特開 2015-209426 高い薬剤ロード量を有する抗体−薬剤コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-209426(P2015-209426A)

(43)【公開日】2015年11月24日

(54)【発明の名称】高い薬剤ロード量を有する抗体−薬剤コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20151027BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20151027BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20151027BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20151027BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20151027BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20151027BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/00ZNA

   C12P21/08

   C12P21/02 B

   A61K39/395 C

   A61K39/395 L

   A61P35/00

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   G01N33/574 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】32

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】89

(21)【出願番号】特願2015-88055(P2015-88055)

(22)【出願日】2015年4月23日

(31)【優先権主張番号】61/984,645

(32)【優先日】2014年4月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/028,731

(32)【優先日】2014年7月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/103,999

(32)【優先日】2015年1月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/147,293

(32)【優先日】2015年4月14日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】505129415

【氏名又は名称】ライナット ニューロサイエンス コーポレイション

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(72)【発明者】

【氏名】パヴェル ストラップ

(72)【発明者】

【氏名】キャサリーン アンネ デラリア

(72)【発明者】

【氏名】マグダレーナ ドリュウォルスカ

(72)【発明者】

【氏名】ダヴィデ ルシアノ フォレッティ

(72)【発明者】

【氏名】ラッセル ジョージ ダッシン

(72)【発明者】

【氏名】デイヴッド ルイス シェルトン

(72)【発明者】

【氏名】アーヴィンド ラジュパル

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064CA10

4B064CA19

4B064CA21

4B064CC24

4B064CE10

4B064CE12

4B064DA05

4B064DA14

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA19

4C085AA22

4C085AA25

4C085AA26

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085CC31

4C085CC32

4C085DD32

4C085DD51

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA51

4H045FA70

4H045GA21

4H045GA26

(57)【要約】      （修正有）

【課題】高い薬剤ロード量を有する抗体−薬剤コンジュゲートを作製する方法および使用する方法の提供。
【解決手段】高い薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）を有するトランスグルタミナーゼ介在性の抗体−薬剤コンジュゲートであって、１）グルタミン含有タグ、内因性グルタミン、および／または抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって（例えば、基質特異性の変化によって）反応性にされた内因性グルタミンと、２）アミンドナー単位、リンカーおよび作用物質部分を含むアミンドナー物質とを含み、ＤＡＲが少なくとも約５である、抗体−薬剤コンジュゲート。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式
抗体−（Ｔ−（Ｘ−Ｙ−Ｚ_ａ）_ｂ）_ｃ
［式中、
Ｔは、１）特異的部位で操作されたグルタミン含有タグ、２）内因性グルタミン、および／または３）抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンであり、
Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分であり、
Ｘ−Ｙ−Ｚは、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質であり、
ａは１〜６の整数であり、
ｂは１〜６の整数であり、
ｃは１〜２０の整数であり、
ａ、ｂおよびｃの積（薬剤−抗体比率）は少なくとも約５である］
を含む抗体−薬剤コンジュゲート。

【請求項2】

抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディまたは抗体断片である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項3】

Ｔが、少なくとも１つの内因性グルタミンまたは反応性の内因性グルタミンを含む、請求項１または２に記載のコンジュゲート。

【請求項4】

反応性の内因性グルタミンが、脱グリコシル化によってまたは抗体の別のアミノ酸のアミノ酸修飾によって反応性にされている、請求項１から３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項5】

別のアミノ酸修飾が、２９７位（ＥＵナンバリングスキーム）における置換である、請求項４に記載のコンジュゲート。

【請求項6】

２９７位における置換が、アスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換またはＮからアラニン（Ａ）への置換である、請求項５に記載のコンジュゲート。

【請求項7】

抗体が、Ｋ２２２位、Ｋ３４０位および／またはＫ３７０位に第２のアミノ酸修飾をさらに含む、請求項５に記載のコンジュゲート。

【請求項8】

第２のアミノ酸修飾が、リジンからアルギニンへの置換である、請求項７に記載のコンジュゲート。

【請求項9】

アミンドナー物質が、１）軽鎖、重鎖または軽鎖および重鎖の両方のいずれかのカルボキシル末端、２）軽鎖、重鎖または軽鎖および重鎖の両方のいずれかのアミノ末端、ならびに３）Ｓ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９〜Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７、および／またはＧ３８５からなる群から選択される抗体の少なくとも１つまたは複数の位置でグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしており、グルタミン含有タグが、抗体に挿入されているか、または抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸と置き換わっている、請求項１から８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項10】

ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、
ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグと
を含み、薬剤−抗体比率が約５〜７である、請求項８に記載のコンジュゲート。

【請求項11】

アミンドナー物質が、Ｓ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９〜Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７およびＧ３８５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしており、グルタミン含有タグが、抗体に挿入されているか、または抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸と置き換わっており、薬剤−抗体比率が少なくとも約６である、請求項１０に記載のコンジュゲート。

【請求項12】

アミンドナー物質が、抗体重鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしており、薬剤−抗体比率が約６〜９である、請求項１０に記載のコンジュゲート。

【請求項13】

アミンドナー物質が、抗体重鎖中のアミノ酸位置Ｔ１３５の後に挿入されたグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしており、薬剤−抗体比率が約６〜９である、請求項１０に記載のコンジュゲート。

【請求項14】

アミンドナー物質が、抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２でグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしており、内因性アミノ酸残基がグルタミン含有タグに置き換えられており、薬剤−抗体比率が約６〜１１である、請求項１０または１３に記載のコンジュゲート。

【請求項15】

ａ）抗体軽鎖のカルボキシル末端で、
ｂ）抗体重鎖のアミノ酸位置Ｔ１３５の後で、および
ｃ）抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２で
グルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質を含み、内因性アミノ酸残基がグルタミン含有タグに置き換えられており、薬剤−抗体比率が約５〜７である、請求項８に記載のコンジュゲート。

【請求項16】

グルタミン含有タグが、Ｑ、ＬＱＧ、ＬＬＱＧＧ（配列番号１）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号３）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４）、ＧＬＬＱＧ（配列番号５）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号６）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱ（配列番号９）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＰＧＫ（配列番号２５）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号２６）、ＬＬＱＧＰ（配列番号２７）、ＬＬＱＰ（配列番号２８）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号２９）、ＬＬＱＡＰＧＫ（配列番号３０）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号３１）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号３２）、およびＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項17】

グルタミン含有タグが、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＱＧ、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、またはＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）である、請求項１６に記載のコンジュゲート。

【請求項18】

アミンドナー単位−リンカー（Ｘ−Ｙ）が、直鎖状または分岐鎖状である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項19】

アミンドナー単位−リンカー（Ｘ−Ｙ）が、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（アセチル−リジン−グリシン）、アミノカプロン酸、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ（アセチル−リジン−β−アラニン）、アミノ−ＰＥＧ２（ポリエチレングリコール）−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ（アセチル−リジン−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、［（３Ｓ，５Ｓ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、プトレシンおよびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシンからなる群から選択される、請求項１８に記載のコンジュゲート。

【請求項20】

作用物質部分が、細胞傷害物質である、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項21】

細胞傷害物質が、アントラサイクリン、オーリスタチン、カンプトセシン、コンブレタスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、マイタンシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、タキサン、ビンカアルカロイド、ツブリシン、ヘミアステリン、スプリセオスタチン、プラジエノライド、またはそれらの立体異性体、アイソスター、類似体もしくは誘導体から選択される、請求項２０に記載のコンジュゲート。

【請求項22】

アミンドナー物質が、Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ−ＬｙｓＧｌｙ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ−６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ−６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１、プトレシニル−ゲルダナマイシン、Ａｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシン、アミノカプロイル−３３７７、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−３３７７、アミノカプロイル−０１３１、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−０１３１、アミノカプロイル−０１２１、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−０１２１、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、２−アミノエトキシ−ＰＥＧ６−ＮＯＤＡＧＡ、およびＮ^２アセチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（２−｛［（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ）−８−ヒドロキシ−７−｛（１Ｅ，３Ｅ）−５−［（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−５−｛［（２Ｚ，４Ｓ）−４−ヒドロキシペンタ−２−エノイル］アミノ｝−３，６−ジメチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］−３−メチルペンタ−１，３−ジエン−１−イル｝−１，６−ジオキサスピロ［２．５］オクタ−５−イル］アセチル｝ヒドラジニル）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミドからなる群から選択される、請求項１から１８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項23】

請求項１から２２のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項24】

請求項１から２２のいずれか１項に記載の複数のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、平均薬剤−抗体比率が少なくとも約５．０である、医薬組成物。

【請求項25】

複数の抗体−薬剤コンジュゲートを含む医薬組成物であって、少なくとも１種の抗体−薬剤コンジュゲートが、請求項１から２２のいずれか１項に記載のコンジュゲートであり、平均薬剤−抗体比率が少なくとも約４．１である、医薬組成物。

【請求項26】

それを必要としている対象において癌を治療する方法であって、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項27】

それを必要としている対象において腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項28】

癌を患っている疑いがある対象において癌を診断する方法であって、ａ）対象の試料を請求項１に記載のコンジュゲートと、コンジュゲートと癌関連タンパク質との結合をもたらす条件下で接触させるステップと、ｂ）癌関連タンパク質へのコンジュゲートの結合を測定するステップとを含む、方法。

【請求項29】

請求項１に記載のコンジュゲートを調製するための方法であって、
ａ）抗体およびグルタミン含有タグ；ならびに／または内因性グルタミンおよび／もしくは反応性の内因性グルタミンを有する抗体を含む抗体−Ｔ分子を提供するステップと、
ｂ）アミンドナー物質をトランスグルタミナーゼの存在下において抗体−Ｔ分子と接触させるステップと、
ｃ）抗体−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、抗体−薬剤コンジュゲートを形成するステップと
を含む、方法。

【請求項30】

コンジュゲートが、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

トランスグルタミナーゼが、微生物トランスグルタミナーゼ、精製トランスグルタミナーゼまたは操作されたトランスグルタミナーゼである、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

精製ステップをさらに含み、コンジュゲートがクロマトグラフィーステップによって精製される、請求項２９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、いずれも参照により全体として本明細書中に組み込まれている、２０１４年４月２５日に出願した米国仮出願第６１／９８４，６４５号、２０１４年７月２４日に出願した米国仮出願第６２／０２８，７３１号、２０１５年１月１５日に出願した米国仮出願第６２／１０３，９９９号および２０１５年４月１４日に出願した米国仮出願第６２／１４７，２９３号の利益を請求する。

【0002】

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介した電子出願であり、電子的に提出された．ｔｘｔ形式の配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０１５年４月９日に作製された「ＰＣ７２０７８０５ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する、９ＫＢのサイズの配列表を含む。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、明細書の一部であり、参照により全体として本明細書中に組み込まれている。

【0003】

本発明は一般に、高い薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）を有するトランスグルタミナーゼ介在性の抗体−薬剤コンジュゲートであって、１）グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって（例えば、基質特異性の変化によって）反応性にされた内因性グルタミンと、２）アミンドナー単位、リンカーおよび作用物質部分を含むアミンドナー物質とを含む、抗体−薬剤コンジュゲートに関する。本発明はまた、このような抗体−薬剤コンジュゲートの作製方法および使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

抗体療法は、癌および免疫疾患などの様々な障害を有する患者における、標的化された治療的処置を提供し、したがって、生物学的リサーチにおいて重要な役割を有する。抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む、標的化された抗体療法の種々のアプローチが探求されている。例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１９：１９６０〜１９６３（２００８）、およびＪｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５〜９３２（２００８）を参照されたい。

【0005】

抗体−薬剤コンジュゲート（すなわち、イムノコンジュゲート）の場合、細胞傷害性低分子（薬剤）は一般に、腫瘍への薬剤部分の標的化された局所的送達のために抗体に連結またはコンジュゲートされる。ＡＤＣの従来のコンジュゲート方法は、リジン側鎖のアミンを介する、または鎖間ジスルフィド結合を還元することによって活性化されたシステインスルフヒドリル基を介する、化学修飾を含む。ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）およびＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン）は、これらの従来の方法を用いたＡＤＣの２つの例である。例えば、Ｔａｎａｋａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５７９：２０９２〜２０９６（２００５）、およびＳｔｒｏｐ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、（印刷中）（２０１４）を参照されたい。従来のＡＤＣコンジュゲーション方法は、変動し得る安全性プロフィール、有効性およびクリアランス速度を有する、非特異的位置に結合した様々な数の薬剤の異種混合物を生じる傾向がある。例えば、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２４３６〜２４４６（２００５）、ならびにＦｉｒｅｒおよびＧｅｌｌｅｒｍａｎ、Ｊ． ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、５：７０（２０１２）を参照されたい。抗体１つ当たり２つ〜４つの薬剤を有するＡＤＣは、インビボでの有効性、耐容性および薬物動態に関して、より高密度にロードされている（例えば、抗体１つ当たり４つを超える薬剤がロードされている）コンジュゲートよりも一般に優れており、より高い治療指数をもたらすことが報告されている。例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０：７０６３〜７０７０（２００４）を参照されたい。

【0006】

抗体−薬剤コンジュゲートの作製にトランスグルタミナーゼを用いる酵素的アプローチもまた、最近探求されている。トランスグルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３；タンパク質−グルタミン：ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ；タンパク質−グルタミン：アミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ、ＣＡＳ８０１４６−８５−６）は、第一級アミンへのアシル付加を触媒する酵素ファミリーに属し、ここで、ペプチド結合したγ−グルタミル残基のガンマ−カルボキサミド基はアシルドナーであり、第一級アミンはアシルアクセプターおよびアミンドナーである。トランスグルタミナーゼを用いる抗体と薬剤のコンジュゲーションは、高い選択性、単純な反応手順および穏やかな反応条件という利点をもたらす。例えば、Ｓｔｒｏｐら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０：１６１〜１６７（２０１３）、およびＦａｒｉａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２５（２）：２４０〜２５０（２０１４）を参照されたい。ＵＳ２０１３／０２３０５４３およびＵＳ２０１３／０１２２０２０は、抗体と低分子とのトランスグルタミナーゼ介在性の部位特異的なコンジュゲーションを記載している。

【0007】

本願において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個別の刊行物、特許、および特許出願が参照することによってそのように組み込まれることが具体的におよび個別に示されるかのように、同程度に全ての目的で、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。限定はしないが定義された用語、用語の使用、記載された技術などを含む、組み込まれた文献および類似の材料の１つまたは複数が、本願と異なるかまたは矛盾する場合、本願が優先される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国仮出願第６１／９８４，６４５号

【特許文献2】米国仮出願第６２／０２８，７３１号

【特許文献3】米国仮出願第６２／１０３，９９９号

【特許文献4】米国仮出願第６２／１４７，２９３号

【特許文献5】ＵＳ２０１３０２３０５４３

【特許文献6】ＵＳ２０１３／０１２２０２０

【特許文献7】米国特許第４，８１６，５６７号

【特許文献8】米国特許第６，７３７，０５６号

【特許文献9】米国特許第５，５００，３６２号

【特許文献10】米国特許第５，８２１，３３７号

【特許文献11】米国特許第５，６６３，１４９号

【特許文献12】米国特許出願公開第２０１３／０１２９７５３号

【特許文献13】ＰＣＴ／ＩＢ２０１５／０５０２８０

【特許文献14】ＷＯ９８／５２９７６

【特許文献15】ＷＯ００／３４３１７

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１９：１９６０〜１９６３（２００８）

【非特許文献2】Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５〜９３２（２００８）

【非特許文献3】Ｔａｎａｋａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５７９：２０９２〜２０９６（２００５）

【非特許文献4】Ｓｔｒｏｐ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、（印刷中）（２０１４）

【非特許文献5】Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２４３６〜２４４６（２００５）

【非特許文献6】ＦｉｒｅｒおよびＧｅｌｌｅｒｍａｎ、Ｊ． ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、５：７０（２０１２）

【非特許文献7】Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０：７０６３〜７０７０（２００４）

【非特許文献8】Ｓｔｒｏｐら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０：１６１〜１６７（２０１３）

【非特許文献9】Ｆａｒｉａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２５（２）：２４０〜２５０（２０１４）

【非特許文献10】Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）

【非特許文献11】Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）

【非特許文献12】ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）

【非特許文献13】Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）

【非特許文献14】Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）

【非特許文献15】Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）

【非特許文献16】Ｓｔｒｏｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０（３）：２０４〜２１９（２０１２）

【非特許文献17】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５（１９８４）

【非特許文献18】Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９（１９８８）

【非特許文献19】Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）

【非特許文献20】ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）

【非特許文献21】Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）

【非特許文献22】ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）

【非特許文献23】Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、ＮＹ）（第４版、１９９９）

【非特許文献24】Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）、６：４０７〜４１５

【非特許文献25】Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３〜２０２

【非特許文献26】Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１

【非特許文献27】Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６

【非特許文献28】Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）

【非特許文献29】ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２

【非特許文献30】Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４

【非特許文献31】ｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１

【非特許文献32】Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、２００５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：２〜４

【非特許文献33】Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７

【非特許文献34】Ｋｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９

【非特許文献35】Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５（１９６９）

【非特許文献36】Ｐｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１〜２９６５（１９９８）

【非特許文献37】ＢｏｇｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：３６４２〜３６４９（１９９５）

【非特許文献38】Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２〜１００５（１９７５）

【非特許文献39】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２２版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１２）

【非特許文献40】Ａｌｌｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１９（３）：７５９〜７６５（２００８）

【非特許文献41】Ｓｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（２）：１８４〜１８９（２０１２）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は一般に、高い薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）を有するトランスグルタミナーゼ介在性の部位特異的な抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、１）グルタミン含有タグ、内因性グルタミン（すなわち、操作されていない天然グルタミン、例えば、可変ドメイン、ＣＤＲなどにおけるグルタミン）および／または抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって（例えば、基質特異性の変化によって）反応性にされた内因性グルタミンと、２）アミンドナー単位、リンカーおよび作用物質部分を含むアミンドナー物質とを含む、抗体−薬剤コンジュゲートに関する。本発明者らは、驚くべきことに、これらのより高ロードの部位特異的ＡＤＣ（例えば、ＤＡＲが少なくとも５以上）は、マレイミド連結を利用する従来のより高ロードのＡＤＣと比較して、インビボでの効力が高く、かつ非特異的なインビトロ細胞傷害性が少ないことを発見した。本発明者らは、これらのより高ロードの部位特異的ＡＤＣが、１）マウスにおいて、コンジュゲートしていない野生型抗体と類似した薬物動態プロフィールを有し、ラットにおいて、改善された薬物動態プロフィールを有し、２）同様にロードされた従来のＡＤＣと比較して同等の安全性プロフィールを維持することをさらに発見した。

【0012】

一態様において、本発明は、式：抗体−（Ｔ−（Ｘ−Ｙ−Ｚ_ａ）_ｂ）_ｃ［式中、Ｔは、１）特異的部位で操作されたグルタミン含有タグ、２）内因性グルタミン、および／または３）抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンであり、Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分であり、Ｘ−Ｙ−Ｚは、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質であり、ａは１〜６の整数であり、ｂは１〜６の整数であり、ｃは１〜２０の整数であり、ａ、ｂおよびｃの積（薬剤−抗体比率）は少なくとも約５である］を含むＡＤＣを提供する。

【0013】

いくつかの実施形態において、抗体−（Ｔ−（Ｘ−Ｙ−Ｚ_ａ）_ｂ）_ｃのＴは、少なくとも１つの内因性グルタミン（例えば、天然グルタミンまたは反応性の内因性グルタミン）を含む。いくつかの実施形態において、反応性の内因性グルタミンは、脱グリコシル化（例えば、酵素的脱グリコシル化）によってまたは抗体中の別のアミノ酸のアミノ酸修飾（例えば、２９７位におけるアミノ酸置換、例えば、Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａ（ＥＵナンバリングスキーム））によって反応性にされる。

【0014】

いくつかの実施形態において、本発明におけるＡＤＣ（例えば、トランスグルタミナーゼ介在性の、より高ロードのＡＤＣ）の抗体は、Ｋ２２２位、Ｋ３４０位および／またはＫ３７０位に第２のアミノ酸修飾（例えば、Ｋ２２２Ｒ、Ｋ３４０Ｒおよび／またはＫ３７０Ｒ）をさらに含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、ＡＤＣのアミンドナー物質（Ｘ−Ｙ−Ｚ）は、１）軽鎖、重鎖または軽鎖および重鎖の両方のいずれかのカルボキシル末端、２）軽鎖、重鎖または軽鎖および重鎖の両方のいずれかのアミノ末端、ならびに３）Ｓ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９〜Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７、および／またはＧ３８５（例えば、表１に列挙した通り）からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数の位置でグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしており、ここで、グルタミン含有タグは抗体に挿入されているか、または抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸と置き換わっている。

【0016】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質（Ｘ−Ｙ−Ｚ）が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグとを含み、ここで、薬剤−抗体比率は約５〜７である。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質が、Ｓ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９〜Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７およびＧ３８５（例えば、表１に列挙した通りである）からなる群から選択される１つまたは複数の位置でグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしており、ここで、グルタミン含有タグは抗体に挿入されているか、または抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸と置き換わっており、薬剤−抗体比率は少なくとも約６である。例えば、いくつかの実施形態において、アミンドナー物質が、抗体重鎖中のアミノ酸位置Ｔ１３５の後に挿入されたグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしており、薬剤−抗体比率は約６〜９である。他の実施形態において、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２でグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしており、ここで、内因性アミノ酸残基はグルタミン含有タグに置き換えられており、薬剤−抗体比率は約６〜１１である。

【0017】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）抗体軽鎖のカルボキシル末端で、ｂ）抗体重鎖のアミノ酸位置Ｔ１３５の後で、およびｃ）抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２でグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質を含み、ここで、内因性アミノ酸残基はグルタミン含有タグに置き換えられており、薬剤−抗体比率は約５〜７である。

【0018】

いくつかの実施形態において、アミンドナー物質（Ｘ−Ｙ−Ｚ）は、Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（アセチル−リジン−グリシン）−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ（アセチル−リジン−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１、プトレシニル−ゲルダナマイシン、Ａｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシン、アミノカプロイル−３３７７、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−３３７７、アミノカプロイル−０１３１、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−０１３１、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、２−アミノエトキシ−ＰＥＧ６−ＮＯＤＡＧＡ、およびＮ^２アセチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４（｛［（２｛［（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ）−８−ヒドロキシ−７｛（１Ｅ，３Ｅ）−５−［（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−５−｛［（２Ｚ，４Ｓ）−４−ヒドロキシペンタ−２−エノイル］アミノ｝−３，６−ジメチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］−３−メチルペンタ−１，３−ジエン−１−イル｝−１，６−ジオキサスピロ［２．５］オクタ−５−イル］アセチル｝ヒドラジニル）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、反応性アミンおよび作用物質部分を含む生体適合性ポリマーである。

【0019】

いくつかの実施形態において、アミンドナー単位−リンカー（Ｘ−Ｙ）は、直鎖状または分岐鎖状である。いくつかの実施形態において、Ｘ−Ｙは、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、アミノカプロン酸、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、［（３Ｓ，５Ｓ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、プトレシンおよびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシンからなる群から選択される。

【0020】

いくつかの実施形態において、作用物質部分（Ｚ）は、アントラサイクリン、オーリスタチン、カンプトセシン、コンブレタスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、マイタンシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、タキサン、ビンカアルカロイド、ツブリシン、ヘミアステリン、スプリセオスタチン、プラジエノライド、およびそれらの立体異性体、アイソスター、類似体または誘導体から選択される細胞傷害物質である。

【0021】

別の態様において、本発明は、本明細書中に記載する複数のより高ロードのＡＤＣを含む医薬組成物であって、平均薬剤−抗体比率が少なくとも約５．０である医薬組成物を提供する。一変形形態において、複数のＡＤＣを含む医薬組成物であって、少なくとも１種のＡＤＣが本明細書中に記載するより高ロードのＡＤＣであり、平均薬剤−抗体比率が少なくとも約４．１である医薬組成物が提供される。別の変形形態において、本発明は、本明細書中に記載するより高ロードのＡＤＣと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0022】

別の態様において、本発明は、本明細書中に記載するＡＤＣを調製するための方法であって、ａ）抗体およびグルタミン含有タグ；内因性グルタミンを有する抗体；ならびに／または反応性の内因性グルタミンを有する抗体を含む抗体−Ｔ分子を提供するステップと、ｂ）アミンドナー単位、リンカーおよび作用物質部分（Ｘ−Ｙ−Ｚ）を含むアミンドナー物質をトランスグルタミナーゼの存在下において抗体−Ｔ分子と接触させるステップと、ｃ）抗体−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、抗体−薬剤コンジュゲートを形成するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する。

【0023】

いくつかの実施形態において、本明細書中において提供する方法は、ＡＤＣをクロマトグラフィーステップによって精製する精製ステップをさらに含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、微生物トランスグルタミナーゼ、精製トランスグルタミナーゼまたは操作されたトランスグルタミナーゼである。

【0025】

別の態様において、本発明は、それを必要としている対象において癌を治療する方法であって、本明細書中に記載するＡＤＣを含む医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。

【0026】

別の態様において、本発明は、それを必要としている対象において腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、本明細書中に記載するＡＤＣを含む医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。

【0027】

別の態様において、本発明は、癌を患っている疑いがある対象において癌を診断する方法であって、ａ）対象の試料を本明細書中に記載するＡＤＣと、ＡＤＣと癌関連タンパク質との結合をもたらす条件下で接触させるステップと、ｂ）癌関連タンパク質へのＡＤＣの結合を測定するステップとを含む方法を提供する。

【0028】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載するＡＤＣ中の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディまたは抗体断片である。

【0029】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載するＡＤＣ中のグルタミン含有タグは、Ｑ、ＬＱＧ、ＬＬＱＧＧ（配列番号１）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号３）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４）、ＧＬＬＱＧ（配列番号５）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号６）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱ（配列番号９）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＰＧＫ（配列番号２５）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号２６）、ＬＬＱＧＰ（配列番号２７）、ＬＬＱＰ（配列番号２８）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号２９）、ＬＬＱＡＰＧＫ（配列番号３０）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号３１）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号３２）、およびＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】従来の方法でコンジュゲートされたＤＡＲ７．２のＡＤＣと比較した、標的発現が高いＢｘＰＣ３細胞における、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの細胞傷害性を示すグラフである。ｍ７Ｅ６は、抗Ｔｒｏｐ２（Ｍ１Ｓ１、ＧＡ７３３−１、ＥＧＰ−１またはＴＡＣＳＴＤ２としても知られるトロホブラスト細胞表面抗原２）抗体であり、Ｈ７ｃ、Ｌ１１ｂ、ＴＧ６およびＬＣＱ０４は、グルタミン含有トランスグルタミナーゼタグおよび抗体中のこのようなタグの位置を表し（表１を参照されたい）；Ｎ２９７Ｑは、Ｔｒｏｐ２抗体の２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換を表し；Ｋ２２２Ｒは、Ｔｒｏｐ２抗体の２２２位でのＫからＲへのアミノ酸置換を表し；マレイミドは、システインコンジュゲーションを介する従来のコンジュゲーション方法を表す。これらの略語は、本明細書中に記載する全ての他の図にも適用される。

【図2】従来の方法でコンジュゲートされたＤＡＲ７．２のＡＤＣと比較した、標的発現が中程度のＣｏｌｏ２０５細胞における、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの細胞傷害性を示すグラフである。

【図3】従来の方法でコンジュゲートされたＤＡＲ７．２のＡＤＣと比較した、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞における、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの細胞傷害性を示すグラフである。

【図4】従来の方法でコンジュゲートされたＤＡＲ７．２のＡＤＣと比較した、標的発現がないＳＷ６２０細胞における、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの非特異的な細胞傷害性を示すグラフである。

【図5】従来の方法でコンジュゲートされた、同様なＤＡＲを有するＡＤＣと比較した、標的発現が中等度のＣｏｌｏ２０５細胞における、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣの細胞傷害性を示すグラフである。

【図6】従来の方法でコンジュゲートされたＤＡＲ７．２のＡＤＣと比較した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルでの長期腫瘍静止の誘発における、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図7】従来の方法でコンジュゲートされた、同様なＤＡＲを有するＡＤＣと比較した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルでの長期腫瘍静止の誘発における、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図8-1】図８Ａ、図８Ｂ：コンジュゲートしていない野生型抗体および同様なＤＡＲを有する従来のＡＤＣと比較した、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣの、マウスおよびラットにおけるＰＫプロフィールを示すグラフである。

【図8-2】図８Ｃ、図８Ｄ：コンジュゲートしていない野生型抗体および同様なＤＡＲを有する従来のＡＤＣと比較した、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣの、マウスおよびラットにおけるＰＫプロフィールを示すグラフである。

【図8-3】図８Ｅ、図９Ｆ：コンジュゲートしていない野生型抗体および同様なＤＡＲを有する従来のＡＤＣと比較した、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣの、マウスおよびラットにおけるＰＫプロフィールを示すグラフである。

【図8-4】図８Ｇ、図８Ｈ：コンジュゲートしていない野生型抗体および同様なＤＡＲを有する従来のＡＤＣと比較した、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣの、マウスおよびラットにおけるＰＫプロフィールを示すグラフである。

【図9】コンジュゲーション部位の種々の組み合わせでのＤＡＲが７．７６および７．７の、本発明のより高ロードの部位特異的ＡＤＣのラットにおけるＰＫプロフィールを示すグラフである。

【図10-1】Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるより高ロードのＡＤＣの毒性を示すグラフである。図１０Ａは、２００ｍｇ／ｋｇで投与された、ＤＡＲ７．８の従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣおよびＤＡＲ７．７６の部位特異的ＡＤＣの毒性動態を示す。図１０Ｂは、ＤＡＲ５．８５およびＤＡＲ７．７１のより高ロードの部位特異的ＡＤＣ、ならびにＤＡＲ７．８の従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣを２００ｍｇ／ｋｇで投与されたマウスの体重増加を示す。

【図10-2】図１０Ｃは、高ロードの部位特異的（ＳＳ）ＡＤＣ「ＤＡＲ６」（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ；ＤＡＲ ５．８５）、およびＳＳ「ＤＡＲ８」（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ；ＤＡＲ ７．７６）、ならびに従来のＡＤＣ「Ｃｙｓ ＤＡＲ８」（ｍ７Ｅ６マレイミドＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ；ＤＡＲ７．８）を２００ｍｇ／ｋｇで投与されたマウスから１４日目に得た試料からの、臨床病理パラメーターを示す。

【図10-3】図１０Ｄは、高ロードの部位特異的（ＳＳ）ＡＤＣ「ＤＡＲ６」（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ；ＤＡＲ ５．８５）、およびＳＳ「ＤＡＲ８」（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ；ＤＡＲ ７．７６）、ならびに従来のＡＤＣ「Ｃｙｓ ＤＡＲ８」（ｍ７Ｅ６マレイミドＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ；ＤＡＲ７．８）を２００ｍｇ／ｋｇで投与されたマウスから１４日目に得た試料からの、肝臓酵素活性パラメーターを示す。ＡＰ、ＡＳＴおよびＡＬＴはそれぞれ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニントランスアミナーゼおよびアルカリホスファターゼを表す。

【図11】ＷＴ（ｍ７Ｅ６−非コンジュゲート）、ＳＳ ＤＡＲ２（ＬＣ）（部位特異的ｍ７Ｅ６ ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＳＳ ＤＡＲ４（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＳＳ ＤＡＲ６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＳＳ ＤＡＲ８（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＣｙｓ ＤＡＲ８（ｍ７Ｅ６マレイミドＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）を含む様々なＡＤＣにおける標的／ＩｇＧ相互作用の動態解析を示すグラフである。各パネルは、１．２、３．７、１１、３３および１００ｎＭの標的（ヒトＴｒｏｐ２）濃度を用いた、所与のＩｇＧの網羅的解析を示す。黒線は、測定データを示し、赤線は全体的適合を示し；残差が、各オーバレイプロットの下に示されている。

【図12】マウスのインビボ試料からの質量分析によるリンカーおよび／またはペイロードの安定性分析を示すグラフである。図は、リンカー安定性（図１２（ａ））、薬剤安定性（図１２（ｂ）；コンジュゲートしているＭＭＡＤ Ｃ末端安定性）、およびリンカー−薬剤組み合わせの安定性（図１２（ｃ））を、ＤＡＲ８の従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣとＤＡＲ６およびＤＡＲ８の高ロードの部位特異的ＡＤＣとの間で比較する。「Ｃｙｓ ＤＡＲ８」は、ｍ７Ｅ６マレイミドＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを表し；「ＳＳ ＤＡＲ６」は、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを表し；ＳＳ「ＤＡＲ８＿１」は、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを表す。

【図13】様々な抗体濃度における、種々の時点で測定された、従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣ（「Ｃｙｓ ＤＡＲ８」：ｍ７Ｅ６マレイミドＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）ならびに高ロードの部位特異的ＡＤＣであるＤＡＲ６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ８＿１（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）のマウスで毒性動態を示すグラフである。

【図14】より低いＤＡＲ（例えば、１．９６および３．９）を有する部位特異的ＡＤＣと比較した、標的発現が高いＢｘＰＣ３細胞における、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの細胞傷害性を示すグラフである。

【図15】より低いＤＡＲ（例えば、１．９６および３．９）を有する部位特異的ＡＤＣと比較した、標的発現が中等度のＣｏｌｏ２０５細胞における、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの細胞傷害性をさらに示すグラフである。

【図16】より低いＤＡＲ（例えば、１．９６および３．９）を有する部位特異的ＡＤＣと比較した、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞における、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの細胞傷害性をさらに示すグラフである。

【図17】より低いＤＡＲ（例えば、１．９６および３．９）を有する部位特異的ＡＤＣと比較して、標的発現がないＳＷ６２０細胞においては、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣの非特異的な細胞傷害性が存在しないことをさらに示すグラフである。

【図18-1】図１８Ａ：標的発現が低いおよび中程度のＬ３６３細胞およびＭＭ１．Ｓ細胞における、より低いＤＡＲ（例えば、１．９６および３．７）を有する部位特異的ＡＤＣと比較した、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣのインビトロでの有効性を示すグラフである。

【図18-2】図１８Ｂ：標的発現が低いおよび中程度のＬ３６３細胞およびＭＭ１．Ｓ細胞における、より低いＤＡＲ（例えば、１．９６および３．７）を有する部位特異的ＡＤＣと比較した、ＤＡＲの増加に伴う部位特異的ＡＤＣのインビトロでの有効性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本発明は一般に、高い薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）を有するトランスグルタミナーゼ介在性の部位特異的な抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、１）グルタミン含有タグ、内因性グルタミン（すなわち、操作されていない天然グルタミン、例えば、可変ドメイン、ＣＤＲなどにおけるグルタミン）および／または抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンと、２）アミンドナー単位、リンカーおよび作用物質部分を含むアミンドナー物質とを含み、ＤＡＲが少なくとも約５である抗体−薬剤コンジュゲートに関する。ＤＡＲが２〜４である従来のマレイミド連結を利用する抗体−薬剤コンジュゲートは、より高ロードのそれらの対応物よりも、インビボでの有効性、耐容性および薬物動態に関して優れており、より高い治療指数をもたらすことがこれまでに分かっている。本明細書中に記載するのは、従来のより高ロードのＡＤＣと比較して、インビボでの効力が高く、かつインビトロでの非特異的な細胞傷害性が少ない、より高ロードの部位特異的ＡＤＣ（例えば、ＤＡＲが少なくとも５以上）である。本明細書中に開示するより高ロードの部位特異的ＡＤＣの単回用量は、長期腫瘍成長静止に関して、同様なＤＡＲを有する従来のＡＤＣより有意に性能的に勝っている。さらにまた、これらのより高ロードの部位特異的ＡＤＣは、マウスにおいては、コンジュゲートしていない野生型抗体と類似した薬物動態プロフィールを有し、ラットにおいては、同様なＤＡＲを有する従来のより高ロードのＡＤＣに比べて改善されたＰＫプロフィールを有する。これらのより高ロードの部位特異的ＡＤＣはまた、等しい薬物ロード量で、従来のＡＤＣと比較して同等の安全性プロフィールを維持する。

【0032】

したがって、より高ロードの部位特異的ＡＤＣであって、各ＡＤＣが、式：抗体−（Ｔ−（Ｘ−Ｙ−Ｚ_ａ）_ｂ）_ｃ［式中、Ｔは、１）特異的部位で操作されたグルタミン含有タグ、２）内因性グルタミン、および／または３）抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンであり、Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分であり、Ｘ−Ｙ−Ｚは、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質であり、ａは１〜６の整数であり、ｂは１〜６の整数であり、ｃは１〜２０の整数であり、ａ、ｂおよびｃの積（薬剤−抗体比率）は少なくとも約５である］を含むＡＤＣが提供される。

【0033】

それを必要とする対象において、癌を治療する方法、腫瘍の成長もしくは進行を阻害する方法、がん細胞もしくは腫瘍の転移を阻害する方法、または腫瘍退縮を誘発する方法であって、本明細書中に記載するＡＤＣを含む医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法もまた、提供される。

【0034】

本明細書中に記載するＡＤＣを調製するための方法であって、ａ）抗体およびグルタミン含有タグ；ならびに／または内因性グルタミンおよび／もしくは反応性の内因性グルタミンを有する抗体を含む抗体−Ｔ分子を提供するステップと、ｂ）アミンドナー物質をトランスグルタミナーゼの存在下において抗体−Ｔ分子と接触させるステップと、ｃ）抗体−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、ＡＤＣを形成するステップとを含む方法もまた、提供される。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、操作されたトランスグルタミナーゼである。

【0035】

一般的な技術および定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。全体として、本明細書において記載される細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名、およびその技術は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる。

【0036】

本発明の方法および技術は、全体として、別段の指示がない限り、当技術分野において周知の従来の、ならびに本明細書を通して引用および議論される様々な一般的なおよびさらに具体的な参考文献において記載されているような方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書において記載されるように、製造者の説明に従って行われる。本明細書において記載される、分子生物学、生化学、免疫学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して用いられる命名、ならびにその実験手順および実験技術は、当技術分野において周知であり一般的に用いられるものである。本明細書および特許請求の範囲を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含めるがいかなる他の整数または整数群も排除しないことを意味すると理解される。

【0037】

本明細書において使用する用語「グルタミン含有タグ」、「グルタミンタグ」、「Ｑ含有タグ」、「Ｑタグ」または「トランスグルタミナーゼタグ」は、トランスグルタミナーゼ反応においてアミンアクセプターまたはアシルドナーとして作用する１つまたは複数のＧｌｎ残基を含有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。

【0038】

本明細書において使用する用語「アミンドナー物質」または「アシルアクセプター」は、１つまたは複数の反応性アミン（例えば、第一級アミン）を含有する作用物質を指す。例えば、アミンドナー物質は、アミンドナー単位（例えば、第一級アミンＮＨ_２）、リンカー（例えば、アミンドナー単位と連結され、ペイロード、例えば、低分子、ポリペプチドまたは生体適合性ポリマーへの結合のための追加の官能基を含有する分子）、および作用物質部分（例えば、ペイロード、例えば、低分子）を含み得る。アミンドナー物質はまた、１つまたは複数の反応性リジン、Ｎ末端または反応性アミンを含有するポリペプチド（例えば、抗体）または生体適合性ポリマーであり得る。

【0039】

明細書において使用する用語「部位特異性」、「部位特異的にコンジュゲートしている（された）」、または「部位特異的に架橋している」は、グルタミン含有タグ、内因性グルタミン、および／または抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンを介する、特異的部位（例えば、表１に列挙される様々な部位）での、抗体へのアミンドナー物質の特異的なコンジュゲーションまたは架橋を指す。部位特異性は、限定はしないが、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、タンデム質量分析（ＭＳ−ＭＳ）、および飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ））、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、部位特異的突然変異生成、蛍光標識、サイズ排除クロマトグラフィー、およびＸ線結晶学を含む、様々な技術によって測定することができる。

【0040】

本明細書中で使用する用語「反応性にされた内因性グルタミン（Ｑ）」は、トランスグルタミナーゼの存在下で抗体の操作（例えば、酵素的脱グリコシル化および／またはアミノ酸修飾）によってまたは操作されたトランスグルタミナーゼによってアミンドナー物質にアクセス可能にされ、曝露されまたは反応性にされた内因性グルタミンを指す。

【0041】

本明細書において用いられる場合、用語「生体適合性ポリマー」は、レシピエント（例えばヒト）においていかなる望ましくない局所的または全身的な影響も引き起こすことのない、レシピエントにおける治療または医療的処置に適切なポリマー（例えば、反復している単量体単位または構造単位）を指す。生体適合性ポリマー（合成の、組換えの、または天然の）は、水溶性のまたは水不溶性のポリマーであり得る。生体適合性ポリマーはまた、直鎖状または分岐鎖状のポリマーであり得る。

【0042】

本明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、文脈によって別段の指示がない限り、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなど）、サメおよびラクダ抗体）を含む一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体およびドメイン抗体、ならびに、本明細書において記載される、抗体部分、多価抗体（例えば、ＣＯＶＸ−ＢＯＤＹ（登録商標））、多重特異的抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を示す限りの、二重特異的抗体）、および抗体断片を含む、融合タンパク質、ならびに、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体構造も包含するものである。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、また抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体構造は周知である。１つの態様において、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、サル、またはウサギの免疫グロブリンである。

【0043】

本明細書において用いられる用語「Ｆａｂ含有ポリペプチド」は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、または「（Ｆａｂ’）２断片を含むポリペプチド」を指す。Ｆａｂ含有ポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部または全てを含み得る（通常は、ポリペプチドのＦａｂ部分のカルボキシル末端で）。Ｆａｂ含有ポリペプチドは、任意の適切な免疫グロブリンから、例えば様々なＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから得ることができるか、または誘導することができる。Ｆａｂ含有ポリペプチドは、１つまたは複数のポリペプチドがＦａｂ含有ポリペプチドに連結している、Ｆａｂ含有融合ポリペプチドであり得る。Ｆａｂ融合体は、免疫グロブリンのＦａｂポリペプチドを通常は任意のタンパク質、ポリペプチド、または低分子であり得る融合パートナーと組み合わせる。事実上任意のタンパク質または低分子が、Ｆａｂポリペプチドに連結して、Ｆａｂ含有融合ポリペプチドを生成し得る。Ｆａｂ含有融合パートナーには、限定はしないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得る。

【0044】

「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖およびＣＨ１および１つの重鎖の可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成し得ない。

【0045】

「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１つの重鎖の一部、また、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域を含有し、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子が形成され得る。

【0046】

「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖を含有し、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間で形成される。Ｆ（ａｂ’）２断片は、したがって、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって共に結び付けられている２つのＦａｂ’断片からなる。

【0047】

本明細書において用いられる「抗体断片」は、無傷抗体の一部分のみを含み、前記部分は好ましくは、無傷抗体内に存在する場合に前記部分に通常は関連する機能の、少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたは全てを保持する。

【0048】

「多重特異的抗体」は、２つ以上の抗原またはエピトープを標的化する抗体である。「二重特異的な（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異的な（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、または「二官能性の」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、多重特異的抗体の種であり、限定はしないがハイブリドーマの融合、Ｆａｂ’断片の連結、または抗体ヒンジおよびＣＨ３ドメインにおける突然変異体を含む、様々な方法によって生産することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）；およびＳｔｒｏｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０（３）：２０４〜２１９（２０１２）を参照されたい。二重特異的抗体の２つの結合部位は、同一のまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。

【0049】

本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」は、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、微量に存在し得る、考えられる天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原に対するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。

【0050】

本明細書におけるモノクローナル抗体は、一部の実施形態において、所望の生物学的活性を示す限りの、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一であるかまたは相同であり、一方、鎖（１つまたは複数）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を具体的に含み得る（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。

【0051】

非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体は、さらに、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインのほぼ全てを含み、超可変ループの全てまたはほぼ全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたはほぼ全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲに対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。また、総説：ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）、およびそこで引用される参考文献も参照されたい。

【0052】

「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または本明細書において開示されるヒト抗体を作製する技術のいずれかを用いて作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。

【0053】

本明細書において使用する「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、およびその変型は、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、ＮＹ）（第４版、１９９９）；Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）、６：４０７〜４１５；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３〜２０２において説明されている、当技術分野において知られている意味を含む。

【0054】

本明細書において使用する用語「Ｆｃ含有ポリペプチド」は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシル末端のポリペプチド配列を含むポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）を指す。Ｆｃ含有ポリペプチドは、天然Ｆｃ領域または変異Ｆｃ領域（すなわち、配列）を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ４ドメインを含んでいてもよい。Ｆｃ含有ポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部または全てを含み得る（一般に、Ｆｃ含有ポリペプチドのアミノ末端に）。Ｆｃ含有ポリペプチドはまた、二量体であり得る。Ｆｃ含有ポリペプチドは、任意の適切な免疫グロブリン、例えば、様々なＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプもしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤもしくはＩｇＭから得ることができるか、または誘導することができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、例えば、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｇｌｕ２１６位のアミノ酸残基から、またはＡｌａ２３１から、そのカルボキシル末端まで伸びていると定義される。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスのナンバリングである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。

【0055】

Ｆｃ含有ポリペプチドは、１つまたは複数のポリペプチドがＦｃ含有ポリペプチドに連結している、Ｆｃ含有融合ポリペプチドであり得る。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃポリペプチドと、一般に任意のタンパク質、ポリペプチドまたは低分子であり得る融合パートナーとを併せ持つ。ほとんど全てのタンパク質または低分子が、Ｆｃ領域に連結して、Ｆｃ含有融合ポリペプチドを生成し得る。Ｆｃ含有融合パートナーには、限定はしないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインが含まれ得る。

【0056】

本明細書において用いられる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」、例えば、受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」を免疫グロブリン定常ドメイン（すなわち、Ｆｃドメイン）のエフェクター成分と組み合わせる抗体様分子または免疫グロブリン様分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位（抗原結合部位）以外の（すなわち「異種の」）、所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、もしくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。

【0057】

用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さの、好ましくは比較的短い（例えば、１０〜１００アミノ酸の）アミノ酸鎖を指すために、本明細書において区別せずに使用する。鎖は、直鎖状または分岐鎖状であり得、これは、修飾されたアミノ酸を含み得、かつ／または非アミノ酸によって介在され得る。この用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されている、アミノ酸鎖を包含する。同様にこの定義に含まれるものは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つまたは複数の類似体、および当技術分野において知られている他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として生じ得ることが理解される。

【0058】

本明細書において用いられる場合、用語「野生型アミノ酸」、「野生型ＩｇＧ」、または「野生型ｍＡｂ」は、ある集団（例えば、ヒト、マウス、ラット、細胞など）内で天然に生じるアミノ酸または核酸の配列を指す。

【0059】

本明細書において用いられる場合、用語「コンジュゲーション効率」または「架橋効率」は、本明細書において記載されるＡＤＣの実験的に測定された量を、ＡＤＣの最大期待量で割った値の間の比率である。コンジュゲーション効率または架橋効率は、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの当業者に周知の様々な技術によって測定することができる。コンジュゲーション効率はまた、室温または３７℃などの異なる温度で測定することができる。

【0060】

用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例としては、限定はしないが、抗体依存性の細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、Ｆｃ受容体の結合、補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）、食作用、Ｃ１ｑの結合、および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節が挙げられる。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号を参照されたい。このようなエフェクター機能は通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを要し、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。エフェクター機能の典型的な測定は、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合を介する。

【0061】

本明細書において用いられる場合、「抗体依存性の細胞介在性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を生じさせる、細胞介在性の反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号において記載されているような、インビトロＡＤＣＣアッセイを用いて評価することができる。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。

【0062】

「補体依存性の細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体の活性化経路は、同族抗原と複合した分子（例えば抗体）への補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の結合によって開始される。補体の活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）において記載されているような、ＣＤＣアッセイを行うことができる。

【0063】

本明細書において用いられる場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合するものであり、対立遺伝子変異体を含むＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩＩサブクラス、およびＦｃｙＲＩＶサブクラスの受容体を含み、あるいは、これらの受容体のスプライシングされた形態を含む。ＦｃｙＲＩＩ受容体には、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃｙＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、２００５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：２〜４において概説されている。「ＦｃＲ」にはまた、胎児への母親ＩｇＧの移入に関与する新生児受容体ＦｃＲｎが含まれる（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。

【0064】

本明細書中で使用する「治療（処置）」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の解釈上、有益なまたは所望の臨床結果には、限定はしないが、以下の１つまたは複数が含まれる：新生物細胞もしくは癌性細胞の増殖低減（もしくは破壊）、新生物細胞の転移阻害、腫瘍の縮小もしくは腫瘍サイズの減少、癌寛解、癌症状の減少、癌を患っている人のクオリティオブライフの向上、癌の治療に必要な他の医薬品の用量の減少、癌進行の遅延、癌の治癒、および／または癌患者の生存期間の延長。

【0065】

本明細書中で使用する、薬剤、化合物または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の結果をもたらすのに充分な量である。予防的使用に関しては、有益なまたは所望の結果には、疾患の生化学的症状、組織学的症状および／もしくは行動症状、その合併症ならびに疾患の発症中に見つかる中間の病理学的表現型を含む疾患の、リスクの排除もしくは低減、重症度の低下または発生の遅延が含まれる。治療的使用に関しては、有益なまたは所望の結果には、様々な癌関連疾患もしくは状態（例えば、胃癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌および膵臓癌）の１つもしくは複数の症状の発生率の低下もしくは寛解、疾患の治療に必要な他の医薬品の用量の減少、別の医薬品の効果の増強、および／または患者における癌の進行の遅延などの臨床結果が含まれる。有効投与量は、１回は複数回の投与で投与し得る。本発明の解釈上、薬剤、化合物または医薬組成物の有効投与量は、直接的または間接的に予防的処置または治療的処置を行うのに充分な量である。臨床に関連して理解されるように、薬剤、化合物もしくは医薬組成物の有効投与量は、別の薬剤、化合物もしくは医薬組成物と併用して達成してもよいし、または達成しなくてもよい。したがって、「有効投与量」は、１種または複数の治療薬の投与との関連において考慮することができ、単剤は、１種または複数の他の作用物質と併用した場合に望ましい結果が達成され得るまたは達成されるならば、有効量で投与されると考えることができる。

【0066】

用語「精製する」およびその文法上の変型は、組成物内のＡＤＣの純度レベルを向上させる（すなわち、組成物内の不純物（１つまたは複数）の量（ｐｐｍ）を減少させることによって）、ＡＤＣおよび１つまたは複数の不純物を含有する混合物からの少なくとも１つの不純物の完全なまたは部分的な除去を意味するために用いられる。

【0067】

本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及は、それ自体がその値またはパラメーターに向けられた実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。

【0068】

「個体」または「対象」は、哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物にはまた、限定はしないが、家畜、スポーツ用の動物、ペット、霊長類、ウマ、犬、猫、マウス、およびラットが含まれる。

【0069】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という記載を用いて実施形態が本明細書において記載されている場合は全て、「からなる」および／または「から基本的になる」と言う用語で記載されているそれ以外の類似の実施形態もまた提供される。

【0070】

本発明の態様または実施形態がマーカッシュグループまたは選択肢の他のグループ分けに関して記載されている場合、本発明は、列挙されたグループ全体をまとめて包含するだけではなく、グループの各メンバーを個別におよびメイングループの全ての考えられるサブグループも包含し、しかしまた、グループメンバーの１つまたは複数が欠けているメイングループも包含する。本発明はまた、特許請求の範囲に記載の発明におけるグループメンバーのいずれかの１つまたは複数を明確に排除することも想定する。

【0071】

本出願における残基の呼称は、定常ドメインのＥＵナンバリングスキームに基づく（Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５（１９６９））。

【0072】

別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。典型的な方法および材料が本明細書において記載されるが、本明細書において記載されるものに類似または同等の方法および材料もまた本発明の実施または試験において用いることができる。本明細書において言及される全ての刊行物および他の参考文献は、参照することによってその全体が組み込まれる。一致しない場合には、定義を含む本明細書が優先される。多くの文献が本明細書において引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当技術分野における一般常識の一部を形成することを承認するものではない。本明細書および特許請求の範囲を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含めることを意味するが、いかなる他の整数または整数群も排除するものではない。文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。材料、方法、および例は例示的なものにすぎず、限定するためのものではない。

【0073】

薬物ロード量が高い抗体−薬剤コンジュゲート
本明細書中における抗体−薬剤コンジュゲートは、操作されたグルタミン含有タグ、内因性グルタミン（すなわち、操作されていない天然グルタミン、例えば、可変ドメイン、ＣＤＲなどにおけるグルタミン）および／または反応性の内因性グルタミンを介して、アミンドナー物質（例えば、アミンドナー単位によってリンカーに結合している低分子）に部位特異的にコンジュゲートしている抗体であって、薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）が少なくとも約５（例えば、抗体１つ当たり少なくとも５つの薬剤／ペイロード）である抗体を含む。内因性グルタミンは、抗体中の１つもしくは複数のアミノ酸の修飾（例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、または突然変異）によって、酵素的脱グリコシル化によってまたは操作されたトランスグルタミナーゼとの反応によって、反応性（すなわち、アミンおよびトランスグルタミナーゼの存在下でアシルドナーとして共有結合を形成する能力）にされ得る。したがって、一態様において、式：抗体−（Ｔ−（Ｘ−Ｙ−Ｚ_ａ）_ｂ）_ｃ［式中、Ｔは、１）特異的部位で操作されたグルタミン含有タグ、２）内因性グルタミン、および／または３）抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンであり、Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分であり、Ｘ−Ｙ−Ｚは、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質であり、ａは１〜６の整数であり、ｂは１〜６の整数であり、ｃは１〜２０の整数であり、ａ、ｂおよびｃの積（薬剤−抗体比率）は少なくとも約５である］を含む抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）が提供される。抗体上のグルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性グルタミンと、本明細書中に記載するアミンドナー物質（Ｘ−Ｙ−Ｚ）はいずれも、トランスグルタミナーゼの基質であり、グルタミン含有タグおよび／または内因性／反応性グルタミンと、アミンドナー物質との間の連結は、式ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−［式中、ＮＨ−は、リンカーおよび作用物質部分に連結されている］を有する。

【0074】

トランスグルタミナーゼは、リジン残基によるグルタミン残基のｐＨ依存的アミド基転移を典型的に触媒するタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．２．１３）である。本明細書中に記載する本発明に使用するトランスグルタミナーゼは、様々な供給源から得るか、もしくは作製して、または操作して、１つもしくは複数のリジン残基によるまたは１つもしくは複数の反応性アミンを含有するアミンドナー物質による１つまたは複数の内因性グルタミン残基のアミド基転移を触媒することができる。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、酵素の立体構造の変化を誘発するためおよび酵素活性を可能にするためにカルシウムを要する、カルシウム依存性のトランスグルタミナーゼである。例えば、トランスグルタミナーゼは、モルモットの肝臓に由来することができ、市販の供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ））を介して得ることができる。いくつかの実施形態において、ｍＴＧａｓｅポリペプチドは、真菌タンパク質（例えば、卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）またはクモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）トランスグルタミナーゼ）に由来する。いくつかの実施形態において、ｍＴＧａｓｅポリペプチドは、粘菌（Ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ）に由来する（例えば、真正粘菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）トランスグルタミナーゼ）。いくつかの実施形態において、ｍＴＧａｓｅポリペプチドは、細菌タンパク質、例えば、ストレプトベルティシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種またはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、ストレプトマイセス・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）またはストレプトベルティシリウム・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ））からのトランスグルタミナーゼに由来する。いくつかの実施形態において、ｍＴＧａｓｅポリペプチドは、細菌タンパク質、例えば，限定はしないが、ストレプトベルティシリウム・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）、ストレプトベルティシリウム・グリセオカルネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）、ストレプトベルティシリウム・ラダカヌム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌａｄａｋａｎｕｍ）、ストレプトマイセス・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｓ）、ストレプトマイセス・ラダカヌム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｄａｋａｎｕｍ）、ストレプトマイセス・カニフェルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｉｆｅｒｕｓ）、ストレプトマイセス・プラテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・ネトロプシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ）、ストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）、ストレプトマイセス・ロゼオベルチビラツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｖｅｒｔｉｖｉｌｌａｔｕｓ）、ストレプトマイセス・シンナマオニウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍａｏｎｅｏｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオカルネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・リディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｙｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・シオヤンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｉｏｙａｎｓｉｓ）、アクチノマズラ属（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）の種、バチルス属（例えば、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の種、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）の種またはそれらの分離株からのトランスグルタミナーゼに由来する。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、酵素の立体構造の変化を誘発するためおよび酵素活性を可能にするためにカルシウムを要しない、カルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、ｍＴＧａｓｅポリペプチドは、Ｓ．モバレンシス（Ｓ．ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）に由来する。ＡＣＴＩＶＡ（商標）（味の素、日本）などの市販されているカルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼもまた、本発明に適している。

【0075】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載する本発明において使用するトランスグルタミナーゼは、１つもしくは複数のリジン残基またはアミンドナー物質中の反応性アミンによる、抗体中の１つまたは複数の内因性グルタミン残基のアミド基転移を触媒する、操作されたトランスグルタミナーゼである。例えば、天然トランスグルタミナーゼ中の１つまたは複数の野生型アミノ酸残基を、欠失させ、または別のアミノ酸残基（１つまたは複数）に置き換えるもしくはそれで置換して、操作されたトランスグルタミナーゼを作製することができる。

【0076】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される、本発明において用いられるトランスグルタミナーゼはまた、当業者に知られている組換え技術を用いて生産された組換えタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される、本発明において用いられるトランスグルタミナーゼは、精製タンパク質であり得る。例えば、精製トランスグルタミナーゼは、少なくとも約５０％の純度である。本明細書において用いられる場合、「純粋な」または「精製」タンパク質は、他の汚染タンパク質を有さないタンパク質（例えば、トランスグルタミナーゼ）を指す。いくつかの実施形態において、精製トランスグルタミナーゼは、少なくとも約５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９８％、または９９％の純度のいずれかである。いくつかの実施形態において、精製トランスグルタミナーゼは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の純度のいずれかである。

【0077】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＡＤＣのグルタミン含有タグは、抗体の反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。例えば、グルタミン含有タグは、ポリペプチドのカルボキシル末端、アミノ末端、またはカルボキシル末端およびアミノ末端の両方において反応性Ｌｙｓに空間的に隣接していない。

【0078】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、抗体の操作によるまたは操作されたトランスグルタミナーゼによるアミド基転移反応において反応性にされた少なくとも１つの内因性グルタミンを含む。いくつかの実施形態において、抗体の操作は、抗体の脱グリコシル化（例えば、酵素的脱グリコシル化）；または抗体におけるアミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異もしくはそれらの任意の組み合わせを含むアミノ酸の修飾である。例えば、抗体の２９７位の野生型アミノ酸Ａｓｎ（Ｎ）を、アミノ酸Ａｌａ（Ａ）で置換するか、またはアミノ酸Ａｌａ（Ａ）に置き換え、その結果、２９７位に非グリコシル化をもたらし、２９５位に反応性の内因性グルタミン（Ｑ）を生じる。別の例において、抗体中のアミノ酸修飾は、２９７位での非グリコシル化、２９５位での反応性の内因性Ｑ、ならびにトランスグルタミナーゼの存在下でＮ２９７ＱおよびＱ２９５と１つまたは複数のアミンドナー物質との間に部位特異的なコンジュゲーションをもたらす、２９７位でのＮからＱへのアミノ酸置換である。

【0079】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、限定はしないが、１）軽鎖、重鎖または軽鎖と重鎖の両方のいずれかのカルボキシル末端；２）軽鎖、重鎖または軽鎖と重鎖の両方のいずれかのアミノ末端；ならびに３）Ｓ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９〜Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７、および／またはＧ３８５を含む少なくとも１つまたは複数の位置で操作されたグルタミン含有タグを含み、グルタミン含有タグは、抗体中に挿入され、または抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸と置き換わり、薬物−抗体比率は少なくとも５である。特異的なグルタミン含有タグおよび対応する操作された位置の例を、表１に示す。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、少なくとも約５（例えば、抗体１つ当たりの薬剤／ペイロードが５）のＤＡＲおよび表１に列挙された任意の１つまたは複数の位置において操作されたグルタミン含有タグを含む。

【0080】

【表1-1】

【0081】

【表1-2】

【0082】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣの抗体は、同一の位置の野生型抗体と比較して、２２２、３４０および／または３７０位（ＥＵナンバリング）に第２のアミノ酸修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、置換は、野生型アミノ酸を別のアミノ酸（例えば、非野生型アミノ酸）に置き換えることを含む。いくつかの実施形態において、他の（例えば、非野生型）アミノ酸は、Ａｒｇ（例えば、Ｋ２２２Ｒ、Ｋ３４０ＲまたはＫ３７０Ｒ）である。いくつかの実施形態において、他の（例えば、非野生型）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである。

【0083】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグとを含み、ここで、薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）は約５〜７である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）またはＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）である。

【0084】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグと、ｃ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体の、Ｓ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９〜Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７およびＧ３８５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしているグルタミン含有タグとを含み、ここで、グルタミン含有タグは抗体に挿入されているか、または抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸と置き換わっており、薬剤−抗体比率は少なくとも約６である。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグと、ｃ）１つまたは複数のグルタミンタグであって、アミンドナー物質が、抗体重鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしているグルタミンタグとを含み、ここで、薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）は、約６〜９である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）またはＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）であり、抗体重鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）またはＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）である。

【0085】

一変形形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグと、ｃ）１つまたは複数のグルタミンタグであって、アミンドナー物質が、抗体重鎖のアミノ酸位置Ｔ１３５の後に挿入されたグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしているグルタミンタグとを含み、ここで、薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）は、約６〜９である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）またはＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）であり、抗体重鎖のＴ１３５の後に挿入されたグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧ（配列番号２）である。

【0086】

別の変形形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグと、ｃ）１つまたは複数のグルタミンタグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２のグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしているグルタミンタグとを含み、ここで、薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）は、約６〜９である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）またはＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）であり、抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２のグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧ（配列番号２）である。

【0087】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣはまた、ａ）Ｎ２９７Ｑ位およびＫ２２２Ｒ位でのアミノ酸置換であって、アミンドナー物質が、２９５位の内因性グルタミンおよび２９７位の置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミノ酸置換と、ｂ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）に部位特異的にコンジュゲートしているグルタミン含有タグと、ｃ）１つまたは複数のグルタミンタグであって、アミンドナー物質が、抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２のグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしているグルタミンタグと、（ｄ）１つまたは複数のグルタミン含有タグであって、アミンドナー物質が、抗体重鎖のアミノ酸位置Ｔ１３５の後に挿入されたグルタミン含有タグに部位特異的にさらにコンジュゲートしているグルタミン含有タグとを含み、ここで、薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）は、約９〜１１である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）またはＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）であり、抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２のグルタミン含有タグはＬＬＱＧ（配列番号２）であり、抗体重鎖のＴ１３５の後に挿入されたグルタミン含有タグもまた、ＬＬＱＧ（配列番号２）である。

【0088】

いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣはまた、ａ）抗体軽鎖のカルボキシル末端で、ｂ）抗体重鎖のアミノ酸位置Ｔ１３５の後で、およびｃ）抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２でグルタミン含有タグに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質を含み、ここで、内因性アミノ酸残基はグルタミン含有タグに置き換えられており、薬剤−抗体比率は約５〜７である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖のカルボキシル末端のグルタミン含有タグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）またはＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）であり、抗体軽鎖のアミノ酸位置Ｇ２００〜Ｓ２０２のグルタミン含有タグはＬＬＱＧ（配列番号２）であり、抗体重鎖のＴ１３５の後に挿入されたグルタミン含有タグもまた、ＬＬＱＧ（配列番号２）である。

【0089】

本発明のＡＤＣの薬剤−抗体比率（ＤＡＲ）は、約５〜約７２０である。いくつかの実施形態において、ＤＡＲは、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００および７１０のいずれかである。

【0090】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載するＡＤＣのグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号３７）［式中、Ｘは、本明細書中に記載する従来のまたは非従来のアミノ酸であり得る］を含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｋ（Ｌｙｓ）またはＷ（Ｔｒｐ）である。いくつかの実施形態において、グルタミン含有タグは、Ｑ、ＬＱＧ、ＬＬＱＧＧ（配列番号１）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号３）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４）、ＧＬＬＱＧ（配列番号５）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号６）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱ（配列番号９）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＰＧＫ（配列番号２５）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号２６）、ＬＬＱＧＰ（配列番号２７）、ＬＬＱＰ（配列番号２８）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号２９）、ＬＬＱＡＰＧＫ（配列番号３０）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号３１）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号３２）、およびＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、グルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＱＧ、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、またはＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）を含む。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＧＧＱＧＧＧ（配列番号３８）、ＧＧＧＱＧＧＬ（配列番号３９）、ＧＸＧＱＧＧＧ（配列番号４０）、ＧＧＸＱＧＧＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＱＸＧＧ（配列番号４２）、およびＧＧＧＱＧＸＧ（配列番号４３）［式中、ＸはＧ、Ａ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、ＮまたはＥである］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含まない。また、他の典型的なタグは、例えば、ＵＳ２０１３０２３０５４３およびＵＳ２０１３／０１２２０２０に記載されている。

【0091】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載するＡＤＣの抗体は、同一の位置の野生型抗体と比較して、カルボキシル末端の最後のアミノ酸位置にアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、置換は、野生型アミノ酸を別のアミノ酸（例えば、非野生型アミノ酸）に置き換えることを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、１つまたは複数のアミノ酸を挿入する（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸を挿入する）ことを含む。いくつかの実施形態において、他の（例えば、非野生型）または挿入されるアミノ酸は、Ａｒｇである。いくつかの実施形態において、他の（例えば、非野生型）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである。例えば、いくつかの実施形態において、抗体（例えば、抗体の重鎖）のカルボキシル末端の最後のアミノ酸は、欠失させることができ、ポリペプチドのＣ末端に対して操作されたグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）またはＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）を含む。

【0092】

いくつかの実施形態において、抗体は、同一の位置の野生型抗体と比較して、アミノ末端の最初のアミノ酸位置にアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アミノ酸の欠失、挿入、置換、突然変異またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、置換は、野生型アミノ酸を別の（例えば、非野生型）アミノ酸に置き換えることを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、アミノ酸を挿入することを含む。いくつかの実施形態において、非野生型のまたは挿入されるアミノ酸は、Ａｒｇである。いくつかの実施形態において、他の（例えば、非野生型のまたは挿入された）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである。

【0093】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載するＡＤＣは、完全長の抗体重鎖および抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディまたは抗体断片である。

【0094】

いくつかの実施形態において、抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。

【0095】

いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである。

【0096】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＡＤＣのエフェクター機能（例えば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合によって測定される）は、野生型抗体と比較して、約１倍以上に増加する、または最大約２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれかまで低下する。いくつかの実施形態において、ＡＤＣの抗体はＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して最大約２分の１まで低下する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１に低下する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１未満に低下する。いくつかの実施形態において、ＡＤＣの抗体はＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１倍以上に増加する。他の実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１倍である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１分の１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれか未満に低下する。

【0097】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＡＤＣのエフェクター機能（例えば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合によって測定される）は、野生型抗体と比較して、少なくとも約１倍から３０００倍に増大する。いくつかの実施形態において、ＡＤＣのエフェクター機能は、野生型抗体と比較して、少なくとも約１倍から５倍、６倍から１０倍、１１倍から１５倍、１６倍から２０倍、２１倍から２５倍、２６倍から３０倍、３１倍から３５倍、３６倍から４０倍、４１倍から４５倍、４６倍から５０倍、５１倍から５５倍、５６倍から６０倍、６１倍から６５倍、６６倍から７０倍、７１倍から７５倍、７６倍から８０倍、８１倍から８５倍、８６倍から９０倍、９１倍から９５倍、９６倍から１００倍、１０１倍から２００倍、２０１倍から３００倍、３０１倍から５００倍、５０１倍から１０００倍、１００１倍から１５００倍、１５０１倍から２０００倍、２００１倍から２５００倍、２５０１倍から３０００倍のいずれかに増大する。いくつかの実施形態において、ＡＤＣの抗体はＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して、約１倍から３００倍に増大する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、または３０００倍のいずれかに増大する。

【0098】

いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、式：Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、式中、Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分である。

【0099】

抗体にコンジュゲートし得るアミンドナー物質の数は、１）抗体に連結／挿入されるグルタミン含有タグの数およびグルタミン含有タグ上のグルタミンの数、ならびに／または２）抗体の内因性グルタミンの数（すなわち、操作されていない天然グルタミン、例えば、可変ドメイン、ＣＤＲなどにおけるグルタミン）、ならびに／または３）本明細書中に記載する抗体の操作もしくは操作されるトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンの数によって異なる。例えば、２つのアミンドナー物質が、２つの軽鎖のカルボキシル末端で抗体に部位特異的にコンジュゲートすることができ、４つのアミンドナー物質が、Ｑ２９５位およびＮ２９７Ｑ位で抗体に部位特異的にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、各コンジュゲーション位置において同一であっても異なっていてもよい。

【0100】

本発明のアミンドナー単位は、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンを介する抗体への作用物質部分へのコンジュゲーションを可能にするトランスグルタミナーゼの基質を提供する第一級アミン（ＮＨ_２）である。したがって、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンとアミンドナー単位との間の連結は、式ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−［式中、１つのＮＨ−は、１つのリンカーおよび１つまたは複数の作用物質部分に連結している］を有する。

【0101】

本発明のリンカーは、切断可能なまたは切断不可能なリンカーであり得る。例えば、リンカー（アミンドナー単位を有する）またはアミンドナー物質は、抗体から放出され得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、従来のおよび／または非従来のアミノ酸（１つまたは複数））および／または非ペプチドリンカーであり得る。非ペプチドリンカーの例としては、アルキルリンカーおよびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカーが挙げられる。

【0102】

いくつかの実施形態において、アミンドナー単位−リンカー（例えば、Ｘ−Ｙ）は、作用物質部分を含む直鎖状の単位である。他の実施形態において、アミンドナー単位−リンカーは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の作用物質部分を含む、分岐鎖状の単位（例えば、少なくとも２つの単位）である。一変形形態において、分岐鎖状リンカー上の作用物質部分は、同一のまたは異なる作用物質部分であり得る。

【0103】

典型的なアミンドナー単位−リンカーには、限定はしないが、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、アミノカプロン酸、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ（シトルリン）−ＰＡＢＣ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、［（３Ｓ，５Ｓ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−、Ａｃ−Ｌｙｓ−プトレシンまたは２−アミノエトキシが含まれる。

【0104】

本発明の操作されたポリペプチドの作用物質部分には、低分子、タンパク質またはポリペプチド、および生体適合性ポリマーが含まれる。

【0105】

いくつかの実施形態において、低分子は、細胞傷害物質、免疫抑制物質またはイメージング剤（例えば、フルオロフォア）である。いくつかの実施形態において、細胞傷害物質は化学療法薬である。

【0106】

細胞傷害物質の例としては、限定はしないが、アントラサイクリン、オーリスタチン、ドラスタチン、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、エンジイン、ゲルダナマイシン、マイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、カンプトセシン、ツブリシン、ヘミアステリン、スプリセオスタチン、プラジエノライド、およびそれらの立体異性体、アイソスター、類似体または誘導体が挙げられる。

【0107】

アントラサイクリンは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓ）の細菌に由来し、広範な癌、例えば、白血病、リンパ腫、乳癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌の治療に使用されている。典型的なアントラサイクリンには、限定はしないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン（すなわち、アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシンおよびミトキサントロンが含まれる。

【0108】

ドラスタチンならびにそのペプチド類似体および誘導体、オーリスタチンは、抗癌活性および抗真菌活性を有することが示されている、非常に強力な抗有糸分裂物質である。例えば、米国特許第５，６６３，１４９号、およびＰｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１〜２９６５（１９９８）を参照されたい。典型的なドラスタチンおよびオーリスタチンには、限定はしないが、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ（モノメチルオーリスタチンＤまたはモノメチルドラスタチン１０）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−フェニルアラニン）、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−ノルエフェドリン）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）および他の新規オーリスタチン（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７５３号に記載されているもの）が含まれる。いくつかの実施形態において、オーリスタチンは、下記構造

【0109】

【化1】

を有する０１０１（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。

【0110】

いくつかの実施形態において、オーリスタチンは、下記構造

【0111】

【化2】

を有する３３７７（Ｎ，２−ジメチルアラニル−Ｎ−｛（１Ｓ，２Ｒ）−４−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシル−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル｝−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。

【0112】

いくつかの実施形態において、オーリスタチンは、下記構造

【0113】

【化3】

を有する３３７７−ＯＭｅ（Ｎ，２−ジメチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。

【0114】

他の実施形態において、オーリスタチンは、下記構造

【0115】

【化4】

を有する０１３１（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。

【0116】

他の実施形態において、オーリスタチンは、下記構造

【0117】

【化5】

を有する０１２１（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。

【0118】

カンプトセシンは、酵素トポイソメラーゼＩを阻害する細胞傷害性キノリンアルカロイドである。カンプトセシンおよびの誘導体の例としては、限定はしないが、トポテカンおよびイリノテカンならびにそれらの代謝産物、例えば、ＳＮ−３８が挙げられる。

【0119】

コンブレタスタチンは、腫瘍における血管破壊性を有する天然のフェノールである。典型的なコンブレタスタチンおよびその誘導体には、限定はしないが、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ−４）およびオンブラブリンが含まれる。

【0120】

デュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５は、細胞傷害性能力を有するＤＮＡアルキル化剤である。ＢｏｇｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：３６４２〜３６４９（１９９５）を参照されたい。典型的なデュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５には、限定はしないが、（＋）デュオカルマイシンＡおよび（＋）デュオカルマイシンＳＡ、（＋）ＣＣ−１０６５、ならびに国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１５／０５０２８０に開示されている化合物、例えば、限定はしないが、構造

【0121】

【化6】

を有するＮ^２−アセチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（２−｛［（｛（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−３−［（５−｛［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−５−（ホスホノオキシ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−３−イル］カルボニル｝チオフェン−２−イル）カルボニル］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−５−イル｝オキシ）カルボニル］（メチル）アミノ｝エチル）（メチル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド、構造

【0122】

【化7】

を有するＮ^２−アセチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（２−｛［（｛（８Ｓ）−８−（クロロメチル）−６−［（３−｛［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−８−メチル−５−（ホスホノオキシ）−１，６−ジヒドロピロロ［３，２−ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル］カルボニル｝ビシクロ［１．１．１］ペンタ−１−イル）カルボニル］−１−メチル−３，６，７，８−テトラヒドロピロロ［３，２−ｅ］インドール−４−イル｝オキシ）カルボニル］（メチル）アミノ｝エチル）（メチル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド、構造

【0123】

【化8】

を有するＮ^２−アセチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（２−｛［（｛（８Ｓ）−８−（クロロメチル）−６−［（４−｛［（１Ｓ）−１−（クロロメチル）−８−メチル−５−（ホスホノオキシ）−１，６−ジヒドロピロロ［３，２−ｅ］インドール−３（２Ｈ）−イル］カルボニル｝ペンタシクロ［４．２．０．０^２，５．０^３，８．０^４，７］オクタ−１−イル）カルボニル］−１−メチル−３，６，７，８−テトラヒドロピロロ［３，２−ｅ］インドール−４−イル｝オキシ）カルボニル］（メチル）アミノ｝エチル）（メチル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミドが含まれる。

【0124】

エンジインは、９員環および１０員環またはコンジュゲートした三重−二重−三重結合の環状系の存在を特徴とする、１つのクラスの抗腫瘍細菌産物である。典型的なエンジインには、限定はしないが、カリケアマイシン、エスペラマイシン、ウンシアラマイシン、ダイネミシンおよびそれらの誘導体が含まれる。

【0125】

ゲルダナマイシンは、Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質９０）に結合するベンゾキノンアンサマイシン抗生物質であり、抗腫瘍薬として使用されている。典型的なゲルダナマイシンには、限定はしないが、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）が含まれる。

【0126】

ヘミアステリンおよびその類似体（例えば、ＨＴＩ−２８６）は、チューブリンに結合し、正常な微小管ダイナミクスを破壊し、化学量論量で微小管を脱重合する。

【0127】

マイタンシンまたはその誘導体であるマイタンシノイドは、チューブリンの重合の阻害を介して有糸分裂の間の微小管形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する。Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２〜１００５（１９７５）を参照されたい。典型的なマイタンシンおよびマイタンシノイドには、限定はしないが、メルタンシン（ＤＭ１）およびその誘導体ならびにアンサミトシンが含まれる。

【0128】

ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）およびインドリノ−ベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）は、二本鎖のＤＮＡに結合する、１つまたは複数のイミン官能基またはそれらの等価物を含有する抗腫瘍薬である。ＰＢＤ分子およびＩＧＮ分子は、天然産物アントラマイシンをベースとし、配列選択的様式でＤＮＡと相互作用し、プリン−グアニン−プリン配列が好ましい。典型的なＰＢＤおよびその類似体には、限定はしないが、ＳＪＧ−１３６が含まれる。

【0129】

スプリセオスタチンおよびプラジエノライドは、スプライシングを阻害しかつスプライセオソーム、ＳＦ３ｂと相互作用する抗腫瘍化合物である。スプリセオスタチンの例としては、限定はしないが、スプリセオスタチンＡ、ＦＲ９０１４６４、および構造

【0130】

【化9】

を有する（２Ｓ，３Ｚ）−５−｛［（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−６−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，７Ｓ）−７−（２−ヒドラジニル−２−オキソエチル）−４−ヒドロキシ−１，６−ジオキサスピロ［２．５］オクタ−５−イル］−３−メチルペンタ−２，４−ジエン−１−イル｝−２，５−ジメチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］アミノ｝−５−オキソペンタ−３−エン−２−イルアセテートが挙げられる。プラジエノライドの例としては、限定はしないが、プラジエノライドＢ、プラジエノライドＤおよびＥ７１０７が挙げられる。

【0131】

タキサンは、抗チューブリン物質または有糸分裂阻害物質として作用するジテルペンである。典型的なタキサンには、限定はしないが、パクリタキセル（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））が含まれる。

【0132】

ツブリシンは、微小管を脱重合して有糸分裂停止を誘発することが示されている、粘液細菌の菌株から分離される天然産物である。典型的なツブリシンには、限定はしないが、ツブリシンＡ、ツブリシンＢおよびツブリシンＤが含まれる。

【0133】

ビンカアルカロイドもまた、抗チューブリン物質である。典型的なビンカアルカロイドには、限定はしないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが含まれる。

【0134】

いくつかの実施形態において、作用物質部分は免疫抑制物質である。免疫抑制物質の例としては、限定はしないが、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキセート、ならびに糖質コルチコイドならびにその類似体および誘導体が挙げられる。

【0135】

いくつかの実施形態において、作用物質部分は、イメージング剤（例えば、フルオロフォアまたはキレート剤）、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ランタニド蛍光体およびそれらの誘導体、またはキレート剤に結合した放射性同位体である。フルオロフォアの例としては、限定はしないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば、５−ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）（例えば、５−ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えば、Ａｌｅｘａ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００または７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば、５−ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）およびスルホローダミン（ＳＲ）（例えば、ＳＲ１０１）が挙げられる。キレート剤の例としては、限定はしないが、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン、１−グルタル酸−４，７−酢酸（デフェロキサミン）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）および１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）（ＢＡＰＴＡ）が挙げられる。

【0136】

いくつかの実施形態において、作用物質部分はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体またはマウスモノクローナル抗体である。

【0137】

いくつかの実施形態において、作用物質部分は、毒素ポリペプチド（または毒素タンパク質）である。毒素ポリペプチドの例としては、限定はしないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖、リジンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチド（例えば、セラトトキシン）、およびコノトキシン（例えば、ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）が挙げられる。

【0138】

いくつかの実施形態において、放射性同位体または他の標識を、キレート剤を有するアミンドナー物質への抗体のコンジュゲーションのための作用物質部分内に（キレート剤への結合によって）組み込むことができる。放射性同位体または他の標識の例としては、限定はしないが、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^１３１Ｉｎ、^１５３Ｓｍ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｂｉおよび^１５３Ｐｂが挙げられる。

【0139】

いくつかの実施形態において、作用物質部分は、生体適合性ポリマーである。抗体は、抗体の生物学的特性を向上させるように、例えば、血清の半減期および生物活性を増大させるように、ならびに／またはインビボでの半減期を延長させるように、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンを介して生体適合性ポリマーにコンジュゲートし得る。生体適合性ポリマーの例としては、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体および両性イオン含有生体適合性ポリマー（例えば、ホスホリルコリン含有ポリマー）が挙げられる。

【0140】

いくつかの実施形態において、アミンドナー物質（Ｘ−Ｙ−Ｚ）は、

【0141】

【化10】

であり、式中、Ｘは、ＮＨ_２であり（すなわち、ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−としてグルタミンと共有結合を形成する）、ｍは０から２０であり、ｎは１から８であり、ｐは０から３であり、ｑは０または１であり、アミノ酸は、任意の従来のまたは非従来のアミノ酸であり、Ｚは、細胞傷害物質またはイメージング剤である。

【0142】

従来のアミノ酸または天然アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいていくつかの群に分けられる：（１）非極性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）電荷を有さない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性（負に荷電している）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性（正に荷電している）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、および（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。従来のアミノ酸には、ＬまたはＤの立体化学が含まれる。

【0143】

非従来のアミノ酸は、非天然アミノ酸である。非従来のアミノ酸の例としては、限定はしないが、アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、シトルリン、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびアミノ酸誘導体（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。

【0144】

いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、反応性アミンおよび作用物質部分を含む生体適合性ポリマーである。

【0145】

いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＦ、プトレシニル−ゲルダナマイシン、Ａｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシン、アミノカプロイル−３３７７、アミノカプロイル−０１３１、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−０１３１、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−３３７７、アミノカプロイル−０１２１、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−０１２１、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、［（３Ｒ，５Ｒ）−１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］プロパノイル｝ピペリジン−３，５−ジイル］ビス−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、２−アミノエトキシ−ＰＥＧ６−ＮＯＤＡＧＡ（または２，２’−（７−（１−アミノ−２８−カルボキシ−２５−オキソ−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサ−２４−アザオクタコサン−２８−イル）−１，４，７−トリアゾナン−１，４−ジイル）二酢酸）、およびＮ−２−アセチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ〜５〜−カルバモイル−Ｎ−［４（｛［（２｛［（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ）−８−ヒドロキシ−７−｛（１Ｅ，３Ｅ）−５−［（２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−５−｛［（２Ｚ，４Ｓ）−４−ヒドロキシペンタ−２−エノイル］アミノ｝−３，６−ジメチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］−３−メチルペンタ−１，３−ジエン−１−イル｝−１，６−ジオキサスピロ［２．５］オクタ−５−イル］アセチル｝ヒドラジニル）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アミンドナー物質は、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１またはアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤである。いくつかの実施形態において、アシルドナーグルタミン含有タグは、アミノ酸配列ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）またはＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、およびさらにＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）またはＬＬＱＧ（配列番号２）を含み、アミンドナー物質は、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−０１０１および／またはアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤである。アミンドナー物質の典型的な構造を、表２に列挙する。

【0146】

【表2-1】

【0147】

【表2-2】

【0148】

【表2-3】

【0149】

【表2-4】

【0150】

【表2-5】

【0151】

【表2-6】

【0152】

【表2-7】

【0153】

より高ロードの抗体−薬剤コンジュゲートを作製するための方法
本明細書中に記載するＡＤＣを作製するための方法もまた、提供する。一態様において、本発明は、式：抗体−（Ｔ−（Ｘ−Ｙ−Ｚ_ａ）_ｂ）_ｃ［式中、Ｔは、１）特異的部位で操作されたグルタミン含有タグ、２）内因性グルタミン、および／または３）抗体の操作もしくは操作されたトランスグルタミナーゼによって反応性にされた内因性グルタミンであり、Ｘはアミンドナー単位であり、Ｙはリンカーであり、Ｚは作用物質部分であり、Ｘ−Ｙ−Ｚは、グルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／または反応性の内因性グルタミンに部位特異的にコンジュゲートしているアミンドナー物質であり、ａは１〜６の整数であり、ｂは１〜６の整数であり、ｃは１〜２０の整数であり、ａ、ｂおよびｃの積（薬剤−抗体比率）は少なくとも約５である］を含むＡＤＣを作製するための方法であって、ａ）抗体およびグルタミン含有タグ；ならびに／または内因性グルタミンおよび／もしくは反応性の内因性グルタミンを有する抗体を含む抗体−Ｔ分子を提供するステップと、ｂ）アミンドナー物質をトランスグルタミナーゼ（例えば、操作されたトランスグルタミナーゼまたは精製されたトランスグルタミナーゼ）の存在下において抗体−Ｔ分子と接触させるステップと、ｃ）抗体−Ｔをアミンドナー物質に共有結合によって連結させて、抗体−薬剤コンジュゲートを形成するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗体−Ｔ分子は、ＣＨＯ細胞において発現される。

【0154】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載する方法を用いて調製されたＡＤＣは、少なくとも約５１％のコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、少なくとも約５１％〜６０％、６１％〜７０％、７１％〜８０％、８１％〜９０％または９１％〜１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％のいずれかのコンジュゲーション効率を有する。

【0155】

いくつかの実施形態において、接触されるアミンドナー物質と接触される抗体−Ｔ分子との間のモル濃度比率は、約４：１〜約１００００：１である。例えば、トランスグルタミナーゼによって触媒されるコンジュゲーション反応のためにロードされるかまたは用いられる、アミンドナー物質（例えば、細胞傷害性薬剤）と抗体（例えば、グルタミン含有タグに結合したまたは天然／反応性のグルタミンを含有している）との間のモル濃度比率は、約２０：１であり得る。いくつかの実施形態において、接触されるアミンドナー物質と接触される抗体−Ｔ分子との間のモル濃度比率は、約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１または１００００：１のいずれかである。

【0156】

いくつかの実施形態において、抗体が特異的部位においてグルタミン含有タグ、内因性グルタミンおよび／もしくは反応性の内因性グルタミンを介してアミンドナー物質とコンジュゲートしている場合、ＡＤＣはより安定であり（例えば、インビボでのＡＤＣ半減期がさらに長く）かつ／またはより高い曝露量を有する。例えば、Ｎ２９７ＱおよびＫ２２２Ｒのアミノの修飾；抗体軽鎖および／または抗体重鎖のカルボキシル末端のならびに／または本明細書中に記載する抗体軽鎖および／もしくは抗体重鎖の１つもしくは複数の位置（例えば、表１を参照されたい）のグルタミン含有タグ（１つまたは複数）を含むＡＤＣは、マレイミド連結を有する従来のＡＤＣより安定である。

【0157】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法はさらに、精製ステップを含む。本明細書において記載されるＡＤＣは、様々な精製方法、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、透析、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（例えば、ＨＩＣでの分画）、硫酸アンモニウム沈殿、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール誘導体沈殿、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、および弱分割クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。

【0158】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの精製ステップは、アフィニティークロマトグラフィー方法のステップを含む。タンパク質Ａリガンド（合成の、組換えの、または天然の）を、本明細書において記載される操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートをアフィニティー精製するために用いることができる。合成のまたは組換えのタンパク質Ａリガンドは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から商業的に購入することができ、天然タンパク質Ａリガンド（例えば、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）、ＰＲＯＳＥＰ（商標）Ｖａ、およびＰＲＯＳＥＰ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から商業的に購入することができる。

【0159】

いくつかの実施形態において、精製ステップから生じる、精製された本明細書において記載されるＡＤＣは、非常に純度が高く、すなわち、少なくとも約７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９８％、または９９％のいずれかの純度である。例えば、精製されたＡＤＣは、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれかの純度である。

【0160】

薬剤ロード量が高い抗体−薬剤コンジュゲートを使用する方法
本発明のＡＤＣは、限定はしないが、治療的処置法および診断的処置方法を含む様々な用途において有用である。

【0161】

一態様において、本発明は、対象において癌を治療するための方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態において、それを必要としている対象において癌を治療する方法であって、本明細書中に記載するＡＤＣを含む組成物（例えば、医薬組成物）の有効量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。本明細書中において使用する癌には、限定はしないが、固体癌（例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、結腸癌、食道癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌および皮膚癌）、および液性癌（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含む）、および成人Ｔ細胞白血病）が含まれる。

【0162】

いくつかの実施形態において、それを必要としている対象において腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、本明細書中に記載するＡＤＣを含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。他の実施形態において、それを必要としている対象において癌細胞または腫瘍（例えば、固形腫瘍または液状腫瘍）の転移を阻害する方法であって、本明細書中に記載するＡＤＣを含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。他の実施形態において、それを必要としている対象において腫瘍退縮を誘発する方法であって、本明細書中に記載するＡＤＣを含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。

【0163】

別の態様において、インビボまたはインビトロで癌関連タンパク質（例えば、Ｔｒｏｐ−２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＥＦＧＲ、５Ｔ４、ＣＤ２２など）と関連する状態を検出、診断および／または監視する方法が提供される。したがって、いくつかの実施形態において、癌を患っている疑いがある対象において癌を診断する方法であって、ａ）対象の試料を本明細書中に記載するＡＤＣと、ＡＤＣと癌関連タンパク質との結合をもたらす条件下で接触させるステップと、ｂ）癌関連タンパク質へのＡＤＣの結合を測定するステップとを含む方法が提供される。

【0164】

本明細書中に記載するＡＤＣの作用物質部分は、検出可能な部分、例えば、イメージング剤および酵素−基質標識であり得る。本明細書中に記載するＡＤＣはまた、インビボ診断アッセイ、例えば、インビボイメージング（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）または染色試薬に使用し得る。

【0165】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載する方法は、追加の治療法形態で対象を治療するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、追加の治療法形態は、限定はしないが、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法および／または追加の免疫療法を含む追加の抗癌療法である。

【0166】

いくつかの実施形態において、追加の治療法形態は、本明細書中に記載するＡＤＣに加えて、１種または複数の治療薬を投与するステップを含む。治療薬には、限定はしないが、第２のＡＤＣ（例えば、従来のＡＤＣ、例えば、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））およびａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）））、抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ２５抗体および／または抗ＣＤ２０抗体）、血管新生阻害薬、細胞傷害物質（例えば、ドセタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、マイトマイシン、タモキシフェンまたはフルオロウラシル）、および抗炎症薬（例えば、プレドニゾンおよびプロゲステロン）が含まれる。

【0167】

医薬組成物
本発明はまた、本明細書中に記載するより高ロードのＡＤＣを、薬学的に許容できる賦形剤または担体中に含む医薬組成物を提供する。ＡＤＣは、単独で、または本発明の１種もしくは複数の他のＡＤＣと組み合わせて、または１種もしくは複数の他の薬剤と組み合わせて（またはその任意の組み合わせとして）投与することができる。例えば、本発明のＡＤＣは、従来のＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ１〜４）または本明細書中に記載するトランスグルタミナーゼ−介在性コンジュゲーション技術を用いるＤＡＲ１〜４の部位特異的ＡＤＣと組み合わせて投与することができる。したがって、本発明の方法および使用はまた、以下に詳述されるように、他の活性物質との組み合わせ（同時投与）の実施形態を包含する。

【0168】

本明細書において用いられる場合、用語「同時投与」、「同時投与された」、または「と組み合わせて」は、（ｉ）本明細書において開示されるＡＤＣおよび治療物質（１つまたは複数）が、このような成分を治療を必要としている患者にほぼ同時に放出する単回投与形態に共に製剤されている場合の、前記成分の組み合わせの、前記患者への同時投与、（ｉｉ）本明細書において開示されるＡＤＣおよび治療物質（１つまたは複数）が、治療を必要としている患者によってほぼ同時に摂取される（その際、前記成分が前記患者にほぼ同時に放出される）個別の投与形態に、互いに分かれて製剤されている場合の、前記成分のこのような組み合わせの、前記患者へのほぼ同時の投与、（ｉｉｉ）本明細書において開示されるＡＤＣおよび治療物質（１つまたは複数）が、各投与間の十分な時間間隔を伴って治療を必要としている患者によって連続的な時点で摂取される（その際、前記成分が前記患者に実質的に異なる時点で放出される）個別の投与形態に、互いに分かれて製剤されている場合の、前記成分のこのような組み合わせの、前記患者への連続投与、ならびに（ｉｖ）本明細書において開示されるＡＤＣおよび治療物質（１つまたは複数）が、制御された様式で前記成分を放出する（その際、これらの成分が、治療を必要としている患者に同時におよび／または異なる時点で同時放出、連続放出、および／またはオーバーラップ放出される）単回投与量に、共に製剤されている場合の、前記成分のこのような組み合わせの、前記患者への連続投与を意味するものであり、これを指す。

【0169】

全体として、本明細書において開示されるＡＤＣは、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせた製剤として投与されることに適している。用語「賦形剤」は、本発明の化合物（１つまたは複数）以外の任意の成分を記載するために本明細書において用いられる。賦形剤（１つまたは複数）の選択は、特定の投与態様、溶解度および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに投与形態の性質などの因子に大きく依存する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる賦形剤」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる賦形剤のいくつかの例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせがある。いくつかの実施形態において、限定はしないが、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、または塩化ナトリウムを含む等張剤が、医薬組成物内に含まれる。薬学的に許容できる物質のさらなる例としては、限定はしないが、抗体の保存期間または有効性を増強させる、湿潤剤または微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝液が挙げられる。

【0170】

本発明はまた、本明細書中に記載する複数の本発明のより高ロードのＡＤＣを含む医薬組成物であって、平均薬剤−抗体比率が約５．０〜約７２０．０である医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、平均ＤＡＲは、少なくとも約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００．０、１１０．０、１２０．０、１３０．０、１４０．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、３５０．０、４００．０、４５０．０、５００．０、５５０．０、６００．０、６５０．０または７００．０である。

【0171】

一変形形態において、本発明は、複数のＡＤＣを含む医薬組成物であって、少なくとも１種のＡＤＣが、本明細書中に記載する本発明のより高ロードのＡＤＣであり、平均薬剤−抗体比率が約４．１〜約７２０．０である、医薬組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、平均ＤＡＲは、少なくとも約４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００．０、１１０．０、１２０．０、１３０．０、１４０．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、３５０．０、４００．０、４５０．０、５００．０、５５０．０、６００．０、６５０．０または７００．０である。例えば、医薬組成物は、本明細書中に記載するＤＡＲが少なくとも約５の、１種または複数の部位特異的ＡＤＣと、ＤＡＲが１、２、３または４の１種または複数の部位特異的ＡＤＣ（本明細書中に記載するトランスグルタミナーゼ−介在性コンジュゲーション技術を用いる）とを含むことができる。別の例として、医薬組成物は、１）本明細書中に記載するＤＡＲが少なくとも約５の１種または複数の部位特異的ＡＤＣと、２）ＤＡＲが１、２、３または４のＤＡＲの１種または複数の部位特異的ＡＤＣ（本明細書中に記載するトランスグルタミナーゼ介在性コンジュゲーション技術を用いる）と、３）ＤＡＲが１、２、３、４またはそれ以上の、マレイミド連結を有する１種または複数の従来のＡＤＣとを含むことができる。

【0172】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＡＤＣは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において記載されているような既知の技術を用いて、対象への投与の際に免疫原性を低減させるために脱免疫化することができる。

【0173】

本発明の医薬組成物およびその調製方法は、当業者に容易に明らかとなる。このような組成物およびその調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２２版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１２）において見ることができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。

【0174】

本発明の医薬組成物は、大量に、１つの単一単位用量で、または複数の単一単位用量で、調製、包装、または販売することができる。本明細書において用いられる場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む、医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、通常、対象に投与される活性成分の投与量、またはこのような投与量の都合の良い画分、例えば、このような投与量の２分の１または３分の１に等しい。当技術分野において認められている、ペプチド、タンパク質、または抗体を投与するための任意の方法を、本明細書において開示される操作されたポリペプチドコンジュゲートに適切に採用することができる。

【0175】

本発明の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。医薬組成物の非経口投与には、対象組織の物理的破壊および組織内の破壊を介する医薬組成物の投与によって特徴付けされる、したがって通常は、血流内、筋肉内、または内臓内への直接的な投与をもたらす、任意の投与経路が含まれる。例えば、非経口投与には、限定はしないが、組成物の注射、外科的切開を介する組成物の適用、組織を貫通する非外科的な創傷を介する組成物の適用などによる、医薬組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与には、限定はしないが、皮下の、腹腔内の、筋肉内の、胸骨内の、静脈内の、動脈内の、髄腔内の、脳室内の、尿道内の、頭蓋内の、滑液嚢内の注射または注入、および腎臓透析注入技術が含まれると考えられる。いくつかの実施形態において、非経口投与は、静脈内経路または皮下経路である。

【0176】

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、滅菌水または無菌の等張生理食塩水などの薬学的に許容できる担体と組み合わされた活性成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製、包装、または販売することができる。注射可能な製剤は、単位投与形態で、例えばアンプル、または防腐剤を含有する多回用量容器で、調製、包装、または販売することができる。非経口投与のための製剤には、限定はしないが、懸濁液、溶液、油性媒体または水性媒体内のエマルジョン、ペーストなどが含まれる。このような製剤はさらに、限定はしないが懸濁剤、安定剤、または分散剤を含む、１つまたは複数のさらなる成分を含み得る。非経口投与のための製剤の１つの実施形態において、活性成分は、適切な媒体（例えば、発熱性物質を有さない滅菌水）で再構成して、その後、再構成された組成物を非経口投与するために、乾燥（すなわち、粉末または粒状）形態で提供される。非経口製剤にはまた、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは３から９のｐＨまで）などの賦形剤を含有し得る水性溶液が含まれるが、一部の適用では、非経口製剤は、無菌の非水性溶液として、または発熱性物質を有さない滅菌水などの適切な媒体と組み合わせて用いるための乾燥形態として、さらに適切に製剤することができる。典型的な非経口投与形態には、無菌の水溶液、例えば水性プロピレングリコール溶液またはデキストロース溶液内の、溶液または懸濁液が含まれる。このような投与形態は、必要に応じて、適切に緩衝することができる。有用な他の非経口投与可能な製剤には、微晶質形態のまたはリポソーム調製物内の活性成分を含むものが含まれる。非経口投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出となるように製剤することができる。調節放出製剤には、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、標的放出製剤、およびプログラム放出製剤が含まれる。例えば、１つの態様において、無菌の注射可能な溶液は、所要の量の操作されたＦｃ含有ポリペプチド、例えば抗体−薬剤コンジュゲートまたは二重特異的抗体を、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒内に組み込み、必要であればその後、濾過滅菌することによって、調製することができる。通常、分散は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙されたもののうち所要の他の成分を含有する無菌媒体内に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と、先に滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分とをもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物内に含めることによってもたらされ得る。

【0177】

投与レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調節することができる。例えば、単一のボーラスを投与することができるか、複数の分割用量を経時的に投与することができるか、または用量を、急迫的な治療的状況によって指示されるように比例的に低減もしくは増大させることができる。投与の容易性および投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に製剤することが、特に有利である。投与単位形態は、本明細書において用いられる場合、治療される患者／対象のための単位投与量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、所要の薬学的担体と組み合わされた、所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、通常、（ａ）作用物質部分（例えば、細胞傷害物質などの低分子）の固有の特徴および達成されるべき特定の治療的効果または予防的効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのこのような活性化合物の配合の当技術分野に特有の限定によって、およびこれらに直接的に応じて、決定される。

【0178】

したがって、当業者には、本明細書において提供される開示に基づいて、用量および投与レジメンが治療分野において周知の方法に従って調節されることが理解されよう。すなわち、最大耐用量を容易に確定することができ、検出可能な治療的利益を患者にもたらす有効量もまた、検出可能な治療的利益を患者にもたらすための各作用物質を投与するための時間的要件が可能であるように、確定することができる。したがって、特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されるが、これらの例は、本発明の実施において患者に提供され得る用量および投与レジメンを限定するものでは全くない。

【0179】

投与量値が、軽減されるべき症状のタイプおよび重症度で変化し得、単回用量または複数回用量を含み得ることに留意されたい。さらに、任意の特定の対象について、具体的な投与レジメンが、個体の要求および組成物を投与するかまたは投与を監督する人の専門的な判断に従って経時的に調節されるべきであること、ならびに本明細書において説明される投与量範囲は典型的なものにすぎず、本発明の組成物の範囲または実施を限定することを意図したものではないことも理解されたい。さらに、本発明の組成物を用いる投与レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、症状の重症度、投与経路、および採用される特定の抗体を含む、様々な因子に基づき得る。したがって、投与レジメンは広く変化し得るが、標準的な方法を用いて通常通りに決定することができる。例えば、用量は、毒性効果などの臨床効果および／または実験値を含み得る薬物動態学的または薬力学的なパラメーターに基づいて調節することができる。したがって、本発明は、当業者によって決定される、患者内での用量増加を包含する。適切な投与量およびレジメンの決定は、関連する分野において周知であり、本明細書において開示される教示を提供された当業者には、包含されることが理解されよう。

【0180】

ヒト対象への投与では、本明細書において開示されるＡＤＣの毎月用量の全量は、典型的には、当然のことながら投与態様に応じて、患者当たり約０．０１ｍｇから約１２００ｍｇの範囲である。例えば、静脈内の毎月用量は、患者当たり約１から約１０００ｍｇを要し得る。毎月用量の全量は、単回用量または分割用量で投与することができ、医師の指示で、本明細書によって示される典型的な範囲から外れてもよい。

【0181】

本明細書において開示されるＡＤＣの治療上または予防上有効な量の典型的な非限定的な範囲は、１月で患者当たり約０．０１から約１０００ｍｇである。一部の実施形態において、ＡＤＣは、１月で患者当たり約１から約２００または約１から約１５０ｍｇで投与することができる。いくつかの実施形態において、患者はヒトである。

【0182】

キット
本発明はまた、上記の障害の治療において用いるためのキット（または製品）を提供する。本発明のキットは、精製されたＡＤＣおよび疾患の治療にコンジュゲートを用いるための指示を含む、１つまたは複数の容器を含む。例えば、指示は、癌（例えば、固体癌または液性癌）などの疾患を治療するためのＡＤＣの投与についての記載を含む。キットはさらに、個体が疾患および疾患の段階を有しているかの同定に基づく、治療に適切な個体の選択についての記載を含み得る。

【0183】

ＡＤＣの使用に関する指示は、通常、目的の治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、大量包装（例えば、多用量包装）、または小単位用量であり得る。本発明のキットにおいて提供される指示は、典型的には、ラベルまたは包装挿入物（例えば、キット内に含まれる紙片）上に書き込まれた指示であるが、機械で読み取り可能な指示（例えば、磁気ディスクまたは光学式記憶ディスク上に記録された指示）もまた許容できる。

【0184】

本発明のキットは、適切な包装内にある。適切な包装には、限定はしないが、バイアル、ボトル、瓶、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチック袋）などが含まれる。特定の装置、例えば吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザー）、またはミニポンプなどの注入装置と組み合わせて用いるための包装もまた検討される。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内の溶液袋、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内の溶液袋、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物内の少なくとも１つの活性物質は、本明細書において記載される高ロードのＡＤＣである。容器はさらに、第２の薬学的に活性な作用物質を含み得る。

【0185】

キットは、緩衝液および説明情報などのさらなる成分を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上のまたは容器と組み合わされたラベルまたは包装挿入物（１つまたは複数）とを含む。

【実施例】

【0186】

本明細書において記載される実施例および実施形態は例示的なものにすぎず、これらに照らした様々な修正または変更は当業者に示唆され、本願の趣旨および範囲に含まれる。

【0187】

（実施例１）
標的発現が高い細胞（ＢｘＰＣ３、Ｔｒｏｐ２＋＋＋）における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現が高いＢｘＰＣ３細胞における、より高ロードのＡＤＣ（部位特異的ＡＤＣおよび従来のＡＤＣ）のインビトロでの細胞傷害性を例示する。

【0188】

抗体−薬剤コンジュゲーション
ａ．トランスグルタミナーゼ介在性抗体−薬剤コンジュゲーション
キメラマウス抗Ｔｒｏｐ−２抗体を、様々なアミノ酸位置でグルタミン含有トランスグルタミナーゼ（「Ｑ」）タグ（例えば、ＴＧ６、ＬＣＱ０４、Ｈ７ｃ、Ｌ１１ｂ；表１を参照されたい）で操作されたヒトＩｇＧ１サブタイプとして発現させ、様々なリンカーおよびペイロード（例えば、アミノカプロイル−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ（アミノカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−ＭＭＡＤ）；アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）とコンジュゲートさせた。一例において、トランスグルタミナーゼタグは、抗体の軽鎖および重鎖のＣ末端の両方で、ならびにヒトＩｇＧの２９７位（ＥＵナンバリングスキーム）で操作した（例えば、Ｔｒｏｐ−２抗体の２９７位において、野生型アミノ酸アスパラギン（Ｎ）を、グルタミンで置換した（Ｎ２９７Ｑ））。抗体の軽鎖および重鎖の両方、または抗体の重鎖もしくは軽鎖内の複数の部位において操作されたタグの組み合わせは、抗体１つ当たり複数のコンジュゲーション部位を有していた（例えば、ＤＡＲ４〜１０）。次いで、ペイロード（例えば、ＭＭＡＤ）への抗Ｔｒｏｐ−２抗体のコンジュゲーションを、特異的部位（例えば、重鎖または軽鎖のカルボキシル末端および／もしくはアミノ末端、２９７位、ならびに／または抗体の別の部位）にグルタミン含有タグ（１つまたは複数）を有する抗Ｔｒｏｐ−２抗体と、ペイロード（例えば、ＭＭＡＤ）に連結されたアミン含有リンカーとの間の、微生物トランスグルタミナーゼによって触媒されるアミド基転移反応を介して行った。場合によっては、抗体の２２２位（ＥＵナンバリングスキーム）の野生型アミノ酸リジンを、アミノ酸アルギニンに置き換えた（「Ｋ２２２Ｒ」）。例えば、Ｋ２２２Ｒ置換は、より均質な抗体およびペイロードコンジュゲート組成物、ならびに／または抗体軽鎖のＣ末端におけるグルタミンタグとの鎖間架橋の著しい減少をもたらすという驚くべき効果を有することが判明した。アミド基転移反応において、抗体上のグルタミンはアシルドナーとして作用し、アミン含有化合物はアシルアクセプター（アミンドナー）として作用した。３３μＭの濃度の精製抗Ｔｒｏｐ−２抗体を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムもしくは硫酸ナトリウム、および２５ｍＭのＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸］またはＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ範囲６．２〜９．２）中、１〜３％（ｗ／ｖ）のストレプトベルティシリウム モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ（商標）、味の素、日本）の存在下で、３３〜３３００μＭの範囲の１０〜１００Ｍ過剰のアシルアクセプターと共にインキュベートした。反応条件を、個別のアシルアクセプター誘導体に応じて調整し、最適な効率および特異性は、典型的には、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中、３３μＭの抗体、６６０μＭの誘導体、および２％（ｗ／ｖ）のトランスグルタミナーゼで観察された。３７℃で１６〜２０時間インキュベーション後、抗体を、当業者に知られている標準的なクロマトグラフィー方法、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの市販のアフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂またはＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製した。

【0189】

ｂ．従来の抗体−薬剤コンジュゲーション
平均薬剤ロード量が４（例えば、抗体１分子当たり４つのＭＭＡＤ）である、従来のマレイミド連結を介してＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤとコンジュゲートされた抗体（例えば、キメラマウス抗Ｔｒｏｐ−２抗体（ｍ７Ｅ６））を生成するために、最初に、５ｍｇ／ｍｌの抗体を、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中７．５モル当量のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で３７℃において２時間還元した。還元された抗体に、室温（約２２℃）において７．５モル過剰のマレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを加え、１時間インキュベートした。反応混合物を、４℃においてＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）に対して透析し、０．２μｍフィルターを通して滅菌濾過した。薬剤ロード量が８の、マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを有するｍ７Ｅ６を生成するために、抗体を、５０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む前述のような反応緩衝液中、１０モル過剰のＴＣＥＰで還元した。１２モル過剰のマレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを、前述のように処理された、還元された抗体および材料に加えた。薬剤ロード量が６の、マレイミド−ＰＥＧ６ＭＭＡＤとコンジュゲートされたｍ７Ｅ６を生成するために、抗体を、ＤＡＲ８の還元に関しては、緩衝液中８倍モル過剰のＴＣＥＰで還元し、続いて８倍モル過剰のマレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを加えた。ＤＡＲ６の種を精製するために、反応混合物を希釈して、０．７５Ｍの硫酸アンモニウム、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７の緩衝液組成物（緩衝液Ａ）を得た。材料を、直列に接続された２×１ｍｌのＢｕｔｙｌ ＨＰ Ｈｉ Ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、２ＣＶ（カラム容量）の緩衝液Ａで洗浄し、２０％イソプロパノールを含む２５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７）への２０ＣＶ直線勾配で溶離させた。ＤＡＲ６を含有するフラクションをプールし、ＰＢＳに対して透析し、１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて濃縮した。

【0190】

インビトロでの研究
キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ ＬＣＱ０４／Ｋ２２２ＲアミノＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９７、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．８３、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７１、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８０、部位特異的）およびｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．２０、従来）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＢｘＰＣ３細胞を用いて行った。この実施例および本明細書中に記載する他の実施例におけるＤＡＲの数は、抗体１分子当たりのペイロードの比率を指す。使用したリンカーはＰＥＧ６であり、使用したペイロードはＭＭＡＤであった。ＢｘＰｃ３は、高い標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋＋＋）を有する癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（すなわち、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表し、試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表した。細胞傷害アッセイの結果を図１に示し、表３に要約する。ＤＡＲ７．７１（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＤＡＲ７．７６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ７．８０（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）の３つの部位特異的分子は、ＤＡＲ７．２０の従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣ（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）と同程度に強力であった。

【0191】

これらの結果は、全てのＡＤＣは、標的発現が高いＢｘＰＣ３細胞へのそれらのペイロードのロード量に関わらず、ほぼ完全な細胞死滅を達成したが、より高ロードのコンジュゲートは、より低ロードのコンジュゲートと比較してより強力であったことを示している。

【0192】

【表3】

【0193】

（実施例２）
標的発現が中等度の細胞（Ｃｏｌｏ２０５、Ｔｒｏｐ２＋）における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現が中程度のＣｏｌｏ２０５細胞における、より高ロードのＡＤＣ（部位特異的ＡＤＣおよび従来のＡＤＣ）のインビトロでの細胞傷害性を例示する。

【0194】

キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ ＬＣＱ０４／Ｋ２２２ＲアミノＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９７、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．８３、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７１、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８０、部位特異的）およびｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．２０、従来）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＣｏｌｏ２０５細胞を用いて行った。Ｃｏｌｏ２０５は、中等度の標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋）を有する癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（すなわち、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表し、試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表した。細胞傷害アッセイの結果を図２に示し、表４に要約する。ＤＡＲが５．８５以上のＡＤＣは、完全な細胞死滅を達成した。ＤＡＲ７．７１（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＤＡＲ７．７６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ７．８０（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）の３つの部位特異的分子は、ＤＡＲ７．２０の従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣ（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）と比較して遜色がなかった。

【0195】

これらの結果は、細胞死滅活性および効力の増加と、標的発現が中程度のＣｏｌｏ２０５細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められることを示している。

【0196】

より高ロードの分子（例えば、５．８５以上のＤＡＲ）のみが、完全な細胞死滅を達成できた。

【0197】

【表4】

【0198】

（実施例３）
標的発現が低い細胞（ＣＦ−ＰＡＣ１、Ｔｒｏｐ２（＋））における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞における、より高ロードの部位特異的ＡＤＣのインビトロ細胞傷害性を例示する。

【0199】

キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９７、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．８３、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７１、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８０、部位特異的）およびｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．２０、従来）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＣＦ−ＰＡＣ１細胞を用いて行った。ＣＦ−ＰＡＣ１は、低い標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋）を有する癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（例えば、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表した。試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表す。表５および図３は、細胞死滅活性および効力の増加と、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められる、例えば、ペイロードのロード量が高いほど、細胞死滅活性が高いことを示している。ＤＡＲ７．７１（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＤＡＲ７．７６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ７．８０（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）の３つの部位特異的分子は、ＤＡＲ７．２０の従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣ（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）と比較して遜色がなかった。

【0200】

この例はまた、細胞死滅活性および効力の増加と、細胞、例えば、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められることを実証している。

【0201】

【表5】

【0202】

（実施例４）
標的発現がない細胞（（ＳＷ６２０、Ｔｒｏｐ２−）における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現がないＳＷ６２０細胞における、より高ロードの部位特異的ＡＤＣのインビトロでの非特異的細胞傷害性を例示する。

【0203】

キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．８８、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．９２、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７１、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８０、部位特異的）およびｍ７Ｅ６マレイミドＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．２０、従来）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現しないＳＷ６２０細胞を用いて行った。ＳＷ６２０は、標的（Ｔｒｏｐ−２−）を発現しない癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（すなわち、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表し、試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表した。この実施例において、ＡＤＣの出発濃度は、ＡＤＣの非標的依存的な細胞傷害性作用があるかどうかを判定するために、他のインビトロでの例と比較して２６６ｎＭから３５００ｎＭまで１３倍を上回って増加させた。細胞傷害アッセイの結果を図４に示し、表６に要約する。ＤＡＲ７．７１（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＤＡＲ７．７６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ７．８０（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）の３つの部位特異的分子は、ＤＡＲ７．２０の従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣと比較して非特異的細胞傷害性が有意に低かった。

【0204】

これらの結果は、より高いＡＤＣ濃度において、非標的依存的な細胞傷害性が観察されたこと、およびこれが、従来のコンジュゲートと比較して、部位特異的ＡＤＣにおいて低かったことを示している。

【0205】

【表6】

【0206】

（実施例５）
標的発現が中等度の細胞（Ｃｏｌｏ２０５、Ｔｒｏｐ２＋）における、次第に高ロードされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣ対従来の方法でコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣ）の細胞傷害性の対照比較
この実施例は、標的発現が中程度のＣｏｌｏ２０５細胞における、より高ロードの部位特異的ＡＤＣのインビトロでの増加した細胞傷害性および効力を例示する。

【0207】

キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６マレイミドＰＥＧ６５−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ４．１３、従来）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．８６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ６．０９、従来）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８０、従来）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７７、部位特異的）および対照ＩｇＧ Ｎ２９７Ｑ／ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８４、部位特異的）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＣｏｌｏ２０５細胞を用いて行った。Ｃｏｌｏ２０５は、中等度の標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋）を有する癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（例えば、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表した、試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表す。細胞傷害アッセイの結果を図５に示し、表７に要約する。ＤＡＲ３．８６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＤＡＲ５．８６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ））およびＤＡＲ７．７７（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）の３つの部位特異的分子はそれぞれ、従来の方法でコンジュゲートされた、ＤＡＲ４．１３（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）、ＤＡＲ６．０９（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ７．８０（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）のＡＤＣと比較して遜色がなかった。

【0208】

これらの結果は、細胞死滅活性および効力の増加と、標的発現が中程度のＣｏｌｏ２０５細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められる（例えば、分子が高ロードであるほど、効力が高いことを示している）。

【0209】

【表7】

【0210】

（実施例６）
薬剤抗体比率が７．７６の抗Ｔｒｏｐ−２ ７Ｅ６部位特異的オーリスタチンコンジュゲートは、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルにおいて長期腫瘍静止を誘発した
この実施例は、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルにおけるより高ロードの部位特異的ＡＤＣの有効性を例示する。

【0211】

ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．２０、従来）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．９２、部位特異的）および対照ＩｇＧ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．６８、部位特異的）のインビボ有効性の研究を、標的を発現するＣｏｌｏ２０５異種移植モデルを用いて行った。Ｃｏｌｏ２０５は、中等度の標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋）を有する癌細胞系である。腫瘍サイズが約２５０ｍｍ^３に達するまで、３００万個のＣｏｌｏ２０５癌細胞を、５〜８週齢のｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植した。動物は、腫瘍サイズによって無作為化し、投与は、ボーラス尾静脈注射を介して行った。合計１用量当たり６ｍｇ／ｋｇのｍＡｂｓを、ボーラス尾静脈注射を介して投与した。腫瘍体積を、週に２回、キャリパー装置によって測定し、下記式：腫瘍容積＝（長さ×幅２）／２で計算した。動物は、その腫瘍体積が２０００ｍｍ^３に達した場合またはその体重が２０％を超えて減少した場合に、安楽死させた。図６は、部位特異的なＤＡＲ７．７６のコンジュゲートの単回用量が、長期腫瘍静止をもたらし、従来のＤＡＲ７．２コンジュゲートより有意に性能的に勝っていたことを示している。

【0212】

さらに、全てのＡＤＣが同様な結合反応速度を示したので、部位特異的な高ＤＡＲコンジュゲートと従来の高ＤＡＲコンジュゲートの効力の差は、ＡＤＣの標的結合が異なることによるものでなかった。図１１および表８。図１１および表８に示す標的／ＩｇＧ相互作用の結合反応速度は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅバイオセンサー（Ｇｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を使用することによって決定した。

【0213】

【表8】

【0214】

総合すれば、この実施例は、本発明のＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ７．７６）が、ＤＡＲが同様なまたはより高い従来のＡＤＣよりも、長期腫瘍静止の誘発において効果的であること、およびＤＡＲが５未満のＡＤＣはこのモデルにおいては本質的に効果がないことを実証している。

【0215】

（実施例７）
薬剤抗体比率が５．８６および７．７７の抗Ｔｒｏｐ−２ ７Ｅ６部位特異的オーリスタチンコンジュゲートは、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルにおいて、対応する従来のコンジュゲートよりも有効であり、長期腫瘍静止を誘発した
この実施例もまた、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルにおける、より高ロードの部位特異的ＡＤＣの有効性を例示する。

【0216】

ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ４．１３、従来）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．８６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ６．０９、従来）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８０、従来）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７７、部位特異的）および対照ＩｇＧ Ｎ２９７Ｑ／ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８４、部位特異的）のインビボ有効性の研究を、標的を発現するＣｏｌｏ２０５異種移植モデルを用いて行った。Ｃｏｌｏ２０５は、中等度の標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋）を有する癌細胞系である。腫瘍サイズが約２００ｍｍ^３に達するまで、３００万個のＣｏｌｏ２０５癌細胞を、５〜８週齢のｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植した。動物は、腫瘍サイズによって無作為化し、投与は、ボーラス尾静脈注射を介して行った。合計１用量当たり６ｍｇ／ｋｇのｍＡｂｓを、ボーラス尾静脈注射を介して投与した。腫瘍体積を、週に２回、キャリパー装置によって測定し、下記式：腫瘍容積＝（長さ×幅２）／２で計算した。動物は、その腫瘍体積が２０００ｍｍ^３に達した場合またはその体重が２０％を超えて減少した場合に、安楽死させた。図７は、部位特異的ＤＡＲ５．８６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ７．７７（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）コンジュゲートの単回用量が、長期腫瘍静止をもたらし、従来のＤＡＲ６．０９（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）およびＤＡＲ７．８０（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）コンジュゲートより有意に性能が勝っていたことを示している。実施例６において論じたように、全てのＡＤＣが同様な結合反応速度を示したので、効力の差は、ＡＤＣの標的結合が異なることに起因しなかった。

【0217】

したがって、この実施例もまた、本発明のＡＤＣ（例えば、部位特異的ＤＡＲ５．８６および７．７７）が、同様なＤＡＲを有する従来のＡＤＣよりも、長期腫瘍静止の誘発において効果的であることを実証している。

【0218】

（実施例８）
高い薬剤抗体比率を有する抗Ｔｒｏｐ−２ ７Ｅ６部位特異的オーリスタチンコンジュゲートは、従来のＡＤＣと比較してより良好な薬物動態（ＰＫ）プロフィールを示す
この実施例は、マウスおよびラットの両方における、従来のより高ロードのＡＤＣと比較した、より高ロードの部位特異的ＡＤＣのＰＫプロフィールを例示する。

【0219】

本発明のＡＤＣの薬物動態研究は、マウスおよびラットの両方において行い、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）を用いて分析した。ＤＡＲは、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ））によって分析した。

【0220】

総抗体ＰＫアッセイ
９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）の各ウェルに、１ｘＰＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏ）中１μｇ／ｍＬのＦｃ特異的なヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）１００μＬをコーティングした。プレートを４〜８℃で終夜インキュベートした。全ての洗浄ステップを、１ｘＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いてＢｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５プレートウォッシャーで行った。３回洗浄後、プレートを、アッセイ緩衝液（１ｘＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０）２００μＬでブロックし、室温で穏やかに撹拌しながら１〜２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、アッセイ緩衝液で１：１００に希釈した標準物質、対照および試料１００μＬを、対応するウェルに加えた。室温で穏やかに撹拌しながら２時間インキュベート後、プレートを６回洗浄してから、アッセイ緩衝液で２５０ｎｇ／ｍＬに希釈した検出抗体（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＨＲＰ標識された、Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧ）１００μＬを分注した。プレートを、室温で穏やかに撹拌しながらさらに１時間インキュベートし、その後に６回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１００μＬを各ウェルに加えた。約５分間発色させてから、１Ｍリン酸１００μＬで反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、６５０ｎｍを基準として、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５．２ソフトウェアを用いて、標準曲線を４−パラメーター回帰に適合させ、試料濃度を計算した。

【0221】

ＡＤＣ ＰＫアッセイ
９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）の各ウェルに、１ｘＰＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏ）中２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μＬをコーティングした。プレートを４〜８℃で終夜インキュベートした。全ての洗浄ステップを、１ｘＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いてＢｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５プレートウォッシャーで行った。３回洗浄後、プレートを、アッセイ緩衝液（１ｘＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０）２００μＬ／ウェルでブロックし、室温で穏やかに撹拌しながら１〜２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、アッセイ緩衝液で１：１００に希釈した標準物質、対照および試料１００μＬを、対応するウェルに2例ずつ加えた。室温で穏やかに撹拌しながら２時間インキュベート後、プレートを６回洗浄してから、アッセイ緩衝液で４μｇ／ｍＬに希釈した検出抗体（ビオチン化抗ＭＭＡＤモノクローナル抗体）１００μＬを分注した。プレートを、室温で穏やかに撹拌しながら１．５時間インキュベートし、その後に６回洗浄した。アビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）をアッセイ緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを各ウェルに分注した。プレートをさらに１時間インキュベートし、その後、６回洗浄した。次いで、ＴＭＢ（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１００μＬを各ウェルに加えた。約５分間発色させてから、１Ｍリン酸１００μＬで反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ、ＰＡ）で、６５０ｎｍを基準として、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５．２ソフトウェアを用いて、標準曲線を４−パラメーター回帰に適合させ、試料濃度を計算した。

【0222】

ＡＤＣのＬＣ／ＭＳインタクト質量分析（ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）およびＤＡＲの計算
ＬＣ／ＭＳ分析の前に、ＡＤＣ（部位特異的ＤＡＲ６およびＤＡＲ８ならびに従来のＤＡＲ８）を、３７℃において非変性条件下でＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ，、ＭＡ）によって終夜脱グリコシル化させた。ＡＤＣ（１μｇ）を、ポリマー材料（Ｍｉｃｈｒｏｍ−Ｂｒｕｋｅｒ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を充填した逆相カラムに装填した。ＬＣ／ＭＳ分析を、エレクトロスプレーイオン源を有するＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）質量分析計に連結された、バイナリーＨＰＬＣポンプ、脱ガス装置、温度制御自動サンプラー、カラムヒーターおよびダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を含むＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて行った。移動相は、溶媒Ａ（水 ０．１％ギ酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル ０．１％ギ酸）から構成された。ＨＰＬＣを、イソクラチック流からなる３０分間のラン（溶媒Ｂ３％に１０分間、続いて１分間にわたる溶媒Ｂ９７％までの勾配、溶媒Ｂ９７％に２分間保持、最後に溶媒Ｂ３％に１７分間の平衡化ステップからなる）での、次第に増加する溶媒Ｂの勾配を用いて行った。得られた質量スペクトルを、ＰｒｏＭａｓｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）を用いてデコンヴォルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）した。部位特異的ＡＤＣに関しては、ＤＡＲは、ＡＤＣのインタクト質量（ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ）を用いて計算した。従来のＡＤＣは分子間ジスルフィド結合がなくかつ鎖が逆相条件下で分離するので、従来のＡＤＣに関しては、ＤＡＲは、重鎖および軽鎖のデコンヴォルーションされたスペクトルから計算した。ＤＡＲの計算は、観察されたＤＡＲ種の相対強度に基づく。

【0223】

インビボでの研究
マウスにおいて、全てのＡＤＣの単回用量（６ｍｇ／ｋｇ）を、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルで試験した。これらの条件下において、（１）ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的）および２）ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的）として、ＰＥＧ６ＭＭＡＤにコンジュゲートしている抗体ｍ７Ｅ６は、コンジュゲートしてない野生型抗体ｍ７Ｅ６と同様な薬物動態プロフィールを示した。総ｍＡｂおよびＡＤＣのシグナルの比較により、より高ロードのＡＤＣ（ｍＡｂまたはＡＤＣ ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的）；またはｍＡｂもしくはＡＤＣ ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的）は、２週間の期間にわたってペイロードの損失をほとんど示さないことが明らかになった。図８Ｃおよび８Ｄを参照されたい。このデータは、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤのトランスグルタミナーゼ介在性連結が安定なコンジュゲートをもたらすことを示している。対照的に、従来の方法を用いてマレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤにコンジュゲートさせた抗体ｍ７Ｅ６（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８））は、総ｍＡｂおよびコンジュゲートしていない抗体の両方と比較して、より低いＡＤＣ曝露量を示し、これはペイロードの損失を示唆した。図８Ｂを参照されたい。マレイミドをベースとするコンジュゲートからのペイロードの損失については既に記載されており（例えば、Ａｌｌｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１９（３）：７５９〜７６５（２００８）、およびＳｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（２）：１８４〜１８９（２０１２）を参照されたい）、逆マイケル付加メカニズムによって起こると考えられている。ＤＡＲ８の従来のコンジュゲートと本発明のＡＤＣコンジュゲートの間のＡＤＣ曝露量の差が、インビボにおいて従来のＡＤＣコンジュゲートの活性が劣る原因である可能性が高い。

【0224】

従来のＡＤＣのＥＬＩＳＡアッセイにみられる曝露量の減少は、これらの実験において用いたＡＤＣアッセイが抗体からのペイロードの損失を過小評価する可能性によって増強される可能性がある。より詳細には、ＡＤＣ ＥＬＩＳＡは、ＤＡＲ８に対してだけでなく、インビボで生成された、ロード量がより低い全ての他の種に対してシグナルを示した。従来のコンジュゲーション方法を用いるＤＡＲ８のＡＤＣに関しては最大７種の薬剤がＥＬＩＳＡシグナルの有意な変化を生じずに失われる可能性があったため、この作用は、より高ロードの種に対してより顕著であった。さらに、切断不可能な従来のコンジュゲート、例えば、ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ８）に関しては、薬剤の損失がおそらく、インビボでの効力が低い主要な理由であった。対照的に、本発明の切断不可能なＡＤＣコンジュゲート（例えば、ＤＡＲ６またはＤＡＲ８）は、マレイミド不安定性の難点がなく、標的発現が中等度のＣｏｌｏ２０５異種移植モデルにおいて腫瘍成長を有意に阻害することができる。

【0225】

また、より高ロードのＡＤＣのＰＫ研究をラットにおいて行って、マウスと比較した。従来のコンジュゲーション方法に基づくＡＤＣ（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．８））は依然として、循環におけるＡＤＣレベルが最低であった。図８Ｅを参照されたい。ＤＡＲ８の本発明のＡＤＣ（例えば、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７６、部位特異的））は、循環において中間のＡＤＣレベルを示し、ＤＡＲ６の本発明のＡＤＣ（例えば、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４ ＰＥＧ６ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的））は、循環において、コンジュゲートしていないｍ７Ｅ６抗体に匹敵する最も高いＡＤＣレベルを示した。図８Ｅを参照されたい。ＤＡＲ７．８の従来のＡＤＣは、コンジュゲートしてない抗体に対して最も大きい差を示し、総抗体およびＡＤＣの両方が、コンジュゲートしてない抗体のレベルと比較してかなり低い曝露量を有していた。図８Ｆを参照されたい。ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４ ＰＥＧ６ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．８５、部位特異的）の場合、総ｍＡｂレベルおよびＡＤＣレベルは、コンジュゲートしていない抗体のレベルにほとんど等しかった。図８Ｇを参照されたい。ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃ ＰＥＧ６ＭＭＡＤ総ｍＡｂレベルおよびＡＤＣレベルは、コンジュゲートしてない抗体と比較して低下した。図８Ｈ。これは、本発明のＤＡＲ８のＡＤＣが、コンジュゲートしてない抗体と同様なＰＫを示した、マウスからのＰＫの結果とは異なる。これらの結果は、野生型ＰＫを個別に示すコンジュゲーション部位を組み合わせると、曝露量が減少し得ることを示唆している。

【0226】

マウスのインビボ試料の質量分析により、従来のＡＤＣ（例えば、ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）はリンカーペイロードを約２８％失っているが、トランスグルタミナーゼリンカーは部位特異的コンジュゲートＤＡＲ６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４ ＰＥＧ６ＭＭＡＤ）ＤＡＲ８＿１（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）の両方においてインタクトのままであることが、さらに明らかになった。図１２Ａを参照されたい。また、質量分析の研究により、部位特異的ＤＡＲ６、ＳＳ ＤＡＲ８＿１および従来のＤＡＲ８コンジュゲート中において同様なレベルを有する薬剤ＭＭＡＤのＣ末端の分解が明らかになった。（図１２Ｂ）。コンジュゲートのリンカー−ペイロード組み合わせの安定性を、図１２Ｃに示す。

【0227】

総合すれば、この実施例は、本発明の高ロードのＡＤＣは、マウスにおいては、コンジュゲートしてない野生型抗体と同様なＰＫプロフィールを有し、ラットにおいては、高ロードの従来のＡＤＣよりも良好なＰＫプロフィールを有することを実証している。

【0228】

（実施例９）
ラットにおいて、野生型薬物動態プロフィールを個別に示すＡＤＣコンジュゲーション部位を組み合わせると、曝露量が減少し得る
この実施例は、ラットにおいて、コンジュゲーション部位の種々の組み合わせを有する、より高ロードの部位特異的ＡＤＣのＰＫプロフィールを例示する。

【0229】

コンジュゲーション部位の種々の組み合わせを有する、より高ロードの部位特異的ＡＤＣのＰＫ研究を、ラットにおいて行った。ＤＡＲ１．９９の部位特異的ＡＤＣ（ｍ７Ｅ６ Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）とＤＡＲ５．８５の部位特異的ＡＤＣ（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）を組み合わせることによって、ＤＡＲ７．７６（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）の部位特異的ＡＤＣを作製した。ＤＡＲ５．８５およびＤＡＲ１．９９の部位特異的ＡＤＣは、ラットにおいて個別に野生型ＰＫプロフィールを示したが、ＤＡＲ７．７６の部位特異的ＡＤＣと一緒に組み合わせた場合、曝露量の減少を示した。図９Ａを参照されたい。それに比べて、ＤＡＲ５．８５の同一の部位特異的ＡＤＣ（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ）を、ＤＡＲ１．９６の異なる部位特異的ＡＤＣ（ｍ７Ｅ６ ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ；ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤのコンジュゲーション部位から遠い、抗体重鎖のＣ末端のコンジュゲーション部位）と組み合わせた場合、得られたＡＤＣ（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．７、部位特異的））は、曝露量のさらなる減少を示さなかった（例えば、ｍ７Ｅ６ ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤよりも大きい減少を示さなかった）。図９Ｂを参照されたい。

【0230】

これらのデータは、近傍の過度に多い疎水性ペイロード（例えば、ＭＭＡＤ）は、ラットにおいてＡＤＣのＰＫプロフィールを低下させる可能性があることを示唆している。これらのデータはまた、コンジュゲーション部位が互いに隔たっている場合、組み合わされた部位のＰＫプロフィールは、ラットにおいては、最も短い個別のＰＫプロフィールと同様であることを示唆している。

【0231】

（実施例１０）
マウスにおける、従来のＡＤＣと比較した、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２ ７Ｅ６オーリスタチンの安全性および耐容性
この実施例は、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるより高ロードの部位特異的ＡＤＣの安全性および耐容性を例示する。

【0232】

Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、従来の方法でコンジュゲートされたＡＤＣ（ｍ７Ｅ６マレイミド−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ「ＤＡＲ８」）またはＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ切断不可能なペイロードとコンジュゲートされた部位特異的ＡＤＣ（ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（「ＤＡＲ６」）およびｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／ＴＧ６アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（「ＤＡＲ８＿１」）の７５、１２５または２００ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与した。臨床的観察、体重、薬物動態および臨床病理パラメーターを、評価した。より詳細には、動物を、注射の直後および２時間後、次いで投与後２週間にわたって毎日観察した。体重は、０日目、２日目、５日目、７日目、９日目、１２日目および１４日目に記録した。薬物動態に関しては投与後５分、７日および１４日に、臨床化学分析および血液分析に関しては１４日目に、血液試料を採取した。

【0233】

従来のコンジュゲートおよび部位特異的コンジュゲートはいずれも、２００ｍｇ／ｋｇの非常に高い用量まで耐容性であった。毒性を示す臨床的観察また体重の意味のある変化は認められなかった。図１０Ｂ。３つのコンジュゲート（従来のＡＤＣ「ＤＡＲ８」ならびに２つの部位特異的ＡＤＣ「ＤＡＲ８＿１」および「ＤＡＲ６」）全てに関して、研究の最後（１４日目）に臨床病理パラメーターを評価し、毒物学的に意味があるまたは有意な変化は観察されなかった。図１０Ｃおよび１０Ｄ。例えば、肝臓の酵素であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［ＡＳＴ］、アラニントランスアミナーゼ［ＡＬＴ］およびアルカリホスファターゼ［ＡＬＰ］）および鍵となる血液パラメーター（好中球、網状赤血球および血小板）に有意な変化は認められなかった。

【0234】

総合すると、これらの結果は、ＤＡＲ８およびＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤを有する部位特異的コンジュゲートおよび従来のコンジュゲートはいずれも、２００ｍｇ／ｋｇの高用量で、マウスにおいて耐容性が良好であることを示している。さらに、従来のＤＡＲ８コンジュゲートと比較して、部位特異的ＤＡＲ８＿１コンジュゲートは、約５５％高い曝露量を達成した。図１０Ａ。さらに、ＤＡＲ８の従来のコンジュゲートはまた、高用量で予想より低い抗体濃度を示した。図１３Ａ。この現象は、２００ｍｇ／ｋｇの最高試験用量でも曝露量の予想される増加を示す部位特異的なＡＤＣＤＡＲ８＿１に関しては観察されなかった。図１３Ｂ。

【0235】

総合すれば、部位特異的コンジュゲートは、従来のコンジュゲートと比較して、より高いＡＤＣ曝露量で良好な安全性プロフィールを示した。

【0236】

（実施例１１）
標的を高発現する細胞（ＢｘＰＣ３、Ｔｒｏｐ２＋＋＋）における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現が高いＢｘＰＣ３細胞における、より高ロードのＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ５．９５〜９．４（部位特異的コンジュゲーション））のインビトロでの細胞傷害性を例示する。

【0237】

キメラの抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．９５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．６、部位特異的）およびＮ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂ／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ９．４、部位特異的）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＢｘＰＣ３細胞を用いて行った。ＢｘＰｃ３は、高い標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋＋＋）を有する癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（すなわち、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表し、試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表した。細胞傷害アッセイの結果を図１４に示し、表９に要約する。これらの結果は、全てのＡＤＣは、標的発現が高いＢｘＰＣ３細胞へのペイロードのロード量に関わらず、ほぼ完全な細胞死滅を達成したが、より高ロードのコンジュゲートは、より低ロードのコンジュゲートと比較してより強力であったことを示している。

【0238】

【表9】

【0239】

（実施例１２）
標的発現が中等度の細胞（Ｃｏｌｏ２０５、Ｔｒｏｐ２＋）における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現が中程度のＣｏｌｏ２０５細胞における、より高ロードのＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ５．９５〜９．４（部位特異的コンジュゲーション））のインビトロでの細胞傷害性を例示する。

【0240】

キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６Ｎ ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．９５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．６、部位特異的）およびＮ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂ／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ９．４、部位特異的）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＣｏｌｏ２０５細胞を用いて行った。Ｃｏｌｏ２０５は、中等度の標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋）を有する癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（すなわち、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表し、試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表した。細胞傷害アッセイの結果を図１５に示し、表１０に要約する。これらの結果は、細胞死滅活性および効力の増加と、標的発現が中程度のＣｏｌｏ２０５細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められることを示している。より高ロードの分子（例えば、５．９５以上のＤＡＲ）のみが、完全な細胞死滅を達成できた。

【0241】

この実施例はまた、コンジュゲートＮ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂ／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤによってＤＡＲを９．４まで増加させると、ＤＡＲ７．６のコンジュゲートｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤよりも効力が増加したことを実証している。

【0242】

【表10】

【0243】

（実施例１３）
標的発現が低い細胞（ＣＦ−ＰＡＣ１、Ｔｒｏｐ２（＋））における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞における、より高ロードのＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ５．９５〜９．４（部位特異的コンジュゲーション））のインビトロでの細胞傷害性を例示する。

【0244】

キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．９５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．６、部位特異的）およびＮ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂ／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ９．４、部位特異的）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＣＦ−ＰＡＣ１細胞を用いて行った。ＣＦ−ＰＡＣ１は、低い標的発現レベル（Ｔｒｏｐ−２＋）を有する癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（例えば、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表した。試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表す。表１１および図１６は、細胞死滅活性および効力の増加と、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められる、例えば、ペイロードのロード量が高いほど、細胞死滅活性が高いことを示している。ＤＡＲ９．４のコンジュゲートＮ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂ／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤは、最大細胞死滅活性をわずかに増加させた。

【0245】

この実施例はまた、細胞死滅活性および効力の増加と、細胞、例えば、標的発現が低いＣＦ−ＰＡＣ１細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められることを実証している。

【0246】

【表11】

【0247】

（実施例１４）
標的発現がない細胞（ＳＷ６２０、Ｔｒｏｐ２−）における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗Ｔｒｏｐ−２−ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現がないＳＷ６２０細胞における、より高ロードのＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ５．９５〜９．４（部位特異的コンジュゲーション））のインビトロでの細胞傷害性を例示する。

【0248】

キメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体、ｍ７Ｅ６ Ｌ１１ｂアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ１．９６、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ３．９、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ５．９５、部位特異的）、ｍ７Ｅ６ Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ７．６、部位特異的）およびＮ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂ／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ（ＤＡＲ９．４、部位特異的）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現しないＳＷ６２０細胞を用いて行った。ＳＷ６２０は、標的（Ｔｒｏｐ−２−）を発現しない癌細胞系である。細胞を、処理の２４時間前に、壁が白く底が澄明なプレートに細胞２０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０、および５０％の細胞死滅（すなわち、細胞傷害性）が起こるＡＤＣ濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによって計算し、濃度（ｎＭ）として表し、試験したＡＤＣの最高濃度において観察された最大の細胞死滅を未処理対照に対するパーセンテージとして表した。細胞傷害アッセイの結果を図１７に示し、表１２に要約する。試験した濃度範囲においては、全てのコンジュゲートが、最小の非特異的な細胞傷害性活性を示した。

【0249】

この実施例は、コンジュゲートＮ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０４／Ｌ１１ｂ／Ｈ７ｃアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤによってＤＡＲを９．４まで増加させても、より低いＤＡＲを有するコンジュゲートと比較して、非特異的な細胞傷害性活性を増加させなかったことを実証している。

【0250】

【表12】

【0251】

（実施例１５）
標的ＢＣＭＡの発現が低い細胞および中程度の細胞における、次第に高ロードにされた、部位特異的にコンジュゲートされた抗ＢＣＭＡ ＡＤＣの細胞傷害性
この実施例は、標的発現がそれぞれ低いおよび中程度のＬ３６３細胞およびＭＭ１．Ｓ細胞における、より高ロードのＡＤＣ（例えば、ＤＡＲ５．９５（部位特異的コンジュゲーション））のインビトロ細胞傷害性を例示する。

【0252】

Ａｂ１−ＬＣＱ０５／Ｋ２２２Ｒ−スプリセオスタチン（２Ｓ，３Ｚ）−５−｛［（２Ｒ，３Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−６−｛（２Ｅ，４Ｅ）−５−［（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，７Ｓ）−７−（２−ヒドラジニル−２−オキソエチル）−４−ヒドロキシ−１，６−ジオキサスピロ［２．５］オクタ−５−イル］−３−メチルペンタ−２，４−ジエン−１−イル｝−２，５−ジメチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］アミノ｝−５−オキソペンタ−３−エン−２−イルアセテート）（ＤＡＲ１．９、部位特異的）、Ａｂ１−ＬＣＱ０４／Ｋ２２２Ｒ−スプリセオスタチン（ＤＡＲ１．９、部位特異的）、Ａｂ１−Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ−スプリセオスタチン（ＤＡＲ３．７、部位特異的）およびＡｂ１−Ｎ２９７Ｑ／Ｋ２２２Ｒ／ＬＣＱ０５−スプリセオスタチン（ＤＡＲ５．９５、部位特異的）を含む、リンカー−ペイロードとコンジュゲートしているヒト抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体（Ａｂ１）のインビトロ細胞傷害性の研究を、標的を発現するＬ３６３（低い標的発現レベルを有する癌細胞系（ＢＣＭＡ（＋））およびＭＭ１．Ｓ（中程度の標的発現レベルを有する癌細胞系（ＢＣＭＡ（＋＋））を用いて行った。細胞を、底が澄明なプレートに細胞３０００個／ウェルで播種した。細胞を、４倍連続希釈された抗体−薬剤コンジュゲートで、3例ずつ処理した。細胞の生存率を、処理の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって決定した。相対的な細胞生存率を、未処理対照に対するパーセンテージとして決定した。ＥＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって計算した。図１８Ａおよび１８Ｂは、細胞死滅活性および効力の増加と、ＡＤＣの高いペイロードのロード量（例えば、５．９）と比較してＡＤＣの低いペイロードのロード量（例えば、１．９および３．７）との間に正の相関が認められることを示している。

【0253】

したがって、この実施例はまた、細胞死滅活性および効力の増加と、細胞、例えば、標的発現が低いＬ３６３細胞および標的発現が中程度のＭＭ１．Ｓ細胞へのＡＤＣのペイロードのロード量との間に正の相関が認められることを実証している。

【0254】

開示された教示は様々な適用、方法、および組成物に関して記載されているが、本明細書における教示および以下の特許請求の範囲に記載の発明から逸脱することなく、様々な変化および変更を行うことができることが理解されよう。前述の実施例は、開示される教示をより良く説明するために提供されており、本明細書において提示される教示の範囲を限定することを意図したものではない。本教示はこれらの典型的な実施形態に関して記載されているが、当業者には、これらの典型的な実施形態の多くの変型および変更が、不必要な実験を伴わずに可能であることが容易に理解されよう。全てのこのような変型および変更は、本教示の範囲内である。

【0255】

特許、特許出願、論文、教科書などおよびそれらに引用された参考文献を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それらがまだ組み入れられていない限り、参照によってその全体を本明細書中に組み入れる。組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が、限定はしないが、定義された用語、用語の用法、記載された技術などを含めて、本出願と異なるまたは矛盾する場合には、本出願が優先する。

【0256】

前述の説明および実施例は、本発明のいくつかの特定の実施形態を詳述するものであり、本発明者らが企図する最良の形態を記載している。しかし、前述の事項が明細書中でいかに詳述されていても、本発明は多くの方法で実施でき、本発明は添付した特許請求の範囲およびそのあらゆる均等形態に従って解釈すべきであることがわかる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【外国語明細書】

2015209426000001.pdf