特開 2015-232009 除去されたエフェクター機能を伴う抗体Ｆｃ突然変異

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-232009(P2015-232009A)

(43)【公開日】2015年12月24日

(54)【発明の名称】除去されたエフェクター機能を伴う抗体Ｆｃ突然変異

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20151201BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20151201BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20151201BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   A61K39/395 M

   A61P1/04

   A61P7/04

   A61P7/06

   A61P9/00

   A61P9/10

   A61P11/06

   A61P17/00

   A61P19/02

   A61P25/28

   A61P29/00

   A61P37/06

   A61P37/08

   A61P43/00 105

【審査請求】有

【請求項の数】22

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2015-144573(P2015-144573)

(22)【出願日】2015年7月22日

(62)【分割の表示】特願2012-541220(P2012-541220)の分割

【原出願日】2010年11月29日

(31)【優先権主張番号】61/265,079

(32)【優先日】2009年11月30日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ストロール，ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】バッファ，オミド

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA33

4C085AA34

4C085BB36

4C085BB42

4C085CC22

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】      （修正有）

【課題】Ｆｃ領域に変異を有する抗体及び他のＦｃ含有分子の利用。
【解決手段】野生型Ｆｃと比較してＦｃ領域に変異を有する抗体及び他のＦｃ含有分子であり、Ｆｃγ受容体との結合活性を低減した性質を示すが、ＦｃＲｎに特異的に結合することができる等の性質を示す為、種々の疾患及び傷害の治療に使用され得る。前記結合分子は、著しい補体依存性溶解又は前記標的の細胞媒介性破壊を引き起こすことなしに、標的分子に結合することができる結合分子であり、結合ドメインが、抗体、酵素、ホルモン、受容体、サイトカイン、免疫細胞表面抗原、配位子、及び接着分子の結合部位から選択される結合分子。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

野生型Ｆｃと比較して少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する低下した親和性を有する
Ｆｃ含有分子であって、突然変異したＩｇＧ定常領域を伴う抗体Ｆｃドメインを含み、Ｅ
Ｕ番号付け方式によって定義されるアミノ酸残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び
２３８が、ＰＡＡＡＰ（配列番号：４）、ＰＡＡＡＳ（配列番号：５）、及びＳＡＡＡＳ
（配列番号：６）から選択される配列を含む、Ｆｃ含有分子。

【請求項2】

前記Ｆｃドメインが更に、ＥＵ番号付け方式によって定義される突然変異Ｈ２６８Ａ又
はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む、請求項１に記載のＦｃ
含有分子。

【請求項3】

前記ドメインが、ＦｃＲｎに特異的に結合することができる、請求項１に記載のＦｃ含
有分子。

【請求項4】

前記Ｆｃドメイン配列が、ヒトＩｇＧ２重鎖ＣＨ２ドメインと少なくとも９０％同一で
ある、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項5】

前記Ｆｃ含有分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１に記載のＦｃ含有
分子。

【請求項6】

残基２２８がＳからＰへ突然変異される、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項7】

組換えポリペプチド系結合分子であって、（ｉ）標的分子に結合することができる結合
ドメインと、（ｉｉ）ヒト免疫グロブリン重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインの全て又
は一部に実質的に相同であるアミノ酸配列を有するＦｃドメインであって、ＥＵ番号付け
方式によって定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８が、ＰＡＡＡ
Ｐ、ＰＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択されるアミノ酸配列を含む、Ｆｃドメインと、
を含み、前記結合分子が、著しい補体依存性溶解又は前記標的の細胞媒介性破壊を引き起
こすことなしに、前記標的分子に結合することができる、結合分子。

【請求項8】

前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎに特異的に結合することができる、請求項７に記載の結
合分子。

【請求項9】

前記結合ドメインが、抗体、酵素、ホルモン、受容体、サイトカイン、免疫細胞表面抗
原、配位子、及び接着分子の結合部位から選択される、請求項８に記載の結合分子。

【請求項10】

前記分子が結合活性を示す、請求項９に記載の結合分子。

【請求項11】

前記結合ドメインが、神経組織、内分泌組織、血管組織、心臓組織、滑膜組織、皮膚組
織、又は粘膜組織内で標的と特異的に結合する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の
結合分子。

【請求項12】

マクロファージの遊走及び集結によって特徴付けられる疾患を治療するための方法であ
って、請求項１〜７のいずれかに記載のＦｃ含有タンパク質調製物を、対象又は患者に投
与する工程を含む、方法。

【請求項13】

移植片対宿主疾患；宿主対移植片疾患；臓器移植拒絶反応；骨髄移植拒絶反応；自己免
疫、血管炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症及び関節炎；胎児／新生児
同種免疫性血小板減少症等の同種免疫；ぜんそく及びアレルギー；慢性若しくは急性炎症
性疾病、クローン病又は強皮症；アルツハイマー病、又は冠状動脈閉塞を治療する方法で
あって、請求項１〜７のいずれかに記載のＦｃ含有分子を対象又は患者に投与する工程を
含む、方法。

【請求項14】

請求項１〜７のいずれかに記載のＦｃ含有分子を対象又は患者に投与する工程を含む、
症状を治療するための方法であって、前記結合分子が、患者に投与されるか、又は任意で
前記患者が胎児である場合に前記患者の母親に投与される、方法。

【請求項15】

野生型Ｆｃと比較してＦｃγ受容体に対する低下した親和性を有するＦｃ含有分子であ
って、ＩｇＧ２定常領域に基づく抗体Ｆｃドメインを含み、ＥＵ番号付け方式によって定
義されるアミノ酸残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８が、ＰＡＡＡＰ、Ｐ
ＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択される配列を含み、かつＥＵ番号付け方式によって定
義される突然変異Ｈ２６８Ａ又はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ
を更に含む、Ｆｃ含有分子。

【請求項16】

ＩｇＧ２系Ｆｃ含有分子のＦｃγ受容体への結合を、野生型ＩｇＧ２系Ｆｃと比較して
変化させる方法であって、ＥＵ番号付け方式によって定義される残基２３３、２３４、２
３５、２３７、及び２３８でのＩｇＧ２定常領域に基づくＦｃドメインの配列を、ＰＡＡ
ＡＰ、ＰＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択される配列を含み、かつ突然変異Ｈ２６８Ａ
又はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含むように、変化させる工
程を含む、方法。

【請求項17】

本明細書に記載されたいずれかの発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｆｃγ受容体に特異的に結合する能力か、又は表面標的抗原のＦｃ受容体媒
介性架橋結合によって免疫細胞による分裂応答を活性化させる能力を実質的に失うように
突然変異される、ヒト抗体ＩｇＧ２定常領域（Ｆｃ領域）に関する。本発明は、突然変異
ＩｇＧ２定常領域が組み込まれ得る、新規の抗体も提供する。

【背景技術】

【0002】

細胞表面抗原を標的とする抗体は、不必要な免疫活性化、及び免疫細胞とのＦｃ受容体
（ＦｃＲ）結合と補体の活性化とに関連するエフェクター機能を引き起こす。標的配位子
機能を標的にし、かつ活性化又は中和するが、必要な局所的細胞又は組織を傷つける又は
破壊することのないように意図された治療用抗体及びＦｃ融合構築物として、縮小された
（除去された）エフェクター機能を伴うＦｃ突然変異が模索されている。

【0003】

ヒトＩｇＧアイソタイプ（成熟γグロブリンクラスＧ抗体のサブクラス、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ、例えば
、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ、例えば、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、例えば、ＩｇＧ
１、ＩｇＧ３）といった免疫機能を回復させる、差異的な能力を示す。そのような免疫機
能のアイソタイプ特異的結合は、別個の免疫細胞上のＦｃ受容体に対する選択性と、Ｃ１
ｑに結合し膜攻撃複合体（ＭＡＣ）のアセンブリを活性化する能力とに基づく。種々のア
イソタイプの中で、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｂ／ｃ、Ｆｃ
γＲＩＩＩａ／ｂ）に対する相対的親和性は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３に対して高いが、し
かしながら、ＩｇＧ２に対しては親和性が最小であり（ＦｃγＲＩＩａ １３１Ｈ多型に
限定される）、またＩｇＧ４はＦｃγＲＩに対してある程度の親和性しか有さない。比較
配列分析及び共結晶構造を用いて、受容体結合に対して主に接触する残基は、より低いヒ
ンジ及びＣＨ２領域にまたがるアミノ酸残基にマッピングされている。標準的タンパク質
工学技術を用いて、Ｆｃ受容体及びＣ１ｑ補体成分に対する抗体調製物の親和性を強化又
は低減することにおいて、いくらかの成功が収められている。

【0004】

アイソタイプの中で、ＩｇＧ２はＦｃ受容体のファミリーに結合する能力が最少である
。ＩｇＧ２を起点として、減少されたエフェクター機能を伴いつつ、しかしＦｃＲｎ結合
、長期安定性、及び低免疫原性を保持する突然変異誘発物質を見出す試みがなされている
。この類の改善された突然変異は、安全性を保持しつつ、改善された抗体治療薬を提供す
ることができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、例えば、ＦＣ領域を含有し細胞表面配位子を標的とするような、抗体又は抗
体様治療薬の技術作業において有用な、修飾されたグリコシル化免疫グロブリン定常ドメ
インを提供する。本発明の組成物は、減少されたＦｃγＲ結合能力を示すが保存されたＦ
ｃＲｎ結合を有する、ＩｇＧ ２Ｆｃ突然変異である。これらのＩｇＧ Ｆｃ突然変異は
、免疫エフェクター機能のＦｃ関連結合及び補体媒介性細胞傷害を最小にしつつ、可溶性
又は細胞表面抗原を治療標的化することを可能にする。１つの態様において、ＩｇＧ ２
Ｆｃ突然変異は、ＥＵ番号付け方式に従うＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓを含む。
別の態様において、ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異は、ＥＵ番号付け方式に従うＶ２３４Ａ、Ｇ
２３７Ａ、Ｈ２６８Ｑ、又はＨ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓを含む。
特定の態様において、ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異は、ＥＵ番号付け方式に従うＶ２３４Ａ、
Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、及び任意
でＰ２３３Ｓを含む。

【0006】

１つの実施形態において、ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異組成物は、ｉ）抗体依存性細胞傷害
（ＡＤＣＣ）、ｉｉ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ｉｉｉ）抗体依存性細胞貪食作用
（ＡＤＣＰ）、ｉｖ）ＦｃＲ媒介性細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋結合を介するサイト
カイン放出）、及びｖ）ＦｃＲ媒介性血小板活性化／枯渇といった、免疫及びエフェクタ
ー機能に関連するＦｃγＲの活性化に由来する潜在毒性が、最小化又は排除されながら、
治療用抗体（又はＦｃ融合体）半減期の保持がＦｃＲｎとの相互作用を通して保存される
効能において、使用される。１つの態様において、ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異は、例えば基
底細胞神経節といった神経疾患に関与する細胞上の配位子；Ｂ細胞又はＴ細胞活性化に、
あるいは線維芽細胞又は幹細胞といった組織修復又は治癒に関与する細胞に関係する免疫
系疾患；を標的とする、多価結合剤等の結合剤の治療用抗体又はＦｃ融合体に組み込まれ
る。

【0007】

別の実施形態において、ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異は医薬組成物を含む。別の実施形態に
おいて、ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異は薬剤活性分子の一部を含む。ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異
又は活性ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異含有分子を含む医薬組成物は、マクロファージ又は単核
細胞の遊走及び集結によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。１つの態様におい
て、ＩｇＧ２ Ｆｃ突然変異含有分子は、神経組織、内分泌組織、血管組織、心臓組織、
滑膜組織、皮膚組織、又は粘膜組織内の標的に結合するのに有用である。本発明のＩｇＧ
２ Ｆｃ突然変異の多くの使用のうちの１つは、移植片対宿主疾患；宿主対移植片疾患；
臓器移植拒絶反応；骨髄移植拒絶反応；血管炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小
板減少症、及び関節炎等の自己免疫；胎児／新生児同種免疫性血小板減少症等の同種免疫
；ぜんそく及びアレルギー；クローン病又は強皮症等の慢性若しくは急性炎症性疾病；ア
ルツハイマー病、冠状動脈閉塞症、の治療におけるものである。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】それぞれの残基に対応するＥＵ番号付けを示す、野生型ヒトＩｇＧ２（配列番号：１）、ＩｇＧ４（配列番号：２）、及びＩｇＧ１（配列番号：３）のアミノ酸配列の整列を示し、ＩｇＧ２のヒンジ領域はＥＵ残基２１８で始まる。

【図2】修飾された残基の表面位置（ＥＵ番号付け）を示す、Ｆｃ断片の構造を示す。

【図3A】それぞれのアイソタイプと、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズアッセイプラットフォームを使用して、ヒトＩｇＧ１野生型アイソタイプの抗体との抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合抗体として構築した突然変異との、競合を示すグラフである。ＦｃｇＲＩ（図示せず）、ＦｃｇＲＩＩａ（Ａ）、ＦｃｇＲＩＩｂ（Ｂ）、ＦｃｇＲＩＩＩａ（図示せず）、及びＦｃＲｎ（Ｃ）。

【図3B】それぞれのアイソタイプと、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズアッセイプラットフォームを使用して、ヒトＩｇＧ１野生型アイソタイプの抗体との抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合抗体として構築した突然変異との、競合を示すグラフである。ＦｃｇＲＩ（図示せず）、ＦｃｇＲＩＩａ（Ａ）、ＦｃｇＲＩＩｂ（Ｂ）、ＦｃｇＲＩＩＩａ（図示せず）、及びＦｃＲｎ（Ｃ）。

【図3C】それぞれのアイソタイプと、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズアッセイプラットフォームを使用して、ヒトＩｇＧ１野生型アイソタイプの抗体との抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合抗体として構築した突然変異との、競合を示すグラフである。ＦｃｇＲＩ（図示せず）、ＦｃｇＲＩＩａ（Ａ）、ＦｃｇＲＩＩｂ（Ｂ）、ＦｃｇＲＩＩＩａ（図示せず）、及びＦｃＲｎ（Ｃ）。

【図4A】それぞれのアイソタイプと、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズアッセイを使用して、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合抗体として構築した突然変異との、直接結合を示すグラフである。ＦｃｇＲＩＩＩａ（Ａ）、ＦｃｇＲＩ（Ｂ）、及びＦｃｇＲＩＩａ（Ｃ）。

【図4B】それぞれのアイソタイプと、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズアッセイを使用して、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合抗体として構築した突然変異との、直接結合を示すグラフである。ＦｃｇＲＩＩＩａ（Ａ）、ＦｃｇＲＩ（Ｂ）、及びＦｃｇＲＩＩａ（Ｃ）。

【図4C】それぞれのアイソタイプと、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズアッセイを使用して、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合抗体として構築した突然変異との、直接結合を示すグラフである。ＦｃｇＲＩＩＩａ（Ａ）、ＦｃｇＲＩ（Ｂ）、及びＦｃｇＲＩＩａ（Ｃ）。

【図5】ＡＤＣＣアッセイの結果、及び選択されたアイソタイプと、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合抗体として構築し、またヒトＰＢＭＣ（２５倍過剰）とＳＫ−Ｂｒ３乳癌細胞とを標的として用いた突然変異と、を示す。

【図6】ヒト補体とＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞とを標的として用いた、選択された抗ＣＤ２０構築物の、ＣＤＣアッセイの結果を示す。

【図7】Ｓｋ−Ｂｒ３標的細胞とＧＭ−ＣＳＦ分化マクロファージとを用いた、選択された抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ構築物の、フローサイトメトリー分析からのＡＤＣＰアッセイの結果を示す。

【図8】ＩｇＧ２野生型及び６つの突然変異を含む、種々の構築物に対するＩｇＧアイソタイプとのビーズ結合を伴うＰＢＭＣの刺激後２４時間からの、サイトカイン（ＴＮＦα）放出を示すグラフ。

【図9】種々のＦｃ領域を伴う、又はＦｃ領域（Ｆａｂ’）２が欠損する抗ＣＤ２０結合ドメイン抗体構築物を注射されたカニクイザル群（Cynomologous monkeys）における、時間経過に伴う平均循環Ｂ細胞数のグラフ。

【0009】

【表1】

【発明を実施するための形態】

【0010】

略語
ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞傷害、ＡＤＣＰ＝抗体依存性細胞貪食作用、ＣＤＣ＝補体依
存性細胞傷害、ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ、ＩＴＡＭ＝免疫受容体チロシン活性化モチー
フ、ＩＴＩＭ＝免疫受容体チロシン阻害モチーフ、Ｍａｂ＝モノクローナル抗体、ＦＤＣ
Ｒ＝Ｆｃ依存性サイトカイン放出、ＦｃγＲ、ＦｃｇＲ、又はＦｃγＲ＝Ｆｃγ受容体。

【0011】

用語の定義＆説明
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」とは、細胞傷害性細胞（例えばナ
チュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（Ｆ
ｃＲ）上に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を
有する標的細胞に特異的に結合してその後標的細胞を細胞毒で殺傷することを可能にする
ような、細胞傷害の形態を意味する。標的細胞の表面を対象とする配位子特異的高親和性
ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を刺激し、またそのような死滅に絶対に必要である。標的
細胞の溶解は細胞外であり、直接の細胞間接触を必要とし、また補体に関与しない。

【0012】

任意の特定の抗体の、ＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を媒介する能力が測定され得る。
ＡＤＣＣ活性を評価するために、目的の抗体は、標的細胞の細胞溶解をもたらす抗原抗体
複合体によって活性化され得る免疫エフェクター細胞と共同して、標的配位子を示す、標
的細胞に添加される。細胞溶解は、通常、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質
、蛍光染料、又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出される。そのようなアッセ
イに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー
（ＮＫ）細胞が挙げられる。生体外ＡＤＣＣアッセイの具体的な例は、Ｗｉｓｅｃａｒｖ
ｅｒら、１９８５，１９：２１１、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９８７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍ
ｅｄ １６６：１３５１、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ２５８：１８３、Ｐａｔｅｌら、１９９５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ １８４：２９に説明される（これらのそれぞれは、参照によって組み込まれる）
。別の方法として、又は追加として、目的の抗体のＡＤＣＣ活性は、生体内で、例えば、
その内容が参照によってその全体において組み込まれるＣｌｙｎｅｓら、１９９８，ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２に開示されるような動物モデルにおいて、評価されてもよい
。

【0013】

「補体指向性細胞傷害」又はＣＤＣは、補体カスケードが、抗体Ｆｃに結合する補体成
分Ｃ１ｑによって活性化される、細胞傷害の形態を指す。

【0014】

本明細書で使用するとき、「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」又は「Ｆｃ含有分子」と
いう用語は、少なくとも免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する単量体、二量
体、又はヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、タンパク質／分
子（例えば、抗体）の二量体領域の少なくとも一部を形成することができる。

【0015】

本明細書で使用される場合の「モノクローナル抗体」という用語は、動物抗体の少なく
とも１つの種の重鎖又は軽鎖抗体可変ドメインのうちの少なくとも１つに対して実質的に
相同性を保持する、少なくとも１つの配位子結合ドメインを含む、Ｆｃ含有タンパク質の
特定の形態である。

【0016】

「野生型ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域」とは、カバットのＥＵ番号付けに従う、ヒトＩｇＧ
重鎖の残基Ｋ２１８から残基Ｋ４４７までである、配列番号：１のアミノ酸配列又はその
断片を有する、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を指す。定常領域内のアミノ酸は、ヒトＩｇＧ１抗
体、ＥＵＩｇＧ１（配列番号：３）との整列によって番号付けされる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈ
ａｍら、１９７０、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，９：３１６１〜７０を参照）。すなわ
ち、抗体の重鎖及び軽鎖は、アミノ酸配列同一性を最大化するようにＥＵの重鎖及び軽鎖
と整列され、抗体内のそれぞれのアミノ酸は、ＥＵにおける対応するアミノ酸と同じ番号
を割り当てられる。ＥＵ番号付け方式は、当該技術分野において従来使用されている（概
略的には、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１
−３２４２，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）を参照）。この慣習に従って、説明される「野生型ＩｇＧ
２」定常領域は、２３６位でアミノ酸を欠損する（図１、配列番号：１）。

【0017】

概論
本発明は、サイトカイン放出を引き起す能力がない、又は標的配位子を示し標的とされ
る細胞を囲む細胞及び組織を損傷若しくは死滅させる能力がないという観点から改善され
た安全性を有する、治療用抗体、Ｆｃ融合体、及び類似のバイオ医薬品生物薬剤の製造に
使用するためのＦｃドメインを同定することへの関心によって動機付けられている。

【0018】

ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体及びＦｃ融合タンパク質は、顕著なＡＤＣＣ（ＮＫによ
り、ＦｃｇＲＩＩＩａだけを発現する）を引き起こさないが、しかし、マクロファージ（
ＦｃγＲＩ、ＩＩａ、及びＩＩＩａを発現する）による貪食作用（ＡＤＣＰ）を誘発し、
かつ可能であれば、免疫複合体において特定の免疫細胞上の活性化ＦｃγＲの分布に起因
する場合に、単核細胞を活性化する能力を、保持する。残留活性を最小化する試みにより
、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号：２）にＶ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（ａｌａ／ａｌａ）
を有する突然変異の、開発及び使用がもたらされた。

【0019】

Ａｒｍｏｕｒらは、ＩｇＧ２において多重点突然変異を生成し、ＦｃｇＲＩ（Ａｒｍｏ
ｕｒら、１９９９）、並びにＦｃｇＲＩＩａ及びＩＩＩａ（Ａｒｍｏｕｒら、２００３）
との結合を最小化した。Ｍｕｅｌｌｅｒらの特許出願（ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９７／１
１９７１号）に開示される追加の突然変異は、ＩｇＧ２ ＣＨ２及びＩｇＧ４ ＣＨ３ド
メインからなる、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４のハイブリッドに由来し、特に、残基３３０及び３
３１は、本発明のＩｇＧ２突然変異内のＩｇＧ４に由来する。免疫活性化作用を減少させ
るための、弱化又は発現抑制の試みはまた、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４又は２つのサブクラス
間を交換するドメインを使用し、ＩｇＧ１（配列番号：３）内に最小のエフェクター機能
を伴うｍＡｂを生成させた（Ｔａｏら、１９９１）。Ｓｔｒｏｈｌの特許出願（米国特許
出願ＵＳ２００７／０１４８１６７号）は、ＥＵ位置２６８、３０９、３３０、及び３３
１位残基でのＩｇＧ２における４つの突然変異を開示している。Ｓｈｉｅｌｄｓら、（２
００１）は、追加の置換物、Ｈ２６８Ａも開示している。

【0020】

本発明は、カバット／ＥＵ番号付け方式に従うＩｇＧ４残基Ｈ２６８Ｑ又はＡ、Ｖ３０
９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを伴う、ＩｇＧ２定常領域（Ｆｃ）の多数の位置にお
ける置換の初めての実証である。多数の残基置換の指向選択は、測定可能なエフェクター
機能を欠く治療用実体の提供の可能性に加え、予想外に抗体工学で用いるための機能的Ｆ
ｃドメインを提供し、融合ポリペプチドとして使用した。

【0021】

多置換ＩｇＧ２突然変異は、Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ競合アッセイ及びＳＰＲ／Ｂｉ
ａｃｏｒｅ分析によって評価された、ヒトＦｃＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、Ｆｃγ
ＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃＲｎ）に対するそれらの相対親和性に基づき選択
された。これらの突然変異は、更に、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、及びＡＤＣＰを誘発し、またＰ
ＢＭＣによるＴＮＦ−α分泌を引き起こす能力について、適切な細胞システムにおいて試
験され順位付けられた。本明細書で提供される一連の実験データにおいて、ＩｇＧ２突然
変異が、既知の調整物、又は野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ２に加えてＩｇＧ１ ａｇ及びＩ
ｇＧ４ Ａｌａ／Ａｌａを含む突然変異と、比較された。いくつかの生体外生物検定にお
けるこれらの突然変異の更なる分析は、最小の検出不可能な活性レベルと、大いに除去さ
れたＦｃＲに対する結合親和性とを実証した。これらの試験に基づき、ＩｇＧ２ Ｆｃ突
然変異は、ＩｇＧ２ｃ４ｄとして名付けられ、ＦｃＲに対する検出可能な親和性又は結合
活性（単量体対二重〜多重配位子結合）を有しておらず、かつ前述の種々のエフェクター
／免疫活性化生物検定において活性を有していないことが確認されている。ＩｇＧ２ｃ４
ｄ Ｆｃは、アラニン、セリン、及びロイシンの置換物：Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２
３８Ｓ、Ｈ２８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ（ＥＵ番号付け）を含む。７つ
の残基置換されたＩｇＧ２であるＩｇＧ２ｃ４ｄは、ＦｃＲに結合する能力、エフェクタ
ー機能を媒介する能力、又はＦｃ媒介性サイトカイン放出に関与する能力がないという点
において、第１の真に「発現抑制された」Ｆｃであると考えられ得る。

【0022】

本発見に基づき、ＩｇＧ２ｃ４ｄの７つの突然変異の一部が使用されるか、又は他のア
ミノ酸突然変異と組み合わされることができ、又は本突然変異は、本明細書で教示される
ようなエフェクター機能の類似又は選択的発現抑制を達成するために別のＩｇＧアイソタ
イプにおいて使用され、また当該技術分野において既知であるものと組み合わされること
ができる。

【0023】

本明細書で具体的に例示されるように、三つ組のＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ
置換物は、分子のＦｃＲｎ結合親和性を維持しつつ、ＦｃγＲＩＩａ結合親和性及びＦｃ
γＲＩＩａ結合活性を低減し、かつＡＤＣＰ及びＦｃ依存性サイトカイン放出が除去され
る。

【0024】

【表2】

【0025】

【表3】

【0026】

【表4】

【0027】

変性Ｆｃ含有分子を作製する方法
置換のための部位は、自然抗体Ｆｃの構造的特性、保持されたＦｃＲｎ結合、良好な安
定性を有し、並びに補体カスケード、細胞溶解、細胞貪食作用、又はサイトカイン放出な
どを刺激する能力が減少された組成物を製造したいという要望に基づき、選択された。

【0028】

ＩｇＧクラス抗体は二価であるため、機能的に関連する重可変ドメイン及び軽可変ドメ
インからなる２つの完全なＦｖドメインを有する。二価性は、結合活性作用と、同一又は
別個の細胞上の標的抗原又はＦｃ受容体を架橋結合し、それによって、抗体の生物活性に
由来する非標的特異的な受容体結合のスペクトルを誘発する能力とを提供する。この理由
により、本発明のＦｃ突然変異は「結合活性関連」内で試験され、すなわち、ＩｇＧのＦ
ｃ突然変異は表面上で多量体形成され、かつ特定のＦｃ受容体の多量体との相互作用に対
して試験された。

【0029】

突然変異の生物学的特徴
Ｆｃ含有タンパク質は、いくつかの周知の生体外アッセイによって、機能性を比較され
得る。具体的には、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩファ
ミリーのメンバーに対する親和性が対象となる。これらの測定値は、受容体の組換え可溶
型又は受容体の細胞結合型を使用して作製され得る。加えて、ＩｇＧの長期の循環半減期
に関与する受容体、ＦｃＲｎに対する親和性は、例えば、組換え可溶性ＦｃＲｎを使用す
る「ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ」の、配位子結合型ビーズフォーマットを使用して、測定す
ることができる。高処理量スクリーニングで使用される、ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮは、結
合等の分子現象の検出を可能にする均質アッセイ技術である。コーティングされた「供与
体」及び「受容体」ビーズが、アッセイ技術の基礎である。ビーズに基づくアッセイとし
て、ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮは、大いに増幅された信号を産生するように働く化学反応の
カスケードをもたらす、近接近したビーズの相互作用を通して機能する。例えば、競合結
合測定といった、直接又は非直接的測定は、タンパク質間の相対親和性及び結合活性を評
価するために、適用され得る。

【0030】

ヒトＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）の
自然進化は、それぞれに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ、例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ
３）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及
びＩｇＧ４）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３）等の、
免疫機能を回復させる能力の異なるスペクトルを示させることを可能にしている。これら
の機能のアイソタイプ特異的結合は、別個の免疫細胞上に存在するＦｃ受容体に対する異
なる選択性と、Ｃ１ｑに結合し、かつエフェクターマクロファージ上の特定受容体結合補
体成分を通じて、ＣＤＣ及びＣＤＰ（補体依存性貪食作用）をもたらす膜攻撃複合体（Ｍ
ＡＣ）のアセンブリを活性化する能力と、に基づく。ヒトアイソタイプの、補体カスケー
ドの初期成分、Ｃ１ｑに結合する能力の優先順位は、ＩｇＧ１＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２＞Ｉ
ｇＧ４であり、しかし微生物感染においてはＩｇＧ２及びＩｇＧ４による補体活性化が十
分に立証されている。

【0031】

ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイ等の細胞に基づいた機能性アッセイは、特定の変
異構造の可能な機能性の結果に関する見識を提供する。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（
ＡＤＣＣ）は細胞媒介性反応であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異性の細胞傷
害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）は、
標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす。１つの実施形
態において、ＡＤＣＣアッセイは、主要エフェクター細胞としてＮＫ細胞を有し、これら
の細胞によって発現されることが知られている唯一のＦｃγ型受容体である、ＦｃγＲＩ
ＩＩＡ上の機能的作用を反映するように構成される。

【0032】

過酸化物又は炎症媒介放出等の細胞応答を測定できるため、貪食作用アッセイを使用し
て、異なる突然変異の免疫エフェクター機能を比較することもできる。生体内モデルは、
Ｆｃ変異型の研究において有用であることが証明されている。例えば、抗ＣＤ３抗体の突
然変異を使用し、マウスにおいて、Ｆｃドメインが、Ｆｃγ受容体等の特異的配位子に関
与することに依存する活性であるＴ細胞活性化を測定することで、実証されている。マク
ロファージの抗体指向性活性化は、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を媒介し、オプ
ソニン化された標的細胞がマクロファージによって飲み込まれ消化されるようにする。高
レベルのＦｃＲを発現する生体外で分化されたマクロファージは、ＩＦＮγ又はＧＭ−Ｃ
ＳＦを使用して単核細胞に対する全ＦｃＲ（ＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩａ，ＦｃγＲＩＩ
Ｉａ）の上昇したレベルを発現する（to expressed）ことによって、Ｍ１表現型へと分化
され得る。そのようなアッセイは、当該抗体工学分野における技術者にとって既知である
。

【0033】

抗体を作製する方法
所定の組換え処理を使用して、Ｆｃ突然変異の生成及び試験の出発点として使用される
ヒトＩｇＧ２定常ドメインに対する、配列内の定方向突然変異が作成された。当該技術分
野の技術者は、コード配列内に変化をもたらす種々の技術が、回収及び試験のための種々
の宿主細胞における、所望のアミノ酸配列の発現に好適なベクターを作成するために、使
用され得るということを理解するであろう。

【0034】

宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本明細書で説明されるように、組換えＦｃ含有タンパク質又はモノクローナル抗体の発
現のために選択される宿主細胞は、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン内でタンパク質を修飾
するオリゴ糖部分の組成物における変化を含むが、しかしそれに限定されず、最終的な組
成物にとって重要な寄与因子である。したがって、本発明の１つの態様は、所望の治療用
タンパク質を発現する産生細胞の使用及び／又は開発のために適切な、宿主細胞の選択を
含む。

【0035】

更に、宿主細胞は、哺乳類起源であるか、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３
、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２，６５３、ＳＰ２／０、２９３、Ｈｅ
Ｌａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫又は植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化
細胞、若しくは形質転換細胞から選択され得る。

【0036】

別の方法としては、宿主細胞は、例えば、天然又は人口の大腸菌種、クレブシェラ菌種
、又はシュードモナス菌種等の、原核細胞又は有機体といった、ポリペプチドをグリコシ
ル化する能力がない種又は有機体から選択されてもよい。

【0037】

抗体
本出願で説明される抗体は、非限定的に、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、
霊長類、ヤギ、又はそれらの任意の組み合わせ等を含むか、又はそれらに由来することが
でき、また、単離したヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化、及び／又はＣ
ＤＲ移植等の抗体、免疫グロブリン、開裂産物及び他の指定部分、並びにそれらの変異を
含む。

【0038】

本明細書で説明される抗体、Ｆｃ含有タンパク質、又はＦｃ断片は、当該技術分野にお
いて周知であるいくつかの方法で、得ることができる。１つの態様において、抗体は、マ
ウス又は他の動物を、標的ペプチド、細胞、又は組織抽出物によって免疫化して調製され
るハイブリドーマから、都合よく得られる。抗体はしたがって、当該技術分野において周
知である任意のハイブリドーマ技術を使用して得ることができ、例えば参照によって本明
細書に全体が組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１
９８９）を参照されたい。

【0039】

抗体若しくはＦｃ融合タンパク質、又はそれらの成分及びドメインは、例えば、ファー
ジライブラリー等の、そのようなドメイン又は成分のライブラリーから選択し、得ること
もできる。ファージライブラリーは、免疫化された動物又はヒトのＢ細胞からのような、
ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリー又は目的の配列を含有するポリヌクレオチド
のライブラリーを挿入することによって、作成できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５〜１３１７）。抗体ファージライブラリーは、１つの
ファージ内に重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の可変領域対を含有し、単一鎖Ｆｖ断片又はＦａ
ｂ断片の発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏ
ｄａｙ ２１（８）３７１〜８）。ファージミドライブラリの多様性は、ライブラリーの
モノクローナル抗体の免疫特異性を増大及び／又は変化させ、追加の望ましいヒトモノク
ローナル抗体を産生しその後同定するように、操作され得る。例えば、遺伝子を符号化す
る重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の免疫グロブリン分子は、組み立てられた免疫グロブリン分
子における新規のＨＬ対を作成するように、無作為に混合（入れ替え）され得る。更に、
遺伝子をコードするＨ鎖及びＬ鎖の一方又は双方は、免疫グロブリンポリペプチドの可変
領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）において変異誘発され、かつその後に望ましい親和性及
び中和能力について篩分けされ得る。抗体ライブラリーはまた、１つ以上のヒトフレーム
ワーク配列を選択し、かつヒト抗体レパートリーから得られるか又は設計変更を通じて得
られるＣＤＲカセットの収集を導入することによって、合成的に作成され得る（Ｋｒｅｔ
ｚｓｃｈｍａｒ及びｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８〜６０２）。多様性の位置はＣＤＲに
限定されないが、可変領域のフレームワークセグメントを含むこともでき、又はペプチド
等の抗体可変領域以外を含んでもよい。

【0040】

抗体可変領域以外を含み得る標的結合成分の他のライブラリーは、リボソームディスプ
レイ、酵母ディスプレイ、及び細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、タ
ンパク質のＲＮＡとの付着を保ちつつ、ｍＲＮＡをそれらの同属タンパク質へと翻訳する
方法である。核酸コード配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉ
ｓ，Ｌ．Ｃ．ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９
０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合αアグルチニン酵母接着受容体の融合タンパク質
の構築物ａｇａ１及びａｇａ２に基づき、接合型システムの一部である（Ｂｒｏｄｅｒら
、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３〜７）。細菌デ
ィスプレイは、細胞膜又は細胞壁に関係している、標的と排出された細菌タンパク質との
融合に基づく（Ｃｈｅｎ及びＧｅｏｒｇｉｏｕ ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉ
ｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３）。

【0041】

ハイブリドーマ技術との比較において、ファージ及び他の抗体ディスプレイ方法は、生
体外の抗原標的に対する選択を操作する機会を与え、かつ宿主の抗原への作用の可能性を
制限せず逆もまた同様である。

【0042】

本発明はまた、単離したポリヌクレオチドとして、又は原核細胞、真核性、又は繊維状
のファージ発現、組成物の分泌及び／又はそれらの定方向突然変異誘発物質又は組成物の
ディスプレイと適合するベクターを含む発現ベクターの部分として、本発明の組成物をコ
ードするする核酸を提供する。

【0043】

Ｆｃ含有分子の使用
上述された方法のうちのいずれかによって生成される組成物（抗体、Ｆｃ融合体、Ｆｃ
断片）は、ヒトの疾患、又は細胞、組織、器官、体液、若しくは概して宿主における特定
の病理を、診断、治療、検出、又は調節するために使用され得る。本明細書で教示される
ように、Ｆｃγ受容体結合及び指定のエフェクター機能を低減又は除去するために、抗体
、Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｃ断片の、Ｆｃ部分を修正することは、抗体が元の標的指
向化性質を保持するが、優れた活性スペクトル、生物物理学的性質、安定性、及び宿主の
身体内に持続させる能力を有する抗体及びＦｃ構築物を提供する。

【0044】

本発明によって提供される組成物を用いた治療に使用できる疾患又は病理としては、例
えばアルツハイマー病であるが、それに限定されない神経性疼痛を含む、神経疾患；皮膚
病；代謝病；変形性関節炎；及び火傷又は怪我から生じる症状；心筋梗塞、うっ血性心不
全、脳卒中、虚血性脳卒中、及び出血を含むがそれに限定されない、心臓血管疾患；並び
にリウマチ性疾患、乾癬、及び強皮症を含む一般的な免疫介在性疾患が挙げられるが、そ
れらに限定されない。

【0045】

本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。

【実施例】

【0046】

実施例１．Ｆｃ突然変異の構築及び試験
表４に示されるヒトＩｇＧ２抗体に由来する突然変異を伴う一連の構築物は、標準的組
換え方法を使用して構築された。完全な可変ドメインを伴う抗体に対して、抗ＨＥＲ２及
び抗ＣＤ２０抗体の既知のＣＤＲ配列が使用され、示されたようなアイソタイプ及びＦｃ
突然変異が構築された。抗体突然変異は、標準的クローン化及び発現手順を使用し、２９
３Ｔ細胞内に一時的に発現された。ＭＡｂは、次の実験的分析の前に、タンパク質Ａカラ
ムを使用して、９５％を超える均質性まで浄化された。

【0047】

【表5】

【0048】

親和性のビアコア（Biacore）研究
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００光学バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌ
ａ，Ｓｗｅｄｅｎ、現在は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部である）を使用して、表
面プラズモン共鳴実験が実行された。実験は、３ ｍＭのＥＤＴＡと０．０１％の界面活
性剤Ｐ２０とを含有するＤ−ＰＢＳ緩衝剤中、摂氏２５度で実行された。受容体とＦｃ突
然変異との相互作用を分析するために、マウスの抗Ｈｉｓ ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅ
ｍｓ ｃａｔ＃ＭＡＢ０５０）をＣＭ−５センサーチップへ共有結合させることによって
、捕捉表面が生成された。抗Ｈｉｓ Ａｂは、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ ４
．５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）の中に希釈され、アミン連結化学剤製造者の説明書を使用
し、ＣＭ−５チップ（〜３０００ ＲＵ）のカルボキシメチル化デキストラン表面と連結
された。表面上に残留する反応基は、エタノールアミンＨＣＬを使用して非活性化された
。動力学的実験を実行するために、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩの、
１６５、３５１、及び２０８反応単位（ＲＵ）がそれぞれ、この表面上で捕捉された。受
容体捕捉の後に、野生型又はＦｃ突然変異の一連の希釈物が（４倍希釈工程で４０００ｎ
Ｍから３．９ｎＭまで）、３０ｕＬ／分で注入された。会合相を３分間観察した。その後
に、２０分間の緩衝剤流入が続き、結合解離を観察した。捕捉表面は、１００ｍＭのリン
酸の９秒パルスを１００ｕＬ／分で使用し、その後の移動緩衝剤の注入によって再生され
た。

【0049】

参照のために、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェアバージョン１．１ｇ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データの二重参照減算（double reference subtracti
on）を実行し、信号及び機器ノイズ（Ｍｙｓｚｋａ １９９９）への緩衝剤寄与を修正し
た。この初期データ処理の後、単純１：１結合モデルを仮定とし、ＢＩＡ評価ソフトウェ
ア、バージョン４．０．１（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＡＢ）を使用して、データの動力学的分析
を実行した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ及び結合研究。

【0050】

種々のＦｃγＲとのＩｇＧの競合結合及び直接結合の双方が、均質ビーズ系結合アッセ
イ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ
）を使用して評価された。手短に言うと、わずかな修正を伴って、以前に説明されたよう
に実験が実行された（Ｌａｚａｒら、２００６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ １０３（１１）：４００５〜１０）。ＦｃγＲＩ、ＩＩａは、Ｒ＆Ｄシステム
から取得された。ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎは、クローン作製、発現、及び浄化され
た。ＩｇＧＦｃ突然変異が、ＮＬＳビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ、２：１比率を使用してビオ
チン化された、ＣＮＴ０６２３４（非特異的制御ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体）、又は抗
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ヒトＩｇＧ２抗体）に対する競合結合について、試験された。

【0051】

競合結合研究において、ビオチン化抗体が、２００ｎｇ／ｍＬの最終アッセイ濃度に添
加され、次にそれぞれの実験図に規定されている指定された最終濃度に、競合試験抗体が
添加された。ＦｃγＲが、２００ｎｇ／ｍＬ最終濃度で９６穴プレートへ添加され、次に
、ストレプトアビジン供与体及びＮｉキレート受容体ビーズが連続的に添加された。プレ
ートを密封し室温で振盪した後、プレートはＥｎｖｉｓｉｏｎ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅ
ｒを使用して読み取られ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてデータがグラフ化され
プロットされた。結合活性研究は、試験ＩｇＧ分子が２：１比率でビオチニル化され、か
つ直接ＦｃＲ結合が競合の不在のもとに対照抗体に対して評価されたということ以外は、
競合研究と同様に実行された。

【0052】

結果
ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって評価され、センサグラムから得られたヒトＦｃＲ
（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａ）に対するＩｇ
Ｇ変異型の相対親和性を、表５に示す。

【0053】

【表6】

【0054】

これらの数字は、１つの実験のグローバル・フィットのために生成されたパラメーター
に対応する。

【0055】

これらの４つのデータセットに対して、単純１：１結合モデル・キネティック・フィッ
トを使用してフィッティングを実行することによって、親和性が獲得された。他の全てに
対して、単純１：１結合定常状態親和性解析を使用してフィッティングを実行することに
よって、親和性が獲得された。

【0056】

ヒトＩｇＧ１（ＣＮＴＯ６２３４）を用いたＡｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ（商標）競合ア
ッセイを使用して測定された、結合活性関連におけるヒトＦｃＲ（ＦｃγＲＩＩａ、Ｆｃ
γＲＩＩｂ、及びＦｃＲｎ）に対する、すなわち高密度の標的分野に結合する二価抗体に
対するＩｇＧ突然変異の相対親和性を、図３Ａ〜Ｃにそれぞれ示す。

【0057】

実験データは、ＩｇＧ１ ａｇ及びＩｇＧ４ Ａｌａ／Ａｌａと同様に、ＩｇＧ２突然
変異が、ＦｃＲｎ（生体内半減期をもたらす新生児Ｆｃ受容体）と結合するそれらの能力
を保持しつつ、ＩｇＧ１と比較して大幅に減少したＦｃγ受容体との結合親和性を示すと
いうことを実証した。具体的には、ＩｇＧ２に対する競合結合における、また高親和性か
ら最低親和性まで順位付けされたＦｃｇＲＩＩａとの結合におけるその順序は、以下の通
りである。ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ｃ４ａ＞ＩｇＧ２ｍ４＞ＩｇＧ２＝ＩｇＧｃ４ｃ＞ＩｇＧ
２ｃ４ｂ＞ＩｇＧ４ａｌａ／ａｌａ＞ＩｇＧ４ａｇｌｙ＞ＩｇＧ２ｃ４ｄ。この順序は、
ＦｃｇＲＩＩｂとの結合におけるＩｇＧ１（ＣＮＴＯ６２３４）に対する競合において、
一致している。ｐＨ ６．４でのＦｃＲｎとの結合における、ＩｇＧ１（ＣＮＴＯ６２３
４）に対する更なる競合結合分析は、全てのアイソタイプ及び突然変異がＦｃＲｎと比較
的均等に結合することを示した。重要なことには、ＩｇＧ２ｃ４ｄ及びＩｇＧ１ ａｇｌ
ｙは、仮にあったとしても、ＦｃｇＲＩＩａ及びＦｃｇＲＩＩｂとで最小の検出可能な結
合を示す。

【0058】

実施例２：ＡＤＣＣ及びＣＤＣ
ＣＤＣは、３つの経路カテゴリーにおいて始まる。抗体依存性（古典経路）、多糖類依
存性（レクチン依存性）、及び外来性表面構造（代替経路）であり、その全ては、タンパ
ク質分解工程のカスケードを産生し、ついには標的細胞又は微細物の溶解に至る膜攻撃複
合体のアセンブリをもたらす（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照）。実験
１で説明されたアイソタイプ及びＦｃ突然変異の部分集合が、抗ＣＤ２０抗体の可変ドメ
インを使用して調製され、ヒト血清存在下におけるＷＩＬ２−Ｓ Ｂ細胞リンパ腫（lymo
phoma）標的細胞を溶解させる能力が評価された。ＷＩＬ２−Ｓ細胞のＣＤＣを媒介する
ことで知られる治療用抗ＣＤ２０である、市販のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）が、溶解に
対する陽性対照として使用された。ＣＤＣ分析のために、Ｗｉｌ２−Ｓ標的細胞が９６穴
プレート内に播種され、ヒト血清補体（１／６希釈）とともに培養され、ＡｌａｍａｒＢ
ｌｕｅを使用して相対的細胞生存率が評価された。

【0059】

ＡＤＣＣアッセイは、実験１に説明されたように、またＳｋＢｒ３乳癌細胞を標的とし
て、異なるＩｇＧアイソタイプ又は変異型の種々のＦｃドメインと組み合わされた、抗Ｈ
ＥＲ２／ｎｅｕ可変ドメインを使用して実行された。アッセイは、以前に説明されたよう
に、細胞溶解検出のＥｕＴＤＡ法（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を
使用して実行された。ＴＤＡを負荷したＳｋＢｒ３乳癌標的細胞が、Ｕ−ｂｏｔｔｏｍ
９６穴プレートに播種され、指定の抗体濃度でオプソニン化され、また３７℃でロイコパ
ックから単離された２５倍過剰のＰＢＭＣとともに共培養された。３時間後、プレートが
遠心分離され、製造者の説明書に従って上清がＴＤＡ放出について分析された。生データ
が正規化され、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してプロットされた。ＣＤＣ分析の
ために、Ｗｉｌ２−Ｓ標的細胞が、９６穴プレート内に一穴あたり５０，０００個で播種
され、ヒト血清補体（１／６希釈）とともに培養され、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して
相対的細胞生存率が評価された。

【0060】

結果
ＮＫ細胞上のＦｃｇＲＩＩＩａに主として関わるＡＤＣＣは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｍ４
、ＩｇＧ２ｃ４ｄ及びｅ、ＩｇＧ１ ａｇｌｙ、並びにＩｇＧ４ ａｌａ／ａｌａ（図５
）を含む、試験された一連の構築物に関して非検出可能であり、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ
（商標）アッセイ（図４Ａ）における結合活性の欠損と同様に、より高い親和性ＦｃｇＲ
ＩＩＩａ（Ｖ）受容体に見られる減少した結合特性と一致した。乳癌細胞上のＨＥＲ２／
ｎｅｕ等の高密度標的の使用は、ＦｃｇＲＩＩＩａ（４０ｕＭより低い）に対するＦｃ親
和性が標的細胞溶解を誘発するには不十分にしか出現しないということを実証した。同様
に、ＩｇＧ１を除いて、抗体又はＦｃ突然変異のいずれも、試験された抗ＣＤ２０構築物
内のＷＩＬ２−Ｓ標的細胞に対する、有意なＣＤＣレベルを示さなかった（図６）。試験
されたＩｇＧサブクラス及び突然変異のうち、ＩｇＧ１のみが、検出可能なＣＤＣレベル
を示し、これは、Ｃ１ｑ結合とは無関係に、残留する突然変異のいずれもがＣＤＣを引き
起こすことはできないということを示唆している（図６）。先行の試みにより、ＩｇＧ２
は、Ｃ１ｑ結合及び古典経路の活性化を通じて最小のＣＤＣを有すると指摘されているが
、我々は、先行文献の観察（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｐｒｅｓｔａら、２０００ Ｊ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ １６４（８）：４１７８〜８４）と一致する抗ＣＤ２０関連において、有意な
活性レベルを観察しなかった。更に、抗ＣＤ２０及びヒト血清を用いて、残留補体活性を
有するＩｇＧ１ ａｇｌｙの先行文献の指摘も検出されなかった（Ｄｏｒａｉ，Ｍｕｅｌ
ｌｅｒら、１９９１ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １０（２）：２１１〜７）。この矛盾に対す
る説明は、低いレベルの補体活性化がＩｇＧ２によって媒介され得るが、活性化は、オプ
ソニン化された細胞を溶解させるのに十分な膜攻撃複合体（ＭＡＣ）のアセンブリを始動
させるには不十分であるかもしれない、ということである。

【0061】

これらのデータは、補体活性化のレベルにかかわらず、ついには標的細胞溶解に至る膜
攻撃複合体のアセンブリが、結合型ＩｇＧ１以外のアイソタイプの抗体に対しては、欠乏
しているか又は不十分であるということを示唆する。

【0062】

実施例３：抗体依存性細胞貪食作用
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合Ｆｃ突然変異が、オプソニン化された標的乳癌細胞であるＳｋ
−Ｂｒ３及びマクロファージを使用して、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を媒介す
る能力について評価された。

【0063】

抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）
末梢血単核球が、標準Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度
勾配調製によってロイコパック（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）から単離され、細胞が等分され、かつ窒素内で貯蔵された。ＰＢＭＣは
解凍され、製造者の説明書に従って、ＣＤ１４陽性細胞が、ＣＤ１６枯渇を伴わないＣＤ
１４ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
を使用する陰性除去（negative depletion）によって単離された。細胞は、０．１×１０
⁶細胞／ｃｍ²で、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で
、ＲＰＭＩ／５％の加熱不活性化したＦＢＳ／５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン内で、７日
間平板培養され、単核細胞由来マクロファージが生成された。ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍細胞は
、製造者の説明書に従って、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で標識付けされた。標的細胞は洗
浄され、かつ４エフェクター細胞に対して１標的細胞の比率で単核細胞由来マクロファー
ジを用いて、抗体の存在下で、３７℃で４時間５％ ＣＯ₂培養器内で培養された。培養
後、細胞はＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって分離され、またマクロファ
ージは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化された抗ＣＤ
１１ｂ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識付けされた。フローサイトメトリー
によって細胞が分析され、腫瘍細胞単独（ＰＫＨ６７^pos、ＣＤ１１ｂ^neg）、マクロファ
ージ単独（ＰＫＨ６７^neg、ＣＤ１１ｂ^pos）、及び貪食された腫瘍細胞（ＰＫＨ６７^pos
、ＣＤ１１ｂ^pos）が測定された。パーセント貪食作用が、次の等式によって決定された
。（貪食された腫瘍細胞）／（貪食された腫瘍細胞＋腫瘍細胞単独）×１００％。細胞は
、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に取得され、その
結果はＦｌｏＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）によって分析された。

【0064】

単離した単核細胞が、ＧＭ−ＣＳＦを使用して生体外で分化され、更に、フローサイト
メトリック分析によってＦｃＲの発現レベルについて特徴付けられた。他者の先行研究で
述べられているように、ＧＭ−ＣＳＦ活性化マクロファージは、親単核細胞に対して、全
ＦｃＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）の上昇したレベルを発現した
（データは図示せず）。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＩｇＧ Ｆｃ突然変異構築物は、その後、
Ｍ１マクロファージを使用して貪食作用アッセイで試験された。

【0065】

結果
それぞれのｍＡｂの存在下での、ＳｋＢｒ３細胞を伴う４時間の共培養後、かなりのレ
ベルのＡＤＣＰがＩｇＧ１に対して出現したが、しかしながら、非グリコシル化ＩｇＧ１
、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｍ４、及びＩｇＧ４ Ｓ＞Ｐ ａｌａ／ａｌａに対しては、より高
濃度の抗体において最小レベルのＡＤＣＰも観察された（図７）。対照的に、ＩｇＧ２ｃ
４ｄは、検出可能なレベルのＡＤＣＰを示さなかった。この観察結果は、以前に実証され
たＦｃＲに対する種々のＩｇＧの結合プロファイルと一致している。例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ ａｇｌｙ、及びＩｇＧ４ ａｌａ／ａｌａは、多数の配位子ディスプレイビーズ
（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）システムを使用して）の使用においてＦ
ｃγＲＩとの結合を実証したが、これら３つの全てはＡＤＣＰも実証した。ＩｇＧ２及び
ＩｇＧ２Ｍ４及びＩｇＧ４ ａｌａ／ａｌａは、より高濃度で最小のＡＤＣＰを示した。
ＩｇＧ２及びＩｇＧ２ｍ４によるＦｃγＲＩＩａの結合は、ＦｃγＲＩＩａの寄与を示唆
する結合活性研究によって示されるように、それ自体としては、有意なレベルのＡＤＣＰ
を生じさせるには不十分であるかもしれない。ＢｉａＣｏｒｅ及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅ
ｎ（商標）の結果（表５、並びに図４Ｂ及び４Ｃ）は更に、ＩｇＧ ａｇｌｙがＦｃγＲ
Ｉとの結合を保持し、ＩｇＧ４ ａｌａ／ａｌａはＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩａの双方
との結合活性を示すが、しかしＡＤＣＰは、ＩｇＧ１ ａｇｌｙに対してＩｇＧ４ ａｌ
ａ／ａｌａよりも幾分強固であるということを示した。ＩｇＧ１ ａｇｌｙは、ＦｃγＲ
ＩＩａに対し、また更には高度に類似した阻害物質ＦｃγＲＩＩｂ（細胞外ドメイン（do
man）内での、配列同一性＞９５％に基づく）に拡大して、仮にあったとしても最小の結
合性を有するため、ＦｃγＲＩ信号伝達を通してのＩＴＡＭの活性化は、ＦｃγＲＩＩｂ
活性化に関連するＩＴＩＭを通しての信号伝達によって相殺されない。対照的に、ＩｇＧ
４ Ｓ＞Ｐ ａｌａ／ａｌａは抑制された貪食作用を示し、ＦｃγＲＩＩｂの活性化に起
因する可能性が高い。最後に、単量体又は結合活性に基づく、種々のＦｃＲとのＩｇＧ２
ｃ４ｄの検出可能な結合の完全な欠損は更に、このＦｃ主鎖の固有の無効にされた貪食能
力を立証する。

【0066】

実施例４：抗体媒介性サイトカイン放出
免疫細胞上のＦｃＲのＦｃ結合は、架橋結合されるとサイトカイン放出を促進する。免
疫細胞上のＦｃＲの結合活性系結合を模倣するために、ｍＡｂがポリスチレンビーズへ結
合された。

【0067】

抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＩｇＧ突然変異を使用したサイトカイン放出が、ＩｇＧをラテッ
クスビーズへ直接結合した後、一晩培養してから、実行された。洗浄されたビーズが、１
ｍＬあたり約１５００個〜２５０，０００個の指定の種々の濃度で単離したヒトＰＢＭＣ
へ添加され、一晩培養した後、共培養上清を除去し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｗａｌｔ
ｈａｍ，ＭＡ）からの標準ＡｌｐｈａＥＬＩＳＡキットを使用して、分泌されたＴＮＦα
が測定された。

【0068】

試験されたＩｇＧアイソタイプ及びＦｃ突然変異は分化能力を有し、ＰＢＭＣからのＦ
ｃ受容体媒介性ＴＮＦα分泌を通じてサイトカイン放出を刺激する（図８）。従って、種
々のアイソタイプ及びそれらのＦｃ突然変異による、高レベルから低レベルまでのＴＮＦ
分泌のレベルは、以下の通りである。ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ２ｍ４＞ＩｇＧ２ｃ４
ａ＞ＩｇＧ１ａｇｌｙ＞ＩｇＧ４ａｌａ／ａｌａ＞ＩｇＧ２ｃ４ｂ＞ＩｇＧ２ｃ４ｃ＞Ｉ
ｇＧ４ｃ４ｄ及びｅ留意すべき点として、ＩｇＧ４ｄ及びｅＦｃ突然変異の双方は、仮に
あったとしても、検出可能なカイトカイン（ＴＮＦ）放出を誘発する最小の能力を持つ。

【0069】

実施例５：生体外Ｂ細胞枯渇
生体内での発現抑制レベルに関するアイソタイプ及び突然変異の能力をより良く理解す
るために、ヘパリン化ヒト全血液の存在下で、ＷＩＬ２−Ｓ Ｂ細胞の生体外枯渇が測定
された。抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１は、全てのエフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣ
Ｐ）に関与することが知られているため、ＰＭＮ（好中球、好塩基球等）、ヒト補体、及
び過剰ＩｇＧの存在を含む全血液システムは、それぞれの変異型によって与えられる「発
現抑制」のレベルを表していると見なされた。

【0070】

手短に言うと、ヒト全血液は、ＡＤＣＣアッセイのための標的細胞の機能を果たすエフ
ェクター細胞及びＷＩＬ２−Ｓ細胞を提供した。標的細胞は、ＢＡＴＤＡ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）を用いて摂氏３７度で３０分間事前標識付けされ、２回洗浄されＤＭＥＭ／
５％の加熱不活性化したＦＢＳ内で再懸濁され、その後５０μＬの標的（１穴あたり２×
１０⁴細胞）が、９６穴Ｕ−ｂｏｔｔｏｍプレートの穴へ添加された。種々の濃度の抗体
を伴って又は伴わないで追加の５０μＬが添加され、細胞は室温で２０分間培養された。
次に、ヒト全血液（１００μＬ）が穴へ添加された。全ての試料は３組で実行された。プ
レートは、２００ｇで３分間遠心分離され、５％ ＣＯ₂培養器において摂氏３７度で３
時間培養され、次に、２００ｇで３分間再び遠心分離された。１穴あたり合計２０μＬの
上清が除去され、細胞溶解が、２００μＬのＤＥＬＰＨＩＡ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ系試薬（
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によって測定された。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０１ Ｍ
ｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、蛍光性が測
定された。データは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞
を処理することによって得られた最大の細胞傷害に対して正規化され、また標的細胞単独
からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照が決定された。データは、ＧｒａｐｈＰａ
ｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．０１を使用して、Ｓ字状用量−応答モデルにフィッティングされ
た。

【0071】

ヒト血液の存在下でのＷＩＬ２−Ｓの共培養は、ＩｇＧ１を使用して、またある程度は
ＩｇＧ２及びＩｇＧ２Ｍ４によって、標識付けされたＷＩＬ２−Ｓのエフェクター媒介に
よる重度の枯渇を明らかにした。留意すべき点として、（Ｆａｂ’）₂及びＦａｂ抗ＣＤ
２０断片の双方は、エフェクター機能を回復する能力がある血清内の開裂ＩｇＧ自己抗体
（例えば、Ｂｒｅｓｋｉら、２００８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８１：３１８３〜３１９
２を参照）の存在を示し得る、あるレベルのＷＩＬ２−Ｓ枯渇を誘発した。先行のＡＤＣ
Ｃ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰデータと一致して、ＩｇＧ２ｃ４ｅに伴って、大幅な又は検出
可能なレベルのサイトカイン放出は、観察されなかった。

【0072】

実施例６：ＣＤ２０標的化を伴う生体内Ｂ細胞生存
ＩｇＧ２ｃ４ｅに関連する生体内エフェクター機能が、抗ＣＤ２０の確立されたカニク
イザルＢ細胞（Cynomologous B-cell）枯渇モデル（Ｒｅｆｆら、１９９４，Ｂｌｏｏｄ
８３：４３５〜４４５）を使用して評価された。

【0073】

カニクイザル（Cynomologous monkeys）（ｎ＝３／群）は、０．２ｍｇ／Ｋｇ又は２ｍ
ｇ／Ｋｇでの、ＩｇＧ１か又はＩｇＧ２Σかの単回ボーラス静脈内投与の７日前に、生理
食塩水を注入された。注入後の所定の日に、全血液試料からのＢ細胞レベルが、抗ＣＤ２
０及び抗ＣＤ３をそれぞれマーカーとして使用するＢ及びＴ細胞のフローサイトメトリー
分析によって測定された。それぞれの群に対する平均Ｂ細胞レベル（ＣＤ２０＋／ＣＤ３
−）が、注入後３週間の間プロットされた（図９）。ＩｇＧ１の低投与量（０．２ｍｇ／
ｋｇ）は、注入後１日で全Ｂ細胞の完全に近い枯渇（９９％）を誘発したのに対し、抗Ｃ
Ｄ２０ ＩｇＧ２ｃ４ｅによっては有意な枯渇は誘発されなかった（群内平均１５％）。
Ｂ細胞レベルは、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ２ｃ４ｅで処理された動物に対しては、後続の数日
に渡って相対的に正常なままであり、またＩｇＧ１で処理された動物に対しては、後続の
数週間の間で、徐々に回復へと向かうＢ細胞レベルの傾向が観察された。留意すべき点と
して、ＩｇＧ２ｃ４ｅ及びＩｇＧ１の双方とも、２ｍｇ／Ｋｇのより高い投与量では、完
全に近いＢ細胞枯渇を誘発した。

【0074】

抗ＣＤ２０媒介性Ｂ細胞枯渇は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びアポトーシスを含むいくつか
のメカニズムによって媒介されると考えられる。ＩｇＧ２ｃ４ｅによる、より高い投与量
（２ｍｇ／Ｋｇ）でのＢ細胞の枯渇を示すサルのＢ細胞枯渇データを考慮し、単離したＢ
細胞内の抗体によって誘発されるアポトーシスのレベルを測定することによって、Ｂ細胞
枯渇の基本メカニズムが更に評価された。

【0075】

単離したＢ細胞は、０、０．２６、２．６、及び２６μｇ／ｍＬ濃度のＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２ｃ４ｅ、（Ｆａｂ’）₂、及びＩｇＧ２と、非結合性の対照ｍＡｂ（ＢＭ２１）とで
、４時間処理され、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性及び７ＡＡＤ陰性細胞が、フローサイトメト
リーによって定量化された。０．２及び２ｍｇ／Ｋｇのボーラス注入後の、概算の最大生
体内血清ＩｇＧ濃度を反映するように、２．６及び２６μｇ／ｍＬの特定の最終濃度が選
択された。

【0076】

これらの３つの全ての結合抗体に対して、アポトーシスの投与量依存性誘発が、（Ｆａ
ｂ’）₂を含む全てのＩｇＧに対して観察され、抗ＣＤ２０媒介性架橋結合は、より高い
投与量での細胞死滅の誘発に十分であるが、しかし、ＩｇＧ２ｃ４ｅに対するより低い投
与量では十分ではないことが示された。留意すべき点として、（Ｆａｂ’）₂はまた、Ｆ
ｃの不在下でも有意なアポトーシスを示し、抗ＩｇＧ媒介性アポトーシスは、以前に観察
されたように、Ｆｃ媒介性架橋結合とは無関係に誘発され得るという考えを裏付けた。

【0077】

したがって、細胞上の標的抗原の架橋結合に関連する正常な機能は、修飾されたＦｃ変異型によって除去されない。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ 野生型Ｆｃと比較して少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する低下した親和性を有するＦｃ含有分子であって、突然変異したＩｇＧ定常領域を伴う抗体Ｆｃドメインを含み、ＥＵ番号付け方式によって定義されるアミノ酸残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８が、ＰＡＡＡＰ（配列番号：４）、ＰＡＡＡＳ（配列番号：５）、及びＳＡＡＡＳ（配列番号：６）から選択される配列を含む、Ｆｃ含有分子。
［２］ 前記Ｆｃドメインが更に、ＥＵ番号付け方式によって定義される突然変異Ｈ２６８Ａ又はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含む、［１］に記載のＦｃ含有分子。
［３］ 前記ドメインが、ＦｃＲｎに特異的に結合することができる、［１］に記載のＦｃ含有分子。
［４］ 前記Ｆｃドメイン配列が、ヒトＩｇＧ２重鎖ＣＨ２ドメインと少なくとも９０％同一である、［１］に記載のＦｃ含有分子。
［５］ 前記Ｆｃ含有分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、［１］に記載のＦｃ含有分子。
［６］ 残基２２８がＳからＰへ突然変異される、［１］に記載のＦｃ含有分子。
［７］ 組換えポリペプチド系結合分子であって、（ｉ）標的分子に結合することができる結合ドメインと、（ｉｉ）ヒト免疫グロブリン重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインの全て又は一部に実質的に相同であるアミノ酸配列を有するＦｃドメインであって、ＥＵ番号付け方式によって定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８が、ＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択されるアミノ酸配列を含む、Ｆｃドメインと、を含み、前記結合分子が、著しい補体依存性溶解又は前記標的の細胞媒介性破壊を引き起こすことなしに、前記標的分子に結合することができる、結合分子。
［８］ 前記Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎに特異的に結合することができる、［７］に記載の結合分子。
［９］ 前記結合ドメインが、抗体、酵素、ホルモン、受容体、サイトカイン、免疫細胞表面抗原、配位子、及び接着分子の結合部位から選択される、［８］に記載の結合分子。
［１０］ 前記分子が結合活性を示す、［９］に記載の結合分子。
［１１］ 前記結合ドメインが、神経組織、内分泌組織、血管組織、心臓組織、滑膜組織、皮膚組織、又は粘膜組織内で標的と特異的に結合する、［７］〜［１０］のいずれか一項に記載の結合分子。
［１２］ マクロファージの遊走及び集結によって特徴付けられる疾患を治療するための方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載のＦｃ含有タンパク質調製物を、対象又は患者に投与する工程を含む、方法。
［１３］ 移植片対宿主疾患；宿主対移植片疾患；臓器移植拒絶反応；骨髄移植拒絶反応；自己免疫、血管炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症及び関節炎；胎児／新生児同種免疫性血小板減少症等の同種免疫；ぜんそく及びアレルギー；慢性若しくは急性炎症性疾病、クローン病又は強皮症；アルツハイマー病、又は冠状動脈閉塞を治療する方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載のＦｃ含有分子を対象又は患者に投与する工程を含む、方法。
［１４］ ［１］〜［７］のいずれかに記載のＦｃ含有分子を対象又は患者に投与する工程を含む、症状を治療するための方法であって、前記結合分子が、患者に投与されるか、又は任意で前記患者が胎児である場合に前記患者の母親に投与される、方法。
［１５］ 野生型Ｆｃと比較してＦｃγ受容体に対する低下した親和性を有するＦｃ含有分子であって、ＩｇＧ２定常領域に基づく抗体Ｆｃドメインを含み、ＥＵ番号付け方式によって定義されるアミノ酸残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８が、ＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択される配列を含み、かつＥＵ番号付け方式によって定義される突然変異Ｈ２６８Ａ又はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを更に含む、Ｆｃ含有分子。
［１６］ ＩｇＧ２系Ｆｃ含有分子のＦｃγ受容体への結合を、野生型ＩｇＧ２系Ｆｃと比較して変化させる方法であって、ＥＵ番号付け方式によって定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７、及び２３８でのＩｇＧ２定常領域に基づくＦｃドメインの配列を、ＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ、及びＳＡＡＡＳから選択される配列を含み、かつ突然変異Ｈ２６８Ａ又はＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含むように、変化させる工程を含む、方法。
［１７］ 本明細書に記載されたいずれかの発明。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【手続補正書】

【提出日】2015年8月20日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

突然変異Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、およびＰ２３８Ａを含む突然変異したＦｃドメインを含み、野生型Ｆｃドメインを有するＦｃ含有分子と比較して少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する低下した結合を有する、単離したＦｃ含有分子。

【請求項2】

前記突然変異したＦｃドメインがＩｇＧ１であり、Ｌ２３４Ａ突然変異をさらに含む、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項3】

前記突然変異したＦｃドメインがＩｇＧ１であり、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ突然変異をさらに含む、請求項２に記載のＦｃ含有分子。

【請求項4】

前記Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、ヒトＦｃドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項３に記載のＦｃ含有分子。

【請求項5】

前記突然変異したＦｃドメインがＩｇＧ４であり、Ｆ２３４Ａ突然変異をさらに含む、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項6】

前記突然変異したＦｃドメインがＩｇＧ４であり、Ｓ２２８Ｐ突然変異をさらに含む、請求項５に記載のＦｃ含有分子。

【請求項7】

前記突然変異したＦｃドメインがＩｇＧ１であり、Ｑ２６８Ａ突然変異をさらに含む、請求項1に記載のＦｃ含有分子。

【請求項8】

突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む突然変異したＩｇＧ１領域を有する抗体Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項9】

突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、および場合によりＧ２３６欠損を含む突然変異したＩｇＧ４領域を有する抗体Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項10】

突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｑ２６８Ａ、および場合によりＧ２３６欠損を含む突然変異したＩｇＧ４領域を有する抗体Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項11】

少なくとも１つのＦｃγＲはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂである、請求項１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項12】

前記Ｆｃ含有分子は抗体、抗体断片、またはＦｃ領域である、請求項１１に記載のＦｃ含有分子。

【請求項13】

請求項１、８、および９のいずれかに記載のＦｃ含有分子をコードする、単離したポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項16】

野生型Ｆｃドメインを有するＦｃ含有分子と比較して少なくとも１つのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する低下した結合を有するＦｃ突然変異含有分子の作製方法であって、
前記Ｆｃ突然変異含有分子が発現される条件で請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程、および
前記発現されたＦｃ突然変異含有分子を浄化する工程、を含む、方法。

【請求項17】

ａ）標的分子に結合することができる結合ドメイン、および
ｂ）ｉ）突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む突然変異したＩｇＧ１定常ドメイン；または
ｉｉ）突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａおよび場合によりＧ２３６欠損を含む突然変異したＩｇＧ４定常ドメイン；
を含む単離した組換えポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは前記標的分子の著しい補体依存性溶解又は細胞媒介性破壊を引き起こすことなしに、前記標的分子に結合することができる、組換えポリペプチド。

【請求項18】

前記結合ドメインが、抗体、酵素、ホルモン、受容体の細胞外ドメイン、サイトカイン、免疫細胞表面抗原、リガンド、及び接着分子の結合部位からなる群から選択される、請求項１７に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記ＦｃドメインはヒトＦｃＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１８に記載のポリペプチド。

【請求項20】

前記結合ドメインは抗体の結合部位である、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項21】

前記結合ドメインは神経組織、内分泌組織、血管組織、心臓組織、滑膜組織、皮膚組織、または粘膜組織内の標的に特異的に結合する、請求項２０に記載のポリペプチド。

【請求項22】

請求項１に記載のＦｃ含有分子または請求項１７に記載のポリペプチドと医薬的に許容される添加剤とを含む医薬組成物。