特開 2015-168631 ＡＣＥ阻害剤の製造方法及びＡＣＥ阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-168631(P2015-168631A)

(43)【公開日】2015年9月28日

(54)【発明の名称】ＡＣＥ阻害剤の製造方法及びＡＣＥ阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/56 20150101AFI20150901BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150901BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/56

   A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2014-42919(P2014-42919)

(22)【出願日】2014年3月5日

【新規性喪失の例外の表示】申請有り

(71)【出願人】

【識別番号】509304933

【氏名又は名称】ワキ製薬株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】505127721

【氏名又は名称】公立大学法人大阪府立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100154726

【弁理士】

【氏名又は名称】宮地 正浩

(72)【発明者】

【氏名】上田 光宏

(72)【発明者】

【氏名】井上 國世

【テーマコード（参考）】

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C087AA01

4C087AA04

4C087AA05

4C087BB11

4C087CA06

4C087CA30

4C087NA14

4C087ZC20

(57)【要約】

【課題】本発明は、ミミズ由来の成分にＡＣＥ阻害能が存在することを確認し、ミミズからＡＣＥ阻害活性能を有するＡＣＥ阻害剤を製造し提供することを目的とする。
【解決手段】ＡＣＥの阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤の製造方法において、ミミズ乾燥粉砕物を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程（＃０１）と、抽出工程で得たミミズ抽出液を分子量分画して、分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を回収する分子量分画工程（＃０２）と、を実行して、分子量分画工程（＃０２）で回収した低分子量画分をＡＣＥ阻害剤として得る
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＣＥの阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤であって、
ミミズ乾燥粉砕物を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうちの分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を主成分とするＡＣＥ阻害剤。

【請求項2】

請求項１に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法であって、
ミミズ乾燥粉砕物を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得たミミズ抽出液を分子量分画して、分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を回収する分子量分画工程と、を実行して、
前記分子量分画工程で回収した低分子量画分をＡＣＥ阻害剤として得るＡＣＥ阻害剤の製造方法。

【請求項3】

前記抽出工程が、前記ミミズ乾燥粉砕物を蒸留水に分散させてなる分散液にオートクレーブ処理を施し、当該オートクレーブ処理後の処理液を遠心分離し、当該遠心分離後の上清液を前記ミミズ抽出液として回収する工程である請求項２に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法。

【請求項4】

前記分子量分画工程で回収した低分子量画分を強陽イオン交換カラムを用いた強陽イオン交換クロマトグラフィーにより分画して、吸着画分を回収する強陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実行し、
前記強陽イオン交換クロマトグラフィー工程で回収した吸着画分をＡＣＥ阻害剤として得る請求項２又は３に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法。

【請求項5】

前記強陽イオン交換クロマトグラフィー工程で回収した吸着画分をＣ１８逆相シリカゲルカラムを用いた逆相高圧液体クロマトグラフィーにより分画して、保持時間が、６分付近、１２分付近、２３分付近、２５分付近、４２分付近、及び、４８分付近の少なくとも１つの特定保持時間の活性画分を回収する逆相高圧液体クロマトグラフィー工程を実行し、
前記逆相高圧液体クロマトグラフィー工程で回収した活性画分をＡＣＥ阻害剤として得る請求項４に記載のＡＣＥ阻害剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）の阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人間には血圧を上げるもしくは上がる作用が存在しており、代表的な機構の一つにレニン−アンジオテンシン系という機構が存在する。レニン−アンジオテンシン系は肝臓で産生されるアンジオテンシノーゲンというタンパク質が腎臓で発現するレニンによって一部分解され、アンジオテンシンＩと呼ばれるペプチドに変換される。
アンジオテンシンＩが肺で発現する酵素であるアンジオテンシン変換酵素（本願において「ＡＣＥ」と呼ぶ。）は、血圧を上昇させる重要な酵素であり、この酵素を阻害することで、高血圧症抑制効果を示すことが知られている。このようなＡＣＥ阻害活性を有する物質（本願において「ＡＣＥ阻害剤」と呼ぶ。）としては、今までにたくさんの食品・漢方・由来のものが発見されている（例えば特許文献１を参照。）。それらの多くはプロテアーゼによる加水分解物や発酵食品に多く見られる。プロテアーゼ加水分解物としてはサケ、ミルク、ワカメなどがあり、発酵食品としては納豆などがあり、これらのＡＣＥ阻害剤はほとんどがペプチド成分である。非ペプチド性のＡＣＥ阻害剤としては、醤油に含まれているニコチアナミン、紅茶などのカテキンなどがある。

【0003】

ミミズは地龍という名で、漢方薬としてよく知られている。中国では、紀元前から生薬として扱われており、食経験が十分な素材といえる。地龍の効能としてよくあげられるものには解熱作用、利尿作用、筋肉・気管支弛緩作用、鎮痛作用、血栓溶解作用、降圧作用などが知られている。
そして、ミミズは、生物の時の利点、食品、餌、薬品としての利点がそれぞれあり、しかも条件さえ整えば、年中増えるので生産が容易という利点が存在する。そして、食用ミミズ凍結乾燥物の健康食品が作られ販売されており（例えば特許文献２を参照。）、ミミズの有用物質の単離、評価が行われている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００５−３０６７７５号公報

【特許文献2】特開２０１３−１８３７２２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ミミズは薬品、健康食品として多くの機能を秘めた生物である。そして、人工的に増殖させるのが容易な生物であり、ミミズの凍結乾燥粉末は一般的に販売されるまでに至っている。また、医療費の増大などから、自身の健康に気を使う人が増えており、健康食品などに頼る人が増えている。
本発明は、かかる点に着目してなされたものであり、ミミズ由来の成分にＡＣＥ阻害能が存在することを確認し、ミミズからＡＣＥ阻害活性能を有するＡＣＥ阻害剤を製造し提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

この目的を達成するための本発明に係るＡＣＥ阻害剤は、
ＡＣＥの阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤であって、
その特徴構成は、
ミミズ乾燥粉砕物を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうちの分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を主成分とする点にある。

【0007】

また、この目的を達成するための本発明に係るＡＣＥ阻害剤の製造方法は、
上記特徴構成を有する本発明に係るＡＣＥ阻害剤であって、
その第１特徴構成は、
ミミズ乾燥粉砕物を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得たミミズ抽出液を分子量分画して、分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を回収する分子量分画工程と、を実行して、
前記分子量分画工程で回収した低分子量画分をＡＣＥ阻害剤として得る点にある。

【0008】

本発明の発明者らは、鋭意研究により、ミミズ由来の成分にＡＣＥ阻害能が存在することを発見し、本発明を完成するに至った。
即ち、上記特徴構成によれば、ミミズ乾燥粉砕物を原料として上記抽出工程を実行することでミミズ抽出液を得て、そのミミズ抽出液に対して上記分子量分画工程を実行して分子量５ｋＤａで分画を行えば、分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を回収することができる。そして、この低分子量画分については、比較的高いＡＣＥ阻害活性を発現することが確認でき、これをＡＣＥ阻害剤として製造し提供することができる。

【0009】

本発明に係るＡＣＥ阻害剤の製造方法の第２特徴構成は、上記第１特徴構成に加えて、
前記抽出工程が、前記ミミズ乾燥粉砕物を蒸留水に分散させてなる分散液にオートクレーブ処理を施し、当該オートクレーブ処理後の処理液を遠心分離し、当該遠心分離後の上清液を前記ミミズ抽出液として回収する工程である点にある。

【0010】

上記特徴構成によれば、ミミズ乾燥粉砕物を原料として用い、その粉砕物を蒸留水に分散させてなる分散液にオートクレーブ処理を施せば、ミミズ乾燥粉砕物からの成分抽出を効率良く行うことができる。また、そのオートクレーブ処理後の処理液を遠心分離して上清液をミミズ抽出液として回収すれば、ミミズ乾燥粉砕物の抽出成分を比較的高濃度且つ高純度で分離することができる。

【0011】

本発明に係るＡＣＥ阻害剤の製造方法の第３特徴構成は、上記第１乃至第２特徴構成の何れかに加えて、
前記分子量分画工程で回収した低分子量画分を強陽イオン交換カラムを用いた強陽イオン交換クロマトグラフィーにより分画して、吸着画分を回収する強陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実行し、
前記強陽イオン交換クロマトグラフィー工程で回収した吸着画分をＡＣＥ阻害剤として得る点にある。

【0012】

上記特徴構成によれば、上述したようにミミズ抽出液に対して分子量分画工程を実行することで分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を回収するのに加えて、その低分子量画分に対して上記強陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実行して強陽イオン交換クロマトグラフィーによる分画を行うことで、強イオン交換カラムに吸着される吸着画分を回収することができる。そして、この吸着画分については、低分子量画分と比べて一層高いＡＣＥ阻害活性を発現することが確認でき、これをＡＣＥ阻害剤として製造することができる。

【0013】

本発明に係るＡＣＥ阻害剤の製造方法の第４特徴構成は、上記第３特徴構成に加えて、
前記強陽イオン交換クロマトグラフィー工程で回収した吸着画分をＣ１８逆相シリカゲルカラムを用いた逆相高圧液体クロマトグラフィーにより分画して、保持時間が、６分付近、１２分付近、２３分付近、２５分付近、４２分付近、及び、４８分付近の少なくとも１つの特定保持時間の活性画分を回収する逆相高圧液体クロマトグラフィー工程を実行し、
前記逆相高圧液体クロマトグラフィー工程で回収した活性画分をＡＣＥ阻害剤として得る点にある。

【0014】

上記特徴構成によれば、上述したようにミミズ抽出液に対して分子量分画工程を実行することで分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を回収し、更に、その低分子量画分に対して強陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実行することで吸着画分を回収するのに加えて、その吸着画分に対して上記逆相高圧液体クロマトグラフィー工程を実行して逆相高圧液体クロマトグラフィーによる分画を行うことで、上記特定保持時間の活性画分を回収することができる。そして、この活性画分については、低分子量画分並びに吸着画分と比べて一層高いＡＣＥ阻害活性を発現することが確認でき、これをＡＣＥ阻害剤として製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＡＣＥ阻害剤の製造方法の各工程の流れを示す図

【図2】濃度とＡＣＥ阻害活性との関係を示すグラフ図

【図3】逆相高圧液体クロマトグラフィーで得られるクロマトグラムを示す図

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明に係るＡＣＥ阻害剤の製造方法及びＡＣＥ阻害剤の実施形態について図面に基づいて説明する。
図１に示すように、本実施形態のＡＣＥ阻害剤の製造方法は、ミミズ乾燥粉砕物を原料とし、所定の工程を実行することにより回収された物質を実施例１、実施例２、及び、実施例３のＡＣＥ阻害剤として得るものである。尚、原料となるミミズ乾燥粉砕物としては、ワキ製薬株式会社が販売するシマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｅｔｉｄａ）の凍結乾燥粉砕物を利用した。尚、本実施形態では、原料となるミミズとしてＬｕｍｂｒｉｃｉｄａｅ科に属するシマミミズを用いた。

【0017】

尚、各工程の詳細については後述するが、実施例１のＡＣＥ阻害剤は、所定の抽出工程（＃０１）及び分子量分画工程（＃０２）を順に実行することで回収される低分子量画分として得られるものであり、実施例２のＡＣＥ阻害剤は、このように回収される低分子量画分に対して強陽イオン交換クロマトグラフィー工程（＃０３）を実行することにより回収される吸着画分として得られるものであり、更に、実施例３のＡＣＥ阻害剤は、このように回収される吸着画分に対して逆相高圧液体クロマトグラフィー工程（＃０４）を実行することにより回収される活性画分として得られるものである。
以下、ＡＣＥ阻害活性の測定方法について説明を加え、続いてＡＣＥ阻害剤の製造方法に含まれる各工程の詳細について説明する。

【0018】

（ＡＣＥ阻害活性測定方法）
本実施形態におけるＡＣＥ阻害活性の測定方法は、以下のとおりである。
ＡＣＥ阻害活性測定法は、１００ｍＭ（１Ｍ＝１ｍｏｌ/Ｌ、以下同じ）のホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．３）にウサギ肺由来ＡＣＥ（ＳＩＧＭＡ Ａ６７７８−．２５ＵＮ）を５０ｍＵ／ｍＬになるように溶解させた溶液２０μＬに、１ＭのＮａＣｌを３０μＬ、サンプルを１０μＬ添加し、３７℃で５分間予備加温を行う。
そして、基質として１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．３）に溶解させた６ｍＭのＨＨＬ（プリル−ヒスチジル−ロイシン）（ＳＩＧＭＡ Ｈ４８８４−１００ＭＧ）を６０μＬを加え、反応を開始させる。この反応液を３７℃で６０分間反応させた後、１ＭのＨＣｌを加え、反応を停止させる。この反応させた溶液をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に供試し、ＨＡ（馬尿酸）を定量する。

【0019】

尚、ＨＰＬＣの条件は以下に示す。
関東化学株式会社製のＨＰＬＣカラム「Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ２５０−４．６」を使用し、カラム温度は室温とする。移動相はメタノールと１０ｍＭのＫＨ_２ ＰＯ_４ とが１：１で混合された混合液とし、溶出液流速スピードは０．５ｍＬ／ｍｉｎとする。そして、生成物の定量は、２２８ｎｍの吸光度を検出することで行う。
また、ＡＣＥ阻害率は以下のように算出する。
阻害率（％）＝１００（１−Ａ／Ｂ）
ここで、Ａはサンプルを使用した時のＨＡピーク面積値とし、Ｂはサンプルの代わりに１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．３）を使用した時のＨＡピーク面積値とする。

【0020】

〔抽出工程〕
図１に示す抽出工程（＃０１）では、ミミズ乾燥粉砕物を１０倍量の蒸留水に分散させてなる分散液に、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理を施す。そして、オートクレーブ処理後の処理液を３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離にかけ、上清をミミズ抽出液として回収した。

【0021】

〔分子量分画工程〕
図１に示す分子量分画工程（＃０２）では、抽出工程（＃０１）で得たミミズ抽出液を分子量分画して、分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分を回収する。そして、このようにして回収した低分子量画分を実施例１のＡＣＥ阻害剤として得る。
具体的に、分子量分画工程（＃０２）では、ザルトリウス社製の遠心濃縮チューブ「ＶＩＶＡＳＰＩＮ（登録商標）２０，ＭＷＣＯ５，０００，ＰＥＳ」を用いて、分子量５ｋＤａでの分画を行い、分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分及び分子量５ｋＤａ超の高分子量画分を夫々回収した。そして、このように回収した低分子量画分及び高分子量画分の夫々について、凍結乾燥し、１００ｍＭのホウ酸緩衝液に溶解し、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、ＡＣＥ阻害活性測定を行なった。
その結果、下記[表１]に示すように、分子量５ｋＤａ超の高分子量画分（比較例１）には、ＡＣＥ阻害活性が確認できなかったのに対し、分子量５ｋＤａ以下の低分子量画分（実施例１）には、比較的高いＡＣＥ阻害活性があることを確認できた。

【0022】

【表1】

【0023】

また、５ｋＤａ以下の低分子量画分を、２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、夫々の濃度でＡＣＥ阻害活性測定を行なった。
その結果、図２に示すように、夫々の濃度でＡＣＥ阻害活性が確認され、具体的に、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＣＥ阻害率が２９．６±０．８％、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＣＥ阻害率が４８．２±１．６％、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＣＥ阻害率が７６．８±０．８％、２５ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＣＥ阻害率が８６．９±０．３％と、ＡＣＥ阻害活性が濃度依存性を有するとともに、２．５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度において実用的なＡＣＥ阻害活性を発現できることが確認できた。また、濃度が１０ｍｇ／ｍＬを超えると、ＡＣＥ阻害活性の濃度依存性が低下することから、ＡＣＥ阻害剤の使用量削減等を踏まえて、濃度は１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることが望ましい。

【0024】

〔強陽イオン交換クロマトグラフィー工程〕
図１に示す強陽イオン交換クロマトグラフィー工程（＃０３）では、上述した分子量分画工程（＃０２）で回収した低分子量画分を強陽イオン交換カラムを用いた強陽イオン交換クロマトグラフィーにより分画して、吸着画分を回収する。そして、このようにして回収した吸着画分を実施例２のＡＣＥ阻害剤として得る。
具体的に、強陽イオン交換クロマトグラフィー工程（＃０３）では、東ソー株式会社製の強陽イオン交換体「ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＳＰ−６５０Ｍ」を充填した強陽イオン交換カラムを利用した。この強陽イオン交換カラムに分子量分画工程（＃０２）で回収した低分子量画分を供試し、２Ｍのアンモニア水による溶出を行うことで、強陽イオン交換体に対する非吸着画分と吸着画分とを夫々回収した。そして、このように回収した非吸着画分と吸着画分の夫々について、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥してサンプルを作成し、これら凍結乾燥したサンプルを１００ｍＭのホウ酸緩衝液に溶解して、５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、ＡＣＥ阻害活性測定を行なった。
その結果、下記[表２]に示すように、強陽イオン交換カラムに対する非吸着画分（比較例２）及び吸着画分（実施例２）の両方についてＡＣＥ阻害活性が確認できたが、吸着画分（実施例２）の方がより高いＡＣＥ阻害活性があることが確認できた。

【0025】

【表2】

【0026】

〔逆相高圧液体クロマトグラフィー工程〕
図１に示す逆相高圧液体クロマトグラフィー工程（＃０４）では、上述した強陽イオン交換クロマトグラフィー工程（＃０３）で回収した吸着画分をＣ１８逆相シリカゲルカラムを用いた逆相高圧液体クロマトグラフィーにより分画して、図３に示すように、大きくピークが出た活性画分、即ち、保持時間が、６分付近（図３のＰ１）、１２分付近（図３のＰ２）、２３分付近（図３のＰ３）、２５分付近（図３のＰ４）、４２分付近（図３のＰ５）、及び、４８分付近（図３のＰ６）の少なくとも１つの特定保持時間の活性画分を回収する。そして、このようにして回収した活性画分を実施例３のＡＣＥ阻害剤として得る。
具体的に、逆相高圧液体クロマトグラフィー工程（＃０４）では、関東化学株式会社製のＨＰＬＣカラム「Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ ２５０−４．６」を使用し、カラム温度は室温とした。移動相はｍｉｌｌｉＱ水（ミリＱ水）１００％＋ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）０．１％から５０分かけてアセトニトリル５０％＋ｍｉｌｌｉＱ水５０％＋ＴＦＡ０．１％にグラジエント溶出条件を設定した。
検出吸光度は２３０ｎｍで行なった。上記ＨＰＬＣカラムに対し強陽イオン交換カラムに吸着した吸着画分を供試し、図３に示すように、大きくピークが出た活性画分（図３のＰ１〜Ｐ６）を回収した。そして、このように回収した活性画分の夫々について、遠心エバポレーターで乾燥させ、それをインジェクションした液量と同量の１００ｍＭのホウ酸緩衝液に溶解して、ＡＣＥ阻害活性測定を行なった。
その結果、下記[表３]に示すように、夫々の活性画分についてＡＣＥ阻害活性が確認できた。

【0027】

【表3】

【0028】

また、逆相高圧液体クロマトグラフィーで回収した活性画分のうち、比較的ピークが大きいものが見られた活性画分Ｐ１，Ｐ２，Ｐ５について、ｍｉｌｉＱ水をコントロールに使用してニンヒドリンによる染色を行なった。結果、活性画分Ｐ１にはペプチド結合の存在が確認されたが、活性画分Ｐ２，Ｐ５にはペプチド結合が確認されなかった。
このことから、活性画分Ｐ１にはペプチドもしくはペプチド類似物質が含まれていることが示唆される。一方、活性画分Ｐ２，Ｐ５については、吸光度のピークにはペプチド結合が確認できなかったことから、ミミズのタンパク質分解物ではなく、ミミズ自身が持っている物質であると考えられる。

【0029】

〔その他の実施形態〕
最後に、本発明のその他の実施形態について説明する。尚、以下に説明する各実施形態の構成は、それぞれ単独で適用されるものに限られず、矛盾が生じない限り、他の実施形態の構成と組み合わせて適用することも可能である。

【0030】

（１）本実施形態では、原料のミミズとしてシマミミズを用いたが、アカミミズなどの健康食品用・薬剤用で用いられる別の種類のミミズを原料として用いてもよい。

【0031】

（２）本実施形態におけるＡＣＥ阻害剤の製造方法に含まれる各工程の処理条件については適宜変更可能である。

【産業上の利用可能性】

【0032】

本発明は、ＡＣＥの阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤及びその製造方法として好適に利用可能である。

【符号の説明】

【0033】

＃０１：抽出工程
＃０２：分子量分画工程
＃０３：強イオン交換クロマトグラフィー工程
＃０４：逆相高圧液体クロマトグラフィー工程

【図1】

【図2】

【図3】