本塩基配列の一致率を指標とすることで、日本産と中国産と韓国産が流通しているマコンブ（変種３種を含む）と日本産だけが流通している６種のコンブ（ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブ）を識別できることが分かった。

【0024】

さらに日本産と中国産と韓国産が存在するマコンブについて、ＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）に含まれる４箇所のＳＮＰ（１１８２番目、１２９４番目、１３５５番目、１５４４番目）を指標に原産国の判別を行った。その結果、中国産マコンブの中で１１８２番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１３５５番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰを保有する個体の割合は９６．５％であった。一方で、日本産及び韓国産のマコンブでは、２箇所の塩基に置換が見られなかった。

【0025】

また、韓国産マコンブは、１２９４番目のグアニンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１５４４番目のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰを保有する個体の割合が９４．７％であることが分かった。一方で，日本産及び中国産のマコンブでは、２箇所の塩基に置換が見られなかった。
すなわち、これらのＳＮＰを指標にマコンブの原産国について判別を行ったところ、日本産の全てを日本産として、中国産の９６．５％を中国産として、韓国産の９４．７％を韓国産として、判別可能であった。

【0026】

これらの結果から、ＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）を用いることにより、食用コンブの原産国を高精度に判別できることが確認できた。
以下、本願発明の背景（裏付）となる実験（試験）方法及び結果について説明するが、これは通常の実施例に相当するものである。

【0027】

（実験方法）
（使用した食用コンブ試料）
乾燥コンブ試料として、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属である日本産のマコンブ、ホソメコンブ（マコンブ変種）、リシリコンブ（マコンブ変種）、オニコンブ（マコンブ変種）、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブの他、中国産マコンブ、韓国産マコンブを試料として用いた。
また、外群としてＳａｃｃｈａｒｉｎａ属以外の褐藻類であるスジメ（Ｃｏｓｔａｒｉａ属）を用い、ＮＪ法による系統樹を作成した。

【0028】

（ＤＮＡの調製）
乾燥コンブ試料から１０〜２０ｍｇを採取し、市販のＤＮＡ抽出キットとＤＮＡ精製キット等を用いてミトコンドリアＤＮＡを含む全ＤＮＡを調整した。

【0029】

（ＰＣＲによるＮＡＤ５遺伝子部分配列の増幅）
次いで、食用コンブ試料からＮＡＤ５遺伝子（１９８６ｂｐ）中の部分配列（１０９０番目〜１６８２番目、５９３ｂｐ）を増幅するために設計したプライマーペア（表１）と市販のＤＮＡ合成酵素（ＫＯＤ ＦＸ、東洋紡績株式会社）を使用し、調製したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った（図１参照）。

【0030】

ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分間の前加熱の後、９８℃で１０秒間の変性工程、５９℃で３０秒間のアニーリング工程及び６８℃で４０秒間の伸長工程の３工程を４０回繰り返した。ＰＣＲ後の試料を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片の増幅及びサイズの確認を行った。

【0031】

【表1】

【0032】

（ＮＡＤ５遺伝子部分配列の解読及び比較解析）
ＰＣＲにより得られた増幅ＤＮＡ断片について、表１に示した１０９０Ｆ、１６８２Ｒの２種類のプライマーを用い、ダイレクトシーケンス法によりＮＡＤ５遺伝子の１１６６番目から１５９０番目までの部分配列（４２５ｂｐ）の塩基を解読した（図２参照）。

【0033】

また、塩基配列の比較解析には、系統解析ソフトウェアであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＥＧＡ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０．８を用い、近隣接合法（ＮＪ法）及びマルチプルアライメント法にて行った。

【0034】

（原産国判別のための参照配列の設定）
函館市で採取したマコンブについて、ＮＡＤ５遺伝子（１９８６ｂｐ）を解読し、比較解析に用いる参照配列とした（配列表）。

【0035】

この参照配列と日本産マコンブ、中国産マコンブ、韓国産マコンブ、マコンブ変種３種（ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ）、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブの各２５個体について、ＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）を指標に、マルチプルアライメント法による比較解析を行った。さらに、日本産（３４７個体）、中国産（２０１個体）、韓国産（７５個体）のマコンブ内においてマルチプルアライメント法による比較解析を行い、原産国に特異的なＳＮＰの探索及びＳＮＰを指標とした原産国判別を行った。

【0036】

（結果と考察）
（ＮＡＤ５遺伝子部分配列の増幅）
アガロースゲル電気泳動の結果、実験に使用した全ての試料から５９３ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された（図３参照）。
Ｃｏｓｔａｒｉａ属であるスジメにおいても増幅が可能なことから、設計したプライマーペアは、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属に限らず多くの褐藻類のＮＡＤ５遺伝子部分配列（１０９０番目〜１６８２番目）の増幅に利用できると考えられた。

【0037】

（ＮＡＤ５遺伝子部分配列の比較解析）
マコンブ（変種含む）、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブのＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）についてＮＪ法による比較解析を行ったところ、それぞれの種内において、個体間に僅かな塩基の違いが見られたものの、各種間の差は明確に識別できることが確認された（図４参照）。

【0038】

この結果は、ＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）が種特異性を保持していることを意味している。７種の食用コンブの内、マコンブ以外の６種は全て日本が原産国であることから、マコンブであるか否かの識別が可能な本配列は、原産国の判別に利用できることが分かった。

【0039】

さらに、マコンブ変種であるホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブを含む日本産マコンブ（３４７個体）と中国産マコンブ（２０１個体）及び韓国産マコンブ（７５個体）について、ＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）を解読し、マコンブ内における比較解析を行った。

【0040】

その結果、中国産マコンブは、１１８２番目（部分配列の１７番目）のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１３５５番目（部分配列の１９０番目）のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰを保有する個体が多く見られた。一方で、日本産及び韓国産のマコンブでは、２箇所の塩基に置換が見られなかった。

【0041】

また、韓国産マコンブは、１２９４番目（部分配列の１２９番目）のグアニンがチミンに置換されたＳＮＰ、あるいは１５４４番目（部分配列の３７９番目）のシトシンがチミンに置換されたＳＮＰを保有する個体が多く見られたが、日本産及び中国産のマコンブでは、２箇所の塩基に置換が見られなかった。

【0042】

これら結果から、ＮＡＤ５遺伝子の１１８２番目、１２９４番目、１３５５番目、１５４４番目の４箇所のＳＮＰの有無を調べることにより、マコンブの原産国を高精度に判別できると考えられた。

【0043】

（ＮＡＤ５遺伝子部分配列を用いた食用コンブの原産国判別）
函館市で採取したマコンブのＮＡＤ５遺伝子を参照配列に設定し、参照配列と日本産マコンブ、中国産マコンブ、韓国産マコンブ、マコンブ変種３種（ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ）、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブの各２５個体のＮＡＤ５遺伝子部分配列（１１６６番目〜１５９０番目、４２５ｂｐ）についてマルチプルアライメント法による比較解析を行い、原産国を判別した。

【0044】

その結果、参照配列と９９％以上の一致率を示したものは日本産、中国産、韓国産マコンブ及びマコンブ変種３種であった。一方、流通市場において日本産しか見られないミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブの一致率は９８％以下であることが分かった。

【0045】

この結果から、ＮＡＤ５遺伝子の部分塩基配列における参照配列との一致率を９９％以上とすることで、マコンブ（日本産、中国産、韓国産）とその他のコンブ（日本産）を判別することが可能と判断された（表２参照）。
すなわち、表２は、ＮＡＤ５遺伝子部分配列（４２５ｂｐ）について、マコンブの参照配列と日本産、中国産、韓国産マコンブ、マコンブ変種３種、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブのそれぞれとを比較した例である。

【0046】

さらにマコンブ（変種３種及び日本産、中国産、韓国産を含む）の種内の比較解析により見出した４箇所の原産国特異的ＳＮＰの有無を指標に原産国を判別した結果、日本産の全てを日本産、中国産の９６．５％を中国産、韓国産の９４．７％を韓国産として判別できることを確認した（表３参照）。
すなわち、表３は、ＮＡＤ５遺伝子部分配列（４２５ｂｐ）中のマコンブ原産国特異的ＳＮＰと原産国判別精度を示した例を示す。

【0047】

以上については、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ属の７〜１０種の乾燥コンブについて、原産国を判別した例（実験結果）を示したが、ＤＮＡを含んでいる試料であれば乾燥だけに限らず生のコンブや加工されたコンブ等でも同様の原産国判別できることは、自明のことと考えられる。

【0048】

また、比較解析の方法は、ダイレクトシーケンス法などのＤＮＡシーケンサーを用いて解読した後の塩基配列を比較する方法に限らず、ＰＣＲによる増幅産物の有無、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＷＡＶＥ法、Ｒｉａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法など、遺伝子多型を検出できる方法を用いることができる。

【0049】

遺伝子多型の検出には、必要に応じて、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）技術によりＤＮＡを増幅するためのプライマーを使用することができる。参考資料として「目的別で選べるＰＣＲ実験プロトコール 失敗しないための実験操作と条件設定」（実験医学別冊）２０１１年１月１日発行、Ｐ．１６−１７「ＰＣＲの原理」を挙げる。
この資料に示すように、プライマーは、短いＤＮＡであり、分析対象試料から抽出したＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）と結合（アニーリング）して目的のＤＮＡ断片を複製することができれば、塩基配列や塩基数は特に限定されない。

【0050】

【表2】

【0051】

【表3】

【産業上の利用可能性】

【0052】

多くの農水畜産物は外観形状から原産国を識別することは困難である。そのため、近年、ブランド力を有する産地を他地域産の農水畜産物に表示して販売する、いわゆる表示偽装が社会的な問題となっている。このような背景から食品原料の産地表示の真偽を科学的に判別できる技術の開発は、ブランドの信頼性を確保するために重要となっている。本発明は、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ５（ＮＡＤ５）遺伝子の塩基配列の多型を用いて食用コンブの原産国判別を正確かつ迅速に行う手法を提供することを課題とする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]