特開 2015-192635 キナーゼ活性の測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-192635(P2015-192635A)

(43)【公開日】2015年11月5日

(54)【発明の名称】キナーゼ活性の測定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/48 20060101AFI20151009BHJP

   C07H 19/20 20060101ALI20151009BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20151009BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20151009BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20151009BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/48 ZZNA

   C07H19/20CSP

   G01N33/53 D

   G01N33/53 J

   G01N33/543 501D

   G01N33/553

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-72967(P2014-72967)

(22)【出願日】2014年3月31日

(71)【出願人】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000280

【氏名又は名称】特許業務法人サンクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】原田 盛義

【テーマコード（参考）】

4B063

4C057

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ02

4B063QQ27

4B063QR02

4B063QR42

4B063QR48

4B063QR57

4B063QS03

4B063QX01

4B063QX02

4C057AA18

4C057BB02

4C057DD03

4C057LL29

4C057LL45

(57)【要約】

【課題】高感度にキナーゼ活性を測定することができる方法、ＡＴＰ誘導体およびそれを含有する試薬キットを提供すること。
【解決手段】キナーゼと、基質と、ＤＮＰ基を含むＡＴＰ誘導体とを反応させて前記基質にＤＮＰ基を導入する工程、ＤＮＰ基含有基質と抗ＤＮＰ抗体とを混合する工程および形成された複合体を検出してキナーゼの活性を測定する工程を含み、前記ＡＴＰ誘導体が、リンカーを介してジニトロフェニル基がＡＴＰのγ位のリン酸基に結合した化合物であるキナーゼ活性の測定方法、前記ＡＴＰ誘導体ならびに前記ＡＴＰ誘導体を含有する試薬キット。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）キナーゼを含む被検試料と、前記キナーゼの基質と、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）基を含むアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）誘導体とを反応させ、前記基質にＤＮＰ基が導入されたＤＮＰ基含有基質を含む混合物を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた混合物と、前記ＤＮＰ基に結合する抗体とを混合し、前記ＤＮＰ基含有基質と前記抗体とを含む複合体を形成させる工程、および
（Ｃ）前記複合体を検出することによって前記キナーゼの活性を測定する工程
を含み、
前記ＡＴＰ誘導体は、ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してＤＮＰ基が結合した化合物である、
キナーゼ活性の測定方法。

【請求項2】

前記工程（Ｂ）において、前記複合体が、固相担体上に形成される、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記工程（Ｂ）において、前記複合体の形成が溶液中で行われ、
前記工程（Ｂ）および（Ｃ）の間に、前記複合体が形成された固相担体と、前記溶液とを分離する工程
をさらに含む、請求項２記載の方法。

【請求項4】

前記固相担体が、磁性粒子である、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記キナーゼが、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記キナーゼが、ＣＤＫ１またはＣＤＫ２である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記基質が、式（ａ１）：
Ｘａａ¹−Ｐｒｏ−Ｘａａ²−Ｘａａ³ （ａ１）
（Ｘａａ¹はセリン残基またはスレオニン残基、Ｘａａ²は任意のアミノ酸残基、Ｘａａ³はリジン残基またはアルギニン残基を示す。）
で表わされるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する基質ペプチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記抗体が、標識物質を含む標識抗体であり、
前記工程（Ｃ）において、前記複合体中の標識物質を検出することによって前記活性を測定する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）誘導体であって、
ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してジニトロフェニル基が結合している、ＡＴＰ誘導体。

【請求項10】

請求項１〜８いずれかに記載のキナーゼ活性の測定方法に用いるためのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）誘導体であって、
ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してジニトロフェニル基が結合している、ＡＴＰ誘導体。

【請求項11】

請求項１〜８いずれかに記載のキナーゼ活性の測定方法に用いるための試薬キットであって、
キナーゼの基質と、
ジニトロフェニル（ＤＮＰ）基を含むアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）誘導体と、
前記ＤＮＰ基に結合する抗体と
を含有してなり、
前記ＤＮＰ基を含むＡＴＰ誘導体が、ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してＤＮＰ基が結合している化合物である、試薬キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キナーゼ活性の測定方法に関する。さらに詳細には、本発明は、アデノシン三リン酸誘導体、それを用いるキナーゼ活性の測定方法およびその試薬キットに関する。

【背景技術】

【0002】

キナーゼ活性の測定方法としては、例えば、リン酸基供与体としてアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」という）を用いる代わりに、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（以下、「ＡＴＰγＳ」という）を用いるサイクリン依存性キナーゼの活性の測定方法が提案されている（特許文献１参照）。

【0003】

特許文献１に記載の方法は、以下のように行なわれる。まず、サイクリン依存性キナーゼ／サイクリン複合体の存在下に、基質タンパク質とＡＴＰγＳとを反応させ、当該基質タンパク質のセリン残基またはスレオニン残基にＡＴＰγＳ由来のモノチオリン酸基を導入する。つぎに、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質または標識酵素を結合させ、標識された基質タンパク質を得る。その後、サイクリン依存性キナーゼの活性値を当該標識された基質タンパク質の標識蛍光物質に由来する蛍光量または標識酵素の反応によって生じた生成物の量から算出する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００２／０１６４６７３号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、より高感度にキナーゼ活性を測定することができる方法が望まれている。

【0006】

本発明は、前記従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、より高感度にキナーゼ活性を測定することができる方法、ＡＴＰ誘導体およびそれを含む試薬キットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

すなわち、本発明は、
（Ａ）キナーゼを含む被検試料と、前記キナーゼの基質と、ジニトロフェニル基（以下、「ＤＮＰ基」という）を含むＡＴＰ誘導体とを反応させ、前記基質にＤＮＰ基が導入されたＤＮＰ基含有基質を含む混合物を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた混合物と、前記ＤＮＰ基に結合する抗体とを混合し、前記ＤＮＰ基含有基質と前記抗体とを含む複合体を形成させる工程、および
（Ｃ）前記複合体を検出することによって前記キナーゼの活性を測定する工程
を含み、
前記ＡＴＰ誘導体は、ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してＤＮＰ基が結合している化合物である、
キナーゼ活性の測定方法を提供する。

【0008】

また、本発明は、ＡＴＰ誘導体であって、ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してＤＮＰ基が結合しているＡＴＰ誘導体を提供する。

【0009】

また、本発明は、上述のキナーゼ活性の測定方法に用いるためのＡＴＰ誘導体であって、ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してＤＮＰ基が結合している、ＡＴＰ誘導体を提供する。

【0010】

また、本発明は、上述のキナーゼ活性の測定方法に用いるための試薬キットであって、キナーゼの基質と、ＤＮＰを含むＡＴＰ誘導体と、前記ＤＮＰ基に結合する抗体とを含有しており、前記ＤＮＰを含むＡＴＰ誘導体が、ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してＤＮＰ基が結合している化合物である、試薬キットを提供する。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、より高感度にキナーゼ活性を測定することができる方法、ＡＴＰ誘導体およびそれを含む試薬キットを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本実施形態に係るキナーゼ活性の測定方法の原理を示す概略説明図である。

【図2】（Ａ）は実施例１に用いられたＡＴＰγＳの吸光スペクトル、（Ｂ）は実施例１に用いられたＤＮＰ−Ｌｙｓの吸光スペクトル、（Ｃ）は実施例１で得られた反応生成物の吸光スペクトルを示す。

【図3】実施例１の結果を示すグラフである。

【図4】実施例１の結果を示すグラフである。

【図5】実施例２および比較例１それぞれの測定方法を評価した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

（ＡＴＰ誘導体）
本実施形態に係るＡＴＰ誘導体は、リンカーを介してＤＮＰ基がＡＴＰのγ位のリン酸基に結合していることを特徴とする。本実施形態に係るＡＴＰ誘導体は、ＡＴＰ部分と、ＤＮＰ基部分とから構成されている。

【0014】

なお、本明細書において、「キナーゼ」とは、ＡＴＰなどの高エネルギーリン酸結合を有する化合物からリン酸基を基質に転移して基質をリン酸化する酵素をいう。かかるキナーゼには、基質である低分子量の化合物をリン酸化する低分子量基質型のキナーゼ、基質である特定のアミノ酸配列を有するタンパク質をリン酸化するプロテインキナーゼなどが包含される。前記低分子量基質型のキナーゼとしては、クレアチンキナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。また、前記プロテインキナーゼは、セリン/スレオニンキナーゼと、チロシンキナーゼとに大別される。前記セリン/スレオニンキナーゼとしては、例えば、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６などのＣＤＫ；Ａｋｔ １、ＩＫＫ、ＰＤＫ１、ＰＫ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＮ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、ＳＧＫ、ＫＳＲ、ＬＫＢ１、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＰＡＫ３、ＰＫＲ、ＰＬＫ１、ＰＲＡＫ、ＰＲＫ２、Ｒａｆ、Ｔａｋ１などが挙げられるが、特に限定されない。前記チロシンキナーゼとしては、例えば、Ｅｃｋ、ＥＧＦ−Ｒ、Ｅｒｂ Ｂ−２、Ｅｒｂ Ｂ−３、Ｅｒｂ Ｂ−４、ＦＧＦ−Ｒ、Ｆｌｔ−１、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｔｉｅ−２などの受容体型チロシンキナーゼ；Ａｂｌ、ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、Ｙｅｓ、Ｃｓｋ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｔｅｃ、Ｂｌｋ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、Ｓｒｃ、Ｅｃｋ、Ｈｃｋ、Ｌｙｎ、Ｔｙｋ２、ＢＴＫ、Ｆｇｒ、Ｓｙｋなどの非受容体型チロシンキナーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのキナーゼのなかでは、ＣＤＫが好ましく、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２がより好ましい。

【0015】

本実施形態に係るＡＴＰ誘導体としては、例えば、式（Ｉ）：

【0016】

【化1】

（式中、Ｘ¹は、直接結合、酸素原子または硫黄原子、Ｌ¹はリンカー部分、Ｒ¹は前記Ｌ¹および前記ＤＮＰの双方に連結可能な反応基、ＤＮＰはジニトロフェニル基を示す）
で表わされる化合物などが挙げられるが、特に限定されない。なお、本実施形態においては、ＡＴＰ誘導体の製造の容易性を確保する観点から、Ｒ¹およびＸ¹は、互いに異なる官能基であることが好ましい。

【0017】

式（Ｉ）において、Ｘ¹は、直接結合、酸素原子または硫黄原子である。これらのＸ¹のなかでは、ＡＴＰ誘導体の製造の容易性を確保する観点から、硫黄原子が好ましい。

【0018】

式（Ｉ）において、Ｌ¹は、リンカー部分である。前記リンカー部分は、Ｒ¹に連結可能な第１の反応基とＸ¹に連結可能な第２の反応基とを有する二官能性リンカーを、Ｒ¹およびＸ^１に連結させることによって生成される部分である。すなわち、Ｌ¹におけるＲ¹側末端の官能基は、前記第１の反応基に由来する官能基（以下、「Ｒ¹結合基」という）である。また、Ｌ¹のＸ¹側末端の官能基は、前記第２の反応基に由来する官能基（以下、「Ｘ¹結合基」という）である。

【0019】

Ｒ¹結合基は、Ｒ¹の種類に応じて適宜選択することができる。Ｒ¹がアミノ酸残基である場合、前記Ｒ¹結合基としては、例えば、カルボニル基、アミノ基、スルフヒドリル基
などが挙げられるが、特に限定されない。前記Ｒ²結合基は、Ｘ²の種類に応じて適宜選択することができる。Ｘ¹が硫黄原子である場合、前記Ｘ¹結合基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド基、ジスルフィド基などが挙げられるが、特に限定されない。前記リンカー部分は、必要に応じ、Ｒ¹結合基とＸ¹結合基との間にスペーサーを有していてもよい。前記スペーサーとしては、置換基を有していてもよい炭素数１〜１２のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数２〜１２のアルケニレン基、置換基を有していてもよい炭素数２〜１２のアルキニレン基、（ポリ）オキシアルキレン基などが挙げられるが、特に限定されない。アルキレン基の炭素数は、ＡＴＰ誘導体のＡＴＰ部分とＤＮＰ部分との間の立体障害を抑制してＡＴＰの機能を十分に発揮させ、リン酸化反応を効率よく行なう観点から、好ましくは１以上、より好ましくは２以上であり、ＡＴＰ誘導体の水溶性を確保して操作の容易性を確保する観点から、好ましくは１２以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは６以下である。炭素数１〜１２のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｓｅｃ−ブチレン基、ｔｅｒｔ−ブチレン基、ｎ−ペンチレン基、イソペンチレン基、ネオペンチレン基、ヘキシレン基などが挙げられるが、特に限定されない。アルケニレン基およびアルキニレン基それぞれの炭素数は、ＡＴＰ誘導体のＡＴＰ部分とＤＮＰ部分との間の立体障害を抑制してＡＴＰの機能を十分に発揮させ、リン酸化反応を効率よく行なう観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、ＡＴＰ誘導体の水溶性を確保して操作の容易性を確保する観点から、好ましくは１２以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは６以下である。炭素数２〜１２のアルケニレン基としては、ビニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基、ペンテニレン基などが挙げられるが、特に限定されない。炭素数２〜１２のアルキニレン基としては、例えば、エチニレン基、プロピニレン基、ブチニレン基、ヘキセニレン基などが挙げられるが、特に限定されない。前記置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基などが挙げられるが、特に限定されない。（ポリ）オキシアルキレン基としては、例えば、オキシアルキレン基の炭素数１〜１２であり、オキシアルキレン基の付加モル数が１〜８である（ポリ）オキシアルキレン基などが挙げられるが、特に限定されない。オキシアルキレン基の炭素数は、ＡＴＰ誘導体のＡＴＰ部分とＤＮＰ部分との間の立体障害を抑制してＡＴＰの機能を十分に発揮させ、リン酸化反応を効率よく行なう観点から、好ましくは１以上、より好ましくは２以上であり、ＡＴＰ誘導体の水溶性を確保して操作の容易性を確保する観点から、好ましくは１２以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは６以下である。炭素数１〜１２のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシメチレン基、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基などが挙げられるが、特に限定されない。

【0020】

式（Ｉ）において、Ｒ¹は、Ｌ¹およびＤＮＰの双方と連結可能な反応基である。前記Ｌ¹およびＤＮＰの双方と連結可能な反応基としては、例えば、アミノ酸残基、アルキル基の炭素数が１〜４のアミノアルキルカルボン酸などが挙げられるが、特に限定されない。前記アミノ酸残基としては、例えば、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、バリン残基などが挙げられるが、特に限定されない。なお、Ｒ¹におけるアミノ酸残基とは、アミノ酸に由来する２価基を意味する。Ｒ¹のなかでは、反応基の反応性および製造の容易性を確保する観点から、リジン残基が好ましい。

【0021】

（ＡＴＰ誘導体の製法）
本実施形態に係るＡＴＰ誘導体は、例えば、式（ＩＩ）：
ＤＮＰ−Ｒ² （ＩＩ）
（式中、Ｒ²は、アミノ酸残基を示し、ＤＮＰは前記と同じ。）
で表わされるＤＮＰ基含有化合物と、式（ＩＩＩ）：

【0022】

【0023】

（式中、Ｘ²は反応基（ただし、ＤＮＰを含む官能基を除く）を示す）
で表わされるＡＴＰ化合物と、Ｒ²に連結可能な第１の反応基およびＸ²に連結可能な第２の反応基を有する二官能性リンカーとを反応させることなどによって製造することができる。なお、本実施形態において、式（ＩＩ）で表わされるＤＮＰ基含有化合物と、式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物と、前記二官能性リンカーとの反応の順番は、特に限定されない。式（ＩＩ）で表わされるＤＮＰ基含有化合物と、式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物と、二官能性リンカーとの反応は、例えば、
（１）式（ＩＩ）で表わされるＤＮＰ基含有化合物と前記二官能性リンカーとを反応させた後、得られた製造中間体と式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物とを反応させること、
（２）式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物と前記二官能性リンカーとを反応させた後、得られた製造中間体と式（ＩＩ）で表わされるＤＮＰ基含有化合物とを反応させること
などによって行なうことができる。

【0024】

以下、前記（１）の製法を例として挙げて説明するが、これに限定されない。まず、式（ＩＩ）で表わされるＤＮＰ基含有化合物と前記二官能性リンカーとを反応させ、式（ＩＶ）：
ＤＮＰ−Ｒ¹−Ｌ² （ＩＶ）
（式中、ＤＮＰおよびＲ¹は前記と同じ。Ｌ²は二官能性リンカーに由来するリンカー部分である）
で表わされる製造中間体を得る（工程１−１）。工程１−１における反応は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中で行なうことができる。工程１−１における反応に際して、反応温度は、前記ＤＮＰ基含有化合物と前記二官能性リンカーとを反応させるに十分な時間であればよい。前記反応温度は、特に限定されないが、通常、１５〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。また、工程１−１における反応に際して、反応時間は、前記ＤＮＰ基含有化合物と前記二官能性リンカーとを反応させるに十分な時間であればよい。前記反応時間は、通常、０．５〜３時間、好ましくは０．５〜２時間である。前記反応によって得られた反応生成物には、ＡＴＰ誘導体の製造中間体が含まれている。前記反応生成物は、逆相高速液体クロマトグラフィーなどで適宜精製し、必要に応じて、さらに濃縮することができる。工程１−１において、式（ＩＩ）で表わされるＤＮＰ基含有化合物１モルあたりの前記二官能性リンカーの量は、前記製造中間体の収率を向上させる観点から、好ましくは０．５モル以上、より好ましくは０．６モル以上であり、次工程での副反応を抑制する観点から、好ましくは２モル以下、より好ましくは１モル以下、さらに好ましくは０．８モル以下である。

【0025】

式（ＩＩ）において、Ｒ²は、アミノ酸残基である。前記アミノ酸残基としては、例えば、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、バリン残基などが挙げられるが、特に限定されない。なお、Ｒ²におけるアミノ酸残基とは、アミノ酸に由来する１価基を意味する。Ｒ²のなかでは、反応基の反応性および製造の容易性を確保する観点から、リジン残基が好ましい。

【0026】

前記二官能性リンカーは、Ｒ²に連結可能な第１の反応基と、Ｘ²に連結可能な第２の反応基とを有する二官能性リンカーからなる。前記第１の反応基は、Ｒ²の種類に応じて適宜選択することができる。Ｒ²がアミノ酸残基であり、当該アミノ酸残基のアミノ基を介して式（ＩＩ）で表わされるＤＮＰ基含有化合物を二官能性リンカーと連結させる場合、前記第１の反応基としては、例えば、カルボニル基、イソチオシアノ基、クロロスルホン基、クロロカルボニル基、カルボキシル基、スクシンイミド基などが挙げられるが、特に限定されない。前記第２の反応基は、Ｘ²の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、Ｘ²が硫黄原子である場合、前記第２の反応基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド基、ジスルフィド基などが挙げられるが、特に限定されない。前記リンカー部分は、必要に応じ、第１の反応基と第２の反応基との間にスペーサーを有していてもよい。前記スペーサーとしては、前述と同様のものが挙げられる。前記二官能性リンカーとしては、例えば、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（６−マレイミドヘキサノイツオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（８−マレイミドオクナノイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミドなどのアルキノイル基の炭素数が１〜１２の（マレイミドアルキノイルオキシ）スクシンイミドなどが挙げられるが、特に限定されない。

【0027】

式（ＩＶ）において、Ｌ²は、前記二官能性リンカーに由来するリンカー部分である。かかるＬ²は、Ｘ¹に連結可能なフリーの第２の反応基を有している。

【0028】

つぎに、工程１−１で得られた製造中間体と、式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物とを反応させ、本実施形態に係るＡＴＰ誘導体を得る（工程１−２）。工程１−２における反応は、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液などの中性水系溶媒中で行なうことができる。工程１−２における反応に際して、反応温度は、式（ＩＶ）で表わされる製造中間体と式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物とを反応させるに相応な温度であればよい。前記反応温度は、特に限定されないが、通常、１５〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。また、工程１−２における反応に際して、反応時間は、式（ＩＶ）で表わされる製造中間体と式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物とを反応させるに十分な時間であればよい。前記反応時間は、通常、０．５〜３時間、好ましくは０．５〜２時間である。前記反応は、例えば、反応系にメルカプトエチルアミンなどの反応停止剤を添加することにより、停止させることができる。得られた製造中間体を含む反応生成物は、逆相高速液体クロマトグラフィーなどで適宜精製し、必要に応じて、さらに濃縮することができる。工程１−２において、式（ＩＶ）で表わされる製造中間体１モルあたりの式（ＩＩＩ）で表わされるＡＴＰ化合物の量は、収率を向上させる観点から、好ましくは０．５モル以上、より好ましくは０．６モル以上、さらに好ましくは０．８モル以上であり、製造コストの低減および次工程の精製の容易性の観点から、好ましくは２モル以下、より好ましくは１．２モル以下、さらに好ましくは１．０モル以下である。

【0029】

式（ＩＩＩ）において、Ｘ²は、反応基である。ただし、式（ＩＩＩ）において、Ｘ²がＤＮＰを含む官能基である場合を除く。前記反応基としては、例えば、スルフドリル基（−ＳＨ）などが挙げられるが、特に限定されない。なお、ＡＴＰ誘導体の製造の容易性を確保する観点から、Ｘ²は、式（ＩＩ）のＲ²と異なる官能基であることが好ましい。例えば、Ｒ²がアミノ酸残基である場合、Ｘ²は、当該アミノ酸残基以外の官能基であることが好ましい。これらのＸ²のなかでは、ＡＴＰ誘導体の製造の容易性を確保する観点から、スルフドリル基が好ましい。

【0030】

得られたＡＴＰ誘導体は、例えば、使用用途に適した溶媒に溶解して保存することができる。

【0031】

本実施形態に係るＡＴＰ誘導体は、キナーゼによるリン酸化反応におけるリン酸基供与体として用いることができる。したがって、後述のキナーゼ活性の測定方法に好適に用いることができる。

【0032】

（キナーゼ活性の測定方法）
本実施形態に係るキナーゼ活性の測定方法は、
（Ａ）キナーゼを含む被検試料と、当該キナーゼの基質と、前述のＡＴＰ誘導体とを反応させ、前記基質にＤＮＰ基が導入されたＤＮＰ基含有基質を含む混合物を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた混合物と、前記ＤＮＰ基に結合する抗体とを混合し、前記ＤＮＰ基含有基質と前記抗体とを含む複合体を形成させる工程、および
（Ｃ）前記複合体を検出することによって前記キナーゼの活性を測定する工程
を含み、
前記ＡＴＰ誘導体は、ＡＴＰのγ位のリン酸基にリンカーを介してジニトロフェニル基が結合した化合物であることを特徴としている（以下、「本実施形態の測定法」という）。

【0033】

本実施形態の測定法の原理を図１に示す。なお、図１においては、キナーゼの１つであるＣＤＫ１を例として挙げて説明する。図中、「ＡＴＰγＤＮＰ」は前述のＡＴＰ誘導体、「ＣＤＫ」はＣＤＫ１、「基質ペプチド」は前記ＣＤＫ１のリン酸化部位のモチーフ配列を有するペプチド、「標識物質」は酵素、「基質」は前記酵素の基質、「シグナル」は前記酵素が前記基質に作用することによって生じるシグナルを示す。図１（Ａ）に示されるように、ＣＤＫ１の反応におけるリン酸基供与体として前記ＡＴＰ誘導体（ＡＴＰγＤＮＰ）を用いる。そして、ＣＤＫ１の作用によって前記ＡＴＰ誘導体（ＡＴＰγＤＮＰ）からＤＮＰ基を含むリン酸基を基質ペプチドのセリン残基またはスレオニン残基に転移させる。その後、図１（Ｂ）に示されるように、ＤＮＰ基を含む基質ペプチドを固相担体に固定し、未反応のＡＴＰγＤＮＰを分離するとともに、ＤＮＰ基を含む基質ペプチドのＤＮＰ基を抗ＤＮＰ抗体で捕捉し、標識物質である酵素が基質に作用することによって生じるシグナルを検出する。

【0034】

以下、本実施形態の測定法の手順を詳述する。本実施形態の測定法では、まず、キナーゼを含む被検試料と、当該キナーゼの基質と、前記ＡＴＰ誘導体とを反応させ、前記基質にＤＮＰ基が導入されたＤＮＰ基含有基質を含む混合物を得る〔工程（Ａ）〕。本工程（Ａ）では、被検試料中のキナーゼと、キナーゼの基質とＡＴＰ誘導体とを接触させることとなるが、これらの接触順序は、特に限定されない。

【0035】

本実施形態の測定法で測定対象となるキナーゼは、前述のキナーゼである。キナーゼを含む被検試料として、生体の細胞や体液などから得られる生体由来試料を用いることができる。前記生体由来試料としては、例えば、胃、肝臓、乳房、乳腺、肺、膵臓、膵臓腺、子宮、皮膚食道、喉頭、咽頭、舌、甲状腺などの細胞、血液、尿、リンパ液などの体液が例示される。

【0036】

なお、キナーゼのなかには、ＣＤＫのように、細胞質中において、細胞の核内に存在する成分であるサイクリンと結合して活性化され、酵素活性を発現する状態（活性化状態）となる酵素がある。また、キナーゼの種類によっては、細胞膜の内側または細胞の核の内部に存在し、細胞の表面には表出していない場合がある。このように、キナーゼが、細胞内の成分と結合して活性化される酵素または細胞膜の内側もしくは細胞の核の内部に存在するキナーゼである場合、キナーゼを含む被検試料は、細胞の細胞膜または核膜を破壊し、測定対象のキナーゼを遊離させることによって得られた可溶化試料であることが好ましい。

【0037】

可溶化試料は、生体の細胞に対して可溶化処理を施すことによって得られる。前記可溶化処理は、生体試料に可溶化処理用の緩衝液（以下、「可溶化剤」という）中で細胞に超音波処理、ピペットでの吸引攪拌などを施すことなどによって行なうことができる。

【0038】

可溶化剤は、細胞膜または核膜を破壊する物質を含有する緩衝液である。前記可溶化剤は、キナーゼの変性または分解を阻害する物質、キナーゼによってリン酸化された基質の分解を抑制する物質などをさらに含有してもよい。

【0039】

細胞膜または核膜を破壊する物質としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤などが挙げられるが、特に限定されない。前記界面活性剤は、測定対象のキナーゼの活性を阻害しない範囲で用いることができる。前記界面活性剤としては、例えば、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、トリトンＸ−１００〔ダウケミカルカンパニー（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）の登録商標〕などのポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；デオキシコール酸、ＣＨＡＰＳなどが挙げられる。前記細胞膜または核膜を破壊する物質は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。可溶化剤における前記細胞膜または核膜を破壊する物質の濃度は、通常、０．１〜２ｗ／ｖ％である。

【0040】

キナーゼの変性または分解を阻害する物質としては、例えば、プロテアーゼインヒビターなどが挙げられるが、特に限定されない。前記プロテアーゼインヒビターとしては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのメタロプロテアーゼインヒビター；ＰＭＳＦ、トリプシンインヒビター、キモトリプシンなどのセリンプロテアーゼインヒビター；ヨードアセトアミド、Ｅ−６４などのシステインプロテアーゼインヒビターなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのキナーゼの変性または分解を阻害する物質は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。可溶化剤における前記キナーゼの変性または分解を阻害する物質の濃度は、通常、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＰＭＳＦの場合、０．５〜１０ｍＭである。

【0041】

前記キナーゼによってリン酸化された基質の分解を抑制する物質としては、脱リン酸化酵素阻害剤などが挙げられるが、特に限定されない。前記脱リン酸化酵素阻害剤としては、フッ化ナトリウムなどのセリン／スレオニン脱リン酸化酵素阻害剤；オルトバナジン酸ナトリウムなどのチロシン脱リン酸化酵素阻害剤などが挙げられるが、特に限定されない。前記キナーゼによってリン酸化された基質の分解を抑制する物質は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。可溶化剤における前記キナーゼによってリン酸化された基質の分解を抑制する物質の濃度は、通常、フッ化ナトリウムでは２５〜２５０ｍＭ、オルトバナジン酸ナトリウムでは０．１〜１ｍＭである。

【0042】

キナーゼによる基質のリン酸化反応は、キナーゼの活性を発現させるのに適した反応用溶液中で行なわれる。前記反応用溶液は、キナーゼの活性を発現させるのに適したｐＨを有する緩衝液、キナーゼの基質、前記ＡＴＰ誘導体、必要に応じて、キナーゼの活性の発現に必要な金属カチオン、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどを含有する。前記緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられる。前記緩衝液のｐＨは、キナーゼの種類などに応じて、適宜決定することができる。例えば、キナーゼがＣＤＫである場合、ｐＨは、通常、６〜８、好ましくは６．５〜７．５である。

【0043】

前記キナーゼの基質は、キナーゼの種類によって適宜選択することができる。キナーゼが低分子量基質型のキナーゼである場合、基質として、当該キナーゼの低分子量基質、例えば、クレアチン、ピルビン酸などを用いることができるが、特に限定されない。また、キナーゼがプロテインキナーゼである場合、基質として、当該プロテインキナーゼの種類に応じた基質タンパク質、当該プロテインキナーゼのリン酸化部位のモチーフ配列を有する基質ペプチドを用いることができるが、特に限定されない。また、前記キナーゼの基質の量は、キナーゼの種類、キナーゼの量などに応じて適宜設定することができる。前記基質は、後述の工程（Ｂ）を固相担体上で行なう場合などには、必要に応じ、ビオチン、ストレプトアビジンなどのように、高い親和性で特異的な結合を生じる物質を含んでいてもよい。

【0044】

本実施形態の測定法では、前記キナーゼは、好ましくはＣＤＫである。この場合、キナーゼとしてＣＤＫの基質を用いることができる。前記ＣＤＫは、正の細胞周期調節因子の１つである。前記ＣＤＫは、通常細胞内では不活性型単体として細胞質に存在し、当該ＣＤＫ自体がリン酸化などによって活性化され、細胞質から核内に移動する。また、核内では、前記ＣＤＫは、核内に存在するサイクリンと結合してＣＤＫとサイクリンとの複合体を形成し、必要な場合はさらに脱リン酸化などを受けて活性型ＣＤＫを形成する。前記活性型ＣＤＫは、細胞周期の様々な段階において、細胞周期の進行を正に調節する。前記ＣＤＫおよびサイクリンの発現プロファイルは、特定のがんに関連していると考えられている。したがって、本実施形態の測定法によって前記ＣＤＫの活性を測定することにより、特定のがんに関する情報を得ることが期待される。前記ＣＤＫとしては、例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８などが挙げられるが、特に限定されない。キナーゼがＣＤＫ１またはＣＤＫ２である場合、キナーゼの基質として、ヒストンＨ１、式（ａ１）：
Ｘａａ¹−Ｐｒｏ−Ｘａａ²−Ｘａａ³ （ａ１）
（Ｘａａ¹はセリン残基またはスレオニン残基、Ｘａａ²は任意のアミノ酸残基、Ｘａａ³はリジン残基またはアルギニン残基を示す。）
で表わされるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する基質ペプチドを用いることができる。式（ａ１）で表わされるアミノ酸配列を有する基質ペプチドとしては、化学的または遺伝子工学的に生成したペプチドであってもよいし、天然に存在するペプチドであってもよい。

【0045】

前記ＡＴＰ誘導体の量は、キナーゼの種類、キナーゼの量などに応じて、適宜設定することができる。

【0046】

キナーゼによる基質のリン酸化反応に際し、反応温度は、キナーゼの種類などに応じて適宜設定することができる。前記反応温度は、通常、３０〜３７℃である。また、反応時間は、キナーゼの種類、キナーゼの量などに応じて適宜設定することができる。前記反応時間は、通常、１０〜６０分間である。

【0047】

工程（Ａ）で得られたＤＮＰ基含有基質は、前記ＡＴＰ誘導体中のＤＮＰ基含有モノリン酸が基質のリン酸化部位に導入された化合物である。したがって、前記ＤＮＰ基含有基質の量を測定することによってキナーゼの活性を測定することができる。

【0048】

本実施形態に係る測定法では、つぎに、工程（Ａ）で得られた混合物と、前記ＤＮＰ基に結合する抗体とを混合し、前記ＤＮＰ基含有基質と前記抗体とを含む複合体を形成させる〔工程（Ｂ）〕。

【0049】

前記ＤＮＰ基に結合する抗体は、前記複合体の検出が容易であることから、標識物質を含む標識抗体であることが好ましい。前記ＤＮＰ基に結合する抗体は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法〔ジョン・イー・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）、１９９２年発行〕などに記載の慣用の方法により、ＤＮＰ基を含む化合物を用いて動物を免疫することによって容易に作製することができる。また、標識物質による抗体の標識は、標識物質の種類に応じた手法に容易に行なうことができる。なお、本実施形態においては、前記抗体の代わりに、当該抗体を精製後、ペプチダーゼなどにより処理することによって得られた抗体断片を用いてもよい。

【0050】

前記標識物質は、酵素であってもよく、蛍光物質であってもよい。

【0051】

前記蛍光物質としては、例えば、ヨードアセチル−フルオレセインイソチオシアネート、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、フルオレセイン−５−マレイミド、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、６−ヨードアセトアミドフルオレセインなどのフルオレセイン誘導体；４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンなどのクマリン誘導体；エオシン−５−マレイミド、エオシン−５−ヨードアセトアミドなどのエオシン誘導体；Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブロモアセトアミドなどのフェナントロリン誘導体；１−ピレンブチリルクロリド、Ｎ−（１−ピレンエチル）ヨードアセトアミド、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド、１−ピレンメチルヨードアセテートなどのピレン誘導体；ローダミンレッドＣ２マレンイミドなどのローダミン誘導体などが挙げられるが、特に限定されない。前記酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。

【0052】

前記ＤＮＰ基含有基質と前記抗体とを含む複合体は、固相担体上に形成させることが好ましい。後の工程において、当該複合体の回収を簡便な操作で行なうことができ、当該複合体の検出を効率よく行なうことができるためである。前記固相担体としては、例えば、磁性ビーズ、マイクロプレートなどが挙げられるが、特に限定されない。固相担体として磁性ビーズを用いる場合、当該磁性ビーズとして、例えば、ストレプトアビジン固定磁性ビーズ、ビオチン固定磁性ビーズなどを用いることができる。ストレプトアビジン固定ビーズまたはビオチン固定磁性ビーズを用いる場合、前記ＤＮＰ基含有基質として、磁性ビーズに固定された物質に結合する物質を含む基質を用いる。例えば、ストレプトアビジン固定ビーズを用いる場合、前記ＤＮＰ基含有基質として、ビオチン標識ＤＮＰ基含有基質を用いることにより、複合体を磁性ビーズ上で形成させることができる。また、ビオチン固定ビーズを用いる場合、前記ＤＮＰ基含有基質として、ストレプトアビジン標識ＤＮＰ基含有基質を用いることにより、複合体を磁性ビーズ上で形成させることができる。

【0053】

前記複合体の形成は、溶液中で行なうことができる。前記溶液は、複合体を形成させるのに適した溶液であればよい。前記溶液は、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング剤などを含有する。前記溶液のｐＨは、前記ＤＮＰ基含有基質および抗体の機能を維持する範囲であればよい。前記溶液のｐＨは、通常、６〜８、好ましくは６．５〜７．５である。

【0054】

前記複合体の形成を溶液中で行なう場合、前記工程（Ｂ）および後述の（Ｃ）の間に、前記複合体が形成された固相担体と、前記溶液とを分離する工程を行なうことができる。これにより、非特異的な夾雑物質などの混入を抑制し、複合体の検出精度を向上させることができる。前記固相担体と前記溶液との分離は、例えば、固相担体として磁性ビーズを用いる場合、磁石で前記磁性ビーズを集めることによって、前記複合体が形成された固相担体と前記溶液とを分離することができる。また、前記固相担体と前記溶液との分離は遠心分離などによって行なってもよい。さらに、非特異的な夾雑物質などの混入を抑制し、複合体の検出精度を向上させる観点から、必要に応じ、前記複合体が形成された固相担体を固相担体洗浄用の洗浄液で洗浄してもよい。

【0055】

つぎに、前記工程（Ｂ）で得られた複合体を検出することによって前記キナーゼの活性を測定する〔工程（Ｃ）〕。

【0056】

前記複合体の検出は、前記抗体が標識物質を含む標識抗体である場合、前記複合体中の標識物質を検出することによって前記活性を測定することができる。具体的には、前記標識物質が蛍光物質である場合、当該蛍光物質に応じた励起光を照射することによってシグナルとしての蛍光を生じさせる。この蛍光の量（強度）を測定することによって、抗体が結合したＤＮＰ基含有基質（反応生成物）の量を測定することができる。この場合、既知量のＤＮＰ基含有基質と蛍光の量（強度）とから作成された検量線を用い、蛍光の量（強度）の測定値からＤＮＰ基含有基質の量を算出する。これにより、算出されたＤＮＰ基含有基質の量を、被検試料中に含まれるキナーゼの活性値として得ることができる。

【0057】

また、前記標識物質が酵素である場合、前記酵素を当該酵素との反応によって発光が生じる酵素基質に作用させることによって発光を生じさせる。この発光の量（強度）を検出することによって、抗体が結合した反応生成物（ＤＮＰ基含有基質）の量を測定することができる。この場合、既知量のＤＮＰ基含有基質と発光の量（強度）とから作成された検量線を用い、発光の量（強度）の測定値からＤＮＰ基含有基質の量を算出する。これにより、算出されたＤＮＰ基含有基質の量を、被検試料中に含まれるキナーゼの活性値として得ることができる。

【0058】

（試薬キット）
本実施形態に係る試薬キットは、前述のキナーゼ活性の測定法に用いるための試薬キットであって、キナーゼの基質と、前述したＡＴＰ誘導体と、前記ＡＴＰ誘導体中のＤＮＰ基に結合する抗体とを含有するものである。本実施形態に係る試薬キットにおけるキナーゼの基質および抗体は、前述のキナーゼ活性の測定法に用いられるキナーゼの基質および抗体と同様である。なお、前記キナーゼの基質は、固相担体に固定されたものであってもよい。

【0059】

本実施形態に係る試薬キットは、キナーゼの基質、前記ＡＴＰ誘導体および抗体がそれぞれ別容器に収容された試薬キットであってもよく、キナーゼの基質、前記ＡＴＰ誘導体および抗体が同一の容器に収容された試薬キットであってもよい。また、本実施形態の試薬キットは、キナーゼの種類に応じて、リン酸化反応時に必要な物質、例えば、金属カチオンなどを含む溶液などをさらに含有していてもよい。また、前記抗体が標識物質としての酵素を有する標識抗体である場合には、当該酵素に対する酵素基質、当該酵素の反応液などをさらに含んでいてもよい。

【実施例】

【0060】

以下、実施例などにより、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、以下において、「ＡＴＰγＤＮＰ」は本実施形態に係るジニトロフェニル基を含むＡＴＰ誘導体、「ＡＴＰγＳ」はアデノシン５’−（γ−チオ三リン酸）〔５’−Ｏ−（ジヒドロキシチオホスフィニルオキシホスホニルオキシホスホニル）アデノシン、メルク社製〕、「ＥＭＣＳ」はＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド〔同仁化学（株）製〕、「ＤＮＰ−Ｌｙｓ」はＮ−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−リジン〔東京化成工業（株）製〕、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、「ＳＭ（ＰＥＧ）_2」はスクシンイミジル−（［Ｎ−マレイミドプロピオンアミド］−ジエチレングリコール）エステル〔サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製〕を示す。

【0061】

実施例１
（１）ＡＴＰγＤＮＰの合成
ＥＭＣＳ９６ｍｇをＤＭＦ３．２ｍＬに溶解させ、１．５当量のＤＮＰ−Ｌｙｓを含む５０ｖ／ｖ％ＤＭＦ溶液と混合し、混合物６ｍＬを得た。得られた混合物６ｍＬを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で２．５倍に希釈した。得られた希釈物を３０℃で１時間静置することにより、ＥＭＣＳとＤＮＰ−Ｌｙｓとを反応させた。その結果、式（ｘ１）で表わされる製造中間体（化合物１）を含む溶液１５ｍＬを得た。

【0062】

【化2】

【0063】

前記ＤＮＰ−Ｌｙｓとの反応に用いられたＥＭＣＳと等モル数のＡＴＰγＳを超純水０．７ｍＬに溶解させ、前記製造中間体（化合物１）を含む溶液１４．５ｍＬに添加した。その後、得られた混合物を３０℃で１時間静置することにより、前記製造中間体（化合物１）とＡＴＰγＳとを反応させた。得られた溶液１５．２ｍＬに、当該溶液の体積の１／２０の量の１Ｍメルカプトエチルアミン溶液を添加し、得られた混合物を３０℃で５分間静置することによって反応を停止させた。

【0064】

得られた反応生成物を含む溶液を、逆相クロマトグラフィーに供して精製した。精製条件は、以下のとおりである。得られた画分を遠心濃縮し、反応生成物を得た。
＜精製条件＞
・検出波長：２６０ｎｍおよび３６０ｎｍ
・使用カラム：Ｃ１８逆相カラム
〔テレダインイスコ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）社製、
商品名：Ｒｅｄｉｓｅｐ Ｒｆ Ｃ１８〕
・カラム温度：室温
・移動相
移動相Ａ： ５０ｍＭテトラエチルアンモニウムブロミド含有水溶液
移動相Ｂ： ５０ｍＭテトラエチルアンモニウムブロミド含有アセトニトリル溶液
移動相ＡおよびＢを用いる濃度勾配
（アセトニトリル濃度：０体積％から４０ｖ／ｖ％までの濃度勾配）
・ 流量： ５ｍＬ／ｍｉｎ

【0065】

（２）反応生成物の同定
得られた反応生成物を５０ｍＭテトラエチルアンモニウムブロミド水溶液で１００倍に希釈し、測定試料を得た。得られた測定試料および参照溶液（５０ｍＭテトラエチルアンモニウムブロミド水溶液）と、分光光度計〔（株）島津製作所社製、商品名：ＵＶ−１８００ＰＣ〕とを用い、波長２２０〜４２０ｎｍの吸光スペクトルを測定した。また、前記反応生成物の代わりに原料であるＡＴＰγＳまたはＤＮＰ−Ｌｙｓを用いたことを除き、前記と同様の操作を行なうことによりに、吸光スペクトルを測定した。ＡＴＰγＳの吸光スペクトルを図２（Ａ）、ＤＮＰ−Ｌｙｓの吸光スペクトルを図２（Ｂ）、反応生成物の吸光スペクトルを図２（Ｃ）に示す。

【0066】

前記（１）において、製造中間体（化合物１）とＡＴＰγＳとの反応時に、製造中間体（化合物１）のマレイミド基とＡＴＰγＳのチオール基とが架橋を形成していると考えられる。また、図２に示された結果から、反応生成物の吸光スペクトルは、波長２６０ｎｍ付近におけるＡＴＰγＳの特徴的なピークおよび波長３６０ｎｍ付近におけるＤＮＰ−Ｌｙｓに特徴的なピークを有していることがわかる。したがって、反応生成物は、式（ｘ２）：

【0067】

【化3】

【0068】

で表わされる化合物２であることが示唆される。なお、式（ｘ２）で表わされる化合物２は、本実施形態に係るＡＴＰ誘導体の１つ（ＡＴＰγＤＮＰ）である。

【0069】

（２）キナーゼ反応（リン酸基転移反応）
９６ウェルフィルタープレート（親水性ＰＶＤＦメンブレン、ミリポア社製）のウェルに免疫沈降用緩衝液〔０．１質量％ノニデットＮＰ−４０と５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）とを含む緩衝液〕７０μＬを入れた。その後、ウェル中の免疫沈降用緩衝液に抗ＣＤＫ１抗体（オペロン社製）１６μｇまたは抗ＣＤＫ２抗体（オペロン社製）８μｇを含む抗体溶液２０μLと、プロテインＡをコートした２０体積％セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社製）３０μＬとを添加した。

【0070】

つぎに、Ｋ５６２細胞を可溶化剤〔組成：０．１ｗ／ｖ％界面活性剤ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）、１×濃度のプロテアーゼ阻害剤〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製、商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ〕、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕中において、マイクロピペットによる吸排攪拌によって可溶化し、細胞破砕物を得た。得られた細胞破砕物を１８０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し、１０．２ｍｇ／ｍＬのＫ５６２可溶化試料を得た。前記Ｋ５６２可溶化試料を前記可溶化剤で４０倍、１６０倍、６４０倍または２５６０倍に希釈した（希釈物における可溶化試料の濃度は、順に２．５％、４．１４％、１．０３％または０．０４％）。得られた各希釈物３０μＬを各ウェルに添加した。その後、各希釈物を添加した後の９６ウェルフィルタープレートを振盪しながら４℃で２時間インキュベーションすることによってＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体との反応またはＣＤＫ２と抗ＣＤＫ２抗体との反応を行なった。

【0071】

反応終了後、ビーズをウェル毎に反応液から回収した。以下において、便宜上、４０倍の希釈物からの反応液より回収されたビーズを「セファロースビーズＡ」、１６０倍の希釈物からの反応液より回収されたビーズを「セファロースビーズＢ」、６４０倍の希釈物からの反応液より回収されたビーズを「セファロースビーズＣ」、２５６０倍の希釈物からの反応液より回収されたビーズを「セファロースビーズＤ」という。セファロースビーズＡ〜Ｄそれぞれをビーズ洗浄液Ａ〔組成：１ｗ／ｖ％ ＮＰ−４０および５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で２回洗浄した。

【0072】

つぎに、洗浄後のセファロースビーズＡ〜Ｄそれぞれをビーズ洗浄液Ｂ〔組成：３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で１回洗浄した。その後、前記セファロースビーズＡ〜Ｄそれぞれをビーズ洗浄液Ｃ〔組成：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で１回洗浄した。

【0073】

つぎに、洗浄後のセファロースビーズＡ〜Ｄそれぞれに、ＣＤＫ基質溶液〔組成：１００ｎｇ／μＬビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチド〔エンゾ（Ｅｎｚｏ）社製、商品名：ＣＤＫ２ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）〕、式（ｘ２）で表わされる化合物２、５４ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）および２０ｍＭ塩化マグネシウム〕５０μＬを添加し、混合物Ａ〜Ｄを得た。化合物２の濃度は、３６２ｎｍの吸光度が２となる濃度であった。この吸光度は、実施例１（２）と同様に測定した。ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドの構造は次の通りであった：Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｈｘ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号：２）。なお、「Ｂｉｏｔｉｎ」はビオチン、「Ａｈｘ」はアミノヘキサン酸（アミノカプロン酸）を示す。

【0074】

得られた混合物Ａ〜Ｄそれぞれを振盪しながら３７℃で２０分間インキュベーションすることによってキナーゼによるリン酸基転移反応を行なった。かかる反応を行なうことにより、ビオチン標識基質ペプチドにＤＮＰ基を導入した。リン酸化反応終了後、各反応液を７６０×ｇで５分間の遠心分離に供し、各濾液を回収した。

【0075】

（３）化学発光を用いるキナーゼの活性の検出
前記（２）で得られた各濾液５０μＬに０．５ｖ／ｖ％ストレプトアビジン標識磁性ビーズ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液３０μＬを添加した。得られた各混合物を３７℃で１０分間振盪しながらインキュベーションすることにより、ビオチン標識ＣＤＫ基質ペプチドを磁性ビーズ上に捕捉した。その後、各濾液から、ビオチン標識ＣＤＫ基質ペプチドが捕捉された磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。以下において、混合物Ａの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズＡ」、混合物Ｂの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズＢ」、混合物Ｃの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズＣ」、混合物Ｄの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズＤ」という。

【0076】

得られた磁性ビーズＡ〜Ｄそれぞれを磁性ビーズ洗浄液〔組成：０．１ｗ／ｖ％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４）および１３８ｍＭ 塩化ナトリウム〕で３回洗浄した。つぎに、洗浄後の磁性ビーズＡ〜Ｄに、アルカリホスフォターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＤＮＰ抗体を含む溶液（抗体量：ＡＬＰ活性として１ユニット）１００μＬを添加した。得られた各混合物を振盪しながら、３７℃で２０分間インキュベーションし、ＤＮＰとＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体とを反応させた。なお、前記ＡＬＰ標識抗ＤＮＰ抗体として、オリエンタル酵母社製のマウス由来抗ＤＮＰ抗体に、アミノ基を介してオリエンタル酵母社製のＡＬＰを結合させた標識抗体を用いた。つぎに、反応後の磁性ビーズＡ〜Ｄを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。

【0077】

得られた磁性ビーズＡ〜Ｄを前記磁性ビーズ洗浄液で３回洗浄した。つぎに、洗浄後の磁性ビーズＡ〜Ｄに、化学発光基質２−クロロ−５−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸ジナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ２−ｃｈｌｏｒｏ−５−（ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ ［３．３．１．１^3,7］ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：ＣＤＰ−ｓｔａｒ〕を含む基質溶液１５０μＬを添加した。得られた各混合物を振盪しながら、３７℃で５分間インキュベーションすることにより、ＡＬＰによるリン酸エステル加水分解反応を行なった。

【0078】

反応終了後、得られた反応液を黒色９６ウェルプレートに移した。その後、反応液が入った黒色９６ウェルプレートをルミノメータ〔ビーエムジーラボテック（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）社製〕に供して各反応液の発光強度を測定した。抗ＣＤＫ１抗体を用いたときの発光強度を「発光強度Ａ１」、抗ＣＤＫ２抗体を用いたときの発光強度を「発光強度Ａ２」という。

【0079】

（４）バックグラウンドの発光強度の測定
前記（２）および（３）において、抗ＣＤＫ１抗体または抗ＣＤＫ２抗体の代わりに、対照としてウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（カルビオケム社製）を用いたことを除き、前記（２）および（３）と同様の操作を行ない、各反応液の発光強度を測定した。ウサギＩｇＧを用いたときの発光強度を「発光強度Ｂ」とする。

【0080】

（５）本実施形態に係る測定法の定量性の検討
発光強度Ａ１、発光強度Ａ２および発光強度Ｂを用い、式（Ａ）または（Ｂ）：
ＣＤＫ１活性に基づく特異的発光強度Ｃ１＝発光強度Ａ１−発光強度Ｂ （Ａ）
ＣＤＫ２活性に基づく特異的発光強度Ｃ２＝発光強度Ａ２−発光強度Ｂ （Ｂ）
にしたがって、ＣＤＫ１活性に基づく特異的発光強度Ｃ１およびＣＤＫ２活性に基づく特異的発光強度Ｃ２を求めた。

【0081】

混合物Ａ〜ＤそれぞれにおけるＣＤＫ１またはＣＤＫ２の濃度（可溶化試料濃度）と、混合物Ａ〜Ｄを用いて得られた各反応液の特異的発光強度Ｃ１または特異的発光強度Ｃ２との関係を調べることにより、本実施形態に係る測定法の定量性を評価した。実施例１において、可溶化試料濃度（ＣＤＫ１濃度）とＣＤＫ１活性に基づく特異的発光強度との関係を調べた結果を図３に示す。実施例１において、可溶化試料濃度（ＣＤＫ２濃度）とＣＤＫ２活性に基づく特異的発光強度との関係を調べた結果を図４に示す。

【0082】

図３に示された結果から、ＣＤＫ１濃度の増加（可溶化試料濃度の増加）に伴ってＣＤＫ１活性に基づく特異的発光強度が増加していることがわかる。また、図４に示された結果から、ＣＤＫ２濃度の増加（可溶化試料濃度の増加）に伴ってＣＤＫ２活性に基づく特異的発光強度が増加していることがわかる。これらの結果から、本実施形態に係る測定法によれば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２などのキナーゼの活性を定量的に測定することができることがわかる。

【0083】

（実施例２）
（１）ＡＴＰγＤＮＰの合成
実施例１と同様の手法により、式（ｘ２）で表わされる化合物２を得た。

【0084】

（２）キナーゼ反応（リン酸基転移反応）
９６ウェルフィルタープレート（親水性ＰＶＤＦメンブレン、ミリポア社製）のウェルに免疫沈降用緩衝液〔０．１質量％ノニデットＮＰ−４０と５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）とを含む緩衝液〕７０μＬを入れた。その後、ウェル中の免疫沈降用緩衝液に抗ＣＤＫ１抗体（オペロン社製）１６μｇを含む抗体溶液２０μＬと、プロテインＡをコートした２０体積％セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社製）３０μＬとを添加した。

【0085】

つぎに、Ｋ５６２細胞を可溶化剤〔組成：０．１ｗ／ｖ％界面活性剤ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）、１×濃度のプロテアーゼ阻害剤〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製、（商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）〕、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕中において、マイクロピペットによる吸排攪拌によって可溶化し、細胞破砕物を得た。得られた細胞破砕物を１８０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し、７．５８ｍｇ／ｍＬのＫ５６２可溶化試料を得た。前記Ｋ５６２可溶化試料を前記可溶化剤で８６倍に希釈した。得られた希釈物３０μＬを各ウェルに添加した。その後、希釈物を添加した後の９６ウェルフィルタープレートを振盪させながら４℃で２時間インキュベーションすることによってＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。

【0086】

反応終了後、得られた反応液からビーズを回収した。回収されたビーズをビーズ洗浄液Ａ〔組成：１ｗ／ｖ％ ＮＰ−４０および５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で２回洗浄した。つぎに、洗浄後のビーズをビーズ洗浄液Ｂ〔組成：３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で１回洗浄した。さらに、洗浄後のビーズをビーズ洗浄液Ｃ〔組成：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で１回洗浄した。

【0087】

つぎに、洗浄後のビーズに、ＣＤＫ基質溶液〔組成：１００ｎｇ／μＬビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチド（エンゾ（Ｅｎｚｏ）社製）、式（ｘ２）で表わされる化合物２、５４ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）および２０ｍＭ塩化マグネシウム〕５０μＬを添加し、混合物を得た。化合物２の濃度は３６２ｎｍの吸光度が２となる濃度であった。この吸光度は、実施例１（２）と同様に測定した。

【0088】

得られた混合物を振盪させながら３７℃で２０分間インキュベーションすることによってキナーゼによるリン酸基転移反応を行なった。かかる反応を行なうことにより、ビオチン標識基質ペプチドにＤＮＰ基を導入した。リン酸化反応終了後、得られた反応液を７６０×ｇ（２０００ｒｐｍ）で５分間の遠心分離に供し、濾液を回収した。

【0089】

（３）化学発光を用いるキナーゼの活性の測定
前記（２）で得られた濾液１０μＬに０．５ｖ／ｖ％ストレプトアビジン標識磁性ビーズ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液３０μＬを添加した。得られた混合物を振盪させながら３７℃で１０分間インキュベーションすることにより、ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドを磁性ビーズ上に捕捉した。その後、濾液から、ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドが捕捉された磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。

【0090】

得られた磁性ビーズを磁性ビーズ洗浄液〔組成：０．１ｗ／ｖ％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）および１３８ｍＭ塩化ナトリウム〕で３回洗浄した。つぎに、洗浄後の磁性ビーズに、抗ＤＮＰ抗体（マウス由来抗ＤＮＰ抗体、オリエンタル酵母社製）を含む溶液（抗体量：０．１ｎｇ／μＬ）１００μＬを添加した。得られた混合物を振盪させながら、３７℃で２０分間インキュベーションし、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体とを反応させた。つぎに、反応後の磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。

【0091】

得られた磁性ビーズを前記磁性ビーズ洗浄液で３回洗浄した。つぎに、洗浄後の磁性ビーズに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」ともいう）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製）を含む溶液（抗体量：１０００倍希釈）１００μＬを添加した。得られた混合物を振盪させながら、３７℃で６０分間インキュベーションし、抗ＤＮＰ抗体のＩｇＧとＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とを反応させた。つぎに、反応後の磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。

【0092】

得られた磁性ビーズを前記磁性ビーズ洗浄液で３回洗浄した。つぎに、洗浄後の磁性ビーズに、化学発光基質〔ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社製、商品名：Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ〕を含む基質溶液１２０μＬを添加した。得られた混合物を振盪させながら、３７℃で５分間インキュベーションした。

【0093】

インキュベーション終了後、得られた反応液を黒色９６ウェルプレートに移した。その後、反応液が入った黒色９６ウェルプレートをルミノメータ〔ビーエムジーラボテック（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）社製〕に供して反応液の発光強度Ａ１を測定した。

【0094】

（４）バックグラウンドの発光強度の測定
前記（２）および（３）において、抗ＣＤＫ１抗体の代わりに、対照としてウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（カルビオケム社製）を用いたことを除き、前記（２）および（３）と同様の操作を行ない、反応液の発光強度Ｂを測定した。

【0095】

（比較例１）
（１）キナーゼ反応（リン酸基転移反応）
９６ウェルフィルタープレート（親水性ＰＶＤＦメンブレン、ミリポア社製）のウェルに免疫沈降用緩衝液〔０．１質量％ノニデットＮＰ−４０と５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）とを含む緩衝液〕７０μＬを入れた。その後、ウェル中の免疫沈降用緩衝液に抗ＣＤＫ１抗体（オペロン社製）１６μｇを含む抗体溶液２０μLと、プロテインＡをコートした２０体積％セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社製）３０μＬとを添加した。

【0096】

つぎに、Ｋ５６２細胞を可溶化剤〔組成：０．１ｗ／ｖ％界面活性剤ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）、１×濃度のプロテアーゼ阻害剤〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製、商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ〕、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕中において、マイクロピペットによる吸排攪拌によって可溶化し、細胞破砕物を得た。得られた細胞破砕物を１８，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し、１０．２ｍｇ／ｍＬのＫ５６２可溶化試料を得た。前記Ｋ５６２可溶化試料を前記可溶化剤で８６倍に希釈した。得られた希釈物３０μＬを各ウェルに添加した。その後、希釈物を添加した後の９６ウェルフィルタープレートを振盪させながら４℃で２時間インキュベーションすることによってＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。

【0097】

反応終了後、得られた反応液からビーズを回収した。回収されたビーズをビーズ洗浄液Ａ〔組成：１ｗ／ｖ％ ＮＰ−４０および５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で２回洗浄した。つぎに、洗浄後のビーズをビーズ洗浄液Ｂ〔組成：３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で１回洗浄した。さらに、洗浄後のビーズをビーズ洗浄液Ｃ〔組成：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）〕で１回洗浄した。

【0098】

つぎに、洗浄後のビーズに、ＣＤＫ基質溶液〔組成：１００ｎｇ／μＬビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチド（エンゾ（Ｅｎｚｏ）社製）、リン酸基供与体としての２ｍＭ ＡＴＰγＳ（メルク社製）、５４ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）および２０ｍＭ塩化マグネシウム〕５０μＬを添加し、混合物を得た。

【0099】

得られた混合物を振盪させながら３７℃で６０分間インキュベーションすることによってキナーゼによるリン酸基転移反応を行なった。かかる反応を行なうことにより、ビオチン標識基質ペプチドにモノチオリン酸基を導入した。リン酸化反応終了後、得られた反応液を７６０×ｇ（２０００ｒｐｍ）で５分間の遠心分離に供し、濾液を回収した。

【0100】

（２）化学発光を用いるキナーゼの活性の測定
前記（１）で得られた濾液１０μＬに、蛍光標識試薬〔組成：０．４ｍＭの５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕、２８５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、４．８ｍＭ ＥＤＴＡおよび４．９ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ〕を添加した。得られた混合物を振盪させながら、遮光下に３７℃で１０分間インキュベーションし、ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドに導入されたモノチオリン酸基と５−ＩＡＦとを反応させた。これにより、ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドに導入されたモノチオリン酸基をフルオレセインで標識した。得られた反応液に、反応停止液〔組成：６０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび２Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）〕添加し、反応を停止させた。

【0101】

得られた反応液１０μＬに０．５ｖ／ｖ％ストレプトアビジン標識磁性ビーズ含有ＨＥＰＥＳ緩衝液３０μＬを添加した。得られた混合物を振盪させながら３７℃で１０分間インキュベーションすることにより、ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドを磁性ビーズ上に捕捉した。その後、濾液から、ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドが捕捉された磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。

【0102】

得られた磁性ビーズを磁性ビーズ洗浄液〔組成：０．１ｗ／ｖ％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４）および１３８ｍＭ 塩化ナトリウム〕で３回洗浄した。つぎに、洗浄後の磁性ビーズに、抗フルオレセイン抗体〔アクリスアンティボディーズ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）社製〕を含む溶液（抗体量：０．４ｎｇ／μＬ）１００μＬを添加した。得られた混合物を振盪させながら、３７℃で６０分間インキュベーションし、フルオレセインと抗フルオレセイン抗体とを反応させた。つぎに、反応後の磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。

【0103】

得られた磁性ビーズを前記磁性ビーズ洗浄液で３回洗浄した。つぎに、洗浄後の磁性ビーズに、化学発光基質〔ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社製、商品名：Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ〕を含む基質溶液１２０μＬを添加した。得られた混合物を振盪させながら、３７℃で５分間インキュベーションした。

【0104】

インキュベーション終了後、得られた反応液を黒色９６ウェルプレートに移した。その後、反応液が入った黒色９６ウェルプレートをルミノメータ〔ビーエムジーラボテック（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）社製〕に供して反応液の発光強度Ａ１を測定した。

【0105】

（３）バックグラウンドの発光強度の測定
前記（１）および（２）において、抗ＣＤＫ１抗体の代わりに、対照としてウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（カルビオケム社製）を用いたことを除き、前記（１）および（２）と同様の操作を行ない、反応液の発光強度Ｂを測定した。

【0106】

（実施例２および比較例１それぞれの測定法の評価）
実施例２で得られた発光強度Ａ１およびＢを用い、Ｓ／Ｎ比〔発光強度Ａ１／発光強度Ｂ〕を求めた。同様に、比較例１で得られた発光強度Ａ１およびＢを用い、Ｓ／Ｎ比〔発光強度Ａ１／発光強度Ｂ〕を求めた。実施例２および比較例１それぞれの測定法を評価した結果を図５に示す。図中、線グラフ（ａ）は実施例２および比較例１それぞれの測定法のＳ／Ｎ比を示す。レーン１は比較例１の測定法の評価結果、レーン２は実施例２の測定法の評価結果を示す。白抜きのバーはＣＤＫ１活性に基づく発光強度Ａ１、黒色のバーはバックグラウンドの発光強度Ｂを示す。

【0107】

図５に示された結果から、比較例１の測定法のＳ／Ｎ比と比べ、実施例２の測定法のＳ／Ｎ比は、著しく高いことがわかる。したがって、これらの結果から、本実施形態に係る測定法によれば、高感度にキナーゼ活性を測定することができることがわかる。

【0108】

（実施例３）
ＳＭ（ＰＥＧ）_２ １００ｍｇをＤＭＦ１ｍＬに溶解させて、得られた溶液０．１１ｍＬを取り、１．５当量のＤＮＰ−Ｌｙｓを含む５０ｖ／ｖ％ＤＭＦ溶液と混合し、混合物０．４９ｍＬを得た。得られた混合物０．４９ｍＬを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で３．９倍に希釈した。得られた希釈物を３０℃で１時間静置することにより、ＳＭ（ＰＥＧ）_２とＤＮＰ−Ｌｙｓとを反応させた。その結果、式（ｙ１）で表わされる製造中間体（化合物３）を含む溶液１．８８ｍＬを得た。

【0109】

【化4】

【0110】

前記ＤＮＰ−Ｌｙｓとの反応に用いられたＳＭ（ＰＥＧ）_２と等モル数のＡＴＰγＳを超純水８８μＬに溶解させ、前記製造中間体（化合物３）を含む溶液１．８１ｍＬに添加した。その後、得られた混合物を３０℃で１時間静置することにより、前記製造中間体（化合物３）とＡＴＰγＳとを反応させた。得られた溶液１．９ｍＬに、当該溶液の体積の１／２０の量の１Ｍメルカプトエチルアミン溶液を添加し、得られた混合物を３０℃で５分間静置することによって反応を停止させた。

【0111】

得られた反応生成物を含む溶液を、逆相クロマトグラフィーに供して精製した。逆相クロマトグラフィーによる精製条件は、以下のとおりである。
＜精製条件＞
・検出波長：２６０ｎｍおよび３６０ｎｍ
・使用カラム：Ｃ１８逆相カラム
〔テレダインイスコ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）社製、
商品名：Ｒｅｄｉｓｅｐ Ｒｆ Ｃ１８〕
・カラム温度：室温
・移動相Ａ： ５０ｍＭテトラエチルアンモニウムブロミド含有水溶液
・移動相Ｂ： ５０ｍＭテトラエチルアンモニウムブロミド含有アセトニトリル溶液
移動相ＡおよびＢを用いるアセトニトリル濃度０体積％から４０ｖ／ｖ％までの濃度勾配
・流量：５ｍＬ／ｍｉｎ

【0112】

得られた精製物を遠心濃縮し、式（ｙ２）：

【0113】

【化5】

【0114】

で表わされる化合物４を得た。

【0115】

また、実施例３において、式（ｘ２）で表わされる化合物２を用いる代わりに、式（ｙ２）で表わされる化合物４を用いることを除き、実施例２と同様に、キナーゼの活性を測定する。その結果、式（ｙ２）で表わされる化合物４を用いた場合のＳ／Ｎ比は、実施例１および２の測定法のＳ／Ｎ比と同様に、比較例１の測定法のＳ／Ｎ比と比べ、高い傾向にあることが示される。

【配列表フリーテキスト】

【0116】

配列番号：１は、キナーゼのリン酸化部位の配列である。１位のＸａａは、Ｓｅｒ（セリン残基）またはＴｈｒ（スレオニン残基）である。３位のＸａａは、任意のアミノ酸残基を示す。４位のＸａａは、Ｌｙｓ（リジン残基）またはＡｒｇ（アルギニン残基）である。
配列番号：２は、ビオチン標識ＣＤＫ２基質ペプチドの配列である。１位のＸａａは、ヒスチジン残基がアミノヘキサン酸（アミノカプロン酸）を介してビオチンで標識されたビオチン標識ヒスチジン残基である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]