特開 2015-6150 鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-6150(P2015-6150A)

(43)【公開日】2015年1月15日

(54)【発明の名称】鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20141212BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2013-133163(P2013-133163)

(22)【出願日】2013年6月25日

(71)【出願人】

【識別番号】304024430

【氏名又は名称】国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学

(71)【出願人】

【識別番号】504133110

【氏名又は名称】国立大学法人電気通信大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000523

【氏名又は名称】アクシス国際特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100127133

【弁理士】

【氏名又は名称】小板橋 浩之

(72)【発明者】

【氏名】藤本 健造

(72)【発明者】

【氏名】中村 重孝

(72)【発明者】

【氏名】橋本 浩寿

(72)【発明者】

【氏名】小林 聡

【テーマコード（参考）】

4B024

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024AA11

4B024AA20

4B024CA01

(57)【要約】

【課題】高速化された鎖交換反応の方法を提供すること。
【解決手段】オリゴヌクレオチド鎖に光応答性修飾塩基を導入して、光架橋を行うことによって、新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドを速やかに製造する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第３のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ３）（ただし、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。

【請求項2】

第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第４のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ４）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ４のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第５のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ５）（ただし、
ＯＤＮ５は、ＯＤＮ４のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ５は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ５の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ４の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ５とＯＤＮ４の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。

【請求項3】

光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式Ｉ：

【化1】

（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｎ−は、Ｎの一価基を表す。）
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。

【請求項4】

光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された１種以上の塩基である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、請求項３〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）が、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）の５’末端側又は３’末端側に隣接している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

光照射が、３６６ｎｍの波長を含む光の光照射である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

光照射が、０．０１〜３０秒間の光照射である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させて、
鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されたことが、蛍光発光によって検出可能である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

ＯＤＮ２が、ＨＹＢ１の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

ＯＤＮ２のＨＹＢ１の塩基配列が、光応答性修飾塩基の位置を除いて、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、
ＯＤＮ３のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ＯＤＮ２と相補的な塩基配列である、請求項１又は請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

ＯＤＮ５が、ＨＹＢ２の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、請求項２に記載の方法。

【請求項13】

ＯＤＮ４のＨＹＢ１の塩基配列が、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、
ＯＤＮ４のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ＯＤＮ５と相補的な塩基配列である、請求項２又は請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）。

【請求項15】

二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させた、請求項１４に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。

【請求項16】

二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖が、担体に固定されてなる、請求項１４〜１５のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

分子生物学の分野の基本的な技術に、二重鎖核酸の鎖交換反応技術がある。この鎖交換反応技術は、多くの応用があり、例えば、ＳＮＰｓの検出や、ＤＮＡ結合タンパクの検出などを効率的に行うために用いられる。そのために、鎖交換反応技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。特に、最近では、テーラーメイド治療への期待が高まるにしたがって、より簡易に遺伝子診断を行うための技術として注目されている。

【0003】

このようなＤＮＡの鎖交換反応は、詳細な解析（非特許文献１：Ｗｉｎｆｒｅｅ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，ｐｐ１７３０３−１７３１４）が行われ、高い精度でシミュレーションすることが可能となっている。このような解析から、鎖交換反応にはある程度の時間を必要とすることがわかっている。そして、鎖交換反応に要する時間の長さは、鎖交換反応を応用を広げるうえで、大きな制約となっている。

【0004】

そこで、鎖交換反応の高速化のための手法が検討されてきた。例えば、カチオン性高分子を導入する手法（非特許文献２：Ｍａｒｕｙａｍａ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００１，７，ｐｐ１７６−１８０）が報告されている。しかし、カチオン性高分子を用いる場合はｂｕｆｆｅｒに制限が生じ生体内に近い条件では使用できないという、大きな制約が生じるという問題がある。

【0005】

あるいは、例えば、ＰＮＡなどの電荷を持たない骨格（非特許文献３：Ｏｌｉｖｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，１６，ｐｐ３４−３９）を用いることによる鎖交換反応の高速化が報告されている。しかし、このように骨格にＰＮＡを使用しなければならないのであれば、天然の核酸配列を使用できないという、大きな制約が生じるという問題がある。

【0006】

本発明者の研究グループによって、光応答性人工ヌクレオチドが開発され、特許出願が行われている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開公報ＷＯ２００９／０６６４４７号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｗｉｎｆｒｅｅ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，ｐｐ１７３０３−１７３１４

【非特許文献2】Ｍａｒｕｙａｍａ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００１，７，ｐｐ１７６−１８０

【非特許文献3】Ｏｌｉｖｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，１６，ｐｐ３４−３９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

このように鎖交換反応の高速化のための手法が求められている。本発明の目的は、高速化された鎖交換反応の方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は、鎖交換反応の高速化を鋭意研究してきたところ、鎖交換反応前の二重鎖、あるいは一重鎖のなかに、ビニルカルバゾール構造を有する光応答性の人工塩基をあらかじめ導入しておき、この光応答性の修飾塩基に光照射して、所定の光架橋を形成させることによって、鎖交換反応が著しく高速化されることを見いだして、本発明に到達した。本発明によれば、鎖交換反応は著しく高速化されて、極めて短時間で、鎖交換された二重鎖を新たに得ることができる。

【0011】

したがって、本発明は、次の（１）〜にある。
（１）
第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第３のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ３）（ただし、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
（２）
第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第４のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ４）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ４のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、
第５のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ５）（ただし、
ＯＤＮ５は、ＯＤＮ４のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、
ＯＤＮ５は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ４は、ＯＤＮ５の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ４の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ５とＯＤＮ４の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。

【0012】

（３）
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式Ｉ：

【化1】

（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｎ−は、Ｎの一価基を表す。）
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。

【0013】

（４）
光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された１種以上の塩基である、（３）に記載の方法。
（５）
光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、（３）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）が、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）の５’末端側又は３’末端側に隣接している、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
光照射が、３６６ｎｍの波長を含む光の光照射である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
光照射が、０．０１〜３０秒間の光照射である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
光照射が、０〜７０℃の範囲の温度で行われる、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させて、
鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されたことが、蛍光発光によって検出可能である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。

【0014】

さらに、本発明は次の（１１）〜にもある。
（１１）
ＯＤＮ２が、ＨＹＢ１の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、（１）に記載の方法。
（１２）
ＯＤＮ２のＨＹＢ１の塩基配列が、光応答性修飾塩基の位置を除いて、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、
ＯＤＮ３のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ＯＤＮ２と相補的な塩基配列である、（１）又は（１１）に記載の方法。
（１３）
ＯＤＮ５が、ＨＹＢ２の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、（２）に記載の方法。
（１４）
ＯＤＮ４のＨＹＢ１の塩基配列が、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、
ＯＤＮ４のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ＯＤＮ５と相補的な塩基配列である、（２）又は（１３）に記載の方法。

【0015】

さらに、本発明は、上述した方法の工程を含む、二重鎖オリゴヌクレオチドを鎖交換する方法にもある。さらに、本発明は、上述した方法の工程を含む、オリゴヌクレオチドを検出する方法にもある。

【0016】

さらに、本発明は次の（２１）〜にもある。
（２１）
第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、
ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、
ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）。
（２２）
ＯＤＮ２が、ＨＹＢ１の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、（２１）に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。

【0017】

（２３）
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式Ｉ：

【化2】

（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｎ−は、Ｎの一価基を表す。）
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、（２１）〜（２２）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。

【0018】

（２４）
光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された１種以上の塩基である、（２３）に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２５）
光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、（２３）〜（２４）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２６）
ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）が、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）の５’末端側又は３’末端側に隣接している、（２１）〜（２５）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２７）
二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させた、（２１）〜（２６）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２８）
二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖が、担体に固定されてなる、（２１）〜（２７）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
（２９）
二重鎖オリゴヌクレオチドが、折り返された１本のオリゴヌクレオチド鎖によって形成されたものである、（２１）〜（２８）のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。

【0019】

さらに、本発明は、上記のＯＤＮ１とＯＤＮ２とＯＤＮ３とからなるキットにもある。また、本発明は、上記のＯＤＮ１とＯＤＮ４とＯＤＮ５とからなるキットにもある。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、鎖交換反応は著しく高速化されて、秒単位という極めて短時間で、鎖交換反応を行って、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドを新たに得ることができる。また、本発明による鎖交換反応の高速化は、その原理を光架橋反応においているものであるために、特殊なバッファを使用する等などの制約がない。本発明によれば、重要な要素技術でありながら、従来はその所要時間の長さから応用が限られていた鎖交換反応技術を、遺伝子診断その他の応用に、広く利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析の変性ＰＡＧＥ解析結果を示す図である。

【図2】図２は、光照射時間によるクロスリンク体の変化を示すグラフである。

【図3】図３は、蛍光測定による鎖交換反応の速度解析の結果を示すグラフである。

【図4】図４は、光架橋の有無による鎖交換反応のグラフを対比した図である。

【図5】図５は、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析の変性ＰＡＧＥ解析結果を表す図である。

【図6】図６は、光照射時間によるクロスリンク体の変化を示すグラフである。

【図7】図７は、蛍光測定による鎖交換反応の速度解析の結果のグラフである。

【図8】図８は、光架橋の有無による鎖交換反応のグラフの比較である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［鎖交換反応の概要］
本発明によれば、二重らせんを形成した二重鎖オリゴヌクレオチドの鎖の１本を、外部から添加した一本鎖のオリゴヌクレオチドの鎖と速やかに交換して、新しい二重鎖オリゴヌクレオチドを得ることができる。すなわち、本発明は、速やかな鎖交換反応によって、新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドを速やかに製造する方法である。本発明による高速化の原理は、オリゴヌクレオチド鎖に光応答性修飾塩基を導入して、光架橋を行うことによって、新しく製造される二重鎖オリゴヌクレオチドの生成が、熱力学的に有利なものとなるように導くことにある。

【0023】

鎖交換後に得られる新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドにおいて、光架橋が形成されているためには、鎖交換前の二重鎖オリゴヌクレオチドの鎖に、光応答性修飾塩基を導入しておいてもよく、外部から添加する一本鎖のオリゴヌクレオチドの鎖に、光応答性修飾塩基を導入しておいてもよく、その両方に導入しておいてもよい。

【0024】

［鎖交換前の二重鎖オリゴヌクレオチドに光応答性修飾塩基が導入された態様］
したがって、本発明の好適な実施の一態様は、第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第２のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ２）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、ＯＤＮ２は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、ＯＤＮ１は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ２のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、第３のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ３）（ただし、ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、ＯＤＮ３は、ＯＤＮ２の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法、にある。

【0025】

好適な実施の態様において、ＯＤＮ２が、ＨＹＢ１の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有しているものとすることができる。また、好適な実施の態様において、ＯＤＮ２のＨＹＢ１の塩基配列が、光応答性修飾塩基の位置を除いて、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、ＯＤＮ３のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ＯＤＮ２と相補的な塩基配列であるものとすることができる。

【0026】

［外部から添加する一本鎖のオリゴヌクレオチドの鎖に光応答性修飾塩基が導入された態様］
したがって、本発明の好適な実施の一態様は、第１のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１）と第４のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ４）とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド（ただし、ＯＤＮ４は、ＯＤＮ１とハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ１）を有し、このＨＹＢ１に隣接して、ＯＤＮ１とハイブリダイズしない塩基配列（ＮＨＹＢ１）を有し、二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＯＤＮ４のＮＹＹＢ１の領域においては一本鎖となっている。）と、第５のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ５）（ただし、ＯＤＮ５は、ＯＤＮ４のＨＹＢ１及びＮＨＹＢ１にハイブリダイズ可能な塩基配列（ＨＹＢ２）を連続して有し、ＯＤＮ５は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、ＯＤＮ４は、ＯＤＮ５の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。）とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、を含む、ＯＤＮ１とＯＤＮ４の二重鎖が鎖交換されてＯＤＮ５とＯＤＮ４の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法、にある。

【0027】

好適な実施の態様において、ＯＤＮ５が、ＨＹＢ２の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有しているものとすることができる。また、好適な実施の態様において、ＯＤＮ４のＨＹＢ１の塩基配列が、ＯＤＮ１と相補的な塩基配列であり、ＯＤＮ４のＨＹＢ２の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ＯＤＮ５と相補的な塩基配列であるものとすることができる。

【0028】

［オリゴヌクレオチド鎖の長さ等］
本発明の好適な実施の態様において、鎖交換に使用されるオリゴヌクレオチドの長さには特に制約はない。例えば、鎖交換されるオリゴヌクレオチド鎖のＨＹＢ１の塩基配列の長さが、４〜４００００塩基、１０〜１００００塩基、１０〜１０００塩基、１０〜１００塩基などとすることができる。塩基配列が長い場合においても、本発明による光架橋は、熱力学的な原理から、鎖交換反応を有効に高速化する。本発明で１本のオリゴヌクレオチド鎖に導入される光応答性修飾塩基の数は、１個に限られるものではなく、例えば、１個以上、例えば、１〜ｌ００個、１〜１０個、１〜５個とすることができる。したがって、塩基配列が長い場合に、高速化の程度を、所望の程度にまで高めるために、複数の光応答性修飾塩基をオリゴヌクレオチド鎖に導入して、複数箇所で光架橋を形成させることも、本発明の範囲内である。また、鎖交換されるオリゴヌクレオチド鎖のＮＨＹＢ１の長さも特に制約はないが、このＮＨＹＢ１の領域は、二重鎖から露出する一本鎖部分となって、外部から添加した一本鎖オリゴヌクレオチドが最初に付着する部分となるので、その役割を果たす程度の長さがあれば十分であり、例えば、ＮＨＹＢ１の塩基配列の長さが、４〜２４塩基、４〜１６塩基、６〜１２塩基などとすることができる。ＯＤＮ２又はＯＤＮ４のオリゴヌクレオチド鎖において、ＮＨＹＢ１の塩基配列は、ＨＹＢ１の塩基配列の５’末端側又は３’末端側に隣接して位置しており、いずれの位置とするかについては、当業者が適宜選択することができる。好適な実施の態様において、例えば、ＮＨＹＢ１の塩基配列は、ＯＤＮ２又はＯＤＮ４のオリゴヌクレオチド鎖において、ＨＹＢ１の塩基配列の５’末端側に隣接させることができる。

【0029】

［光応答性修飾塩基］
光応答性修飾塩基としては、上記原理を実現可能な光応答性修飾塩基であれば使用することができるが、好適に使用可能な光応答性修飾塩基としては、次式Ｉ：

【0030】

【化3】

【0031】

で表される人工塩基を挙げることができる。この人工塩基が、オリゴヌクレオチド中でジエステル結合したヌクレオチドの塩基部分として、天然の核酸塩基の塩基部分に置換されて、導入されている。

【0032】

Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。

【0033】

Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。

【0034】

上記のＮ−は、Ｎの一価基を表し、この部分が五単糖の１位にグリコシド結合して、人工塩基として導入されている。すなわち、次式ＩＩ：

【0035】

【化4】

【0036】

で表されるリボヌクレオチド、または、次式ＩＩＩ：

【0037】

【化5】

【0038】

で表されるデオキシリボヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合によって、オリゴヌクレオチドの塩基配列中に導入されて、次式ＩＶ：

【0039】

【化6】

【0040】

で表される核酸（ただし、Ｒｂは、式Ｉの基が塩基部分として導入されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入されたオリゴヌクレオチドの鎖を表す）となっている。なお、１本のオリゴヌクレオチドの鎖に導入される式Ｉの人工塩基の数は、１個に限られるものではない。

【0041】

上記ビニルカルバゾール構造を有する光応答性の人工塩基（光応答性修飾塩基）を導入したオリゴヌクレオチドと、それに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせて二重らせんを形成させて、形成した二重らせんに光照射を行うと、ハイブリダイズした相手方のオリゴヌクレオチドの配列中において、光反応性の人工塩基と相補的に対応して塩基対となるべき塩基から１塩基分だけ３’末端側にある塩基と、光架橋を形成する。

【0042】

この光応答性の人工塩基が光架橋を形成可能である相手方の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。一方で、この光応答性の人工塩基は、プリン環を有する塩基とは光架橋を形成しない。すなわち、この光応答性の人工塩基は、例えば、シトシン、ウラシル、及びチミン、さらにシュードウラシル及びシュードチミンに対して光架橋を形成し、一方で、グアニン及びアデニンに対しては光架橋を形成しないという、強い特異性を有している。したがって、本発明においては、それぞれの１本鎖オリゴヌクレオチドの相補的な関係は、光応答性の人工塩基に関して、この条件を満たすようになっている。一方、ハイブリダイズした相手方のオリゴヌクレオチドの配列中において、この光応答性の人工塩基と塩基対となるべき塩基の位置にある塩基については、相補鎖による２重らせんの形成を妨げない限りは、特段の制約がなく、どのような塩基であってもよく、例えば、核酸塩基として、シトシン、ウラシル、チミン、グアニン及びアデニン、あるいはさらにシュードウラシル及びシュードチミンのいずれであっても使用することができる。

【0043】

［鎖交換反応の条件］
本発明による鎖交換反応の高速化は、その原理が光化学反応にあるので、後述する光照射の条件を妨げない限り、鎖交換反応において使用される公知の条件を、特に制限無く使用することができる。例えば、溶液としては、水溶液を使用することができ、公知の塩類、公知の緩衝液、を所望により使用することができる。このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、等をあげることができる。このような塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等を挙げることができ、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂等をあげることができるが、これらに限られるものではない。また、例えば、溶液のｐＨは、鎖交換反応に使用される公知のｐＨを使用することができ、例えば、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．５等とすることができる。また、鎖交換反応に先立って、二重鎖オリゴヌクレオチドを用意するために、適宜、アニーリング等を行ってもよい。また、本発明の鎖交換反応は、広汎な条件下で行うことができることから、この鎖交換反応をＰＣＲのプロセスと組み合わせて、ＰＣＲで使用される条件下で行うこともできる。

【0044】

［光照射］
光架橋を形成させるための光照射は、一般に３３０〜３７０ｎｍの範囲、好ましくは３３０〜３６０ｎｍの波長を含む光を使用することができる。また、好適な実施の態様において、３６６ｎｍの波長を含む光、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光を使用することができる。鎖交換反応に有利に、光架橋反応を進行させるために、例えば、０〜７０℃の範囲の温度、例えば０〜４０℃の範囲の温度、例えば２０〜４０℃の範囲の温度で、光照射を行うことができる。この光架橋は、光反応を使用しているために、光照射時のｐＨ、塩濃度などに特段の制約がない点で有利である。この光架橋の形成は、光照射によって極めて迅速に進行するために、光照射の時間は、極めて短時間で十分であり、例えば、０．０１〜３０秒間、０．０１〜２０秒間、０．０５〜１０秒間、０．１〜１０秒間、０．１〜５秒間、０．１〜１秒間などの光照射時間とすることができる。光照射によって生じる光架橋は、共有結合であって、十分に安定であり、例えば、二重鎖オリゴヌクレオチドが完全に解離してしまうような強い変性条件下においても、切断されることはない。この光架橋によって、鎖交換反応が、熱力学的に有利となり、迅速に進行する。

【0045】

［鎖交換反応の検出］
鎖交換反応によって、開始時に存在した二重鎖オリゴヌクレオチドが消耗して、新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドが生成したことは、公知の手段によって検出することができる。例えば、分子量の変化があればＰＡＧＥ等の手段でそれを検出してもよく、いずれかの鎖を公知の手段で標識しておいて、ＰＡＧＥ等と組み合わせて検出してもよい。好適な実施の態様において、蛍光発光色素分子と蛍光消光分子とを用いた検出を行うことができる。例えば、鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの１本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る１本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させれば、鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドは蛍光発光しない。しかし、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されると、蛍光発光色素分子は蛍光消光分子から離れて、蛍光発光可能となる。蛍光発光分子が鎖交換反応によって一本鎖として遊離するようにしてもよく、蛍光発光分子が鎖交換反応によって二重鎖として残るようにしてもよい。また、このような蛍光発光分子や蛍光消光分子を含めて、所望の標識の部位をいずれかのオリゴヌクレオチドの鎖に結合させて使用する態様もまた、本発明の範囲内である。さらに、このような検出を容易にするために、いずれかのオリゴヌクレオチドの鎖を、担体や固定基板に結合させて使用する態様もまた、本発明の範囲内である。また、上記のように鎖交換反応を検出することによって、鎖交換反応が可能な、二重鎖オリゴヌクレオチド、あるいは外部の一本鎖オリゴヌクレオチドが存在することを検出するということができる。したがって、本発明は、高速化された鎖交換反応によって、二重鎖オリゴヌクレオチド、あるいは外部の一本鎖オリゴヌクレオチドを、検出する方法にもある。

【実施例】

【0046】

以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例で使用するＯＤＮ１等の番号付けは、実施例以外で使用するＯＤＮ１等の番号付けとは異なるものである。

【0047】

［^CNVＫ含有ＯＤＮの合成］
次の式Ｖ：

【0048】

【化7】

【0049】

で表されるヌクレオチド（^CNVＫ）を塩基配列中に有するＯＤＮ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）を製造するために、次のスキーム１（Ｓｃｈｅｍｅ１）にしたがって合成を行った。合成は、特許文献１（国際公開公報ＷＯ２００９／０６６４４７号）に開示された手順にしたがって行った。

【0050】

【化8】

【0051】

上記のように合成した光応答性人工核酸３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅのアミダイト体をアセトニトリルで１００ ｍＭに調整し、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＡＢＩ３４００）にてＯＤＮ（オリゴヌクレオチド）を合成した。合成したＯＤＮ配列を以下の表１に示す。合成後、２８％アンモニア水を用いて５５℃で８時間脱保護を行った。その後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。

【0052】

【表1】

【0053】

［^CNVＫを組み込んだＯＤＮによる鎖交換反応の変性ＰＡＧＥ解析］
上記で製造したＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３を使用して、次のスキーム２（Ｓｃｈｅｍｅ２）に示す鎖交換反応を行って、その進行を変性ＰＡＧＥ解析で確認した。この実施例で使用するＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３の番号付けは、本明細書の「課題を解決するための手段」や「発明を実施するための形態」におけるＯＤＮ１、ＯＤＮ２、ＯＤＮ３にそれぞれ相当する。

【0054】

【化9】

Ｓｃｈｅｍｅ ２

【0055】

１３塩基長のＯＤＮ１は、２１塩基長のＯＤＮ２の３’末端側と相補性ある配列を有しており、二重らせんを形成している。表１のＯＤＮ２の^CNVＫは、スキーム２のなかではＸと記載した。二重らせんの中で、ＯＤＮ２の^CNVＫ（Ｘ）に対しては、ＯＤＮ１のＡが位置している（スキーム２の上段の図参照）。２１塩基長のＯＤＮ３は、ＯＤＮ２と相補性ある配列を有しており、上記のＯＤＮ２の５’末端側の相補的配列に塩基対を形成して付着する。ＯＤＮ２に付着したＯＤＮ３は、ＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対を適宜形成する。このＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対は、熱力学的な原理にしたがって、ＯＤＮ１−ＯＤＮ２間の塩基対と、あたかも線ファスナーのように、可逆的に置換してゆく（スキーム２の中段の左側の図参照）。可逆的な置換が、Ｘの５’末端側に隣接する塩基（上記ＯＤＮ２においてはＴ）と相補的な位置にある塩基に至ったときに、すなわちＸの５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置にＯＤＮ３のＴが配置されたときに、３６６ｎｍの光照射を行うと、ＯＤＮ２のＸと、Ｘの５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置にあるＯＤＮ３のＴとが、光連結される（スキーム２の中段の右側の図参照）。このようにＸとＴの光連結を介して、ＯＤＮ２とＯＤＮ３とが共有結合的に結合されると、この点において、ＯＤＮ１−ＯＤＮ２間の塩基対と、ＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対との置換は、可逆的ではないものとなり、ＯＤＮ１−ＯＤＮ２間の塩基対が、ＯＤＮ３−ＯＤＮ２間の塩基対へ置換される反応が、速やかに進行して、結果としてＯＤＮ１とＯＤＮ２の二重らせんは、ＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重らせんに鎖交換される（スキーム２の下段の図参照）。ただし、ＯＤＮ２のＸと連結したＯＤＮ３のＴの相補的な位置にはＴがあり、ＯＤＮ３とＯＤＮ２の二重らせんは、１箇所だけミスマッチがある。

【0056】

このようなスキーム２の反応を、具体的には次のように行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ１と５００ｎＭ ＯＤＮ２をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ３を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、すぐＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を３７℃もしくは２５℃で行った。光照射時間は０，０．１，０．５，１，２，５，１０，１５秒（ｓ）行った。それぞれのサンプルを変性ＰＡＧＥによる解析を行い、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析を行った。その結果を図１に示す。

【0057】

図１は、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析の変性ＰＡＧＥ解析結果を示す図である。この変性ＰＡＧＥ解析の結果より、鎖交換反応中に光照射を行うことにより、光照射後にクロスリンク体（上記のＯＤＮ２とＯＤＮ３のクロスリンク体）のバンドが出現していることが確認できた。鎖交換前は^CNVＫのターゲット塩基の位置（すなわち、^CNVＫの５’末端側に隣接する塩基と相補的な位置）にはアデニン（Ａ）が来ており、光照射を行ってもクロスリンク体は出現しないが、鎖交換反応が起こると、ターゲット塩基の位置にチミン（Ｔ）が来るため、クロスリンク体が出現する。そのためクロスリンク体の出現により鎖交換反応の速度の解析を行うことが出来る。光照射時間によるクロスリンク体の割合変化を図２にまとめた。

【0058】

図２は、光照射時間によるクロスリンク体の変化を示すグラフである。全てのＯＤＮがクロスリンク体（上記のＯＤＮ２とＯＤＮ３のクロスリンク体）となった場合を、１００％とした。^CNVＫを組み込み、光照射を行うことによって、５秒間で約７０％以上（２５℃）及び７５％以上（３７℃）の鎖交換反応が進行していた。また、０．５秒間の光照射によっても、５５％から６５％以上（２５℃）、６０％から７２％以上（３７℃）の鎖交換反応が進行していた。２５℃よりも３７℃のほうが鎖交換反応の進行は早い傾向にあったが、２５℃であっても極めて迅速に鎖交換反応が進行していた。

【0059】

［^CNVKを組み込んでいないＯＤＮによる鎖交換反応の蛍光解析］
次の表２に示すＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ６を使用して、実験を行った。これらのＯＤＮを使用して、次のスキーム３（Ｓｃｈｅｍｅ３）に示す鎖交換反応を行った。

【0060】

【表2】

【0061】

【化10】

Ｓｃｈｅｍｅ ３

【0062】

１３塩基長のＯＤＮ４は、５’末端に蛍光色素分子（Ｃｙ３）（Ｆ）を有しており、２１塩基長のＯＤＮ５は、３’末端に蛍光消光分子（Ｄａｂｃｙｌ）（Ｑ）を有している。ＯＤＮ５は、上記のＯＤＮ２においてＸであった位置にＴが位置しており、ＯＤＮ４との配列の相補性は、完全である。これらが二重らせんを形成することによって、蛍光色素分子部位と、蛍光消光分子部位とが近接している場合には、蛍光は観察されない（Ｓｃｈｅｍｅ３の上段の図参照）。２１塩基長のＯＤＮ３は、ＯＤＮ５と相補性の塩基配列を有しており、蛍光色素分子及び蛍光消光分子のいずれも有していない。Ｓｃｈｅｍｅ ２と同様に、ＯＤＮ３がＯＤＮ５に付着して（Ｓｃｈｅｍｅ３の中段の左側の図参照）、熱力学的な原理によって、ＯＤＮ４−ＯＤＮ５の塩基対が、ＯＤＮ３−ＯＤＮ５の塩基対によって、可逆的に置換されていく（Ｓｃｈｅｍｅ３の中段の右側の図参照）。この置換が完全に進行すると、ＯＤＮ３とＯＤＮ５との二重らせんが形成されて、ＯＤＮ４が離脱し、蛍光色素分子部位は、蛍光消光分子部位から隔離されて、蛍光発光可能となる（Ｓｃｈｅｍｅ３の下段の図参照）。ただし、ＯＤＮ３とＯＤＮ５の二重らせんは、１箇所だけ、ＴとＴが相補的な位置に置かれており、ミスマッチがある。

【0063】

このスキーム３にしたがった実験を、具体的には次のように行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ４と５００ｎＭ ＯＤＮ５をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ３を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、蛍光分光光度計を用い、Ｃｙ３の蛍光強度の変化を測定した。その結果を図３に示す。

【0064】

図３は、蛍光測定による鎖交換反応の速度解析の結果を示すグラフである。全てのＯＤＮがＯＤＮ３とＯＤＮ５の二重らせんとなった場合を、鎖交換率１００％とした。図３の左図は０秒から３００秒までの変化を示したグラフであり、このうち０秒から１２０秒までの変化を拡大して右図のグラフとして示した。^CNVＫを用いていないスキーム３の鎖交換反応では、ＯＤＮ３投入の後に鎖交換反応が７０％超に進行するには、約３００秒を要した。

【0065】

［光架橋による、鎖交換反応の加速の検討］
光架橋の有無による鎖交換反応の比較を図４にまとめた。図４は、光架橋の有無による鎖交換反応のグラフを対比した図である。ここからわかるように、光架橋した場合は、光架橋しない場合と比較して、５秒間で７０％以上の鎖交換反応が進行しており、２５℃と３７℃のいずれの温度であっても、鎖交換反応の進行の圧倒的な加速が確認された。

【0066】

鎖交換反応の立ち上がりの近似曲線の傾きからそれぞれの初速を求め光架橋により、おおよそ何倍加速しているのかを求めた。このように求めた光架橋による鎖交換反応の加速率の対比の結果を、次の表３に示す。

【0067】

【表3】

【0068】

このように、２５℃の際には、光架橋があることで鎖交換反応が５６倍加速しており、３７℃の際も、光架橋があることで鎖交換反応が７０倍と大きく加速していることが分かった。

【0069】

［３本目のＯＤＮ鎖に^CNVＫを導入した系による鎖交換反応の変性ＰＡＧＥ解析］
鎖交換反応の開始時点において、形成されている二重らせんには^CNVＫが導入されておらず、遊離のＯＤＮに^CNVＫが導入されている実験系を使用して、鎖交換反応を解析した。実験には、次の表４に示すＯＤＮ１、ＯＤＮ６、ＯＤＮ７を使用した。これらのＯＤＮを使用して、次のスキーム４（Ｓｃｈｅｍｅ４）に示す鎖交換反応を行った。この実施例で使用するＯＤＮ１、ＯＤＮ６、ＯＤＮ７の番号付けは、本明細書の「課題を解決するための手段」や「発明を実施するための形態」におけるＯＤＮ１、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５にそれぞれ相当する。

【0070】

【表4】

【0071】

【化11】

Ｓｃｈｅｍｅ４

【0072】

１３塩基長のＯＤＮ１は、２１塩基長のＯＤＮ６の３’末端側と相補性ある配列を有しており、二重らせんを形成している。二重らせんの形成に参加していない３本目のＯＤＮ鎖である、２１塩基長のＯＤＮ７は、ＯＤＮ６と相補性ある配列を有しており、配列中に^CNVＫ（Ｘ）を有している（スキーム４の上段の図参照）。ＯＤＮ７がＯＤＮ６の５’末端側の相補的配列に塩基対を形成して付着すると、ＯＤＮ７−ＯＤＮ６間の塩基対は、熱力学的な原理にしたがって、ＯＤＮ１−ＯＤＮ６間の塩基対と、あたかも線ファスナーのように、可逆的に置換してゆく（スキーム４の中段の左側の図参照）。可逆的な置換が、ＯＤな７のＸに至ったときに、すなわちＸが、相補的な位置にある塩基の３’末端側に隣接する塩基（ＯＤＮ６におけるＴ）と、光連結可能な位置に配置されたときに、３６６ｎｍの光照射を行うと、ＯＤＮ７のＸと、相補的な位置にある塩基の３’末端側に隣接する塩基（ＯＤＮ６におけるＴ）とが、光連結される（スキーム４の中段の右側の図参照）。ＸとＴの光連結を介して、ＯＤＮ６とＯＤＮ７とが共有結合的に結合されると、ＯＤＮ１−ＯＤＮ６間の塩基対が、ＯＤＮ７−ＯＤＮ６間の塩基対へ置換される反応が、速やかに進行して、結果としてＯＤＮ１とＯＤＮ６の二重らせんは、ＯＤＮ７とＯＤＮ６の二重らせんに鎖交換される（スキーム４の下段の図参照）。

【0073】

このスキーム３にしたがった実験を、具体的には次のように行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ１と５００ｎＭ ＯＤＮ６をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ７を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、すぐＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を３７℃もしくは２５℃で行った。光照射時間は０，０．１，０．５，１，５，１０，１５秒行った。それぞれのサンプルを変性ＰＡＧＥによる解析を行い、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析を行った。その結果を図５に示す。

【0074】

図５は、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析の変性ＰＡＧＥ解析結果を表す図である。この変性ＰＡＧＥ解析の結果より、光照射後にクロスリンク体のバンドが出現していることが確認できた。鎖交換反応中に光照射を行うことにより、クロスリンク体のバンドが出現している。鎖交換によって^CNVＫを含むＯＤＮが二本鎖を形成し、チミンと架橋することによってクロスリンク体のバンドが出現する。そのため、クロスリンク体の出現により鎖交換反応の速度の解析を行うことができる。光照射時間によるクロスリンク体の割合変化を図６に示す。

【0075】

図６は、光照射時間によるクロスリンク体の変化を示すグラフである。５秒間の光照射により反応はほぼ定常状態に達していた。光架橋により鎖交換反応が高速に進行していることがわかった。２５℃よりも３７℃のほうが鎖交換反応の進行は早い傾向にあった。

【0076】

［^CNVKを組み込んでいないＯＤＮによる鎖交換反応の蛍光解析］
次の表５に示すＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ８を使用して、実験を行った。これらのＯＤＮを使用して、次のスキーム５（Ｓｃｈｅｍｅ５）に示す鎖交換反応を行った。

【0077】

【表5】

【0078】

【化12】

Ｓｃｈｅｍｅ５

【0079】

このスキーム５では、スキーム３において使用したＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ３に代えて、ＯＤＮ４、ＯＤＮ５、ＯＤＮ８を使用して、同様の手順で反応を行っている。ＯＤＮ８は、ＯＤＮ３の塩基配列の１箇所でＴがＡに置換した配列を有しており、その結果、ＯＤＮ５とＯＤＮ８の二重鎖には、ＯＤＮ５とＯＤＮ３の二重鎖に存在していたミスマッチがない。

【0080】

この実験は、具体的には次の手順で行った。
５００ｎＭ ＯＤＮ４と５００ｎＭ ＯＤＮ５をバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭカコジル酸ナトリウム）中で７０℃で５分間加熱した後、３７℃もしくは２５℃で１時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ＯＤＮ８を最終濃度が５００ｎＭとなるように加え、蛍光分光光度計を用い、Ｃｙ３の蛍光強度の変化を測定した。その結果を図７に示す。

【0081】

図７は、蛍光測定による鎖交換反応の速度解析の結果のグラフである。図７の左図のグラフの上側の曲線が３７℃、下側の曲線が２５℃の結果である。図７の右図は、左図の横軸の０〜１２０秒の範囲を拡大したグラフである。^CNVＫを用いていない鎖交換反応では２５℃では、約３００秒で６０％近い鎖交換反応が、３７℃の場合は３０秒で８０％近い鎖交換反応が進行していた。光架橋の有無による鎖交換反応の比較を図８にまとめた。

【0082】

図８は、光架橋の有無による鎖交換反応のグラフの比較である。図８の左図は２５℃、右図は３７℃の結果であり、いずれのグラフでも上側の曲線が光架橋ありの場合、下側の曲線が光架橋なしの場合である。光架橋した場合では、秒単位での鎖交換反応の進行が確認され。光架橋していないものとでは圧倒的な加速が確認された。そこで、鎖交換反応の立ち上がりの近似曲線の傾きからそれぞれの初速を求め光架橋により、おおよそ何倍加速しているのかを求めた。光架橋による鎖交換反応の加速率を、次の表６に示す。

【0083】

【表6】

【0084】

この結果から、２５℃の際には、光架橋により鎖交換反応が１０倍加速しており、３７℃の際も１３倍と大きく加速していることが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0085】

本発明によれば、鎖交換反応は著しく高速化されて、秒単位という極めて短時間で、鎖交換反応を行って、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドを新たに得ることができる。本発明は産業上有用な発明である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】