特開 2015-163602 ［（４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシン化合物の結晶形及びそれらの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-163602(P2015-163602A)

(43)【公開日】2015年9月10日

(54)【発明の名称】［（４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシン化合物の結晶形及びそれらの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 401/06 20060101AFI20150814BHJP

   A61K 31/444 20060101ALN20150814BHJP

【ＦＩ】

   C07D401/06

   A61K31/444

【審査請求】有

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2015-13881(P2015-13881)

(22)【出願日】2015年1月28日

(31)【優先権主張番号】特願2014-13886(P2014-13886)

(32)【優先日】2014年1月29日

(33)【優先権主張国】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000002819

【氏名又は名称】大正製薬株式会社

(72)【発明者】

【氏名】吉田 浩二

(72)【発明者】

【氏名】濱田 まこと

(72)【発明者】

【氏名】清水 由紀

(72)【発明者】

【氏名】柴田 剛

【テーマコード（参考）】

4C063

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA01

4C063BB03

4C063CC12

4C063DD11

4C063EE01

4C086AA04

4C086BC17

4C086GA08

4C086GA15

4C086MA01

4C086MA04

4C086ZA55

4C086ZC20

(57)【要約】

【課題】［（４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシン化合物の医薬品としての使用環境で安定な結晶形及びそれらの製造方法を提供する。
【解決手段】上記課題は、（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６４６ｃｍ^-1、１５６７ｃｍ^-1、１４８３ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのＢ型結晶などにより解決される。
【選択図】 図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５３ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１６８℃〜１７２℃にある。

【請求項2】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンにアセトン−酢酸エチル混合液を加えて、溶液とした後、結晶化させ、得られた結晶を乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５３ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１６８℃〜１７２℃にある。

【請求項3】

下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６４６ｃｍ^-1、１５６７ｃｍ^-1、１４８３ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【請求項4】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンに水−エタノール混合液を加え、溶液とした後、結晶化させ、得られた結晶を乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６４６ｃｍ^-1、１５６７ｃｍ^-1、１４８３ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【請求項5】

下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５６ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある。

【請求項6】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンにメタノールを加えて、溶液とした後、氷冷下にて結晶化させ、得られた結晶を氷冷下にて乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（b）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５６ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある。

【請求項7】

下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのナトリウム塩の結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１５６６ｃｍ^-1、１４７８ｃｍ^-1、１２６６ｃｍ^-1、及び１２４６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１１０℃〜１１４℃にある。

【請求項8】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのアセトン懸濁液へ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、作用させた後、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１５６６ｃｍ^-1、１４７８ｃｍ^-1、１２６６ｃｍ^-1、及び１２４６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１１０℃〜１１４℃にある。

【請求項9】

下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのカリウム塩の結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６０７ｃｍ^-1、１５４７ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、及び１２８４ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが２３３℃〜２３７℃にある。

【請求項10】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのアセトン懸濁液へ水酸化カリウム水溶液を添加し、作用させた後、溶媒を留去して得られた残渣にアセトンを加え、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６０７ｃｍ^-1、１５４７ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、及び１２８４ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが２３３℃〜２３７℃にある。

【請求項11】

下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのカルシウム塩の結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５７５ｃｍ^-1、１４８５ｃｍ^-1、及び１２３６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９６℃〜２００℃にある。

【請求項12】

水とエタノールとの混合液にＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのナトリウム塩を溶解させた後、塩化カルシウム（II）水溶液を添加し、作用させた後、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５７５ｃｍ^-1、１４８５ｃｍ^-1、及び１２３６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９６℃〜２００℃にある。

【請求項13】

下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６４７ｃｍ^-1、１５６０ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２２８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【請求項14】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンに水−エタノール混合液を加え、溶液とした後、結晶化させ、得られた結晶を乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６４７ｃｍ^-1、１５６０ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２２８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、［（４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシン化合物の結晶形及びそれらの製造方法に関する。さらに詳しくは、例えば、貧血、貧血に由来する疾病など、プロリルヒドロキシラーゼ（ｐｒｏｌｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、以下、「ＰＨＤ」ともいう）、特にプロリルヒドロキシラーゼ２（以下、「ＰＨＤ２」ともいう）が関与しているとされる疾患の治療剤及び予防剤として有用性が期待されるＰＨＤ阻害剤である［（４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシン化合物の結晶形及びその製造方法の結晶多形及びそれら製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血液中の赤血球細胞は全身への酸素運搬を担い、恒常的な生体内の酸素濃度の維持に重要な働きをしている。ある種の疾病や事故・手術などによる出血により、血液中の赤血球数やヘモグロビン量が低下すると、倦怠感やめまい、息切れ等の貧血症状を呈する。貧血になると全身が酸素不足にさらされることになるが、この様な低酸素条件下では、生体は代償反応として、主に腎臓から赤血球の形成を促進する造血因子エリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」ともいう。）を産生し、血液中の赤血球やヘモグロビン量を増加させて貧血の改善を促す。しかしながら、ある種の疾病においては、このエリスロポエチンによる赤血球新生作用が障害を受け、慢性的な貧血が持続する。例えば腎臓に障害を持つような腎不全患者では、この低酸素条件下でのエリスロポエチン産生機構が上手く機能せず、赤血球数やヘモグロビン量が低下した貧血（腎性貧血）を呈することが知られている（非特許文献１、２参照）。

【0003】

腎性貧血及び癌の化学療法やＨＩＶ感染患者の薬剤療法に伴う貧血の治療は、現在遺伝子組み換えヒトエリスロポエチン製剤等の赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）により行われている。ＥＳＡは赤血球数、ヘモグロビン量を増加させ貧血に伴う症状を改善することで、患者の生活の質の向上に大きく貢献している。しかしながら一方で現在のＥＳＡはいずれも生物製剤であり高価な注射薬であることから、経口投与可能な貧血治療医薬品が望まれている。

【0004】

また最近の研究では、エリスロポエチンには、虚血に伴う低酸素状態に置かれた心臓や脳等の組織を保護する作用もあることが報告されている。したがって経口投与可能なＥＳＡは、腎性貧血を含む種々の原因で起こる貧血のみならず、さまざまな虚血性疾患にも幅広く適応できる可能性がある（非特許文献３参照）。

【0005】

エリスロポエチンの産生を増加させる因子として低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ、以下、「ＨＩＦ」ともいう）が挙げられる。ＨＩＦは、酸素濃度の変化により分解が調節されるαサブユニットと、恒常的に発現しているβサブユニットからなる転写因子である。ＨＩＦのαサブユニット（ＨＩＦ−α）の分解を調節する因子としてプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ−１, ２, ３）が知られている。正常の酸素圧条件下では、これらプロリルヒドロキシラーゼによりＨＩＦ−αのプロリン残基が水酸化され、速やかにＨＩＦ−αはプロテアソームにより分解される。一方、低酸素条件下では、プロリルヒドロキシラーゼの活性が低下するため、ＨＩＦ−αの分解が抑制され、その結果エリスロポエチンを含むＨＩＦ応答性遺伝子の転写が促進される。従ってプロリルヒドロキシラーゼを阻害することで、ＨＩＦ−αの安定化を促し、エリスロポエチンの産生を増加させることが可能となる（非特許文献１、２、４参照）。

【0006】

本発明の化合物は、これらプロリルヒドロキシラーゼの活性を阻害し、エリスロポエチン量を増加させ、それにより貧血を治療する手段を提供する。また貧血のみならずさまざまな虚血性疾患（脳卒中、心筋梗塞、虚血性腎障害など）や糖尿病性合併症（腎症、網膜症、神経症）等も、本発明化合物の投与による治療や予防あるいは症状の改善や緩和といった利益を得る可能性がある（非特許文献５参照）。

【0007】

一般的なＰＨＤ阻害剤としては、４−ヒドロキシイソキノリン誘導体（特許文献１参照）、５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール誘導体（特許文献２参照）、４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン誘導体（特許文献３参照）、３−ヒドロキシピリジン誘導体（特許文献４参照）、２−オキソ−２，３−ジヒドロインドール誘導体（特許文献５参照）等が報告されているが、本発明の構造を有する化合物は開示されていない。また、６−ヒドロキシ−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン誘導体（特許文献６参照）、４−ヒドロキシ−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン誘導体（特許文献７参照）、５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，３−ジヒドロピリダジン誘導体（特許文献８参照）、６−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−１，３−ジオキシン誘導体（特許文献９参照）、４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｂ］ピリジン誘導体（特許文献１０参照）、４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン誘導体（特許文献１１、１２参照）等が報告されているが、本発明化合物であるＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンは開示されていない。

【0008】

また、医薬品の観点からは、工業的規模における取扱いし易く、保存安定性に優れた物理的特性を有する化合物が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】ＷＯ２００４／１０８６８１号

【特許文献2】ＷＯ２００６／１１４２１３号

【特許文献3】ＷＯ２００７／０３８５７１号

【特許文献4】ＵＳ２００７／０２９９０８６号

【特許文献5】ＷＯ２００８／１４４２６６号

【特許文献6】ＷＯ２００７／１５００１１号

【特許文献7】ＷＯ２００８／０８９０５１号

【特許文献8】ＷＯ２００８／０８９０５２号

【特許文献9】ＷＯ２００９／０４９１１２号

【特許文献10】ＷＯ２００９／１０８４９６号

【特許文献11】ＷＯ２００９／１５８３１５号

【特許文献12】ＷＯ２０１０／０２５０８７号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，２９９，Ｆ１−１３

【非特許文献2】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，２９８，Ｆ１２８７−１２９６

【非特許文献3】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１１，５８９，１２５１−１２５８

【非特許文献4】Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ，２０１０，２０，１２１９−１２４５

【非特許文献5】Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００８，１０，１−９

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の目的は、優れたＰＨＤ２阻害作用を有し、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品及び医薬品原料の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れた物理学的特性を有する新規な化合物の結晶形及びそれらの製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、下記式（Ａ）で表されるＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシン（以下、化合物（Ａ）又は本発明化合物と記すこともある）が、優れたＰＨＤ２阻害作用を有すること、また、上記物理的特性に優れた化合物（Ａ）の結晶及びそれらの製造方法を提供することができることを発見し、本発明を完成するに至った。

【0013】

【化1】

【0014】

以下、本発明の態様を説明する。

【0015】

（１）本発明の１つの態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶（以下、Ａ形結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５３ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１６８℃〜１７２℃にある。

【0016】

（２）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンにアセトン−酢酸エチル混合液を加えて、溶液とした後、結晶化させ、得られた結晶を乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（Ａ形結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５３ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１６８℃〜１７２℃にある。

【0017】

（３）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶（以下、Ｂ形結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６４６ｃｍ^-1、１５６７ｃｍ^-1、１４８３ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【0018】

（４）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンに水−エタノール混合液を加え、溶液とした後、結晶化させ、得られた結晶を乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（Ｂ形結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６４６ｃｍ^-1、１５６７ｃｍ^-1、１４８３ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【0019】

（５）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶（以下、Ｃ形結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５６ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある。

【0020】

（６）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンにメタノールを加えて、溶液とした後、氷冷下にて結晶化させ、得られた結晶を氷冷下にて乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（b）の物性を有する結晶（Ｃ形結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５６ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある。

【0021】

（７）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのナトリウム塩の結晶（以下、ナトリウム塩の結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１５６６ｃｍ^-1、１４７８ｃｍ^-1、１２６６ｃｍ^-1、及び１２４６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１１０℃〜１１４℃にある。

【0022】

（８）本発明の他の態様は、 Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのアセトン懸濁液へ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、作用させた後、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（ナトリウム塩の結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１５６６ｃｍ^-1、１４７８ｃｍ^-1、１２６６ｃｍ^-1、及び１２４６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１１０℃〜１１４℃にある。

【0023】

（９）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのカリウム塩の結晶（以下、カリウム塩の結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６０７ｃｍ^-1、１５４７ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、及び１２８４ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが２３３℃〜２３７℃にある。

【0024】

（１０）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのアセトン懸濁液へ水酸化カリウム水溶液を添加し、作用させた後、溶媒を留去して得られた残渣にアセトンを加え、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（カリウム塩の結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６０７ｃｍ^-1、１５４７ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、及び１２８４ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが２３３℃〜２３７℃にある。

【0025】

（１１）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのカルシウム塩の結晶（以下、カルシウム塩の結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５７５ｃｍ^-1、１４８５ｃｍ^-1、及び１２３６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９６℃〜２００℃にある。

【0026】

（１２）本発明の他の態様は、水とエタノールとの混合液にＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのナトリウム塩を溶解させた後、塩化カルシウム（II）水溶液を添加し、作用させた後、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（カルシウム塩の結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５７５ｃｍ^-1、１４８５ｃｍ^-1、及び１２３６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９６℃〜２００℃にある。

【0027】

（１３）本発明の１つの態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶（以下、Ａ形結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１７ｃｍ^-1、１５４６ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１６８℃〜１７２℃にある。

【0028】

（１４）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンにアセトン−酢酸エチル混合液を加えて、溶液とした後、結晶化させ、得られた結晶を乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（Ａ形結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１７ｃｍ^-1、１５４６ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１６８℃〜１７２℃にある。

【0029】

（１５）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶（以下、Ｂ形結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６４７ｃｍ^-1、１５６０ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２２８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【0030】

（１６）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンに水−エタノール混合液を加え、溶液とした後、結晶化させ、得られた結晶を乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（Ｂ形結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６４７ｃｍ^-1、１５６０ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２２８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【0031】

（１７）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶（以下、Ｃ形結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１４ｃｍ^-1、１５５１ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある。

【0032】

（１８）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンにメタノールを加えて、溶液とした後、氷冷下にて結晶化させ、得られた結晶を氷冷下にて乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（b）の物性を有する結晶（Ｃ形結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１４ｃｍ^-1、１５５１ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある。

【0033】

（１９）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのナトリウム塩の結晶（以下、ナトリウム塩の結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１５５９ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、１４１４ｃｍ^-1、及び１２６４ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１１０℃〜１１４℃にある。

【0034】

（２０）本発明の他の態様は、 Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのアセトン懸濁液へ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、作用させた後、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（ナトリウム塩の結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１５５９ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、１４１４ｃｍ^-1、及び１２６４ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１１０℃〜１１４℃にある。

【0035】

（２１）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのカリウム塩の結晶（以下、カリウム塩の結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６０３ｃｍ^-1、１４７６ｃｍ^-1、１３９１ｃｍ^-1、及び１２８０ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが２３３℃〜２３７℃にある。

【0036】

（２２）本発明の他の態様は、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのアセトン懸濁液へ水酸化カリウム水溶液を添加し、作用させた後、溶媒を留去して得られた残渣にアセトンを加え、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（カリウム塩の結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６０３ｃｍ^-1、１４７６ｃｍ^-1、１３９１ｃｍ^-1、及び１２８０ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが２３３℃〜２３７℃にある。

【0037】

（２３）本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのカルシウム塩の結晶（以下、カルシウム塩の結晶と記すこともある）を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１６ｃｍ^-1、１５７６ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９６℃〜２００℃にある。

【0038】

（２４）本発明の他の態様は、水とエタノールとの混合液にＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンのナトリウム塩を溶解させた後、塩化カルシウム（II）水溶液を添加し、作用させた後、生じた結晶を濾取し、乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶（カルシウム塩の結晶）の製造方法を提供することである。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１６ｃｍ^-1、１５７６ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９６℃〜２００℃にある。

【0039】

（２５）本発明の他の態様としては、
（１）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）、（１５）、（１７）、（１９）、（２１）、（２３）のいずれかに記載の、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシン又はその塩の結晶を有効成分として含有する医薬を提供することである。

【0040】

（２６）本発明の他の態様としては、
ＰＨＤ２阻害剤である（２５）に記載の医薬を提供することである。

【0041】

（２７）本発明の他の態様としては、
ＥＰＯ産生促進剤である（２５）に記載の医薬を提供することである。

【0042】

（２８）本発明の他の態様としては、
貧血の予防薬又は治療薬である（２５）に記載の医薬を提供することである。

【発明の効果】

【0043】

本発明により、優れたＰＨＤ２阻害作用を有するＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶を提供することが可能となった。該結晶は、室温付近の温度で安定な結晶形であり、保存安定性に優れている。また、本発明により、上記結晶を、同一品質で安定して得るための新規な製造方法を提供することができた。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】Ａ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

【図2】Ａ形結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。

【図3】Ａ形結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。

【図4】Ｂ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

【図5】Ｂ形結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。

【図6】Ｂ形結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。

【図7】Ｃ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

【図8】Ｃ形結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。

【図9】ナトリウム塩の結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

【図10】ナトリウム塩の結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。

【図11】ナトリウム塩の結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。

【図12】カリウム塩の結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

【図13】カリウム塩の結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。

【図14】カリウム塩の結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。

【図15】カルシウム塩の結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。

【図16】カルシウム塩の結晶の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。

【図17】カルシウム塩の結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。

【図18】Ａ形結晶の赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）を示す。

【図19】Ｂ形結晶の赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）を示す。

【図20】Ｃ形結晶の赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）を示す。

【図21】ナトリウム塩の結晶の赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）を示す。

【図22】カリウム塩の結晶の赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）を示す。

【図23】カルシウム塩の結晶の赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0045】

以下、本発明を実施するための態様を具体的に説明する。

【0046】

本発明化合物であるＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンは、前記に示した化学構造式を有している。

【0047】

本発明化合物の結晶（以下、「本発明結晶」ということがある）は、上述のように一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れたものである。

【0048】

本発明化合物の結晶は、たとえば、以下の方法により製造することができる。

【0049】

所定の有機溶媒に化合物（Ａ）を加熱溶解させた後、徐冷することにより結晶を析出させ、析出した結晶をろ過、遠心分離等により溶媒と分離した後に乾燥させることにより化合物（Ａ）の結晶を得ることができる。なお、再結晶は、１度のみならず２度以上繰り返してもよいが、通常は１度のみ再結晶を行う。

【0050】

冷却させる時間は、１０秒以上であれば特に制限されないが、通常１０分から２４時間であり、好ましくは３０分から５時間である。

【0051】

また、結晶化に際しては種晶を使用することができる。種晶は、晶析のための溶液が入った容器の壁をスパチュラ（Ｓｐａｔｕｌａ）でこするなど、当業者にとって良く知られた方法で取得しておくことができる。

【0052】

本発明化合物のＡ形結晶について、以下に説明する。

【0053】

化合物（Ａ）のＡ形結晶は、以下の（ａ）〜（ｃ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５３ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１６８℃〜１７２℃にある。

【0054】

また、化合物（Ａ）のＡ形結晶は、以下の（ｄ）の物性も有する。
（ｄ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１７ｃｍ^-1、１５４６ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある。

【0055】

化合物（Ａ）のＡ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図１に、赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は図２に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図３に、赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）は図１８に示した通りである。

【0056】

なお、粉末Ｘ線結晶回折による特徴的なピークは、測定条件によって変動することがある。そのため、本発明化合物の粉末Ｘ線結晶回折のピークについて、誤差が生じたり、明確でなかったりする場合がある。

【0057】

また、同様に、赤外線吸収スペクトルの特徴的なピークも、測定条件によって変動することがある。そのため、本発明化合物の赤外線吸収スペクトルのピークについて、誤差が生じたり、明確でなかったりする場合がある。

【0058】

図１〜３及び１８から分かるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のＡ形結晶は、基本的に純度の高い結晶であることが分かる。結晶の純度は高いものが望ましく、好ましくは他の結晶形のものを実質的に含まないものである。
また、後述の実施例に示されるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のＡ形結晶は、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品及び医薬品原料の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れた物理学的特性を有する。

【0059】

次に、化合物（Ａ）のＡ形結晶の製造方法について説明する。
化合物（Ａ）のＡ形結晶は、たとえば、以下の方法により製造することができる。

【0060】

所定の溶媒に化合物（Ａ）を加熱溶解させた後、徐冷することにより結晶を析出させ、析出した結晶をろ取、遠心分離等により溶媒と分離した後に乾燥させることにより化合物（Ａ）のＡ形結晶を得ることができる。

【0061】

溶媒に溶解前の、原料の化合物（Ａ）は、非晶質又は結晶である。

【0062】

前記所定の溶媒の具体例としては、アセトン及び酢酸エチルこれらの混合溶媒が挙げられる。

【0063】

アセトンと酢酸エチルとの混合溶媒における混合比は適宜に変更することができる。

【0064】

化合物（Ａ）のＡ形結晶の結晶化は、通常０℃〜１００℃で行う。好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0065】

析出した化合物（Ａ）のＡ形結晶は、溶液からろ取、遠心分離などにより溶媒と分離することができる。

【0066】

化合物（Ａ）のＡ形結晶の乾燥は、通常１００℃以下で行う。好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0067】

本発明化合物のＢ形結晶について、以下に説明する。

【0068】

化合物（Ａ）のＢ形結晶は、以下の（ａ）〜（ｃ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６４６ｃｍ^-1、１５６７ｃｍ^-1、１４８３ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９０℃〜１９５℃にある。

【0069】

また、化合物（Ａ）のＢ形結晶は、以下の（ｄ）の物性も有する。
（ｄ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６４７ｃｍ^-1、１５６０ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２２８ｃｍ^-1にある；

【0070】

化合物（Ａ）のＢ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図４に、赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は図５に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図６に、赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）は図１９に示した通りである。

【0071】

また、化合物（Ａ）のＢ形結晶は、融点が、１８８℃〜１９４℃である。

【0072】

図４〜６及び１９から分かるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のＢ形結晶は、基本的に純度の高い結晶であることが分かる。結晶の純度は高いものが望ましく、好ましくは他の結晶形のものを実質的に含まないものである。
また、後述の実施例に示されるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のＢ形結晶は、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品及び医薬品原料の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れた物理学的特性を有する。

【0073】

次に、化合物（Ａ）のＢ形結晶の製造方法について説明する。
化合物（Ａ）のＢ形結晶は、たとえば、以下の方法により製造することができる。

【0074】

所定の溶媒に化合物（Ａ）のＡ形結晶を加熱溶解させた後、徐冷することにより結晶を析出させ、析出した結晶をろ取、遠心分離等により溶媒と分離した後に乾燥させることにより化合物（Ａ）のＢ形結晶を得ることができる。

【0075】

前記所定の溶媒の具体例としては、エタノールなどの低級アルコール、水及びこれらの混合溶媒が挙げられる。

【0076】

低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが挙げられる。好ましくは、エタノールである。

【0077】

水とエタノールとの混合溶媒における混合比は適宜に変更することができる。好ましい水−エタノールの混合比は５：４である。

【0078】

化合物（Ａ）のＢ形結晶の結晶化は、通常０℃〜１００℃で行う。好ましくは、２０℃〜１００℃であり、さらに好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0079】

析出した化合物（Ａ）のＢ形結晶は、溶液からろ取、遠心分離などにより溶媒と分離することができる。

【0080】

化合物（Ａ）のＢ形結晶の乾燥は、通常１００℃以下で行う。好ましくは、２０℃〜１００℃であり、さらに好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0081】

本発明化合物のＣ形結晶について、以下に説明する。

【0082】

化合物（Ａ）のＣ形結晶は、以下の（ａ）〜（ｂ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５５６ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1にある。

【0083】

また、化合物（Ａ）のＣ形結晶は、以下の（ｃ）の物性も有する。
（ｃ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１４ｃｍ^-1、１５５１ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある。

【0084】

化合物（Ａ）のＣ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図７に、赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は図８に、赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）は図２０に示した通りである。

【0085】

図７〜８及び２０から分かるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のＣ形結晶は、基本的に純度の高い結晶であることが分かる。結晶の純度は高いものが望ましく、好ましくは他の結晶形のものを実質的に含まないものである。
また、後述の実施例に示されるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のＣ形結晶は、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品及び医薬品原料の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れた物理学的特性を有する。

【0086】

次に、化合物（Ａ）のＣ形結晶の製造方法について説明する。
化合物（Ａ）のＣ形結晶は、たとえば、以下の方法により製造することができる。

【0087】

所定の溶媒に化合物（Ａ）のＡ形結晶を加熱溶解させた後、徐冷することにより結晶を析出させ、析出した結晶をろ取、遠心分離等により溶媒と分離した後に乾燥させることにより化合物（Ａ）のＣ形結晶を得ることができる。

【0088】

前記所定の溶媒の具体例としては、メタノールなどの低級アルコールが挙げられる。

【0089】

低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが挙げられる。好ましくは、メタノールである。

【0090】

化合物（Ａ）のＣ形結晶の結晶化は、通常氷冷下で行う。

【0091】

析出した化合物（Ａ）のＣ形結晶は、溶液からろ取、遠心分離などにより溶媒と分離
することができる。

【0092】

化合物（Ａ）のＣ形結晶の乾燥は、通常氷冷下で行う。

【0093】

本発明化合物のナトリウム塩の結晶について、以下に説明する。

【0094】

化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶は、以下の（ａ）〜（ｃ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１５６６ｃｍ^-1、１４７８ｃｍ^-1、１２６６ｃｍ^-1、及び１２４６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１１０℃〜１１４℃にある。

【0095】

また、化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶は、以下の（ｄ）の物性も有する。
（ｄ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１５５９ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、１４１４ｃｍ^-1、及び１２６４ｃｍ^-1にある。

【0096】

化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図９に、赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は図１０に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図１１に、赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）は図２１に示した通りである。

【0097】

図９〜１１及び２１から分かるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶は、基本的に純度の高い結晶であることが分かる。結晶の純度は高いものが望ましく、好ましくは他の結晶形のものを実質的に含まないものである。
また、後述の実施例に示されるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶は、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品及び医薬品原料の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れた物理学的特性を有する。

【0098】

次に、化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶の製造方法について説明する。
化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶は、たとえば、以下の方法により製造することができる。

【0099】

所定の溶媒に化合物（Ａ）のＡ形結晶を溶解又は懸濁させた後、水酸化ナトリウム水溶液を添加し作用させることにより結晶を析出させ、析出した結晶をろ取、遠心分離等により溶媒と分離した後に乾燥させることにより化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶を得ることができる。

【0100】

前記所定の溶媒の具体例としては、アセトン、水及びこれらの混合溶媒が挙げられる。

【0101】

アセトンと水との混合溶媒における混合比は適宜に変更することができる。

【0102】

化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶の結晶化は、通常０〜１００℃で行う。好ましくは、０℃〜３０℃であり、さらに好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0103】

析出した化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶は、溶液からろ取、遠心分離などにより溶媒と分離することができる。

【0104】

化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶の乾燥は、通常１００℃以下で行う。好ましくは、２０℃〜４０℃であり、さらに好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0105】

本発明化合物のカリウム塩の結晶について、以下に説明する。

【0106】

化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶は、以下の（ａ）〜（ｃ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６０７ｃｍ^-1、１５４７ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、及び１２８４ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが２３３℃〜２３７℃にある。

【0107】

また、化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶は、以下の（ｄ）の物性も有する。
（ｄ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６０３ｃｍ^-1、１４７６ｃｍ^-1、１３９１ｃｍ^-1、及び１２８０ｃｍ^-1にある。

【0108】

化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図１２に、赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は図１３に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図１４に、赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）は図２２に示した通りである。

【0109】

図１２〜１４及び２２から分かるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶は、基本的に純度の高い結晶であることが分かる。結晶の純度は高いものが望ましく、好ましくは他の結晶形のものを実質的に含まないものである。
また、後述の実施例に示されるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶は、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品及び医薬品原料の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れた物理学的特性を有する。

【0110】

次に、化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶の製造方法について説明する。
化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶は、たとえば、以下の方法により製造することができる。

【0111】

第１の所定の溶媒に化合物（Ａ）のＡ形結晶を溶解又は懸濁させ、水酸化カリウム水溶液を添加し作用させた後、溶媒を留去して得られた残渣に第２の所定の溶媒を加えることにより結晶を析出させ、析出した結晶をろ取、遠心分離等により溶媒と分離した後に乾燥させることにより化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶を得ることができる。

【0112】

前記第１の所定の溶媒の具体例としては、アセトン、水及びこれらの混合溶媒が挙げられる。

【0113】

前記第２の所定の溶媒の具体例としては、アセトン、水及びこれらの混合溶媒が挙げられる。

【0114】

前記第２の所定の溶媒として使用できるアセトンと水との混合溶媒について、混合比は適宜に変更することができる。

【0115】

化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶の結晶化は、通常０〜１００℃で行う。好ましくは、０℃〜３０℃であり、さらに好ましくは、０℃〜５℃である。

【0116】

析出した化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶は、溶液からろ取、遠心分離などにより溶媒と分離することができる。

【0117】

化合物（Ａ）のカリウム塩の結晶の乾燥は、通常１００℃以下で行う。好ましくは、２０℃〜４０℃であり、さらに好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0118】

本発明化合物のカルシウム塩の結晶について、以下に説明する。

【0119】

化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶は、以下の（ａ）〜（ｃ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）において、特性吸収帯が、１６２２ｃｍ^-1、１５７５ｃｍ^-1、１４８５ｃｍ^-1、及び１２３６ｃｍ^-1にある；並びに
（ｃ）示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）において、吸熱ピークが１９６℃〜２００℃にある。

【0120】

また、化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶は、以下の（ｄ）の物性も有する。
（ｄ）赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）において、特性吸収帯が、１６１６ｃｍ^-1、１５７６ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1にある。

【0121】

化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図１５に、赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は図１６に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図１７に、赤外吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）は図２３に示した通りである。

【0122】

図１５〜１７及び２３から分かるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶は、基本的に純度の高い結晶であることが分かる。結晶の純度は高いものが望ましく、好ましくは他の結晶形のものを実質的に含まないものである。
また、後述の実施例に示されるように、本発明の製造方法により製造される化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶は、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品及び医薬品原料の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れた物理学的特性を有する。

【0123】

次に、化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶の製造方法について説明する。
化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶は、たとえば、以下の方法により製造することができる。

【0124】

所定の溶媒に化合物（Ａ）のナトリウム塩の結晶を溶解又は縣濁させ、塩化カルシウム（II）水溶液を添加し作用させることにより結晶を析出させ、析出した結晶をろ取、遠心分離等により溶媒と分離した後に乾燥させることにより化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶を得ることができる。

【0125】

前記所定の溶媒の具体例としては、エタノールなどの低級アルコール、水及びこれらの混合溶媒が挙げられる。

【0126】

低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２-プロパノールなどが挙げられる。好ましくは、エタノールである。

【0127】

エタノールと水との混合溶媒における混合比は適宜に変更することができる。

【0128】

化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶の結晶化は、通常０〜１００℃で行う。好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0129】

析出した化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶は、溶液からろ取、遠心分離などにより溶媒と分離することができる。

【0130】

化合物（Ａ）のカルシウム塩の結晶の乾燥は、通常１００℃以下で行う。好ましくは、２０℃〜４０℃であり、さらに好ましくは、２０℃〜３０℃である。

【0131】

本発明の化合物は、互変異性を有し、種々の互変異性体が存在する。本発明の化合物は、それらの異性体、及びそれらの異性体を任意の割合で含んだ混合物も含む。

【0132】

ＰＨＤ２（プロリルヒドロキシラーゼドメイン−２）とは、プロリルヒドロキシラーゼファミリーに属するタンパク質である。ＰＨＤ２は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）プロリルヒドロキシラーゼ活性を有する酵素であり、特に、通常の酸素状態においてＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−３α分子（以下一括してＨＩＦ−α分子と呼ぶ）の特定のプロリン残基を水酸化（ヒドロキシ化）する作用を有する。

【0133】

ＨＩＦ−α因子は、造血因子であるエリスロポエチンの転写因子である。ＰＨＤ２はＨＩＦを水酸化することで分解へと促し、過剰なエリスロポエチン産生を抑制している。本発明化合物は、前述の通り優れたＰＨＤ２阻害作用を有する。したがって、ＰＨＤ２の阻害によって、ＨＩＦ−１α分子の特定のプロリン残基を水酸化することを防ぎ、ＨＩＦ−α分子の安定化に寄与する。これによって体内のＥＰＯの産生を促し、貧血又は貧血に関連する疾患を予防又は治療することができる。

【0134】

よって、本発明化合物は、ＰＨＤ２阻害剤、ＥＰＯ産生促進剤、又は貧血若しくは貧血に関連する疾患の予防又は治療剤の有効成分として用いることができる。

【0135】

ここで、「貧血」には、腎臓の機能低下によりＥＰＯ産生能が落ちることで発症する「腎性貧血」、鉄代謝の不全による「鉄欠乏性貧血」の他、特定の原因によるその他の型の貧血が含まれる。

【0136】

ここで、「貧血に関連する疾患」とは、慢性腎臓病、心不全などが挙げられる。

【0137】

また本発明化合物により、ＰＨＤ２を阻害しＨＩＦ−αの安定化を促すことで、虚血性疾患の改善、炎症性疾患の改善が期待できる。またＨＩＦ−α安定化によりＶＥＧＦなど血管新生を促す因子の発現増加のほか、発現されたＥＰＯによる臓器保護作用などが期待できる。ここで言う臓器とは、腎臓、すい臓、脳などが含まれる。

【0138】

本発明化合物は、単独又は薬学的あるいは薬剤学的に許容される担体又は希釈剤と共に投与することができる。

【0139】

本発明の化合物を医薬として用いるためには、固体組成物、液体組成物及びその他の組成物のいずれの形態でもよく、必要に応じて最適のものが選択される。本発明の医薬は、本発明の化合物に薬学的に許容されるキャリヤーを配合して製造することができる。具体的には、常用の賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、糖衣剤、ｐＨ調整剤、溶解剤又は水性若しくは非水性溶媒などを添加し、常用の製剤技術によって、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤等に調製する事ができる。賦形剤、増量剤としては、たとえば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコール等やその他常用されるものを挙げることができる。

【0140】

また、本発明化合物は、α、β若しくはγ−シクロデキストリン又はメチル化シクロデキストリン等と包接化合物を形成させて製剤化することができる。

【0141】

本発明化合物をＰＨＤ２阻害剤などとして使用する場合は、本発明化合物をそのまま経口投与、又は非経口投与してもよい。また、本発明化合物を有効成分として含む剤として経口投与、又は非経口投与してもよい。非経口投与としては、静脈内投与、経鼻投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与があげられる。

【0142】

本発明化合物の投与量は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状などによっても異なるが、例えば、成人の貧血を呈した患者に経口投与する場合、通常１回量として０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜２００ｍｇであり、この量を、１日に１回〜３回、又は２日〜３日に１回投与するのが望ましい。
なお、本発明化合物は、医薬品として望ましい性質を有している。例えば、エリスロポエチンの過剰な産生を回避しうる性質が挙げられる。

【0143】

本発明化合物のＰＨＤ２阻害活性を評価するには、例えば、本明細書の試験例に記載した方法など、公知の手法に従って行うことができる。

【実施例】

【0144】

次に、以下に示す参考例、実施例及び試験例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではなく、また、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。

【0145】

本明細書中で用いられている略語は下記の意味を示す。
ｓ ： シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）
ｄ ： ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）
ｔ ： トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）
ｑ ： クァルテット（ｑｕａｒｔｅｔ）
ｑｕｉｎ ： クィンテット（ｑｕｉｎｔｅｔ）
ｓｅｐｔ ： セプテット（ｓｅｐｔｅｔ）
ｄｄ ： ダブルダブレット（ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ）
ｄｔ ： ダブルトリプレット（ｄｏｕｂｌｅ ｔｒｉｐｌｅｔ）
ｔｄ ： トリプレットダブレット（ｔｒｉｐｌｅｔ ｄｏｕｂｌｅｔ）
ｍ ： マルチプレット（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ）
ｂｒ ： ブロード（ｂｒｏａｄ）
Ｊ ： カップリング定数（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）
Ｈｚ ： ヘルツ（Ｈｅｒｔｚ）
ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ−ｄ ： 重クロロホルム
ＤＭＳＯ−ｄ_６： 重ジメチルスルホキシド
ＭＥＴＨＡＮＯＬ−ｄ_４ ： 重メタノール
ｐｏｓｉ ： ｐｏｓｉｔｉｖｅ（ｍｏｄｅ）
ｎｅｇａ ： ｎｅｇａｔｉｖｅ（ｍｏｄｅ）

【0146】

^１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴スペクトル）は下記のフーリエ変換型ＮＭＲで測定した。
２００ＭＨｚ： Ｇｅｍｉｎｉ２０００ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
３００ＭＨｚ： Ｉｎｏｖａ３００ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
６００ＭＨｚ： ＪＮＭ−ＥＣＡ６００ （ＪＥＯＬ）
解析にはＡＣＤ／ＳｐｅｃＭａｎａｇｅｒ ｖｅｒ．１２．０１（商品名）、ＡＣＤ／Ｓｐｅｃｔｒｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ^ＴＭなどを用いた。水酸基やアミノ基などのプロトンが非常に緩やかなピークについては記載していない。

【0147】

ＭＳ（マススペクトル）は以下の装置にて測定した。
ＰｌａｔｆｏｒｍＬＣ （Ｗａｔｅｒｓ）
ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ （Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ （Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
ＧＣＴ （Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）
Ａｇｉｌｅｎｔ６１３０ （Ａｇｉｌｅｎｔ）
ＬＣＱ Ｄｅｃａ ＸＰ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
イオン化法としては、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化）法、ＥＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、電子イオン化）法、又は、ＥＳＩ及びＡＰＣＩ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、大気圧化学イオン化）法とのデュアルイオン化法を用いた。データは実測値（ｆｏｕｎｄ）を記載した。通常、分子イオンピークが観測されるが、水酸基（−ＯＨ）を有する化合物の場合、フラグメントピークとしてＨ_２Ｏが脱離したピークが観測されることもある。塩の場合は、通常、フリー体の分子イオンピーク若しくはフラグメントイオンピークが観測される。

【0148】

分取高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）による精製は以下の条件により行った。ただし、塩基性官能基を有する化合物の場合、本操作でトリフルオロ酢酸を用いたときには、フリー体を得るための中和操作等を行う場合がある。
機械：Ｇｉｌｓｏｎ社 ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅ^ＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ^ＴＭ ５μｍ ３０ｘ５０ｍｍ
流速：４０ｍＬ／ｍｉｎ、検出法：ＵＶ ２５４ｎｍ
溶媒：Ａ液；０．１％トリフルオロ酢酸含有水、Ｂ液；０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル
グラジエント：０分（Ａ液／Ｂ液＝９０／１０）、２分（Ａ液／Ｂ液＝９０／１０）、１２分（Ａ液／Ｂ液＝２０／８０）、１３．５分（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）、１５分（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）

【0149】

Ｘ線結晶構造解析にはＸＲ−ＡＸＩＳ ＲＡＰＩＤ II（Ｒｉｇａｋｕ）装置を用いた。

【0150】

赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にて測定した。

【0151】

赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法）は、ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ−１（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）にて測定した。

【0152】

示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｓ Ｅｖｏ ＴＧ８１２０（Ｒｉｇａｋｕ）にて測定した。

【0153】

フェーズセパレーターは、バイオタージ社のＩＳＯＬＵＴＥ（登録商標） Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを用いた。

【0154】

マイクロウェーブ反応装置はＢｉｏｔａｇｅ社Ｉｎｉｔｉａｔｏｒを用いた。

【0155】

化合物の命名には、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ （ＡＣＤ／Ｌａｂｓ １２．０１， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．）等のソフトを使用している場合がある。

【0156】

元素分析は以下の装置にて測定した。
２４００II （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
ｖａｒｉｏ ＭＩＣＲＯ ｃｕｂｅ （ｅｌｅｍｅｎｔａｒ）
ＭＴ−６ （ヤナコ分析工業）

【0157】

イオンクロマト分析は以下の装置にて測定した。
ＤＸ５００ （ダイオネクス）
ＸＳ１００ （三菱化学）
ＩＣＳ３０００ （ダイオネクス）

【0158】

融点は以下の装置にて測定した。
ＭＰ−Ｊ３ （ヤナコ機器開発研究所）

【0159】

本明細書では、室温とは２０℃〜３０℃を指す。
氷冷下とは０℃〜５℃を指す。

【0160】

参考例１
６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−カルバルデヒド

【0161】

【化2】

４−クロロフェノール（２７７ｇ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．００Ｌ）溶液へ炭酸カリウム（３２８ｇ）を加え、室温にて攪拌した。反応系へ６−ブロモニコチンアルデヒド（４０１ｇ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１６０ｍＬ）を加え、内温９９℃にて２．５時間攪拌した。室温まで冷却した後、反応液を水（３．２４Ｌ）へ加えた。さらに水（２．１６Ｌ）を加えた後、室温にて１７時間攪拌した。生じた析出物を濾取し、減圧下乾燥して表題化合物を茶色固体（４５１ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 7.02 - 7.16 (m, 3 H) 7.35 - 7.46 (m, 2 H) 8.21 (dd, J=8.5, 2.3 Hz, 1 H) 8.61 (d, J=2.3 Hz, 1 H) 9.99 (s, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 234[M+H]⁺.
参考例２
エチル Ｎ−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−β−アラニネート

【0162】

【化3】

６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−カルバルデヒド（２９０ｇ）、β-アラニンエチルエステル塩酸塩（２１０ｇ）及びクロロホルム（１．２４Ｌ）の混合物へ氷冷下、酢酸（８２．０ｇ）及びトリエチルアミン（１３８ｇ）を順次加えた後、３０分攪拌した。反応液へナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（３９５ｇ）を加え、室温にて３時間攪拌した後、水（３．００Ｌ）を加えた。炭酸水素ナトリウム（４１７ｇ）を加えた後、１時間攪拌した。水層を分離した後、クロロホルムで抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。乾燥剤を濾別した後、濾液を減圧下濃縮した。得られた残渣（４４６ｇ）へ酢酸エチル（１．７８Ｌ）及びＮＨシリカゲル（４４７ｇ）を加え、１．５時間攪拌した。沈殿物をセライト（登録商標）濾過にて濾別し、濾液を減圧下濃縮して表題化合物を茶色油状物（４０３ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.20 - 1.30 (m, 3 H) 2.52 (t, J=6.4 Hz, 2 H) 2.84 - 2.92 (m, 2 H) 3.76 (s, 2 H) 4.07 - 4.20 (m, 2 H) 6.83 - 6.93 (m, 1 H) 7.01 - 7.11 (m, 2 H) 7.29 - 7.39 (m, 2 H) 7.61 - 7.75 (m, 1 H) 7.99 - 8.13 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 335[M+H]⁺.

【0163】

なお、表題化合物のマレイン酸塩を、以下に示す手法で得ることができる。

【0164】

【化4】

参考例２で得られたエチル Ｎ−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−β−アラニネート（３００ｍｇ）を酢酸エチル（４．５ｍＬ）に溶解し、マレイン酸（１０４ｍｇ）のエタノール（０．４５ｍＬ）溶液を加えた。エタノール（０．４５ｍＬ）及び酢酸エチル（１．５ｍＬ）を加えて室温にて１８時間攪拌した。不溶物を濾取し、エチル Ｎ−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−β−アラニネートのモノマレイン酸塩を無色固体（３５７ｍｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.20（t，J=7.2 Hz，3 H）2.72（t，J=7.1 Hz，2 H）3.16（t，J=7.1 Hz，2 H）3.33（br s，1 H）4.11（q，J=7.2 Hz，2 H）4.18（s，2 H）6.02（s，2 H）7.13 - 7.22（m，3 H）7.45 - 7.53（m，2 H）7.97（dd，J=8.6，2.4 Hz，1 H）8.22（d，J=2.4 Hz，1 H）8.66（br s，2 H）.
MS ESI/APCI Dual posi : m/z 335[(M-C₄H₄O₄)+H]⁺.

【0165】

得られた表題化合物のマレイン酸塩は、塩基等を作用させてフリー体にして、参考例３の出発物質として用いることができる。
参考例３
エチル Ｎ−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−Ｎ−（３−エトキシ−３−オキソプロパノイル）−β−アラニネート

【0166】

【化5】

エチル Ｎ−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−β−アラニネート（４０３ｇ）の酢酸エチル（４．０２Ｌ）溶液へ、氷冷下トリエチルアミン（２４７ｇ）を加え、続いてエチルマロニルクロリドを３回に分けて（２１９ｇ、３６．３ｇ、３９．２ｇ）加えた。１時間攪拌した後、反応液へ水（２．００Ｌ）を加え、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を９％炭酸水素ナトリウム水溶液及び１０％食塩水で順次洗浄した。不溶物をセライト（登録商標）濾過にて濾別した後、濾液を減圧下濃縮して表題化合物を含む混合物を茶色油状物（５９０ｇ）として得た。
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 449[M+H]⁺.
参考例４
ナトリウム １−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−３−（エトキシカルボニル）−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−オレート

【0167】

【化6】

参考例３で得られた混合物（５９０ｇ）のエタノール（１．２０Ｌ）溶液へ、ナトリウムエトキシド（約２０％、エタノール溶液、８２０ｇ）を加え、室温にて３時間攪拌した。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（４．２６Ｌ）を加えた後、１３時間攪拌した。沈殿物を濾取し、表題化合物を淡黄色固体（３１３ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.02 - 1.20 (m, 3 H) 2.07 (t, J=6.5 Hz, 2 H) 3.02 - 3.18 (m, 2 H) 3.94 (q, J=7.1 Hz, 2 H) 4.43 (s, 2 H) 7.01 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.10 - 7.19 (m, 2 H) 7.40 - 7.47 (m, 2 H) 7.74 (dd, J=8.4, 2.5 Hz, 1 H) 8.04 (d, J=2.2 Hz, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 403[M+H]⁺.
参考例５
ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシネート

【0168】

【化7】

ナトリウム １−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−３−（エトキシカルボニル）−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−オレート（１９１ｇ）の１，２−ジメトキシエタン（１．５０Ｌ）懸濁液へ、グリシン ｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩（９０．４ｇ）を加え、１時間還流した。室温まで冷却した後、シリカゲルパッドにて不溶物を濾別し、濾液を減圧下濃縮した。得られた残渣をｎ−ヘキサン−酢酸エチル混合液にて粉末化し、析出物を濾取して表題化合物を無色固体（１５４ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.49 (s, 9 H) 2.47 - 2.70 (m, 2 H) 3.25 - 3.41 (m, 2 H) 3.99 - 4.07 (m, 2 H) 4.56 (s, 2 H) 6.86 - 6.97 (m, 1 H) 7.02 - 7.13 (m, 2 H) 7.31 - 7.39 (m, 2 H) 7.64 - 7.74 (m, 1 H) 8.03 - 8.11 (m, 1 H) 10.06 - 10.52 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 488[M+H]⁺.
参考例６
エチル Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシネート

【0169】

【化8】

参考例４で得られたナトリウム １−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−３−（エトキシカルボニル）−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−オレート（４５０ｇ）、グリシンエチル塩酸塩（１７８ｇ）及び１，２−ジメトキシエタン（３．５３Ｌ）の混合物へ、トリエチルアミン（１０８ｇ）を加え、内温７９℃にて１時間攪拌した。室温まで冷却した後、１０％塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を減圧下濃縮し、得られた濃縮物へ酢酸エチル（２．１９Ｌ）及びシリカゲル（５６７ｇ）を加え、１時間攪拌した。沈殿物をセライト（登録商標）濾過にて濾別し、濾液を減圧下濃縮した。得られた濃縮物をエタノールで再結晶し、表題化合物を無色固体（３９３ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.30 (t, J=7.1 Hz, 3 H) 2.49 - 2.69 (m, 2 H) 3.29 - 3.42 (m, 2 H) 4.06 - 4.15 (m, 2 H) 4.24 (q, J=7.1 Hz, 2 H) 4.53 - 4.59 (m, 2 H) 6.88 - 6.97 (m, 1 H) 7.03 - 7.13 (m, 2 H) 7.30 - 7.40 (m, 2 H) 7.70 (dd, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 8.04 - 8.11 (m, 1 H) 10.08 - 10.50 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 460[M+H]⁺.
参考例７
メチル Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシネート

【0170】

【化9】

参考例４で得られた１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−３−（エトキシカルボニル）−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−オレート（１．６３ｇ）に対して、グリシンエチル塩酸塩の代わりにグリシンメチル塩酸塩（０．５７８ｇ）を用いて、参考例６と同様な反応を行い、表題化合物を無色固体（０．９４０ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 2.49 - 2.71 (m, 2 H) 3.29 - 3.41 (m, 2 H) 3.78 (s, 3 H) 4.07 - 4.19 (m, 2 H) 4.52 - 4.59 (m, 2 H) 6.86 - 6.97 (m, 1 H) 7.03 - 7.11 (m, 2 H) 7.31 - 7.40 (m, 2 H) 7.70 (dd, J=8.4, 2.5 Hz, 1 H) 8.05 - 8.12 (m, 1 H) 10.06 - 10.50 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 446[M+H]⁺.
実施例１
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ａ形結晶）

【0171】

【化10】

ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシネート（１７５ｇ）へ４ｍｏｌ／Ｌ塩化水素−１，４−ジオキサン溶液（１．５０Ｌ）を加え、室温にて１４時間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、得られた残渣へアセトンを加え、懸濁し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣へ再度アセトンを加え、沈殿物を濾取した。得られた濾取物へアセトン及び４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（３５９ｍＬ）を順次加えた。３０分攪拌した後、沈殿物を濾取した。得られた濾取物へ、２０％クエン酸水溶液（１．０４Ｌ）及び酢酸エチル（１．２０Ｌ）を順次加え、１５時間攪拌した。酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層を水及び飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。乾燥剤を濾別した後、濾液を減圧下濃縮した。得られた残渣をアセトン−酢酸エチル混合液にて再結晶し、析出物を濾取した。得られた固体をペンタン−酢酸エチル混合液にて１時間懸濁攪拌した。沈殿物を濾取し、表題化合物を無色固体（１３９ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.41 - 2.79 (m, 2 H) 3.34 - 3.54 (m, 2 H) 3.90 - 4.10 (m, 2 H) 4.44 - 4.65 (m, 2 H) 7.05 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.12 - 7.21 (m, 2 H) 7.40 - 7.50 (m, 2 H) 7.79 (dd, J=8.4, 2.5 Hz, 1 H) 8.10 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 9.90 - 10.27 (m, 1 H) 12.77 - 12.95 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 432[M+H]⁺.

【0172】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、Ａ形結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．６度、及び２３．４度にピークが認められた。
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）については、１７１℃に吸熱ピークが認められた。
実施例２
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ａ形結晶）

【0173】

【化11】

エチル Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシネート（５．００ｇ）のエタノール（１０．０ｍＬ）懸濁液へ水（１０．０ｍＬ）を加えた。反応液へ２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１１．４ｍＬ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応液へ２ｍｏｌ／Ｌクエン酸水溶液（１１．４ｍＬ）を加え、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取し、濾取物をエタノール−水混合溶液（１：３）及び水にて順次洗浄し、表題化合物を無色固体（４．５７ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.40 - 2.77 (m, 2 H) 3.30 - 3.52 (m, 2 H) 3.92 - 4.11 (m, 2 H) 4.45 - 4.64 (m, 2 H) 7.05 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.12 - 7.21 (m, 2 H) 7.39 - 7.50 (m, 2 H) 7.73 - 7.86 (m, 1 H) 8.06 - 8.16 (m, 1 H) 9.90 - 10.29 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 432[M+H]⁺.

【0174】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン、赤外線吸収スペクトル及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、Ａ形結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝５．１度、１３．７度、２０．７度、及び２３．４度にピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）については、１６２２ｃｍ^-1、１５５３ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）については、１６９℃に吸熱ピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）については、１６１７ｃｍ^-1、１５４６ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
実施例３
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ｂ形結晶）

【0175】

【化12】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ａ形結晶）（３０ｍｇ）へ水−エタノール混合液（５：４）を加え、８０℃水浴で加熱し溶液とした後、室温にて終夜静置した。窒素気流下にて溶媒を留去し、表題化合物を無色固体（３０ｍｇ）として得た。

【0176】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、Ｂ形結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝４．２度、７．２度、１２．５度、及び１５．０度にピークが認められた。
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）については、１９１℃に吸熱ピークが認められた。

【0177】

また、Ｂ形結晶の融点を測定したところ、１９１℃であった。

【0178】

なお、表題化合物は次の手法でも得ることができる。
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ａ形結晶）（１３０ｇ）、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ｂ形結晶）（６．９５ｇ）及びエタノール（２．７４Ｌ）との混合物を室温下１３２時間攪拌した。沈殿物を濾取、減圧乾燥し、表題化合物を無色固体（１３４ｇ）として得た。

【0179】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン、赤外線吸収スペクトル及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、Ｂ形結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝４．１度、７．２度、１２．４度、及び１５．０度にピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）については、１６４６ｃｍ^-1、１５６７ｃｍ^-1、１４８３ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）については、１９４℃に吸熱ピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）については、１６４７ｃｍ^-1、１５６０ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２２８ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
実施例４
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ｃ形結晶）

【0180】

【化13】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ａ形結晶）（３０ｍｇ）へメタノールを加え、８０℃水浴で加熱し溶液とした後、終夜氷冷攪拌した。氷冷下窒素気流下にて溶媒を留去し、表題化合物を無色固体（３０ｍｇ）として得た。

【0181】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン及び赤外線吸収スペクトルを測定したところ、Ｃ形結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝１５．４度、１８．４度、２１．８度、及び２４．７度にピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）については、１６２２ｃｍ^-1、１５５６ｃｍ^-1、１４８２ｃｍ^-1、及び１２３８ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）については、１６１４ｃｍ^-1、１５５１ｃｍ^-1、１３９８ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
実施例５
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシンナトリウム（ナトリウム塩の結晶）

【0182】

【化14】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ａ形結晶）（２９．１ｇ）のアセトン（１Ｌ）懸濁液へ１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（６７．５ｍＬ）を加え、室温にて１３時間攪拌した。生じた析出物を濾取し、表題化合物を無色固体（２９．７ｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.40 - 2.60 (m, 2 H) 3.34 (t, J=6.9 Hz, 2 H) 3.47 (d, J=4.4 Hz, 2 H) 4.52 (s, 2 H) 7.04 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 7.12 - 7.21 (m, 2 H) 7.40 - 7.49 (m, 2 H) 7.79 (dd, J=8.4, 2.3 Hz, 1 H) 8.09 (d, J=2.3 Hz, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 432[M+H]⁺.
MS ESI/APCI Dual nega: m/z 430[M-H]^-.
元素分析：C₂₀H₁₉ClN₃NaO₇の理論値：C,50.91, H,4.06, N,8.91. 実測値：C,50.75, H,4.07, N,8.86.
イオンクロマトグラフィー：C₂₀H₁₉ClN₃NaO₇の理論値：Cl,7.51, Na,4.87. 実測値：Cl,7.43, Na,4.90.

【0183】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン、赤外線吸収スペクトル及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、ナトリウム塩の結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝１４．１度、１７．３度、１９．１度、及び２６．９度にピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）については、１５６６ｃｍ^-1、１４７８ｃｍ^-1、１２６６ｃｍ^-1、及び１２４６ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）については、１１２℃に吸熱ピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）については、１５５９ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、１４１４ｃｍ^-1、及び１２６４ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
実施例６
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシンカリウム（カリウム塩の結晶）

【0184】

【化15】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシン（Ａ形結晶）（１．００ｇ）のアセトン（２５．０ｍＬ）懸濁液へ１ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウム水溶液（２．３２ｍＬ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。減圧下溶媒を留去した後、アセトン（２５．０ｍＬ）を加えた。室温にて３０分、続いて氷冷下３０分攪拌した後、沈殿物を濾取し、表題化合物を無色固体（９５９ｍｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.43 - 2.62 (m, 2 H) 3.35 (t, J=7.1 Hz, 2 H) 3.42 (d, J=4.4 Hz, 2 H) 4.53 (s, 2 H) 7.05 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.13 - 7.22 (m, 2 H) 7.40 - 7.49 (m, 2 H) 7.79 (dd, J=8.4, 2.5 Hz, 1 H) 8.09 (d, J=2.3 Hz, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 432[M+H]⁺.
元素分析：C₂₀H_17.6ClKN₃O_6.3の理論値：C,50.54, H,3.37, N,8.84. 実測値：C,50.59, H,3.70, N,8.85.
イオンクロマトグラフィー：C₂₀H_17.6ClKN₃O_6.3の理論値：Cl,7.46, K,8.23. 実測値：Cl,7.38, K,8.39.

【0185】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン、赤外線吸収スペクトル及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、カリウム塩の結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝１２．８度、１４．５度、２０．０度、及び２５．６度にピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）については、１６０７ｃｍ^-1、１５４７ｃｍ^-1、１４７７ｃｍ^-1、及び１２８４ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）については、２３５℃に吸熱ピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）については、１６０３ｃｍ^-1、１４７６ｃｍ^-1、１３９１ｃｍ^-1、及び１２８０ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
実施例７
Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシンカルシウム（カルシウム塩の結晶）

【0186】

【化16】

Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）ピリジン−３−イル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）カルボニル］グリシンナトリウム（ナトリウム塩の結晶）（８００ｍｇ）のエタノール懸濁液（１２．５ｍＬ）へ、水（１２．０ｍＬ）を加えた。塩化カルシウム（II）（純度９０％、１０５ｍｇ）の水溶液（２．００ｍＬ）を加え、室温にて１６時間攪拌した。水（４．００ｍＬ）及びエタノール（２．００ｍＬ）を加え、２時間攪拌した。沈殿物を濾取、減圧下乾燥し、表題化合物を無色固体（７５４ｍｇ）として得た。
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.35 - 3.70 (m, 4 H) 3.72 - 3.85 (m, 2 H) 4.51 (s, 2 H) 7.02 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.11 - 7.20 (m, 2 H) 7.40 - 7.49 (m, 2 H) 7.79 (dd, J=8.5, 2.3 Hz, 1 H) 8.10 (d, J=2.0 Hz, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi: m/z 432[M+H]⁺.
元素分析：C₂₀H₁₉Ca_0.5ClN₃O₇の理論値：C,51.23, H,4.08, N,8.96. 実測値：C,51.23, H,4.12, N,8.88.
イオンクロマトグラフィー：C₂₀H₁₉Ca_0.5ClN₃O₇の理論値：Cl,7.56, Ca,4.27. 実測値：Cl,7.31, Ca,4.26.

【0187】

上記固体の粉末Ｘ線回折パターン、赤外線吸収スペクトル及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、カルシウム塩の結晶であった。
粉末Ｘ線回折パターンについては、２θ＝４．９度、９．８度、１２．４度、及び２５．８度にピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）については、１６２２ｃｍ^-1、１５７５ｃｍ^-1、１４８５ｃｍ^-1、及び１２３６ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）については、１９８℃に吸熱ピークが認められた。
赤外線吸収スペクトル（ＡＴＲ法、クリスタル：ダイヤモンド）については、１６１６ｃｍ^-1、１５７６ｃｍ^-1、１４８１ｃｍ^-1、及び１２３５ｃｍ^-1に特性吸収帯が認められた。

【0188】

本発明の化合物のＰＨＤ２に対する阻害活性を、以下に示す試験例１及び２に従って測定した。
試験例１

【0189】

（１）ヒトＰＨＤ２の発現・調製
ヒトＰＨＤ２の発現は、昆虫細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞）にて行った。ヒトＰＨＤ２登録配列（ＮＭ＿０２２０５１）をｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、配列を確認した。当該ベクターをＳｆ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、ヒトＰＨＤ２バキュロウィルスを取得した。この組換えウィルスをＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に感染させ、２７℃で７２時間培養後、各種プロテアーゼ阻害剤を含んだ細胞溶解溶液を加え破砕懸濁した。破砕懸濁溶液を４℃、１００，０００×ｇ，３０分間遠心し、上清を回収して細胞ライセートとした。ウエスタンブロット解析により、ＰＨＤ２バキュロウィルス感染細胞ライセートにのみ、ヒトＰＨＤ２蛋白質の発現を確認した。

【0190】

（２）ヒトＰＨＤ２阻害活性の測定
ヒトＰＨＤ２酵素活性は、ＨＩＦ−１αの配列を基にした１９残基の部分ペプチドを基質として測定した。具体的には、ペプチド中に含まれるプロリン残基をＰＨＤ２酵素が水酸化する時に同時に起こる２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅからｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄへの変換反応を利用した。すなわち、［^１４Ｃ］−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅを反応系に添加して酵素反応を開始し、反応後に残存している［^１４Ｃ］−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅを２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（ＤＮＰＨ）と結合させ沈殿物としてフィルターで除去した。その後、生成した［^１４Ｃ］− ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄの放射カウントを測定した。
酵素及び基質は、６．６７ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１３．３μＭ硫酸鉄、２．６７ｍＭアスコルビン酸、１．３３ｍＭ ＤＴＴを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、試験化合物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。
試験化合物、ＨＩＦ−１αペプチドおよび［^１４Ｃ］−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅを９６穴プレートにあらかじめ添加し、ヒトＰＨＤ２酵素溶液（４μｇ／ｗｅｌｌ）を添加することにより反応を開始した。３７℃で１５分間インキュベーションした後、ＤＮＰＨを含む停止液を添加し、室温で３０分間静置した。その後過剰量の放射能ラベルしていない２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅを添加し、室温で６０分間静置した。生成した沈殿物をフィルターで除去し、［^１４Ｃ］−ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄの放射カウントを（マイクロベータにて）定量した。各ウェルの放射カウントを測定し、試験化合物のヒトＰＨＤ２阻害活性を、基質無添加群および試験物質無添加群の値に基づいて計算した。

【0191】

（３）結果
本発明化合物のヒトＰＨＤ２阻害率（％、試験化合物濃度は１μＭ）を以下の表１に示す。

【0192】

【表1】

【0193】

表１に示された結果より、化合物（Ａ）は、優れたＰＨＤ２阻害作用を有することが示された。
試験例２

【0194】

（１）ヒトＰＨＤ２の発現・調製
ヒトＰＨＤ２の発現は、ヒト細胞（２９３ＦＴ細胞）にて行った。ヒトＰＨＤ２登録配列（ＮＭ＿０２２０５１）をｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、配列を確認した。当該ベクターを２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で４８時間培養後、各種プロテアーゼ阻害剤を含んだ細胞溶解溶液を加え破砕懸濁した。破砕懸濁溶液を４℃、１００，０００×ｇ、３０分間遠心し、上清を回収して細胞ライセートとした。ウエスタンブロット解析により、細胞ライセートにヒトＰＨＤ２蛋白質の発現を確認した。

【0195】

（２）ヒトＰＨＤ２阻害活性の測定
ヒトＰＨＤ２酵素活性は、ＨＩＦ−１αの配列を基にした１９残基の部分ペプチドを基質として、ペプチド中に含まれるプロリン残基の水酸化をＦＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）法にて測定した。
酵素及び基質は、１２．５ｍＭ ＫＣｌ、３．７５ｍＭＭｇＣｌ_２、２５μＭ硫酸鉄、５ｍＭアスコルビン酸、２．５ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、試験化合物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。
試験化合物及び基質溶液を３８４穴プレートにあらかじめ添加し、ヒトＰＨＤ２酵素溶液（４０ｎｇ／ ｗｅｌｌ）を添加することにより反応を開始した。３０℃で２０分間インキュベーションした後、ＥＤＴＡを含む停止液を添加し、ＨＩＦ−ＯＨ抗体溶液を添加・結合させて、水酸化されたプロリン残基の量を蛍光偏光測定法により定量した。
各ウェルの蛍光偏光を測定し、試験化合物のヒトＰＨＤ２阻害活性を、試験物質無添加群の値に基づいて計算した。

【0196】

（３）結果
本発明化合物のヒトＰＨＤ２阻害活性について、阻害率（％、試験化合物濃度は１μＭ）を以下の表２−１に、また、ＩＣ_５０（ｎＭ）を以下の表２−２に示す。

【0197】

【表2-1】

【0198】

【表2-2】

【0199】

表２−１及び表２−２に示された結果からも、化合物（Ａ）は、優れたＰＨＤ２阻害作用を有することが示された。

【産業上の利用可能性】

【0200】

本発明により、Ｎ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンは、優れたＰＨＤ２阻害作用を有することが示された。従って、本発明化合物は、貧血、貧血に由来する疾病等の予防又は治療薬として使用することが可能である。また、本発明のＮ−［（１−｛［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジニル］メチル｝−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］グリシンの結晶は、優れた保存安定性、その他の物性を有しており、医薬品原体として有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】