特開 2015-33337 無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株を用いた組換えタンパク質の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-33337(P2015-33337A)

(43)【公開日】2015年2月19日

(54)【発明の名称】無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株を用いた組換えタンパク質の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150123BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20150123BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20150123BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12P21/02 C

   C12N5/00 102

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2013-164837(P2013-164837)

(22)【出願日】2013年8月8日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ｈｔｔｐ：／／ｂｅｎｔｈａｍｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｏｐｅｎ／ｔｏｂｉｏｔｊ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／Ｖ００７／１ＴＯＢＩＯＴＪ．ｐｄｆ （「Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，７，１−６」） 平成２５年２月２２日

(71)【出願人】

【識別番号】390023951

【氏名又は名称】極東製薬工業株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】301023238

【氏名又は名称】独立行政法人物質・材料研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100113402

【弁理士】

【氏名又は名称】前 直美

(74)【代理人】

【識別番号】100107799

【弁理士】

【氏名又は名称】岡田 希子

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 哲二

(72)【発明者】

【氏名】谷口 彰良

【テーマコード（参考）】

4B024

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B024AA11

4B024AA20

4B024BA80

4B024CA02

4B024DA02

4B024EA04

4B024FA02

4B024GA11

4B024HA03

4B064AG01

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4B064CC24

4B064CD09

4B064CD13

4B064DA01

4B064DA13

4B064DA16

4B065AA90Y

4B065AA91X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA23

4B065BB10

4B065BB12

4B065BB15

4B065BB19

4B065BC13

4B065CA24

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】 安全性の心配がなく、安定的に低コストで効率的に組換えタンパク質を製造する方法を提供する。
【解決手段】 外因性の増殖因子を含有しない無タンパク質・無脂質培地において浮遊状態で増殖可能であることを特徴とするチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株の細胞に、この細胞において作動しうるプロモーターの制御下にタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを導入した形質転換細胞を、外因性の増殖因子を含有しない無タンパク質・無脂質培地において培養する工程、及びこの細胞によって産生されたタンパク質を回収する工程を含むことを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

外因性の増殖因子を含有しない無タンパク質・無脂質培地において浮遊状態で増殖可能であることを特徴とするチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株の細胞に、この細胞において作動しうるプロモーターの制御下にタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを導入した形質転換細胞を、外因性の増殖因子を含有しない無タンパク質・無脂質培地において培養する工程、及びこの細胞によって産生されたタンパク質を回収する工程を含むことを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。

【請求項2】

細胞株が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６４１である、請求項１記載の方法。

【請求項3】

形質転換細胞の培養工程で用いる無タンパク質・無脂質培地が、通常の３〜５倍のグルコースを含有するＤＭＥＭ培地に、さらにプトレッシン、チミジン、ヒポキサンチン及びモノエタノールアミンを含有し、外因性の増殖因子を含有しないことを特徴とする培地である、請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

形質転換細胞の培養工程で用いる無タンパク質・無脂質培地が、２０００〜５０００ｍｇ／Ｌのグルコース、０．００１〜２ｍｇ／Ｌのプトレッシン、０．０１〜１ｍｇ／Ｌのチミジン、０．１〜１０ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン及び０．１〜５ｍｇ／Ｌのモノエタノールアミンを含有する無タンパク質・無脂質培地である、請求項３記載の方法。

【請求項5】

形質転換細胞の培養工程で用いる無タンパク質・無脂質培地が、１〜２０ｍｇ／Ｌのインスリン及び／又は０．１〜１０ｍｇ／ＬのガングリオシドＧＭ３をさらに含む無タンパク質・無脂質培地である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

形質転換細胞が、遺伝子導入前に、ＧＭ３及びインスリンを含有する無タンパク質・無脂質培地で培養されたものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

形質転換細胞が、遺伝子導入前に、ＧＭ３及びインスリンを含有する無タンパク質・無脂質培地で培養した後に、ＧＭ３を含有しない無タンパク質・無脂質培地において遺伝子導入を行うことにより形質転換されたものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、実質的にタンパク質及び脂質を含まない培地に適応した新規培養細胞株、その製造方法、その培養株を培養するための培地、及び遺伝子組換えタンパク質生産におけるその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

医薬品の市場におけるバイオ医薬品のシェアは急激に拡大している。中でも酵素、ホルモン、抗体、成長因子、血液凝固因子等などの遺伝子組換えタンパク質製剤の増大は顕著であり、これらの医薬品の安定供給のために安全、安価で効率の良い遺伝子組換えタンパク質生産系の確立が望まれている。

【0003】

遺伝子組換えタンパク質は、従来、生産性や効率の点から大腸菌などで作られていた。しかし、大腸菌の生産系ではタンパク質の高次構造の再現が難しく、糖鎖修飾等の翻訳後修飾ができないという欠点がある。そのため、活性に高次構造や翻訳後修飾が関与するようなサイトカイン、酵素、抗体医薬などを含む遺伝子組換えタンパク質製剤の多くは、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary；ＣＨＯ）細胞を用いて生産されている。

【0004】

ＣＨＯ細胞を用いる生産系においても問題点は存在する。近年まで、ＣＨＯ細胞の培養には血清や異種動物由来の生体物質が用いられてきた。しかし、血清や異種動物由来の生体物質は、動物起源のウイルスなどによる感染リスクや異種動物抗原によるアレルギーなどの安全性に関する問題をもたらす。また、ロット間差など、生体物質を用いることには安定性についての問題もある。そこで、血清などの生体物質を、化学合成や遺伝子組換え等で製造された成分に置き換えた完全合成培地も開発されている（非特許文献１：Sunstromら，２０００）。しかし、化学合成や遺伝子組換えによる成分、特に増殖因子は高価かつ不安定であり、産業的にはこれらの物質や増殖因子を加えずに培養できることが望ましい。

【0005】

ＣＨＯ細胞の培養からこれらの因子を排除する方法として、生体由来物質や増殖因子を全く含まない環境に、時間をかけて細胞を馴化させる培地馴化法がある。細胞は環境に適応する能力を持っており、最低限の必須栄養素のみの環境でも、時間をかけて適応させることが可能であるということは古くから報告されている（非特許文献２：Kagawaら，１９６９、非特許文献３：Kagawaら，１９７０）。タンパク質発現系ではＣＨＯ細胞に目的タンパク質のｃＤＮＡを組み込んだベクターを遺伝子導入して発現させる際、目的の遺伝子が組み込まれた細胞を選択するために、薬剤耐性遺伝子による形質転換が行われる。目的のタンパク質の遺伝子導入以外に余計な形質転換を行うと、選別する方法が限られてくるため、余計な遺伝子導入は行わないことが望ましい。培地馴化法では、細胞自身が環境に適応していくために、遺伝子導入などの余計な遺伝子的な改変操作を行う必要がない。その意味では、培地馴化法は目的遺伝子の導入に対して自由度の高い方法である。しかし、培地馴化法は時間と労力がかかる上に成功率が低く、生産性の高いＣＨＯ細胞株由来の馴化細胞を得ることは試みられてこなかった。

【0006】

さらに、ＣＨＯ細胞には別の問題もある。本来、ＣＨＯ細胞は接着性の細胞であり、産業向けの物質大量生産で用いられているバイオリアクター等のタンク培養による生産には不向きである。接着性の細胞は容器壁に接着して増殖するため、広い細胞接着面積が必要となる。この接着面積を確保するために、積層型ないしは中空糸型などの高密度培養装置や、マイクロキャリヤーのような付着性担体を用いることにより、培養装置の複雑化や生産コストの増大などの問題が生じる。また、細胞を浮遊化させるために担体や界面活性剤等の浮遊剤を用いることがある。担体は生産コストを押し上げる。一方、界面活性剤は細胞傷害性があり、細胞に対して毒性を示す場合もあるうえ、生産物の精製の際、不純物として除去する必要があり、精製の障害となることがある。したがって、このような浮遊剤を用いることなくＣＨＯ細胞を浮遊させることが望まれていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Sunstrom NA, Gay RD, Wong DC, Kitchen NA, DeBoer L, Gray PP. Insulin-Like Growth Factor-I and Transferrin Mediate Growth and Survival of Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol Prog., 2000; 16: 698-702.

【非特許文献2】Kagawa Y, Takaoka T, Katsuta H. Mitochondria of mouse fibroblasts, L-929, cultured in a lipid- and protein-free chemically defined medium. J Biochem., 1969; 65: 799-808.

【非特許文献3】Kagawa Y, Takaoka T, Katsuta H. Absence of essential fatty acids in mammalian cell strains cultured in lipid-and protein-free chemically defined synthetic media. J Biochem., 1970; 68: 133-6.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、安全性の心配がなく、安定的に遺伝子組換えタンパク質の生産に用いることができ、浮遊状態で増殖可能であり、低コストで培養可能なＣＨＯ由来細胞株、すなわち生体由来物質や高価で不安定な因子に依存せずに高増殖性の無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞株を提供することを課題とする。本発明は、さらに、無タンパク質・無脂質培地を用いたＣＨＯ細胞の培地馴化法、それらに使用される培地等を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は、培地馴化法を用いてタンパク質性の生体物質や増殖因子、脂質類を含まない無タンパク質・無脂質培地に馴化したＣＨＯ細胞株を樹立することに成功した。したがって、本発明は、以下のものを提供する。

【0010】

〔１〕 外因性の増殖因子を含有しない無タンパク質・無脂質培地において浮遊状態で増殖可能であることを特徴とするチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株の細胞に、この細胞において作動しうるプロモーターの制御下にタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを導入した形質転換細胞を、外因性の増殖因子を含有しない無タンパク質・無脂質培地において培養する工程、及びこの細胞によって産生されたタンパク質を回収する工程を含むことを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法；
〔２〕 細胞株が受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６４１である、前記〔１〕記載の方法；
〔３〕 形質転換細胞の培養工程で用いる無タンパク質・無脂質培地が、通常の３〜５倍のグルコースを含有するＤＭＥＭ培地に、さらにプトレッシン、チミジン、ヒポキサンチン及びモノエタノールアミンを含有し、外因性の増殖因子を含有しないことを特徴とする培地である、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法；
〔４〕 形質転換細胞の培養工程で用いる無タンパク質・無脂質培地が、２０００〜５０００ｍｇ／Ｌのグルコース、０．００１〜２ｍｇ／Ｌのプトレッシン、０．０１〜１ｍｇ／Ｌのチミジン、０．１〜１０ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン及び０．１〜５ｍｇ／Ｌのモノエタノールアミンを含有する無タンパク質・無脂質培地である、前記〔３〕記載の方法；
〔５〕 形質転換細胞の培養工程で用いる無タンパク質・無脂質培地が、１〜２０ｍｇ／Ｌのインスリン及び／又は０．１〜１０ｍｇ／ＬのガングリオシドＧＭ３をさらに含む無タンパク質・無脂質培地である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法；
〔６〕 形質転換細胞が、遺伝子導入前に、ＧＭ３及びインスリンを含有する無タンパク質・無脂質培地で培養されたものである、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法；
〔７〕 形質転換細胞が、遺伝子導入前に、ＧＭ３及びインスリンを含有する無タンパク質・無脂質培地で培養した後に、ＧＭ３を含有しない無タンパク質・無脂質培地において遺伝子導入を行うことにより形質転換されたものである、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明は、生体由来物質や高価で不安定な因子の添加に依存しないで浮遊増殖可能な無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞株を提供する。本発明の無タンパク質・無脂質培地による馴化細胞株は、界面活性剤などの浮遊剤を用いずに浮遊細胞用の一般的なスピン培養やバイオリアクター型高密度培養装置を使用して浮遊培養が可能である。さらに、細胞の浮遊形態は、細胞外マトリックス（Extracellular Matrix；ＥＣＭ）の欠乏が原因ではないこと、及び遺伝子変異を伴う不可逆的な形態変化ではないことがわかっている。したがって、本発明の馴化細胞株は、タンク培養による大量生産が可能な浮遊形態を持ち、かつ変異を伴わない安定な株であって、バイオ医薬品の生産系に求められる、安全で安定的な細胞株である。

【0012】

本発明の馴化細胞株は、細胞自らが産生している（すなわちオートクリン的な作用による）上皮成長因子（Epidermal Growth Factor；ＥＧＦ）に依存した増殖性を示し、外来の増殖因子の添加に依らずに増殖可能である。インスリン及び／又はＧＭ３ガングリオシドを培地に供給することで細胞膜の脂質ラフトの形成を誘導することにより、本発明の馴化細胞株は元株のＣＨＯ細胞と同程度以上の増殖性を示す。

【0013】

また、本発明の馴化細胞株は、元株のＣＨＯ細胞より優れた組換えタンパク質の産生効率を有する。したがって、本発明の馴化細胞株を使用することにより、所望の遺伝子組換えタンパク質を効率よく生産することが可能であり、バイオ医薬品の生産性を向上させることができる。本発明の馴化細胞株を用いることにより、バイオ医薬品をより安全、安価、安定的に生産することができる。

【0014】

本発明の馴化細胞の製造法は、特別な装置を必要とせず、再現性よく浮遊培養可能な馴化細胞を製造することができる。また、本発明の培地は、実質的に無タンパク・無脂質であり、安価で安定的に利用することができ、遺伝子組換えタンパク質を精製する際に障害となる余分な物質を含まないので有利である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、本発明の馴化細胞株の製造方法の手順を示す図である。パネルＡは、ＤＭＥＭ培地馴化細胞株、パネルＢは、ＮＰＬ培地馴化細胞株の製造方法をそれぞれ示す。

【図2】図２は、本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞の細胞形態を示す倒立位相差顕微鏡写真である（倍率１００倍）。パネルＡ：ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、パネルＢ：ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、パネルＣ：元株のＣＨＯ−Ｋ１細胞株。

【図3】図３は、本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞（ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞）の形態に対するＥＣＭの影響を示す倒立位相差顕微鏡写真である（倍率４０倍）。パネルＡ：無処理プレート、パネルＢ：フィブロネクチンコートプレート、パネルＣ：１型コラーゲンコートプレート、パネルＤ：アルブミンコートプレート。

【図4】図４は、本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞の形態に対する血清添加の影響を示す倒立位相差顕微鏡写真である（倍率４０倍）。パネルＡ：ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、パネルＢ：逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（３継代目）、パネルＣ：逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（２０継代目）、パネルＤ：ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、パネルＥ：逆馴化ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（２継代目）、パネルＦ：逆馴化ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（９継代目）、パネルＧ：元株のＣＨＯ細胞。

【図5】図５は、逆馴化培養法による細胞増殖率の復帰を表す図である。−○−：元株のＣＨＯ細胞、−×−：ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、−●−：逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（２５継代）。 数値は各群３ウェルの平均±ＳＤで示している。

【図6】図６は、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖に対する抗ＥＧＦ中和抗体による影響及びインスリンによる細胞増殖誘導を表す図である。−●−：インスリン添加、−○−：インスリン＋抗ＥＧＦ中和抗体（５ｍｇ／ｍＬ）添加。 数値は各群３ウェルの平均±ＳＤで示している。

【図7】図７は、インスリン添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞と元株のＣＨＯ細胞の増殖比較を表す図である。□：元株のＣＨＯ細胞、■：インスリン添加（１０ｍｇ／Ｌ）ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞。 数値は各群３ウェルの平均±ＳＤで示している。

【図8】図８は、ＥＧＦ／ＥＧＦＲのオートクリンループと抗ＥＧＦ抗体による増殖阻害を模式的に示す図である。

【図9】図９は、細胞膜及び脂質ラフトの構造を模式的に表す図である。

【図10】図１０は、ガングリオシドＧＭ３の添加による細胞形態への影響を示す倒立位相差顕微鏡写真である（倍率４０倍）。パネルＡ：ＧＭ３ ０ｎｇ／ｍＬ、パネルＢ：ＧＭ３ ２５０ｎｇ／ｍＬ、パネルＣ：ＧＭ３ １，２５０ｎｇ／ｍＬ、パネルＤ：ＧＭ３ ２，５００ｎｇ／ｍＬ。

【図11】図１１は、ガングリオシドＧＭ３の添加量による細胞増殖に対する影響を表す図である。 数値は各群３ウェルの平均±ＳＤで示している。

【図12】図１２は、インスリン及びＧＭ３添加ＮＰＬ培地で培養したＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞及び血清添加培地で培養した元株のＣＨＯ細胞の増殖性比較を表す図である。−○−：インスリン＋ＧＭ３添加ＮＰＬ培地で培養したＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、−●−：血清添加培地で培養した元株のＣＨＯ細胞。 数値は各群３ウェルの平均±ＳＤで示している。

【図13】図１３は、ＧＭ３添加による脂質ラフト形成の誘導の概念を模式的に表す図である。

【図14】図１４は、トランジェント法による元株のＣＨＯ細胞及び馴化細胞株の組換えタンパク質生産性比較実験のフローを示す模式図である。

【図15】図１５は、NanoLuc reporter vector pNL1.3.CMVのベクターマップである。

【図16】図１６は、元株のＣＨＯ細胞に対する、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、ＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞及びＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞のルシフェラーゼ比活性の比較を示す図である。−▲−：ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、−○−：ＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、−●−：ＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞。 数値は３回の実験の全実験群のルシフェラーゼ比活性の平均±ＳＤで示している。

【図17】図１７は、ＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、ＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及び元株のＣＨＯ細胞における、細胞当たりのルシフェラーゼ活性の推定値の比較を示す図である。−●−：ＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、−○−：ＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、−△−：ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、及び−×−：元株のＣＨＯ細胞。 数値は図１６で測定した各細胞の発光量を、同一培地、培養条件で培養した場合の同細胞の経時的な細胞数で割った値で、平均±ＳＤで示している。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本明細書及び特許請求の範囲において、以下の用語は、それぞれ以下に定義された意義を有するものとする。樹立細胞株とは、同一の細胞播種密度で継代した場合、３継代以上に渡って増殖速度、細胞継代に変化がないことを確認された細胞株と定義する。無タンパク質・無脂質培地とは、その組成にタンパク質及び脂質の一方又は両方、あるいはタンパク質及び脂質の一方又は両方を含む添加物（たとえば血清、組織抽出液など）が積極的に添加されていない、実質的にタンパク質及び脂質を含まない培地を意味し、添加成分の不純物又は混入物として存在する微量のタンパク質又は脂質の存在は許容される。増殖因子とは、特定の細胞に対して増殖を促進する分子量８ｋＤを超えるサイトカインを意味し、上皮成長因子（Epidermal growth factor：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Insulin-like growth factor：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor：ＴＧＦ）、神経成長因子（Nerve growth factor：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Vesicular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Erythropoietin：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Thrombopoietin：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor：ＨＧＦ）を含む。

【0017】

ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変（又は変法）イーグル培地（Dulbecco's medified Eagle's medium））とは、イーグル最少必須培地（Eagle, Science 1959 Aug 21;130(3373):432-7）をダルベッコが改変した組成(Dulbecco, Virology 1959 July; 8(3):396-7)を有する、哺乳動物細胞用の合成培地であり、このダルベッコの組成を基本とするものである限りにおいて、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド、ピルビン酸等の成分の含有の有無又は含量の異なるものをも包含する。但し、タンパク質又は脂質を添加してなるものを含まない。

【0018】

１．無タンパク質・無脂質培地
本発明の無タンパク質・無脂質培地は、ＤＭＥＭ培地を改変したものである。ＤＭＥＭ培地は、元株のＣＨＯ細胞が血清添加ＤＭＥＭ培地で長期間継代されているため、元株のＣＨＯ細胞はＤＭＥＭ培地の培地組成に適応しており、容易に馴化できる可能性が高いと考えられたため、これを基本の培地として使用した。

【0019】

本発明の無タンパク質・無脂質培地（Non-Protein, Non-Lipid Medium；ＮＰＬ培地）は、ＤＭＥＭ培地をベースに、細胞の増殖性などを改善するために設計した。ＤＭＥＭ培地に血清を添加しないことによって起きる栄養成分の低下、特に非必須成分は代謝による合成で補充されるものの、合成までのタイムラグ等による細胞増殖の低下を起こす可能性がある。そのため、ＮＰＬ培地の組成としては、ＤＭＥＭには含まれない非必須アミノ酸類（１〜１００ｍｇ／Ｌの範囲のアラニン（望ましくは１〜５０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは１０ｍｇ／Ｌ）、５〜１００ｍｇ／Ｌの範囲のアスパラギン（望ましくは２０〜８０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは５０ｍｇ／Ｌ）、５〜１００ｍｇ／Ｌの範囲のアスパラギン酸（望ましくは５〜５０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは２５ｍｇ／Ｌ）、５〜１００ｍｇ／Ｌの範囲のシステイン（望ましくは５〜５０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは２０ｍｇ／Ｌ）、１〜２５０ｍｇ／Ｌの範囲のグルタミン酸（望ましくは１００〜２５０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは２００ｍｇ／Ｌ）、１〜１００ｍｇ／Ｌの範囲のフェニルアラニン（望ましくは４０〜１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは７０ｍｇ／Ｌ）、１０〜１００ｍｇ／Ｌの範囲のプロリン（望ましくは５０〜１００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは１００ｍｇ／Ｌ）、無機塩類（０．１〜１０ｍｇ／Ｌの範囲の硫酸亜鉛（７水和物）（望ましくは０．５〜５ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは２ｍｇ／Ｌ）、０．００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム（望ましくは０．００１〜０．００８ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは０．００４ｍｇ／Ｌ）、０．０００１〜０．００５ｍｇ／Ｌの範囲の硫酸銅（II）５水和物（望ましくは０．０００１〜０．００３ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは０．００２ｍｇ／Ｌ）、ビタミンとして０．００１〜１ｍｇ／Ｌの範囲のビオチン（望ましくは０．００５〜０．５ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ及び０．０１〜２ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２（望ましくは０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ）、核酸前駆体として０．０１〜１ｍｇ／Ｌの範囲のチミジン（望ましくは０．０５〜０．８ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは０．７ｍｇ／Ｌ）、０．１〜１０ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン（望ましくは０．５〜７ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは４ｍｇ／Ｌ）、さらに０．０００１〜２ｍｇ／Ｌの範囲のプトレッシン（望ましくは０．００１〜１ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは０．２ｍｇ／Ｌ）、０．１〜５ｍｇ／Ｌの範囲のモノエタノールアミン（望ましくは０．５〜３ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは１．５ｍｇ／Ｌ）をＤＭＥＭの組成に加え、グルコースをＤＭＥＭの２〜５倍量（２０００〜５０００ｍｇ／Ｌ）とした。

【0020】

なお、タンパク質又は脂質以外であれば、その他の低分子化合物を添加してもよい。培地は、最終的に使用時の浸透圧が２００〜４００ｍＯｓｍｌ／ｋｇの範囲（望ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍｌ／ｋｇの範囲）になるように調整する。

【0021】

本発明のＮＰＬ培地には、さらに、１〜２０ｍｇ／Ｌのインスリン（望ましくは１〜１５ｍｇ／Ｌ）、及び／又は０．１〜１０ｍｇ／Ｌ（望ましくは１〜５ｍｇ／Ｌ）のガングリオシドＧＭ３（１−Ｏ−［４−Ｏ−（３−Ｏ−α−ノイラミノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］セラミド）：

【0022】

【化1】

【0023】

を添加してもよい。これらの一方又は両方を添加することにより、細胞の増殖速度を促進し、又は馴化期間を短縮することができる。

【0024】

本発明のＮＰＬ培地は、使用時に溶解又は希釈することにより上記の組成を有する水溶液となるように、予め上記含有成分の一部又は全部を配合した乾燥組成物又は濃縮液を調製しておくことができる。このような組成物を使用することにより、使用時に簡便に本発明のＮＰＬ培地を調製することができる。

【0025】

２．ＣＨＯ馴化細胞株の樹立方法
元株のＣＨＯ細胞は、市販のものを入手して使用することができる。通常、血清を添加した培地で維持培養されているＣＨＯ細胞を、次第に血清の添加量を低下させながら継代培養し、最終的には血清及び増殖因子を含まない培地で安定的に増殖するようになるまで馴化させる。この馴化の過程において使用する培地としては、ＤＭＥＭ培地等の標準的な培地を用いることができるが、無血清状態での安定的な増殖性を得るために、本発明のＮＰＬ培地を使用することが好ましい。また、インスリン及び／又はＧＭ３を添加したＮＰＬ培地は、より短期間で馴化させることができるので、好ましい。

【0026】

樹立された馴化細胞株は、静置培養において浮遊状態で安定増殖する能力を獲得している。したがって、本発明の馴化細胞株は、担体又は浮遊させるための薬剤等を使用せずに、スピナーやタンクで容易かつ大量に浮遊培養することができる。

【0027】

このようにしてＮＰＬ培地を用いて樹立されたＣＨＯ馴化細胞株は、「ＮＰＬＡｄ００１」として２０１３年６月２８日に、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６４１が付与された。

【0028】

３．組換えタンパク質の生産方法
本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株は、所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、組換えタンパク質の生産に使用することができる。導入遺伝子を担持するベクターの製造法及び遺伝子導入法は、ＣＨＯ細胞に適用可能な方法であれば特に制限はなく、当該技術分野で用いられている方法を使用することができる。本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株は、大容量の浮遊系で培養することができ、ＣＨＯ細胞と比較して数倍のタンパク質生産性を有するので、トランジェント法でも十分に生産量を確保できる。組換えタンパク質を生産する場合、培地としては、ＤＭＥＭ、ＮＰＬなどの任意の無タンパク質・無脂質培地培地を使用することができるが、トランスフェクション前の培養において、ＧＭ３及び／又はインスリンを添加して培養し、トランスフェクションを行う際にはＧＭ３を含まない培地中で行うことにより、効率的に組換えタンパク質生産を行うことができる。

【0029】

本発明の方法により製造される組換えタンパク質は、ＣＨＯ細胞で生産可能なものであれば特に制限はないが、たとえば、ティッシュプラスミノーゲンアクティベーター、酵素類（例としてグルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、尿酸オキシダーゼ、ＤＮＡ分解酵素等がある）、血液凝固第ＩＸ因子、トロンボモデュリン、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、エリスロポエチン、抗体類（例として抗ＣＤ２０抗体、抗ＩＬ６受容体抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、ＴＮＦα抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＣＣＲ４抗体等がある。）などがある。生産された組換えタンパク質は、タンパク質の特徴に応じて当該技術分野で用いられている任意の方法を使用することにより、本発明の細胞又は培地から回収し、精製することができる。

【実施例】

【0030】

１． 培地馴化法による無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞株の樹立
以下のようにして、培地馴化法を用い、２種類のＣＨＯ細胞株を樹立した。

【0031】

（１）細胞
培地馴化法のために用いたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、欧州細胞カルチャーコレクション（European Collection of Cell Cultures；ＥＣＡＣＣ）より購入した。この細胞は、１０％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル（Dulbecco’s Modified Eagle’s MEM；ＤＭＥＭ）培地（極東製薬工業）で維持培養を行った。

【0032】

（２）培地
ＣＨＯ細胞に培地馴化法を試みるに当って、培地としては、表１に示すＤＭＥＭ培地（極東製薬工業）及びＮＰＬ培地を使用した。

【0033】

各培地は、それぞれの所定の最終濃度になるように所定の成分を蒸留水に溶解し、ろ過滅菌することにより調製した。

【0034】

【表1】

【0035】

（３）培地馴化法
（３−１）ＤＭＥＭ培地による馴化
ＤＭＥＭ培地による馴化は次の手順に従った（図１、パネルＡ）。まず、元株細胞の維持培地である１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地から、血清濃度が３％になるまで、順次、血清濃度を下げて約１週間培養を行った。さらに１ヶ月の間、１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養を継続した。細胞増殖性が安定するまで１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養を行い、安定した段階で血清の添加を止めて培養した。

【0036】

無血清のＤＭＥＭ培地による培養で細胞の増殖が著しく悪くなった場合には、再度１％の血清を添加して、状態が回復するまで培養を行い、安定した段階で再度、無血清化を試みた。最終的には無血清状態で安定的に培養ができるまでこの操作を繰り返した。この間の培養はすべて３７℃、５％ＣＯ₂条件で行った。

【0037】

ＤＭＥＭ培地によって馴化した細胞株を「ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞」と名付けた。ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞は、馴化後３０継代以上経過したものを以下の実験において用いた。

【0038】

なお、馴化による株細胞の定義としては、増殖速度が安定した段階で、生存率９０％以上の細胞を１０万個／ｍＬの細胞密度で２５ｃｍ²のカルチャーフラスコに播種し、３継代以上、増殖速度と細胞形態が変化しないことを持って馴化株とした。

【0039】

（３−２）ＮＰＬ培地による馴化
ＮＰＬ培地による馴化は次の手順に従った（図１、パネルＢ）。まず、元株細胞の維持培地である１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地から、血清濃度が３％になるまで、順次、血清濃度を下げてＤＭＥＭ培地で約１週間培養を行った。さらに２週間の間、１％ＦＢＳ添加ＮＰＬ培地に移し替えて培養を継続した。細胞増殖性が安定するまで１％ＦＢＳ添加ＮＰＬ培地で培養を行い、安定した段階で血清の添加を止めて培養した。

【0040】

無血清のＮＰＬ培地による培養で細胞の増殖が著しく悪くなった場合には、再度１％の血清を添加して、状態が回復するまで培養を行い、安定した段階で再度、無血清化を試みた。最終的には無血清状態で安定的に培養ができるまでこの操作を繰り返した。この間の培養はすべて３７℃、５％ＣＯ₂条件で行った。ＮＰＬ培地によって馴化した細胞株を「ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞」と名付けた。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は馴化後２００継代以上経過したものを以下の実験において用いた。

【0041】

（４）結果
ＤＭＥＭ培地及びＮＰＬ培地のいずれを用いた場合も、馴化細胞株を樹立することができた。樹立した馴化株の細胞と元株の細胞の形態を図２に示す。継代培養中のＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＡ）及びＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＢ）、ならびに元株のＣＨＯ−Ｋ１細胞株（パネルＣ）を、倒立位相差顕微鏡で観察した（倍率１００倍）。元株であるＣＨＯ細胞は敷石状に増殖するのに対して（パネルＣ）、無タンパク質・無脂質培地に馴化したＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＢ）及びＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＡ）は、単一で又は集塊状に浮遊していた。通常、ＣＨＯ細胞の浮遊化には振とうや、界面活性剤などの浮遊剤の添加が必要であるが、馴化株の細胞はこのような操作を加えなくとも集塊状に浮遊培養することができた。

【0042】

ＣＨＯ細胞は血清より供給される脂質類、増殖因子が増殖に必要であるとされているが、馴化細胞は、馴化の過程においてこのような物質を自己生産できるようになったものと考えられる。さらに２株の馴化細胞株は共に元株のＣＨＯ細胞と異なり、何ら浮遊状態にする処理を加えていないのにもかかわらず、集塊状の浮遊状態へと形質が変化し、浮遊剤等なしに浮遊状態で増殖可能となった。

【0043】

本発明の馴化細胞株の増殖速度は、上記のようにフラスコ中で静置培養した場合、元株のＣＨＯ細胞より若干劣っていた。ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞は１週間〜１０日でコンフルエントになったのに対して、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は５日でコンフルエントになり継代が必要となった。したがって、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖速度はＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞と比較して速い。元株のＣＨＯ細胞の継代間隔は３〜４日間であるから、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞のいずれも、元株と比較すると増殖速度はやや遅くなっていた。

【0044】

これは、無タンパク質・無脂質培地馴化株は細胞の増殖に自己増殖因子のみに依存しているため、自己増殖因子以外の因子が不足している可能性や、長期間のタンパク質及び／又は脂質の欠損状態による細胞機能の低下など、幾つかの原因が考えられる。しかし、スピン培養法やバイオリアクター型の培養装置は効率的に栄養成分の交換や酸素供給などができるため、静置培養と比較して増殖速度が早いとされており、また、静置培養と比較して高細胞密度で培養することが可能である。したがって、この程度の細胞増殖速度の違いは培養法の選択や改良で十分補うことができると考えられる。

【0045】

上記で樹立したＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、ＮＰＬＡｄ００１として、２０１３年６月２８日に、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６４１が付与された。

【0046】

２． 無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞の接着性に関する検討
一般的に血清を用いて培養されている接着系細胞では、自らが出しているインテグリンなどの細胞接着因子でフィブロネクチンなどの血清中のＥＣＭを介して結合することで培養器壁に接着する。馴化細胞の培養形態が接着性から浮遊形態に至った原因は、無タンパク質・無脂質培地からＥＣＭが供給されていないことである可能性がある。そこで、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン等のＥＣＭ及びアルブミンでコートしたプレートにＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を播種、培養することにより、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞が接着形態に戻るかを観察した。

【0047】

（１）培養基質
以下の培養基質を用いた：（1）フィブロネクチンコート２４ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製、「フィブロネクチンコート２４ウェルプレート」）、（2）Ｉ型コラーゲンコート２４ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製、「Ｉ型コラーゲンコート２４ウェルプレート」）、（3）アルブミンコート２４ウェルプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製の２４ウェルプレートに、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin；ＢＳＡ）／リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline；ＰＢＳ）１ｍＬを注入して３７℃で２時間インキュベート後、２回ＰＢＳでリンスして余分なＢＳＡを洗い流し、クリーンベンチ内で無菌乾燥したもの）、及び（4）無処理プレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製の２４ウェルプレート）。

【0048】

（２）実験方法
細胞はＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を用い、培地はＮＰＬ培地を使用した。ＮＰＬ培地で維持しているＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を、ＮＰＬ培地で２回洗浄した。洗浄後、ＮＰＬ培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。生存率が９０％以上であることが確認した後、ＮＰＬ培地で５万個／ｍＬになるように細胞数を調整し、フィブロネクチンコート２４ウェルプレート、Ｉ型コラーゲンコート２４ウェルプレート、アルブミンコート２４ウェルプレート及び無処理の２４ウェルプレートに、１ｍＬ／ウェルの量で播種した。

【0049】

播種したプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件で５日間培養し、培養中の各細胞の接着の有無を倒立位相差顕微鏡下で観察した（倍率４０倍）。

【0050】

（３）結果
各プレートで培養５日目の細胞形態を図３に示す。細胞の形態は、フィブロネクチンコートプレート（パネルＢ）、Ｉ型コラーゲンコートプレート（パネルＣ）及びアルブミンコートプレート（パネルＤ）のいずれも、無処理のプレート（パネルＡ）と同様に集塊状の形態を示し、接着せずに浮遊しており、差は見られなかった。細胞が一度培養基に接着し、その後コンフルエントになって培養基から細胞が剥離している可能性も否定できなかったので、継続的な観察を行なった。しかし、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は培養初期から培養基に接着することなく、増殖していることが観察された。以上の結果から、馴化細胞株の浮遊化はＥＣＭの不足によるものではないと考えられた。

【0051】

馴化細胞における接着性の消失がＥＣＭの欠乏に起因するものではない場合、インテグリンなどの細胞接着因子の形成不良が考えられる。次に考えられることは細胞膜構造の変化である。リン脂質を含む脂質類は、糖から生合成されるもののほか、血液中の担体タンパク質であるアルブミンを介して細胞内に取り込まれて細胞膜などで利用される。馴化細胞株の場合、長期間の脂質欠損により細胞膜構造が変化し、このことが細胞の接着性に影響を与えた可能性が考えられる。

【0052】

３． 無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞の形質変化の可逆性の検証
元株のＣＨＯ細胞は、無タンパク質・無脂質培地では増殖することができないが、馴化細胞株は、培地に馴化したことにより貧栄養状態でも増殖することが可能になっている。この形質の変化は、ある遺伝子変異により増殖可能になったクローンの細胞が培養に伴ってドミナントになり形質が変化したためである可能性がある。ＣＨＯ細胞の形質変化が遺伝子変異によるものならば、遺伝子のポイント変異、染色体の一部脱落による遺伝子の欠失や染色体の欠損等で予測できない形質転換を伴う可能性があり、細胞機能そのものに障害が起こる場合も考えられる。そのような細胞は生産系の細胞として安定性が保証されない。さらに、同じ手法を用いても同様の性質を持つ株が得られるとは限らず、培地馴化法の再現性も保証されないことになる。そこで、樹立した馴化細胞株の形質変化は遺伝子変異を伴っているかを検証するため、この形質変化が可逆的であるか、すなわち馴化細胞株を再度血清添加の培地に戻し、元株のＣＨＯ細胞と同様な形態、増殖速度に戻るかを検討した。

【0053】

（１）実験方法
（１−１）ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の逆馴化培養
細胞は樹立後３０継代を越えたＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞、及び樹立後２８０継代を越えたＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を用い、培地は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を使用した。

【0054】

ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及びＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞をＤＭＥＭで２回洗浄後、ＤＭＥＭ培地で懸濁して細胞集塊を分散させた後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。その後、１０万個／ｍＬの細胞数になるように１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いて希釈した。この細胞希釈液を２５ｃｍ²のカルチャーフラスコに５ｍＬ播種し、３７℃、５％ＣＯ₂条件で培養を行った。コンフルエントになった段階で、同様の手順で継代培養を行った。

【0055】

細胞が接着していた場合には、浮遊していた細胞を回収後に、トリプシンを用いて細胞を剥離、分散した。特定の傾向を持つ細胞を選択しないようにするため、細胞の再播種には浮遊細胞と接着細胞を混合して用いた。この逆馴化培養を経たＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及びＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を、それぞれ逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及び逆馴化ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞と名付けた。

【0056】

（１−２）逆馴化細胞株の増殖率測定
元株のＣＨＯ細胞、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及び逆馴化培養を２５継代以上した逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞を用いた。培地は、元株のＣＨＯ細胞及び逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞には１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞にはＤＭＥＭを用いた。

【0057】

元株のＣＨＯ細胞及び逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞は接着しているので、トリプシンで剥離、分散させ、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞はＤＭＥＭ培地で懸濁し細胞集塊を解した後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。

【0058】

元株のＣＨＯ細胞、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及び逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞は各々の継代培地で５万個／ｍＬの細胞数になるように希釈し、すべての細胞を２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルの量で播種した。播種したプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件で７日間培養し、一定期間毎に細胞数を改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞及び逆馴化ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞についても同様に培養し、生存率を算定した。

【0059】

（２）結果
元株のＣＨＯ細胞、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及びＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞、血清入りＤＭＥＭ培地で逆馴化培養した逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及び逆馴化ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の形態を図４に示す。細胞形態の変化を、倒立位相差顕微鏡にて倍率４０倍で観測した。逆馴化培養を開始したＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及びＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、培地に血清を加えて培養を開始した直後から、一部に接着した細胞が観察された。継代培養を継続することで接着性の細胞形態へと移行し、３継代目逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＢ）及び２継代目逆馴化ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＥ）では接着形態と球状の浮遊形態の細胞が混在した。２０継代目の逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＣ）、９継代目逆馴化ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（パネルＦ）は、元株のＣＨＯ細胞（パネルＧ）と比較して形態的な差異は見られなかった。

【0060】

それぞれの細胞の増殖率を図５に示す。逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（‐●‐）及び元株のＣＨＯ細胞（‐○‐）はＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（‐×‐）よりも細胞増殖率が高く、ほぼ匹敵する細胞増殖率を示した。逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞と元株のＣＨＯ細胞は、培養３日目までの立ち上がりは増殖率が一致しており、培養７日目では僅かに逆馴化ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖が良好であるが、有意な差はなかった。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞においても同様の結果が得られた（データ未記載）。

【0061】

樹立した無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞株の形質の変化は可逆的なものであり、血清を加えて培養することで元株のＣＨＯ細胞と同等の細胞形態及び増殖性に戻すことが可能であった。使用したＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞株及びＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、それぞれ樹立後３０継代及び樹立後２８０継代を越えたものであり、この形質の変化が長期間継代培養しても固定化されることがないことが確認できた。さらには、４００継代を過ぎたＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞においても血清添加による逆馴化により元株の形態に戻ることが確認された（データ未記載）。このことから樹立した無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞株の形質の変化は、遺伝子の変異を伴う不可逆な変化ではないものと考えられる。

【0062】

本発明の馴化細胞株は、遺伝子変異を伴っておらず、偶然に得た形質である可能性が低く、本発明の方法により同様の形質の細胞株を再現性よく樹立することができると考えられる。したがって、本発明の馴化細胞及びその製造方法は、組換えタンパク質、さらにはバイオ医薬品の生産における安全性や生産性の点で重要な、遺伝子変異による想定できない形質の変化無しに望ましい形質を実現したものであり、安定的なバイオ医薬品の生産のための細胞株及びそれを作り出す方法として有用である。

【0063】

４． 無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞の細胞増殖因子に対する反応性
産業用途に用いられる細胞株では高増殖能、高物質産生能が求められる。本発明の馴化細胞株の細胞増殖速度を向上させるために、細胞増殖因子に対する応答性を検討した。

【0064】

一般的に、ＣＨＯ細胞は培地中の血清や生体成分中から供給される増殖因子に依存して増殖しているとされているが、馴化培養に用いた無タンパク質・無脂質培地は血清や生体成分を全く含んでいないので、培地からこれらの増殖因子は供給されない。そのため、馴化細胞株はオートクリン的に増殖因子を産生し、増殖していると考えられる。また、馴化細胞は無タンパク質・無脂質培地によって馴化されてきた長期間の脂質の欠損状態により、膜構造の変化が起きている可能性がある。したがって、馴化細胞株の増殖能は、細胞の増殖因子の発現を増大させるか、あるいは、膜構造を正常化し増殖因子のシグナルを十分に受け取るようにすることで改善できる可能性が考えられる。

【0065】

そこでまず、馴化細胞株におけるオートクリン因子の関与を検討するため、中和抗体による増殖因子の受容体への阻止試験を行った。馴化株のオートクリン因子としてはＥＧＦに着目した。これはＣＨＯ細胞を含む多くの上皮系細胞でＥＧＦが増殖因子として働いているとの報告があるためである（Fisherら，Mead Johnson Symp Perinat Dev Med., 1988; 33-40.）。そこで、抗ＥＧＦ中和抗体によってＥＧＦが受容体に結合することを阻害することで増殖が制御されるかを検討した。ＥＧＦ中和抗体によって増殖性が阻害されるならば、ＥＧＦがオートクリン因子として馴化株の増殖に関与していると判断できる。

【0066】

次に、馴化細胞株のさらなる増殖を誘導するためエンドクリン因子の添加を考えた。エンドクリン因子としてはインスリンに着目した。インスリンは膵臓のランゲルハンス島のβ細胞によって産生される典型的なエンドクリン因子であり、多くの細胞にとって不可欠な成長因子であり、ＣＨＯ細胞にとってもインスリンが増殖に寄与するという報告がある（Chunら，Biotechnol Prog., 2003; 19: 52-7.）。

【0067】

インスリンは、増殖因子であると同時に糖尿病の治療薬として１９２２年に製品化されている（Rosenfeld，Clin Chem., 2002; 2270-88.）。遺伝子組換え医薬品としては最も古くからあるものの１つであり、他のタンパク質性の増殖因子より安定性が高く、生産量が多いため他の遺伝子組換えの増殖因子と比較して安価である。これらの理由から本検討においてインスリンを使用した。

【0068】

（１）抗ＥＧＦ中和抗体によるＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖の影響及びインスリンによる細胞増殖誘導
抗ＥＧＦ中和抗体（R&D Systems, Inc.）及び遺伝子組換えインスリン（Sigma-Aldrich）は市販のものを使用した。

【0069】

細胞はＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を、培地はＮＰＬ培地を用いた。ＮＰＬ培地で維持しているＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を、ＮＰＬ培地で２回洗浄した。洗浄後、ＮＰＬ培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。生存率が９０％以上であることを確認した後、ＮＰＬ培地で５万個／ｍＬになるように細胞数を調整し、２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルの量で播種した。細胞を播種したウェルの半数に抗ＥＧＦ中和抗体を５ｍｇ／ｍＬになるように加えた。

【0070】

抗ＥＧＦ中和抗体添加又は不添加の細胞播種ウェルに、各々インスリンを０、１、２、５、又は１０ｍｇ／Ｌになるように加えた。播種したプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件で５日間培養し、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。

【0071】

（２）インスリン添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞と元株のＣＨＯ細胞の増殖比較
元株のＣＨＯ細胞及びＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を用いた。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞には１０ｍｇ／Ｌのインスリン（Sigma-Aldrich）を添加したＮＰＬ培地を用いた。また、元株のＣＨＯ細胞には１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。

【0072】

元株のＣＨＯ細胞は接着細胞なので、トリプシンで剥離、分散させ、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。

【0073】

元株のＣＨＯ細胞は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞はインスリン添加ＮＰＬ培地で、それぞれ５万個／ｍＬの細胞数に希釈し、すべての細胞を２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルの量で播種した。播種したプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件で５日間培養し、細胞数を改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。細胞数の有意差検定にはスチューデントのｔ検定を用いた。

【0074】

（３）結果
ＥＧＦ、及びＣＨＯ細胞に対して増殖誘導の効果があるとされているインスリンが馴化細胞の増殖に与える影響を検討した。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の培養５日目のインスリン濃度依存的細胞増殖を図６に示す。

【0075】

ＮＰＬ培地に抗ＥＧＦ中和抗体を添加した場合（−○−）、インスリンの添加濃度に関係なくＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖が抑制された。特に、インスリンを不添加で、抗ＥＧＦ中和抗体を添加した場合、その細胞数（−●−のインスリン濃度０ｍｇ／Ｌ）は２３．５万個／ｍＬであるのに対して、インスリンを不添加で、抗ＥＧＦ中和抗体を加えた場合の細胞数（−○−のインスリン濃度０ｍｇ／Ｌ）は１５．５万個／ｍＬであり、約３５％増殖が抑制された。この結果は、インスリンの有無に関係なく、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖はＥＧＦに依存していることを示している。また、ＮＰＬ培地はＥＧＦを含んでいないので、抗ＥＧＦ中和抗体によって受容体への結合が阻害されたＥＧＦは、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞自身が産生したもの、いわゆるオートクリン増殖因子であることが示唆された。しかし、抗ＥＧＦ中和抗体によって結合を阻害しても、細胞播種数（５万個／ｍＬ）に対して、培養５日目で３倍程度の細胞増加が見られることから、ＥＧＦ以外のオートクリン因子が増殖に関与することが考えられる。

【0076】

ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞はインスリンの濃度依存的に増殖した（−●−）。細胞数は、インスリン濃度が２ｍｇ／Ｌでは４０万個／ｍＬ、１０ｍｇ／Ｌでは５３万個／ｍＬとなり、インスリン不添加の細胞数に対して１０ｍｇ／Ｌの濃度で２倍以上の細胞の増加が見られた。インスリンを添加することによって元株のＣＨＯ細胞と比較してどの程度まで増殖が増大するのかを検証した。その結果、培養５日目で１０ｍｇ／Ｌのインスリンを添加したＮＰＬ培地を用いたＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞では５５万個／ｍＬ程度まで増大したが、元株のＣＨＯ細胞の細胞数は８０万個／ｍＬを超えていた（Ｐ＜０．００５）（図７）。この結果から、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖速度はＮＰＬ培地にインスリンを添加しただけでは元株のＣＨＯ細胞の増殖速度には及ばないことが示唆されたものの、インスリンの濃度依存的にＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖を誘導する効果が確認できた。

【0077】

以上のとおり、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞株は、パラクリン因子であるインスリンの添加濃度に依存的に細胞増殖性が上がることを見出し、更に培地にＥＧＦを添加していないにもかかわらず、ＥＧＦ中和抗体によって細胞の増殖が抑制されることが見出された。また、インスリン刺激によって誘導される細胞増殖においても、ＥＧＦを中和抗体で阻害することで細胞増殖が抑制される事も明らかになった。培地にＥＧＦを添加していないので、ＥＧＦ中和抗体によって受容体への結合が中和されたＥＧＦは馴化細胞株自身から産生されているオートクリンの増殖因子であり、ＥＧＦ−ＥＧＦ受容体のオートクリンループをなして自己の増殖を誘導しているものと考えられる。

【0078】

ＥＧＦは５３アミノ酸残基より成る６，０４５Ｄａの分子量を持つタンパク質であり、細胞表面に存在するＥＧＦ受容体に結合して細胞の増殖を制御している。上皮系細胞を含む様々な細胞においてオートクリン増殖因子としてＥＧＦ−ＥＧＦ受容体のオートクリンループをなして自己の増殖を誘導していると報告されている（Shvartsmanら，Am J Physiol Cell Physiol., 2002; 282: C545-59；DeWittら，J Cell Sci., 2001; 114: 2301-13.）。ＥＧＦを含むＥＧＦファミリーの増殖因子は最初から分泌型として合成されるのではなく、細胞内で前駆体として発現される。翻訳後、膜を貫通して細胞表面に出てきた後、細胞表面でプロテアーゼによって切断されて、分泌型の増殖因子になるとされている。図８に示すように、細胞内で生成されたＥＧＦは細胞膜に埋め込まれた膜貫通タンパク質として細胞表面に存在（膜結合型ＥＧＦ）する。プロテアーゼに切断されると、細胞外ドメインが遊離し、分泌型ＥＧＦとなってＥＧＦ受容体に結合する。ＥＧＦ受容体に分泌型ＥＧＦが結合することにより、ＥＧＦ受容体の膜貫通ドメインを介して細胞内へシグナル伝達が行われ、細胞増殖が誘導される。本検討で用いた抗ＥＧＦ中和抗体はＥＧＦに直接結合して受容体への結合を阻害するので、抗ＥＧＦ中和抗体によって馴化細胞株の細胞増殖の抑制が生じたのは、受容体からの増殖シグナルの伝達が行われなくなったためと推察される（図８）。さらに、本発明の馴化細胞株におけるＥＧＦ中和抗体の増殖抑制は自己の増殖のみではなく、パラクリン増殖因子であるインスリンによる増殖も抑制している。したがって、馴化細胞株においてＥＧＦのオートクリンな産生は自己の増殖のために非常に重要で要素である。

【0079】

以上のように、馴化細胞株にとってはＥＧＦのシグナル伝達が細胞増殖にとって重要であると考えられた。そこで、以後の検討ではＥＧＦのシグナル伝達効率を上げることで馴化細胞株の増殖速度を促進できないかを検討した。

【0080】

なお、ＥＧＦ以外のオートクリン因子のうち、ＩＧＦ−１（Insulin-like Growth Factor-1）はＣＨＯ細胞の増殖を誘導するとの報告がある（Ｐａｋら，Cytotechnology, 1996; 22: 139-46.）。そこで、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞では抗ＩＧＦ−１中和抗体による結合阻害を行なったが、細胞増殖の抑制は見られなかったことから、馴化株のオートクリン的な増殖に対してＩＧＦ−１の関与はないと考えられる。しかし、抗ＥＧＦ中和抗体によって結合を阻害しても、馴化細胞株の細胞増殖が完全に抑制されなかったという結果から、ＩＧＦ−１以外の増殖因子がオートクリン因子として馴化細胞株の増殖に関与している可能性は十分に考えられる。

【0081】

５． 無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞の増殖に対するＧＭ３の影響
細胞膜は、主にホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等のリン脂質が無数に並んで形成される脂質二重膜層より成っており、その間に膜貫通タンパク質やアンカータンパク質等の各種タンパク質などが絡んで形成されている。脂質ラフトは、特にスフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質及びコレステロールを多く含む膜の構造物であり、受容体の膜貫通タンパク質が集中していることから、細胞内に情報伝達を行なっているとされている（図９）。特に、脂質ラフトのスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドがシグナル伝達の制御に関与するという報告は多い。さらに、ＥＧＦの受容体も脂質ラフトに局在していることが報告されている（Balbisら，J Cell Biochem., 2010; 109(6): 1103-8.）。したがって、この脂質ラフトの形成が不十分な場合には、受容体からの情報伝達が十分に行われない可能性がある。

【0082】

上記のように、無タンパク質・無脂質培地で長期に継代された馴化細胞株は脂質類の不足によって細胞膜構造が変化した可能性があり、馴化細胞株は脂質ラフトの形成が不十分で、ＥＧＦ受容体からの情報伝達が十分に行われていない可能性が考えられる。そこで、脂質ラフトの構成に重要な役割をはたしているスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドＧＭ３に着目し、ＧＭ３の添加が馴化細胞の細胞形態及び増殖速度に与える影響について検討した。すなわち、ＧＭ３を添加することにより細胞膜構造が再構築され、細胞接着性が回復する可能性、ＧＭ３の有無や添加濃度による細胞形態の変化、特に接着性細胞の増加や細胞集塊の大きさの変動がある可能性を調べた。

【0083】

（１）無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞の形態に対するＧＭ３の影響
ガングリオシドＧＭ３（Neu5A, Enzo Life Sciences）は市販のものを使用した。細胞はＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を用いた。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞はＮＰＬ培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。

【0084】

ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、１０ｍｇ／Ｌになるようにインスリンを加えたＮＰＬ培地で５万個／ｍＬの細胞数になるように希釈し、すべての細胞を２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルの量で播種した。その後、細胞播種プレートにガングリオシドＧＭ３を、０、２５０、１，２５０、又は２，５００ｎｇ／ｍＬになるように加えた。

【0085】

播種したプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件で５日間培養し、細胞の形態変化を倒立位相差顕微鏡下で観察した。次いで、細胞数を改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で計測し、生存率を算定した。細胞数の有意差の検定にはスチューデントのｔ検定を用いた。

【0086】

（２）インスリン及びＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞と元株のＣＨＯ細胞との増殖速度の比較
細胞は、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞と元株のＣＨＯ細胞を用いた。元株のＣＨＯ細胞は、接着しているので、トリプシンで剥離分散させ、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、ＮＰＬ培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。

【0087】

元株のＣＨＯ細胞は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は１０ｍｇ／Ｌのインスリン及び２，５００ｎｇ／ｍＬのＧＭ３を加えたＮＰＬ培地で、それぞれ５万個／ｍＬの細胞数になるように希釈し、すべての細胞を２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルの量で播種した。播種したプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件で５日間培養し、一定期間ごとに細胞数を改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。細胞数の有意差の検定にはスチューデントのｔ検定を用いた。

【0088】

（３）結果
ＧＭ３の添加による細胞形態の変化についての観察結果を図１０に示す。ＧＭ３の添加の有無及び濃度（２，５００ｎｇ／ｍＬまで）にかかわらず、接着性細胞の増加や細胞集塊の大きさの変動等の形態の変化は観察されなかった。

【0089】

ＧＭ３の添加による細胞増殖に対する影響の結果を図１１に示す。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の培養液にＧＭ３を１，２５０ｎｇ／ｍＬ加えると、不添加に比べ有意に細胞数が増加した（Ｐ＜０．０５）。この効果はＧＭ３の濃度依存的であった。ＧＭ３を２，５００ｎｇ／ｍＬで添加した場合、不添加の約２倍である１００万個／ｍＬ程度に細胞数が増加した。したがって、ＧＭ３にはＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖を誘導する効果があることが明らかになった。

【0090】

次に、インスリンとＧＭ３の添加による増殖促進を検証した。結果を図１２に示す。ＮＰＬ培地にインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）とＧＭ３（２，５００ｎｇ／ｍＬ）を加えた場合、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（−○−）は血清添加培地の元株のＣＨＯ細胞（−●−）とほぼ同程度の細胞増殖率を示した。したがって、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、培地にインスリンとＧＭ３を添加することでＣＨＯ細胞に匹敵する増殖速度を得ることが示された。

【0091】

以上のとおり、ＧＭ３の添加によってＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の増殖が誘導され、さらに、インスリンとの併用により静置培養においても元株のＣＨＯ細胞と同程度まで増殖速度を上げることができた。一方、細胞形態には変化は見られなかった。したがって、細胞浮遊化に関してはＧＭ３の欠失は関与していないと考えられる。

【0092】

ＧＭ３は脂質ラフトの主要構成成分であると同時に、細胞のシグナル伝達にも関与するとされている。しかし、ＧＭ３のシグナル伝達の関与に関しては抑制的にも誘導的にも働くといった矛盾した報告が成されている。BremerらはＥＧＦ受容体を過剰に発現したＡ４３１細胞やＫＢ細胞において、外因性のＧＭ３の添加がＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼの自己リン酸化を抑制することでシグナル伝達を制御して、ＥＧＦ依存性の細胞増殖を抑えるため、ＧＭ３はＥＧＦ受容体の制御因子であるとしている（Bremerら，J Biol Chem., 1986; 261: 2434-40）。一方、Jiらは同じＡ４３１細胞に対して、生細胞表面のスフィンゴ糖脂質を生理的条件下で切断できるエンドグリコセラミダーゼを用いて、細胞表面のガングリオシドを除去すると、ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼのＥＧＦ受容体の自己リン酸化が低下することを報告している（Jiら，Glycobiology, 1995; 5: 343-50）。また、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３線維芽細胞にグリコシルセラミドの合成阻害剤であるＤ−ＰＰＰＰ（D-l-threo-1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3- pyrrolidino-1-propanol-HCl）塩酸を用いて、ガングリオシドを除くと、ＥＧＦ受容体のみならず、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦなどの増殖因子及びその受容体のチロシンキナーゼの活性が阻害され、増殖が抑制されるが、外因性のガングリオシドを加えると抑制が解除されて増殖が戻るという報告もある（Liら，J Biol Chem., 2000; 275: 34213-23）。上記の一見矛盾した報告から、ガングリオシドは増殖因子と受容体の機能発現には欠くべからざる要素で、特にガングリオシドが欠乏すると各種増殖因子の受容体の機能が損なわれるが、ＥＧＦ受容体が過剰に発現をしているような細胞株において、外因性のＧＭ３を加えることは機能を抑制する方向で働くものと考える。近年の糖尿病研究において、ＴＮＦ−α刺激によるＧＭ３合成亢進が脂質ラフトの機能異常を引き起こし、インスリンの代謝性シグナルを選択的に抑制するという報告がある（Tagamiら，J Biol Chem., 2002; 277: 3085-92；井ノ口，肥満研究, 2006; 12: 260-2）。これは、過剰なＧＭ３はインスリン抵抗性を惹起するというものである。このような事実から、脂質ラフト形成に必要な量のＧＭ３は増殖に対して促進的に働くが、過剰のＧＭ３は抑制的に働くと考えられる。

【0093】

本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株は、長期に渡って脂質類、特にガングリオシドの欠損状態に曝されており、脂質ラフト上の受容体が影響を受けた可能性が考えられる。脂質欠乏状態の馴化細胞株ではＧＭ３を加えることによって、脂質ラフト上の受容体の機能が正常化し、増殖を誘導する方向に働くものと考えられる（図１３）。

【0094】

６． 無タンパク質・無脂質培地馴化ＣＨＯ細胞における遺伝子組換えタンパク質の生産
物質の生産系の検証にトランジェント法を用い、無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株が元株のＣＨＯ細胞に対してどの程度の遺伝子組換えタンパク質の生産能力があるかを、図１４に示す手順にしたがって分泌型ルシフェラーゼの発現を指標に比較検討した。

【0095】

（１）実験方法
（１−１）分泌型ルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターの導入
元株のＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養した。ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞は、ＤＭＥＭ培地で培養した。ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、インスリン（１０ｍｇ／Ｌ）添加ＮＰＬ培地、又はインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）＋ＧＭ３（２，５００ｎｇ／ｍＬ）添加ＮＰＬ培地のいずれかで培養した。
トランスフェクション試薬として「TransIT-LT1 Transfection Reagent」（タカラ、ＭＩＲ２３０４）、分泌型ルシフェラーゼ発現ベクターとして「NanoLuc（登録商標）reporter vector pNL1.3.CMV ［secNluc/CMV］」（プロメガ、Ｎ１１０１）（図１５）をそれぞれ使用した。

【0096】

元株のＣＨＯ細胞はトリプシンで単離後、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で２回洗浄した。洗浄後、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞はＤＭＥＭ培地で、ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞はインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）添加ＮＰＬ培地及びインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）＋ＧＭ３（２，５００ｎｇ／ｍＬ）添加ＮＰＬ培地で、それぞれ洗浄後、ＮＰＬ培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。

【0097】

生存率が９０％以上であることを確認した後、各々の培地で４０万個／ｍＬになるように細胞数を調整し、２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルの量で播種した。播種したプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件で２４時間培養した。

【0098】

７００μＬのＤＭＥＭ培地に１μｇ／μＬの「NanoLuc reporter vector pNL1.3.CMV」を７μＬ加えて混和後、「TransIT-LT1 Transfection Reagent」を２１μＬ加えてさらに混和した。室温で３０分間放置し、トランスフェクションコンプレックス（Transfection Complex）を調製した。また、対照として、「NanoLuc reporter vector pNL1.3.CMV」の代わりにＴＥ緩衝液を加えたダミーコンプレックス（Dummy Complex）を同様に調製した。

【0099】

細胞播種プレートに調製済みのトランスフェクションコンプレックスを５２μＬずつ、細胞と培地の組み合わせ毎に各３ウェル分滴下し、緩やかに揺すって混合した。また、同様にダミーコンプレックスを細胞と培地毎に各１ウェル分滴下し、緩やかに揺すって混合した。混合後、３７℃、５％ＣＯ₂条件で５日間培養した。

【0100】

以後、インスリン（１０ｍｇ／Ｌ）添加ＮＰＬ培地で培養し、トランスフェクションしたＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を「ＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞」と、インスリン（１０ｍｇ／Ｌ）＋ＧＭ３（２，５００ｎｇ／ｍＬ）添加ＮＰＬ培地で培養し、トランスフェクションしたＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞を「ＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞」とそれぞれ呼ぶ。

【0101】

（１−２）ルシフェラーゼ比活性の測定
ルシフェラーゼアッセイキットとして、「Nano-Glo Luciferase Assay System」（プロメガ、Ｎ１１１０）を使用した。
細胞を播種し、トランスフェクションの終わったプレートから５、２４、４８、７２及び１２０時間毎に上清を１０μＬ分取し、上清中の分泌型ルシフェラーゼの活性を「Nano-Glo Luciferase Assay System」を用いて、ルミノメーターで測定した。
（１−３）ルシフェラーゼ比活性の算定
ルシフェラーゼ比活性は経時的にサンプリングした中の元株のＣＨＯ細胞の培養上清の発光量に対して、培養条件毎の馴化細胞株の培養上清の発光量を比較したもので、計算法は以下のとおりとした。

【0102】

【数1】

【0103】

実験を３回繰り返し、データは全実験間のルシフェラーゼ比活性の平均±ＳＤで示し、有意差の検定にはスチューデントのｔ検定を用いた。

【0104】

（１−４）細胞毎の発光量比較
細胞毎の発光量比較はトランスフェクション後に経時的にサンプリングした各細胞の培養上清の発光量を、同じ細胞を用いて、同一培地組成、培養条件で培養した際の経時的な細胞の増加数で割っており、細胞当たりの発光量を推定的に算出した。

【0105】

（２）結果
馴化細胞株のタンパク質生産性を検討する目的で、ＣＭＶプロモーターの下流に分泌型ルシフェラーゼｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＮＬ１．３．ＣＭＶベクターをリポフェクション法でトランスフェクションし、馴化細胞株と元株のＣＨＯ細胞の培地に分泌されるルシフェラーゼ活性を発光量定量比較した。結果を図１６に示す。ＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は、トランスフェクション直後の産生の立ち上がりは遅いものの、１２０時間後には元株のＣＨＯ細胞に対するルシフェラーゼ比活性に有意差は見られなかった。最終的な産生量は元株のＣＨＯ細胞と同等であった（−●−）。また、ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（−▲−）及びＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（−○−）はトランスフェクション後１２０時間で元株のＣＨＯ細胞の３倍以上のルシフェラーゼ比活性（有意差は各々ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００５）を示した。したがって、樹立した細胞株のタンパク質生産性は元株のＣＨＯ細胞より高いものと考えられた。

【0106】

また、細胞当たりの発光量として換算するために、図１６において測定した経時的な発光量を、同一培地組成、培養条件で培養した際の経時的な細胞の増加数で割ることで、細胞当たりの発光量を推定的に算出した（図１７）。結果として、トランスフェクション後１２０時間のＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞（−△−）は、ＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞（−○−）の細胞当たりの発光量とほぼ同等であり、元株のＣＨＯ細胞（−×−）の約４倍程度の発光量であると見積もられる。また、やはりトランスフェクション後１２０時間後にはＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞の細胞当たりの発光量（−●−）は、元株のＣＨＯ細胞とほぼ同等であると見積もられた。

【0107】

これらの結果から、馴化細胞株はいずれも元株のＣＨＯ細胞と同等以上の遺伝子組換えタンパク質の生産が可能であることが示された。ＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及びＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞が元株のＣＨＯ細胞と比較して３倍以上のルシフェラーゼ産生を行なっていた（図１６）。また、細胞当たりのルシフェラーゼ活性を推定すると、トランスフェクション１２０時間後でＤＭＡｄ ＣＨＯ細胞及びＧＭ３非添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞で元株のＣＨＯ細胞と比べて４倍活性が高く、ＧＭ３添加ＮＰＬＡｄ ＣＨＯ細胞は元株のＣＨＯ細胞とほぼ同等であった（図１７）。

【0108】

馴化細胞株が元株のＣＨＯ細胞より高いルシフェラーゼの生産性を示す原因については明確にわかっていないが、馴化細胞株の膜構造の変化による影響による可能性が考えられる。上述のように、馴化細胞株は無タンパク質・無脂質培地による継代培養で長期間の脂質の欠損状態に曝されたために細胞膜の構造に変化が生じ、それによりトランスフェクションの効率が上がった可能性がある。また、細胞内で合成されたタンパク質の膜透過性が亢進したため、より多くのルシフェラーゼタンパク質が分泌される可能性も考えられる。

【0109】

これらの結果から、トランスフェクション前の培養において、ＧＭ３及びインスリンを添加して十分な量の細胞数を確保した後、ＧＭ３を除いてトランジェント法でトランスフェクションを行うことにより、効率的な組換えタンパク質生産が可能であることがわかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】