特開 2015-203007 ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-203007(P2015-203007A)

(43)【公開日】2015年11月16日

(54)【発明の名称】ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20151020BHJP

   B82Y 30/00 20110101ALI20151020BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20151020BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20151020BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/00ZNA

   B82Y30/00

   B82Y5/00

   B82Y40/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2014-82093(P2014-82093)

(22)【出願日】2014年4月11日

(71)【出願人】

【識別番号】000003609

【氏名又は名称】株式会社豊田中央研究所

(71)【出願人】

【識別番号】000003207

【氏名又は名称】トヨタ自動車株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】391022614

【氏名又は名称】学校法人幾徳学園

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】特許業務法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】星野 文彦

(72)【発明者】

【氏名】今枝 孝夫

(72)【発明者】

【氏名】西田 愛

(72)【発明者】

【氏名】小池 あゆみ

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA63

4H045CA11

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA01

4H045GA15

(57)【要約】      （修正有）

【課題】リング状にナノ粒子構造を安定化させたナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を提供する。
【解決手段】直径２ｎｍ以下の複数のナノ粒子で構成され、かつ、直径４〜１０ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体と、該リング状ナノ粒子構造体を内包するＧｒｏＥＬ変異体と、を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体であって、前記リング状ナノ粒子構造体を構成する複数のナノ粒子が、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空間に内包されている、ことを特徴とするナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

直径２ｎｍ以下の複数のナノ粒子で構成され、かつ、直径４〜１０ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体と、該リング状ナノ粒子構造体を内包するＧｒｏＥＬ変異体と、を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体であって、
前記ＧｒｏＥＬ変異体が、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群から選択される少なくとも一種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなり、
前記リング状ナノ粒子構造体を構成する複数のナノ粒子が、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空間に内包されている、
ことを特徴とするナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体。

【請求項2】

前記リング状ナノ粒子構造体が、直径４〜７ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体。

【請求項3】

前記ナノ粒子が、Ａｕ（金）であることを特徴とする請求項１又は２に記載のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体。

【請求項4】

前記ＧｒｏＥＬ変異体が、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種のヌクレオチドを更に含むことを特徴とする請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体。

【請求項5】

配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群から選択される少なくとも一種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるＧｒｏＥＬ変異体と、
ナノ粒子と、
を接触させて、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットで、前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体を包囲して内包することを含むナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法。

【請求項6】

前記ＧｒｏＥＬ変異体と前記ナノ粒子との接触は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの存在下に行われることを特徴とする請求項５に記載のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、半導体を中心とするエレクトロニクス、オプトエレクトロニクス、メカトロニクス、医療など様々な分野において、ナノスケール材料の必要性がますます高まっている。特に、半導体エレクトロニクス分野においては、素子の微細化によって、高機能、高性能、低消費電力化などが実現されてきた。しかしながらこのような進歩に対し、従来の微細加工技術（トップダウン手法）は技術的障壁やコストなどの経済的障壁に阻まれ、ブレークスルー技術が俟たれていた。一方、自己組織化機能を有するナノスケール材料を利用するボトムアップ手法は、微細加工技術が直面する課題の有力な解決策として注目されている。

【0003】

安定なナノ粒子構造体を得る方法として、例えば、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４２３（６９４０）、ｐ６２８〜６３２、２００３（非特許文献１）には、ＣｄＳナノ粒子を１個入れた高次構造を有するシャペロニンタンパク質が開示されている。しかしながら、このような高次構造を有するシャペロニンタンパク質は、ナノ粒子を蛋白質の内部に入れたのみで複数個入れることはできず、安定なナノ粒子構造体を得るには必ずしも十分ではなかった。

【0004】

また、特開２０１０−１１９３２２号公報（特許文献１）には、基質の保持時間を大幅に長くしたシャペロニンタンパク質変異体を作製し１個のナノ粒子を安定的にタンパク質に内包させる方法が、特開２０１３−１９９４５７号公報（特許文献２）には、特許文献１に記載のタンパク質に５ｎｍのＦｅＰｔナノ粒子を１個内包させる方法が、それぞれ開示されている。同公報の記載によれば、シャペロニン複合体の保持時間が延長されるシャペロニン変異体、及び優れた効率で金属ナノ粒子を内包可能なシャペロニン複合体を提供することが可能となっている。しかしながら、近年は、より高度に安定なナノ粒子構造体、例えば、ナノ粒子の粒径がより小さく、かつ二次元又は三次元構造を有し高密度化したナノ粒子構造体が求められるようになってきた。

【0005】

更に、特表２００５−５１９７８０号公報（特許文献３）には、野生型及び変異型シャペロニンポリペプチドからなるナノ鋳型、ナノ構造、ナノ配列、ナノ装置、それら合成物の作成法及び使用法、それら合成物の製造に使用される特定のシャペロニンポリペプチドに関する技術であり、タンパク質の上部にシステイン残基を遺伝子組換え導入されたシャペロニンタンパク質を二次元結晶にて固定化した基板をテンプレートとし、１．４ｎｍのマレイミド化金ナノ粒子を結合させたナノ構造が開示されている。しかしながら、このようなナノ構造では、二次元又は三次元構造の安定なナノ粒子構造体が得られておらず、安定なナノ粒子構造体を得るには必ずしも十分ではなかった。

【0006】

また、特開２０１２−２５１０号公報（特許文献４）には、金属貯蔵タンパク質フェリチンにより５−７ｎｍ程度の酸化物ナノ粒子を作製し基板上に配列する方法が開示されている。しかしながら、このような配列方法（配置方法）では、ナノ粒子が形成される機序から還元された金属そのもののナノ粒子は不可能で有り、しかも二次元又は三次元構造の安定なナノ粒子構造体が得られておらず、安定なナノ粒子構造体を得るには必ずしも十分ではなかった。

【0007】

更に、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、２０１２，１２、ｐ６２９〜６３３（非特許文献２）には、タバコモザイクウイルスのタンパク質リングを利用し、直径２３ｎｍ程度で３．５ｎｍ〜５ｎｍのナノ粒子により形成されたリングが開示されている。しかしながら、このようなナノ粒子は、タンパク質の外部に配置されているため、安定なナノ粒子構造体を得るには必ずしも十分ではなかった。また、このナノ粒子は、ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィンによりコーティングされているため、ナノ粒子の触媒活性の発現及び粒子間の電子伝達等ができない。

【0008】

また、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、２０１２，１２、ｐ２０５６〜２０５９（非特許文献３）には、リング形状をした蛋白質（ｔｒｐ ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の外側にシステイン残基を変異導入し、これにマレイミド化金ナノ粒子（１．４ｎｍ）を結合させた２０ｎｍ程度のリング状ナノ粒子構造体が開示されている。しかしながら、このようなナノ粒子は、タンパク質の外部に配置されているため、安定なナノ粒子構造体を得るには必ずしも十分ではなかった。また、このナノ粒子は、ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィンによりコーティングされているため、ナノ粒子の触媒活性の発現及び粒子間の電子伝達等ができない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２０１０−１１９３２２号公報

【特許文献2】特開２０１３−１９９４５７号公報

【特許文献3】特表２００５−５１９７８０号公報

【特許文献4】特開２０１２−２５１０号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４２３（６９４０）、ｐ６２８〜６３２、２００３．

【非特許文献2】Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、２０１２，１２、ｐ６２９〜６３３

【非特許文献3】Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、２０１２，１２、ｐ２０５６〜２０５９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及びその製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ナノ粒子構造を特定の配置構造を有するリング状のナノ粒子構造体とすること、及びシャペロニンタンパク質の構造（ＧｒｏＥＬ又はその変異体）を利用しリング状に配列したナノ粒子構造を製造することにより、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及びその製造方法を提供することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0013】

すなわち、本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、直径２ｎｍ以下の複数のナノ粒子で構成され、かつ、直径４〜１０ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体と、該リング状ナノ粒子構造体を内包するＧｒｏＥＬ変異体と、を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体であって、前記ＧｒｏＥＬ変異体が、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群から選択される少なくとも一種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなり、前記リング状ナノ粒子構造体を構成する複数のナノ粒子が、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空間に内包されている、ことを特徴とするものである。

【0014】

上記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、前記リング状ナノ粒子構造体が、直径４〜７ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されていることが好ましい。

【0015】

また、上記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、前記ナノ粒子が、Ａｕ（金）であることが好ましい。

【0016】

また、上記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、前記ＧｒｏＥＬ変異体が、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種のヌクレオチドを更に含むことが好ましい。

【0017】

本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群から選択される少なくとも一種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるＧｒｏＥＬ変異体と、ナノ粒子と、を接触させて、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットで、前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体を包囲して内包することを含むことを特徴とするものである。

【0018】

上記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法においては、前記ＧｒｏＥＬ変異体と前記ナノ粒子との接触は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの存在下に行われることが好ましい。

【0019】

なお、本発明によって上記目的が達成される理由は必ずしも定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。

【0020】

すなわち、本発明者らは、先ず、上記目的を達成するために、安定なナノ粒子構造体を実現するための配置構造等に着目した。安定なナノ粒子構造体とするためには、ナノ粒子の粒径が小さいこと、ナノ粒子に表面コーティングがなく反応面が露出していること、二次元又は三次元構造を有し高密度化かつ凝集抑制がなされていることが重要と考えた。そこで、粒径が小さい複数のナノ粒子で構成されかつ特定の微小領域内に複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体とすることにより、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体及び該構造体を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体が可能となるものと本発明者らは推察する。また、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体及び該構造体を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を作製する方法として、シャペロニンタンパク質の構造（ＧｒｏＥＬ又はその変異体）に着目した。特定構造のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成されるシャペロニン変異体は、優れた効率でナノ粒子が内包されたＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を生成することが可能となる。また、内包されるナノ粒子の粒子径を均一にすることが可能となる。更に、このようなＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、所定の時間経過後には、内包されたナノ粒子を放出することが可能となる。本発明者らは、特定構造のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成されるシャペロニン変異体を利用し、特定構造のＧｒｏＥＬ変異体を構成する複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空間において、前記複数のＧｒｏＥＬサブユニットに対して決まった位置に特定のナノ粒子を配位させることにより、前記空間においてリング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体が得られるものと考えた。そして、前記特定構造のＧｒｏＥＬ変異体と特定のナノ粒子とを接触させて、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットで、前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体を包囲して内包することにより、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体を得ることが可能になるものと本発明者らは推察する。

【発明の効果】

【0021】

本発明によれば、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及びその製造方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】本発明の実施例１にかかるＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）写真の一例を示す図である。

【図2】本発明の実施例１にかかるＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）写真の拡大像の一例を示す図である。

【図3】本発明の実施例１にかかるＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）写真の拡大像の予想図の一例を模式的に示す図である。

【図4】本発明の実施例１にかかるＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）写真の拡大像についてナノ粒子配置の分類分けを行った結果を示す図である。

【図5】本発明の実施例２にかかるＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）写真の一例を示す図である。

【図6】本発明の実施例２にかかるＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）写真の拡大像についてナノ粒子配置の分類分けを行った結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。

【0024】

［ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体］
本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、直径２ｎｍ以下の複数のナノ粒子で構成され、かつ、直径４〜１０ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体と、該リング状ナノ粒子構造体を内包するＧｒｏＥＬ変異体と、を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体であって、前記ＧｒｏＥＬ変異体が、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群から選択される少なくとも一種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなり、前記リング状ナノ粒子構造体を構成する複数のナノ粒子が、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空間に内包されている、ことを特徴とするナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体である。

【0025】

（リング状ナノ粒子構造体）
このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるリング状ナノ粒子構造体としては、直径２ｎｍ以下の複数のナノ粒子で構成され、かつ、直径４〜１０ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されことが必要である。

【0026】

このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるリング状ナノ粒子構造体のナノ粒子の粒子径は、前記ＧｒｏＥＬ変異体に内包可能なものであり、直径２ｎｍ以下であることが必要である。前記ナノ粒子の直径が２ｎｍを超える場合には、高い割合でナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を得ることは極めて困難となる。

【0027】

なお、前記ナノ粒子は、直径が０．５〜２ｎｍであることが好ましい。なお、ナノ粒子の粒子径は、走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）や透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって求められる。また、前記ナノ粒子は１個のナノ粒子からなる１次粒子であっても、複数のナノ粒子からなる２次粒子であってもよい。

【0028】

このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるリング状ナノ粒子構造体のナノ粒子としては、前記ＧｒｏＥＬ変異体に内包可能なものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、セラミックなどの無機ナノ粒子、高分子の固体などの有機ナノ粒子、半導体ナノ粒子、結晶性材料ナノ粒子、非晶性材料ナノ粒子など、又はそれらの組み合わせを用いることができる。

【0029】

金属ナノ粒子としては、実質的に単一の金属元素からなる金属ナノ粒子、２種以上の金属元素を含む合金又は金属化合物からなる金属ナノ粒子、金属元素と非金属元素を含む金属化合物からなる金属ナノ粒子等のいずれであってもよい。また前記金属ナノ粒子は、磁性粒子及び反磁性粒子のいずれでもあってもよく、また導体粒子及び半導体粒子のいずれであってもよい。ここで「実質的に」とは、不可避的に混入する他の元素が含まれることを排除しないことを意味する。具体的には他の元素の含有率が１質量％以下である。

【0030】

前記金属ナノ粒子を構成する金属元素としては、長周期律表（ＩＵＰＡＣ１９９１）の第３周期、第４周期、第５周期、及び第６周期からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属元素を挙げることができる。中でも第２〜１４族から選ばれる少なくとも１種の金属が好ましく、第２族、第４族、第５族、第６族、第７族、第８族、第９族、第１０族、第１１族、第１２族、第１３族、及び第１４族から選ばれる少なくとも１種の金属元素が更に好ましい。

【0031】

前記金属元素としては、具体的には、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、鉄、銅、コバルト、オスミウム、ニッケル、錫、イリジウム、鉄、ルテニウム、マンガン、モリブデン、タングステン、ニオブ、タンタル、チタン、ビスマス、アンチモン、鉛、ケイ素、ゲルマニウム、カドミウム、インジウム、クロムなどが挙げられる。中でも、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ニッケル、チタンからなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。

【0032】

また、上記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、前記ナノ粒子が、Ａｕ（金）からなる金属ナノ粒子であることが特に好ましい。前記金属ナノ粒子の金属元素として金（Ａｕ）を用いることにより、構造及び導体としてより安定な状態を維持することができる。

【0033】

半導体ナノ粒子としては、周期表第１２族元素と周期表第１６族元素を含むか、又は周期表第１１族元素と周期表第１３族元素と周期表第１６族元素を含むか、又は周期表第１３族元素と周期表第１５族元素を含む半導体ナノ粒子が挙げられる。具体的には、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、リン化インジウムなどが挙げられる。

【0034】

このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるリング状ナノ粒子構造体のナノ粒子は、直径４〜１０ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されていることが必要である。ナノ粒子の前記配置領域が前記下限未満では、ナノ粒子の凝集等によりリング状にナノ粒子構造を安定化したナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体とすることが難しい。

【0035】

なお、本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、前記リング状ナノ粒子構造体が、直径４〜７ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されていることが好ましい。

【0036】

また、ナノ粒子の粒子間隔は、０．５〜２ｎｍであることが好ましい。ナノ粒子の粒子間隔が前記下限未満では、凝集した二次粒子となる傾向にあり、また、ナノ粒子の粒子間隔が前記上限を超えると、電子伝導が極端に低くなる傾向にある。なお、前記ナノ粒子の粒子間隔が０．５〜１ｎｍであることが特に好ましい。

【0037】

なお、このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるリング状ナノ粒子構造体のナノ粒子としては、直径が２ｎｍ以下であり、かつ該ナノ粒子に表面コーティングや他の物質などによる表面コート層や表面被覆部がなく該ナノ粒子による反応面が露出したものであることが好ましい。このようなナノ粒子を用いることにより、二次元又は三次元構造を有し高密度化かつ高度に凝集抑制がなされたリング状ナノ粒子構造体とすることができる。

【0038】

（ＧｒｏＥＬ変異体）
このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるＧｒｏＥＬ変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び、配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群から選択される少なくとも一種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む、複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなることが必要である。

【0039】

特定構造のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成されるＧｒｏＥＬ変異体は、優れた効率でナノ粒子が内包されたナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を生成することができる。また、内包されるナノ粒子の粒子径の均一性に優れる。更に、前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、所定の時間経過後には、内包されたナノ粒子を放出可能である。

【0040】

これは、例えば以下のように考えることができる。Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４２３（６９４０）、ｐ６２８〜６３２、２００３．（非特許文献１）に記載の複合体は、ＡＴＰ等の非存在下にシャペロニン分子とＣｄＳナノ粒子の自発的な相互作用により形成されるため、生成効率が充分とは言い難い。一方、本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、ＡＴＰの加水分解速度が抑制されたＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬ変異体を有するため、ＡＴＰ等との存在下に形成されることが可能である。これにより、ＧｒｏＥＬ変異体にナノ粒子が効率的に内包されると考えることができる。また前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、ＧｒｏＥＬ変異体としてＧｒｏＥＬＣｙｓ変異体を用いた場合には、ＧｒｏＥＬＣｙｓ変異体とナノ粒子の相互作用が強化されると考えることができる。

【0041】

また前記ＧｒｏＥＬ変異体は、分散状態にあるナノ粒子を取り込んで、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を形成する。すなわち、前記ＧｒｏＥＬ変異体は凝集状態のナノ粒子とナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を形成しないことから、内包されるナノ粒子の粒子径が均一になると考えることができる。

【0042】

なお、複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなり、ＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空間（空洞）を有するＧｒｏＥＬサブユニット多量体を「ＧｒｏＥＬサブユニット多量体」、ＧｒｏＥＬサブユニットとして少なくとも１つのＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニット多量体を「ＧｒｏＥＬ変異体」、ＧｒｏＥＬ変異体とナノ粒子との複合体を「ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体」と称する。

【0043】

このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるＧｒｏＥＬ変異体に含まれるＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなる第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが必要である。

【0044】

このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体におけるＧｒｏＥＬ変異体に含まれる前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、ＡＴＰの加水分解活性が野生型ＧｒｏＥＬサブユニットよりも低下しているものであれば特に制限はない。前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のうち５２番及び３９８番のアラニン残基以外の位置における、アミノ酸残基の置換、欠失、又は付加した変異部位の数が１５以下であることが好ましく、１０以下であることがより好ましく、５以下であることが更に好ましい。

【0045】

このような本発明の前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体の前記アミノ酸残基の置換（変異）としては、以下のような具体例が挙げられる。

【0046】

一般にタンパク質の機能を維持するためには、置換するアミノ酸残基は、置換前のアミノ酸残基と類似の性質を有するアミノ酸残基であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸残基に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸残基としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸残基としては、Ａｓｐ及びＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸残基としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸残基の置換は好ましく許容される。

【0047】

前記アミノ酸残基の置換は、前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体に機能を追加するものであってもよい。新たな機能を付加する置換の具体例としては、例えば、野生型ＧｒｏＥＬの４９０番のアスパラギン酸残基をシステイン残基に変異させた変異体（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１，Ｓｅｐ；１９（９）：８６１−５．）が挙げられる。かかる変異は、ＧｒｏＥＬ変異体をガラス基板等に固定化することを可能にする。また、２６５番のアスパラギン残基をアラニン残基に変異させた変異体（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０００，Ｊａｎ，２７；２６７（３）：８４２−９．）を挙げることもできる。かかる変異はナノ粒子をより効率的にＧｒｏＥＬ変異体に内包することを可能にする。

【0048】

また、前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、前記第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体と同様の機能を有するものであっても、更に機能が追加されたものであってもよい。これらの具体例としては、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニットにおけるＣ末端の繰返し配列を欠失、付加した変異体（Ｃｅｌｌ，２００６ Ｊｕｎ ２；１２５（５）：９０３−１４．）を挙げることができる。かかる変異は、ＧｒｏＥＬ変異体の空間（空洞）の体積を変化させることを可能とする。

【0049】

更に、前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、用途に応じて、１以上のアミノ酸残基が更に付加したものであってもよい。このような付加可能なアミノ酸残基としては、シグナルペプチド、タグ配列等を構成しうるアミノ酸残基を挙げることができる。

【0050】

前記第二のＧｒｏＥＬ変異体サブユニットとしては、前記具体例として挙げた変異以外の変異を有するものであってもよい。そのような変異としては例えば、Ｃｅｌｌ．２００２，Ｄｅｃ，２７；１１１（７）：１０２７−３９．等に記載された特定のタンパク質をより効率的にフォールディングすることを可能にする変異や、Ｃｅｌｌ．１９９５、Ｎｏｖ１７；８３（４）：５７７−８７．等に記載された単一のリングからなる７量体を形成することを可能にする変異等をあげることができる。

【0051】

前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを通常用いられる方法で発現させることで製造することができる。具体的には、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを、組換えベクターに応じて選択される宿主細胞に感染させて、宿主細胞を培養することで製造することができる。

【0052】

前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の製造方法の詳細については、例えば、特開２００１０−１１９３２２号公報に記載の製造方法を参照することができる。

【0053】

前記ＧｒｏＥＬ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む。すなわち、前記ＧｒｏＥＬ変異体を構成する複数個（好ましくは７個、より好ましくは１４個）のＧｒｏＥＬサブユニットのうち、少なくとも１個は上記のＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。

【0054】

前記ＧｒｏＥＬ変異体は、従来知られているシャペロニン変異体（例えば、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ））と比べて顕著にＡＴＰの加水分解活性が低下している。そのため形成されたナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、所定の時間、安定的にナノ粒子を内包することができる。

【0055】

また、前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの存在下に、ナノ粒子を内包可能であるため、ナノ粒子の内包効率が高く、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を優れた効率で生成することができる。

【0056】

更に、前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、ＧｒｏＥＬ変異体を構成する２つのリングの空間（空洞）に同時にナノ粒子を内包することができるため、より効率的にナノ粒子をナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体内に内包することができる。

【0057】

前記ＧｒｏＥＬ変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニットの数は、リング状ナノ粒子構造体を内包可能であれば特に制限はない。前記ＧｒｏＥＬ変異体はＧｒｏＥＬサブユニットの７量体であることが好ましく、より好ましくは１４量体である。また前記ＧｒｏＥＬ変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニット群のうち、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の総数は少なくとも１とすることができる。前記ＧｒｏＥＬ変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、ＡＴＰの加水分解活性の観点から、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の総数は、７以上であることが好ましく、１４であることがより好ましい。

【0058】

なお、前記ＧｒｏＥＬ変異体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニット群から、通常の条件下、例えば、ＡＴＰ依存的（Ｎａｔｕｒｅ， １９９０ Ｎｏｖ ２２； ３４８（６２９９）： ３３９−４２）に形成される。

【0059】

（ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体）
本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、上記の特定のリング状ナノ粒子構造体と、該リング状ナノ粒子構造体を内包する上記の特定のＧｒｏＥＬ変異体と、を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体であって、前記リング状ナノ粒子構造体を構成する複数のナノ粒子が、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空間（空洞）に内包されていることを特徴とするナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体である。

【0060】

前記ＧｒｏＥＬ変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、ＧｒｏＥＬ変異体はナノ粒子を内包可能な２つの空間（空洞）を有する。前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体において、リング状ナノ粒子構造体は２つの空間（空洞）のうち少なくとも１つに内包されていればよい。なお、リング状ナノ粒子構造体が２つの空間（空洞）の両方に内包されることでリング状ナノ粒子構造体の含有率が高いナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体とすることができる。また、リング状ナノ粒子構造体が１つの空間（空洞）にのみ内包されることで、後述の支持体への接着性に優れるナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体とすることができる。

【0061】

なお、前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体が２つのリング状ナノ粒子構造体を内包可能である場合、それぞれのリング状ナノ粒子構造体は、該リング状ナノ粒子構造体を構成するナノ粒子の数が同一のものでも又は異なったものでも、前記リング状ナノ粒子構造体の配置構造が同一のものでも又は異なったものでも、更に前記ナノ粒子の材質が同一のものであっても、同種又は異種で異なったものであってもよい。

【0062】

ＧｒｏＥＬ変異体の１つの空間（空洞）に内包されるナノ粒子の数は、目的とするリング状ナノ粒子構造体を構成するナノ粒子の数に応じて適宜選択される。内包されるリング状ナノ粒子構造体の観点から、１つの空間（空洞）に内包されるナノ粒子の数は３個以上であることが好ましい。

【0063】

また、上記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、前記ＧｒｏＥＬ変異体が、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種のヌクレオチドを更に含むことが好ましい。前記ＧｒｏＥＬ変異体がＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを更に含むことで、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体に構造変化が生じて、より効率的にＧｒｏＥＬ変異体にナノ粒子を内包しリング状ナノ粒子構造体を形成することができる。

【0064】

なお、前記ＡＤＰ又はＡＴＰの誘導体としては、例えば、ＡＤＰＢｅＦｘ、ＡＭＰＢｅＦｘ、ＡＴＰγＳ、後述するＡＴＰ代替化合物等を挙げることができる。例えば、前記ＧｒｏＥＬ変異体がヌクレオチドとしてＡＤＰＢｅＦｘを含むことで、フットボール型及び弾丸型のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体をより安定化することができる。
また、ＧｒｏＥＬ変異体におけるＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの含有数は、ＧｒｏＥＬ変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、ＧｒｏＥＬ変異体１分子あたりに７分子又は１４分子であることが好ましく、前記ヌクレオチドがＡＤＰ又はその誘導体の場合にはＧｒｏＥＬ変異体１分子あたりに７分子であり、前記ヌクレオチドがＡＴＰ又はその誘導体の場合にはＧｒｏＥＬ変異体１分子あたりに１４分子であることがより好ましい。

【0065】

また、前記ヌクレオチドがＡＤＰ又はＡＴＰの誘導体である場合、ＧｒｏＥＬ変異体におけるヌクレオチド含有数は、誘導体の種類に応じて適宜選択することが好ましい。

【0066】

本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体は、リング状ナノ粒子構造体を内包している。このリング状ナノ粒子構造体は、特定の閉鎖された空間内にリング状にその構造が高密度化され安定化されており、ナノ粒子同士の凝集が抑制し、量子効果を発生させることができるため、光電変換、反応触媒、燃料電池や二次電池などにおける電極材料、反応触媒、燃料電池や二次電池などにおける触媒材料、光電気化学エネルギー変換システムや光電気化学水分解システムなどにおける光電変換素子材料、光捕集アンテナや光応答ナノセンシング素子などの光応答性機能材などの用途に用いることができる。

【0067】

［ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法］
本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番及び３９８番のアラニン残基以外の１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群から選択される少なくとも一種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるＧｒｏＥＬ変異体と、ナノ粒子と、を接触させて（接触工程）、前記ＧｒｏＥＬ変異体の複数のＧｒｏＥＬサブユニットで、前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体を包囲して内包することを含むことを特徴とするものである。

【0068】

このような本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法における接触工程においては、前記ＧｒｏＥＬ変異体と前記ナノ粒子とを接触させる方法としては、特に制限されず、公知の方法を適宜採用することができる。例えば、適当な緩衝液中で、ＧｒｏＥＬ変異体とナノ粒子とを混合する方法、あらかじめ準備したＧｒｏＥＬ変異体分散液及びたナノ粒子分散液（又はナノ粒子コロイド溶液など）とを混合する方法、等を挙げることができる。ＧｒｏＥＬ変異体とナノ粒子とを混合する方法としては、通常用いられる攪拌方法から適宜選択して用いることができる。例えば、マイクロチューブ中で、ピペティングにより混合する方法、ローテーターを用いて混合する方法、ボルテックスを用いて混合する方法等を挙げることができる。ＧｒｏＥＬ変異体とナノ粒子とを接触させる温度としては、例えば４〜６０℃とすることができ、２５〜３７℃であることがより好ましい。接触時間は例えば１〜６０分間であることが好ましく、１〜２分間であることがより好ましい。

【0069】

前記緩衝液としては、通常用いられる緩衝液から適宜選択して用いることができる。例えば、ＨＫＭ−Ｄ、ＨＫ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ等を挙げることができる。

【0070】

前記緩衝液のｐＨとしては５〜９であることが好ましく、７〜８であることがより好ましい。ｐＨの調整には例えば、ＫＯＨ、ＮａＯＨ等の無機塩基や、ＨＣｌ等の無機酸を用いることができる。

【0071】

前記緩衝液は、無機塩を更に含むことが好ましい。無機塩としては、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、Ｎａ_２ＳＯ_４等を挙げることができる。中でもナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の生成効率の観点から、ＫＣｌ及びＭｇＣｌ_２を含むことが好ましい。

【0072】

前記緩衝液の濃度としては、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の生成効率の観点から、１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、２０ｍＭ〜４０ｍＭであることがより好ましい。

【0073】

前記緩衝液が無機塩としてＫＣｌを含む場合、ＫＣｌの濃度は１ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましく、５０ｍＭ〜１００ｍＭであることがより好ましい。また前記緩衝液が無機塩としてＭｇＣｌ_２を含む場合、ＭｇＣｌ_２の濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、４ｍＭ〜６ｍＭであることがより好ましい。

【0074】

前記接触工程におけるＧｒｏＥＬ変異体とナノ粒子の混合比率は特に制限されない。例えば、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の生成効率の観点から、ＧｒｏＥＬ変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニット１μｍｏｌあたりにナノ粒子を０．１〜１０ｍｇ混合することが好ましく、１〜１０ｍｇ混合することがより好ましい。
上記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法においては、前記ＧｒｏＥＬ変異体と前記ナノ粒子との接触は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの存在下に行われることが好ましい。また、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、金属イオン（好ましくは、マグネシウムイオン）の存在下に行われることがより好ましい。これにより優れた生成効率でリング状ナノ粒子構造体が内包されたナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を生成することができる。

【0075】

前記ＧｒｏＥＬ変異体が２つの空間（空洞）を有し、前記接触工程をＡＴＰの存在下に行う場合、ＧｒｏＥＬ変異体の２つの空間（空洞）の両方にリング状ナノ粒子構造体が内包されたフットボール型のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を優先的に得ることができる。

【0076】

一方、前記ＧｒｏＥＬ変異体が２つの空間（空洞）を有し、前記内包工程をＡＤＰの存在下に行う場合、ＧｒｏＥＬ変異体の２つの空間（空洞）の一方にのみリング状ナノ粒子構造体が内包された弾丸型のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を優先的に得ることができる。

【0077】

更に、前記接触工程を、ＧｒｏＥＬ変異体、第一のナノ粒子、及びＡＤＰの存在下に行って、ＧｒｏＥＬ変異体の２つの空間（空洞）の一方に第一のナノ粒子が内包された第一のＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を得た後、第一のＧｒｏＥＬ蛋白質複合体と、第二のナノ粒子とを、ＡＴＰの存在下に接触させることで、第一のナノ粒子と第二のナノ粒子とが１つのＧｒｏＥＬ変異体に内包されリング状ナノ粒子構造体を形成したハイブリッド型のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を得ることもできる。
前記接触工程においては、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ代替化合物を用いてもよい。ＡＴＰ代替化合物としては、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体のＡＴＰ結合部位に結合可能で、ＧｒｏＥＬ変異体の構造変化を引き起こすことが可能な化合物であれば特に制限はない。例えば、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物（Ｊ．Ｂｉｏｌ．、Ｃｈｅｍ．、２７９、４５７３７−４５７４３（２００４）．）、ＡＤＰとフッ化アルミニウムやフッ化ガリウムの付加物（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００３，Ｍａｙ，２３；３２９（１）：１２１−３４．）等を挙げることができる。

【0078】

前記接触工程をＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの存在下に行う場合、ＧｒｏＥＬサブユニットに対して、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを１０^３〜１０^６のモル比で用いることが好ましく、１０^３〜１０^４のモル比で用いることがより好ましい。

【0079】

前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法は、前記接触工程に加えて、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の精製工程、修飾工程等を更に含んでいてもよい。前記精製工程としては、例えば、クロマトグラフィーにより分離する方法、限外ろ過する方法、等を挙げることができる。

【0080】

［リング状ナノ粒子構造体］
なお、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体を得ることを目的として、前記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及び前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法に得られたナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体から蛋白質を除去することにより、直径２ｎｍ以下の複数のナノ粒子で構成され、かつ、直径４〜１０ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されたリング状ナノ粒子構造体を得ることができる。

【0081】

このようなリング状ナノ粒子構造体においては、前記リング状ナノ粒子構造体が、直径４〜７ｎｍの間の領域内に前記複数のナノ粒子が離間した状態でリング状に配置されていることが好ましい。また、ナノ粒子の粒子間隔は０．５〜２ｎｍであることが好ましい。

【0082】

また、このようなリング状ナノ粒子構造体としては、ナノ粒子が直径が２ｎｍ以下のＡｕナノ粒子であり、かつ該ナノ粒子に表面コーティングや他の物質などによる表面コート層や表面被覆部がなく該ナノ粒子による反応面が露出したものであることが好ましい。このようなナノ粒子を用いることにより、二次元又は三次元構造を有し高密度化かつ高度に凝集抑制がなされたリング状ナノ粒子構造体とすることができる。

【0083】

なお、このようなリング状ナノ粒子構造体においては、前記リング状ナノ粒子構造体は、目的とする用途に応じて支持体（基材）上に結合又は付着などして配置したものであることが好ましい。

【0084】

このようなリング状ナノ粒子構造体に用いる支持体（基材）としては、特に制限されず、通常用いられる支持体から、目的に応じて適宜選択して用いることができる。支持体としては、例えば、ガラス基材、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリシリケート、ポリカーボネート、ナイロン、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能基化シラン、ポリプロピルフマラート、フェノール樹脂等の有機基材、アルミナ、金、銀、白金、イリジウム、タングステン、銅、コバルト、ニッケル、鉄等の金属基材、カーボン、セラミック等の無機基材、半導体基材、などを挙げることができる。また、基材は、チューブ、プレート、膜、マイクロアレイ、ファイバー、フィルム、ビーズ、チップ、粒子及び微粒子を含む任意の有用な形を持つことができる。

【0085】

このようなリング状ナノ粒子構造体は、特定の微小領域内にリング状にその構造が高密度化され安定化されており、ナノ粒子同士の凝集が抑制され量子効果を発生させることができるため、光電変換、反応触媒、燃料電池や二次電池などにおける電極材料、反応触媒、燃料電池や二次電池などにおける触媒材料、光電気化学エネルギー変換システムや光電気化学水分解システムなどにおける光電変換素子材料、光捕集アンテナや光応答ナノセンシング素子などの光応答性機能材などの用途に用いることができる。

【0086】

このようなリング状ナノ粒子構造体の製造方法としては、前記本発明のナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及び前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の製造方法に得られたナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体から蛋白質を除去する（蛋白質除去工程）ことを特徴とするものである。このような前記蛋白質除去工程において、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体から蛋白質を除去する方法としては、特に制限されず、公知の方法を適宜採用することができる。このような除去方法としては、例えば、前記ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を乾燥又は加熱処理する方法等が挙げられる。なお、このような方法としては、酸素雰囲気での熱処理又はＵＶオゾン処理等により行うことが好ましい。これより、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体から蛋白質を除去してリング状ナノ粒子構造体を得ることができる。なお、このようなリング状ナノ粒子構造体は、所望の支持体や基板に配置又は固定して用いることができる。

【実施例】

【0087】

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0088】

（実施例１）
［ＧｒｏＥＬ蛋白質の調製］
配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体（野生型ＧｒｏＥＬの５２番目のアスパラギン酸をアラニンに、３９８番目のアスパラギン酸をアラニンにそれぞれ変異させた変異体：以下、名称「ＧｒｏＥＬ」、略称「ＤＲ体」ともいう）を、特開２０１０−１１９３２２号公報に記載の方法に準じて調製した。なお、ＧｒｏＥＬは、硫安沈殿として冷蔵保存した。

【0089】

次に、前記冷蔵保存していたＧｒｏＥＬを、可溶化後、脱塩カラムにより脱塩した。すなわち、先ず、冷蔵保存していたＧｒｏＥＬ硫安沈殿１００μＬを、二度遠心分離（それぞれ１４０００ｒｐｍ×５分）した。次いで、ＨＫＭ−Ｄ緩衝液（ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）が２０ｍＭ、ＫＣｌが１００ｍＭ、ＭｇＣｌ_２が５ｍＭ、ＡＤＰが５ｍＭ）に前記沈殿物を加えてピペッティングにより可溶化した。透析後、ＨＫＭ−Ｄ緩衝液で平衡化した脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ＮＡＰ−５）へアプライした。なお、脱塩カラムへのアプライは、０．４ｍＬのＨＫＭ−Ｄ緩衝液をアプライした後、続いて０．１ｍＬのＨＫＭ−Ｄ緩衝液をアプライし、得られたＧｒｏＥＬ蛋白質０．６ｍＬ分をポリエチレン製エッペンチューブに入れた。

【0090】

次に、得られたＧｒｏＥＬ蛋白質の吸光度Ａ２８０ｎｍを測定して蛋白質の定量を行った後、溶出画分を冷蔵保存した。

【0091】

［ナノ粒子溶液の調整］
Ａｕナノ粒子のコロイド溶液（ＡＴＲ社製、品番：Ａ１１−１．８−２５）を準備し、脱塩カラムによりバッファー交換を行った。すなわち、先ず、Ａｕナノ粒子コロイド溶液をＨＫ緩衝液（ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）が２０ｍＭ、ＫＣｌが１００ｍＭ）で平衡化した脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ＮＡＰ−５）にかけ、０．４ｍＬのＨＫ緩衝液をアプライし、次いで０．１ｍＬのＨＫ緩衝液をアプライし、得られたＡｕナノ粒子溶液０．６ｍＬ分をポリエチレン製エッペンチューブに入れた。次に、目視にて溶出画分を判別し、溶出画分を冷蔵保存した。

【0092】

［ＧｒｏＥＬ蛋白質へのＡｕナノ粒子の内包］
得られたＧｒｏＥＬ蛋白質のＨＫＭ−Ｄ緩衝液分散液及びＡｕナノ粒子のＨＫ緩衝液分散液を用いて、マイクロチューブに最終濃度がそれぞれ以下のようになるように各材料を順次添加して、ナノ粒子内包蛋白質溶液を作製した。

【0093】

すなわち、先ず、マイクロチューブに（Ａ）ＧｒｏＥＬ蛋白質のＨＫＭ−Ｄ緩衝液分散液（ＧｒｏＥＬ：０．１μＭ、ＨＫＭ−Ｄ緩衝液：１０μＬ）と（Ｂ）Ａｕナノ粒子のＨＫ緩衝液分散液（１０μＬ）を添加し、室温で１０秒間マイクロピペットで混合後、１分間静置した。次に、（Ａ）と（Ｂ）の混合分散液に（Ｃ）ＨＫＭ緩衝液（ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）が２０ｍＭ、ＫＣｌが１００ｍＭ、ＭｇＣｌ_２が５ｍＭ）８０μＬを添加し、室温で１０秒間マイクロピペットで混合した。次いで、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の混合分散液に（Ｄ）ＡＴＰ（１０ｍＭ）１０ｕＬを添加し、室温で１０秒間マイクロピペットで混合してＡｕナノ粒子内包蛋白質溶液を作製した。

【0094】

＜ＴＥＭ観察＞
得られたナノ粒子内包蛋白質溶液について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、日本電子（株）製，ＪＥＭ−２０００ＥＸ）により写真を撮影し、その写真上の画像からＡｕナノ粒子の配置形態を観察した。

【0095】

先ず、ナノ粒子内包蛋白質溶液１０μＬを、プラズマ処理したカーボン支持膜（Ｃｕ２００メッシュ）グリッド上に載せ、１分間静置した。次に、純水５００μＬの水滴にグリッドを浮かべ、洗浄し、余分な溶液を濾紙で吸い取った。次いで、２％酢酸ウラン水溶液１０μＬで染色を行い、余分な溶液は濾紙で吸い取った。次に、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて加速電圧２００ｋＶで観察した。得られた透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を図１に示す。

【0096】

図１に示した結果から明らかなとおり、蛋白質由来の輪郭の内部にＡｕナノ粒子が存在する像が確認され、Ａｕナノ粒子がＧｒｏＥＬ蛋白質に内包しているＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体が得られていることが確認された。なお、本実施例では、ＧｒｏＥＳ蛋白質を用いることなくＡｕナノ粒子をＧｒｏＥＬ蛋白質に内包できることが確認された。

【0097】

次に、図１中の任意の１個のＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を拡大して、Ａｕナノ粒子の配置を観察した。Ａｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の拡大像を、図２に示す。また、図２のＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体の拡大像の予想図を、図３に示す。

【0098】

図２及び図３に示した結果から明らかなとおり、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体において、一つのナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体において、直径１．８ｎｍ程度のＡｕナノ粒子が、直径８．５ｎｍの間の領域内に６つのＡｕナノ粒子が離間した状態（粒子間隔が約１．２ｎｍ程度）でリング状に配置されていることが確認された。これより、７量体であるサブユニットに対して決まった位置にＡｕナノ粒子が１対１で存在している（配位している）ことが確認された。また、図１中に示された他のＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、直径１．８ｎｍ程度のＡｕナノ粒子が、直径８．５ｎｍ程度の間の領域内に３つ〜６つのＡｕナノ粒子が離間した状態（粒子間隔が約１．２ｎｍ程度）でリング状に配置されていることが確認された。なお、図１中に示された他のＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、Ａｕナノ粒子が存在するものの、Ａｕナノ粒子がランダム配置したものなど、リング状配置構造とはならなかったものも存在した。

【0099】

次いで、得られた全てのナノ粒子−蛋白質複合体の画像について、Ａｕナノ粒子配置の分類分けを行った。得られた全てのナノ粒子−蛋白質複合体のＴＥＭ写真図を図４に示す。２つの変異体についてカウントした結果を表１に示す。

【0100】

【表1】

【0101】

図４及び表１に示した結果から明らかなとおり、ＧｒｏＥＬ蛋白質（ＤＲ体）においてＡｕナノ粒子が配位していることが確認され、蛋白質の内部に２個以上あって配位の可能性があるナノ粒子−蛋白質複合体の比率は３０％程度であり、Ａｕナノ粒子が積極的に蛋白質内部に集積し、更には決まった部位に吸着していることが確認された。

【0102】

なお、本実施例においては、配位が確認されたＡｕナノ粒子の最大個数は６個であり、Ａｕナノ粒子とシステイン残基の相互作用を強化させたり、ＧｒｏＥＬ蛋白質の高次構造を安定化させたりすることで、理想的に７個が配位したリング状ナノ粒子の構造体が得られることが確認された。

【0103】

（実施例２）
ワイルドタイプのＧｒｏＥＬ（野生型ＧｒｏＥＬ）のＣ末端にシステインを導入した変異体（以下、名称「ＧｒｏＥＬＣｙｓ変異体」、略称「ＤＲ−Ｃ体」ともいう）を、特開２０１０−１１９３２２号公報に記載の方法に準じて調製した。なお、ＧｒｏＥＬＣｙｓ変異体は、硫安沈殿として冷蔵保存した。

【0104】

次に、冷蔵保存していたＧｒｏＥＬＣｙｓ変異体を用い、実施例１と同様にしてＧｒｏＥＬ蛋白質のＨＫＭ−Ｄ緩衝液分散液を得、蛋白質の定量を行った後、溶出画分を冷蔵保存した。

【0105】

次いで、実施例１と同様にしてＡｕナノ粒子のＨＫ緩衝液分散液を得、得られたＧｒｏＥＬ蛋白質のＨＫＭ−Ｄ緩衝液分散液及びＡｕナノ粒子のＨＫ緩衝液分散液を用いて、実施例１と同様にしてＡｕナノ粒子内包蛋白質溶液を得た。

【0106】

次に、得られたナノ粒子内包蛋白質溶液について、実施例１と同様にしてＴＥＭ観察を行った。得られた透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を図５に示す。

【0107】

図５に示した結果から明らかなとおり、蛋白質由来の輪郭の内部にＡｕナノ粒子が存在する像が確認され、Ａｕナノ粒子がＧｒｏＥＬ蛋白質に内包しているＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体が得られていることが確認された。なお、本実施例では、ＧｒｏＥＳ蛋白質を用いることなくＡｕナノ粒子をＧｒｏＥＬ蛋白質に内包できることが確認された。

【0108】

次に、図５中の任意の１個のＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体を拡大して、Ａｕナノ粒子の配置を観察した。その結果、ナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体において、一つのナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体において、直径２ｎｍ程度のＡｕナノ粒子が、直径１０ｎｍの間の領域内に６つのＡｕナノ粒子が離間した状態（粒子間隔が約１ｎｍ程度）でリング状に配置されていることが確認された。また、図５中に示された他のＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、直径２ｎｍ程度のＡｕナノ粒子が、直径１０ｎｍ程度の間の領域内に３つ〜６つのＡｕナノ粒子が離間した状態（粒子間隔が約１．２ｎｍ程度）でリング状に配置されていることが確認された。なお、図５中に示された他のＡｕナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体においては、Ａｕナノ粒子が存在するものの、Ａｕナノ粒子がランダム配置したものなど、リング状配置構造とはならなかったものも存在した。

【0109】

次いで、得られた全てのナノ粒子−蛋白質複合体の画像について、Ａｕナノ粒子配置の分類分けを行った。得られた全てのナノ粒子−蛋白質複合体のＴＥＭ写真図を図６に示す。２つの変異体についてカウントした結果を表１に示す。

【0110】

図６及び表１に示した結果から明らかなとおり、ＧｒｏＥＬ蛋白質（ＤＲ体）においてＡｕナノ粒子が配位していることが確認され、蛋白質の内部に２個以上あって配位の可能性があるナノ粒子−蛋白質複合体の比率は５３％程度で前記実施例１より高く、Ａｕナノ粒子が積極的に蛋白質内部に集積し、更には決まった部位に吸着していることが確認された。

【0111】

なお、本実施例においては、配位が確認されたＡｕナノ粒子の最大個数は６個であり、Ａｕナノ粒子とシステイン残基の相互作用を強化させたり、ＧｒｏＥＬ蛋白質の高次構造を安定化させたりすることで、理想的に７個が配位したリング状ナノ粒子の構造体が得られることが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0112】

以上説明したように、本発明によれば、リング状にナノ粒子構造を安定化させたリング状ナノ粒子構造体を有するナノ粒子−ＧｒｏＥＬ蛋白質複合体及びその製造方法を提供することができる。なお、このリング状ナノ粒子構造体は、粒径が小さい複数のナノ粒子で構成されかつ特定の閉鎖された空間内にリング状にその構造が高密度化され安定化されている。したがって、ナノ粒子同士の凝集が抑制し、量子効果を発生させることができるため、光電変換、反応触媒、燃料電池や二次電池などにおける電極材料、反応触媒、燃料電池や二次電池などにおける触媒材料、光電気化学エネルギー変換システムや光電気化学水分解システムなどにおける光電変換素子材料、光捕集アンテナや光応答ナノセンシング素子などの光応答性機能材などの用途に用いることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]