特開 2015-6181 中鎖ＰＨＡ／長鎖ＰＨＡ及び特殊なＰＨＡの効率的な製造のための新規な環境分離微生物であるシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2015-6181(P2015-6181A)

(43)【公開日】2015年1月15日

(54)【発明の名称】中鎖ＰＨＡ／長鎖ＰＨＡ及び特殊なＰＨＡの効率的な製造のための新規な環境分離微生物であるシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20141212BHJP

   C12P 7/62 20060101ALI20141212BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   C12P7/62

【審査請求】未請求

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2014-127756(P2014-127756)

(22)【出願日】2014年6月20日

(31)【優先権主張番号】13173575.5

(32)【優先日】2013年6月25日

(33)【優先権主張国】EP

(71)【出願人】

【識別番号】510109165

【氏名又は名称】ドリッテ・パテントポートフォリオ・ベタイリグンスゲゼルシャフト・エムベーハー・ウント・コンパニー・カーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｄｒｉｔｔｅ Ｐａｔｅｎｔｐｏｒｔｆｏｌｉｏ Ｂｅｔｅｉｌｉｇｕｎｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】バサス ガリア，モニカ

(72)【発明者】

【氏名】アリアス リバス，サグラリオ

(72)【発明者】

【氏名】モリナーリ，ガブリエラ

(72)【発明者】

【氏名】ティミス，ケネス ナイジェル

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AD83

4B064BJ04

4B064BJ05

4B064CA02

4B064CC03

4B064CE08

4B064DA16

4B065AA41X

4B065AC14

4B065BB02

4B065BB10

4B065BC26

4B065BD16

4B065CA12

4B065CA54

(57)【要約】

【課題】本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９８として寄託されているシュードモナス属微生物に関する。また、本発明は、中鎖ＰＨＡ及び長鎖ＰＨＡの製造方法であって、炭素源を含む培地内において前記微生物を培養し、ＰＨＡを前記微生物から単離することを含む方法に関する。
【解決手段】前記微生物は、ＰＨＡを高収量で生成することができる。また、本発明の微生物は、不飽和脂肪酸及び／又は芳香属変性脂肪酸を得られるＰＨＡに効率的に取り込む貴重な能力を有する。従って、本発明の微生物によって化学的に多様なＰＨＡを製造することができ、ＰＨＡを新たな用途・分野において使用することが可能となる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９８として寄託されているシュードモナス属微生物。

【請求項2】

中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法であって、
炭素源を含む培地内において、ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９８として寄託されているシュードモナス属微生物を培養し、
前記ＰＨＡを前記微生物から単離することを含む方法。

【請求項3】

前記培地がＣ−Ｙ培地、好ましくはＣ−Ｙ（２Ｎ）培地である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記炭素源が、
必要に応じて１以上の不飽和部分を含む脂肪酸であって、少なくとも１種の炭素原子数が４〜２０の脂肪酸、好ましくは炭素原子数が８〜１８の脂肪酸と、
芳香族部分を含む少なくとも１種のカルボン酸、好ましくはω−フェニル置換脂肪酸、より好ましくは脂肪酸鎖に４〜１０個の炭素原子を含む脂肪酸、
又はこれらの混合物、を含む、
請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸と１以上の不飽和部分を含むカルボン酸との混合物を前記培地に流加する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記培地には、好ましくは約８〜３０ｍＭの範囲、特に約１０〜２０ｍＭの範囲のアンモニウムモル濃度で、窒素がアンモニウム塩として存在する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記方法はフラスコ振盪法又は回分法であり、前記培地中の炭素／窒素（Ｃ／Ｎ）比が、約２０〜４５の範囲、好ましくは約２５〜３５の範囲である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

初期回分段階後に前記炭素源を半回分式で前記培地に添加して炭素源量を指数的に増加させ、好ましくは約０．０５〜０．１ｈ^−１の範囲、より好ましくは約０．０６〜０．０８５ｈ^−１の範囲の比増殖速度μ_ｓｅｔとする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記回分段階において、前記炭素源を培地に添加した後、前記炭素源が完全に消費される時間にわたって培養を維持し、好ましくは、前記初期回分段階を１２〜２２時間、より好ましくは１２〜１５時間維持する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記炭素源の初期添加により、前記培地中の炭素源濃度を約１０〜２０ｍＭの範囲、好ましくは約１２〜１７ｍＭの範囲とする、請求項８又は９に記載の方法。

【請求項11】

炭素原子数が３〜８のケトン、好ましくはアセトンによって前記ＰＨＡを抽出する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

約６０℃以下、好ましくは約２０〜４０℃の温度によって前記ＰＨＡを抽出する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られるＰＨＡであって、好ましくは不飽和部分及び／又は芳香族部分を含み、より好ましくは５〜２０モル％の飽和モノマー、３０〜７０モル％の不飽和モノマー及び２０〜６０モル％の芳香族モノマーを含むＰＨＡ。

【請求項14】

請求項１に記載の微生物の、中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法における使用。

【請求項15】

遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）に寄託番号ＪＮ６５１４１９（ｐｈａＣ１）又はＪＮ２１６８８４（ｐｈａＣ２）として寄託されているＰＨＡ合成酵素、その類似体又はそれらの混合物の、ＰＨＡ、好ましくは炭素−炭素二重結合及び／又は芳香族部分を含むＰＨＡの製造のための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（ＰＨＡ））の生合成に関する。本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ ＣｕｌｔｕｒｅｓにＤＳＭ２６１９８として寄託されているシュードモナス属の野生型微生物に関する。上記微生物は、ＰＨＡの製造方法において非常に有用であることが判明している。上記微生物は遺伝子改変されておらず、不飽和部分及び芳香族部分を含む炭素源であっても取り込んで様々な特性を有する新規な種類のＰＨＡを生成することができる。また、本発明は、中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法における上記微生物の使用並びにそのような方法によって得られるＰＨＡに関する。

【背景技術】

【0002】

ＰＨＡは、再生可能資源から製造される生分解性・生体適合性熱可塑性材料（ポリマー）（３−ヒドロキシ脂肪酸のポリエステル）であり、広範な工業及び生物医学的用途を有する（非特許文献１）。ＰＨＡは様々な微生物によって合成され、従来の石油化学系プラスチックの代替として使用することにより、プラスチック廃棄物の有害性から環境を保護できる可能性を有するため、広く研究されている。

【0003】

ＰＨＡは、側鎖長及び生合成経路の違いによって２つのグループに分けることができる。（Ｒ）−３−ヒドロキシブチル酸単位のホモポリマーであるＰＨＢ等の短い側鎖を有するＰＨＡは結晶性熱可塑性物質であり、長い側鎖を有するＰＨＡはより高い弾性を有する。前者は約９０年前から知られている（非特許文献２）が、後者の材料は比較的最近発見された（非特許文献３）。ただし、それ以前に、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸単位と、より長い側鎖を有し、炭素原子数が５〜１６の（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位を含む、微生物起源のＰＨＡが同定されていた（非特許文献４）。
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸と、炭素原子数が５〜１６の１種以上の長側鎖ヒドロキシル酸単位のコポリマーを生成する多くの微生物が確認されている（非特許文献５〜１１及び特許文献１）。これらのコポリマーは、ＰＨＢ−ｃｏ−ＨＸ（Ｘは、炭素原子数が６以上の３−ヒドロキシアルカノエート、アルカノエート又はアルケノエートである）と呼ばれる。特定の二成分コポリマーの有用な例は、ＰＨＢ−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である（非特許文献１２及び１３及び特許文献２）。

【0004】

ＰＨＡは、生分解性熱可塑性物質及びバイオポリマーのための再生可能資源としての利用可能性を有するために広く研究され、商業的に開発・販売されている（非特許文献１４）が、ＰＨＡの製造コストは従来の石油化学系プラスチックよりもはるかに高く、ＰＨＡのより広範な使用への大きな障害となっている（非特許文献１５）。
上述したように、多くの微生物（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｌａｎｄｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ等）がＰＨＡを生成する。
公知の全てのＰＨＡ生成微生物は細胞内でＰＨＡを生成し、ＰＨＡ顆粒内にＰＨＡを蓄積する（非特許文献１６）。ＰＨＡの製造が石油化学系プラスチックと比較して高価で不利なものとなる大きな要因は、ＰＨＡを高い収量で生成し、ＰＨＡが蓄積された微生物の細胞から生成したＰＨＡを回収することが困難であることである。
ＰＨＡの総製造コストを減少させるために、一般的にｉ）適切な溶媒、ｉｉ）ＰＨＡの次亜塩素酸塩抽出及び／又はｉｉｉ）非ＰＨＡ細胞物質の消化による細胞破壊（非特許文献１７）を目的とする、効率的な回収方法の開発が必要であると考えられていた。

【0005】

工業規模では、利用可能な微生物は比較的少量のＰＨＡを生成するため、これらの微生物によるＰＨＡの製造は経済的に現実的ではない。公知の方法は、ＰＨＡの製造時に大量の水を必要とすると共に、ＰＨＡの回収のために大量の化学試薬及び／又は酵素を必要とする。これらは、製造コストを減少させるための障害となっている。従って、ＰＨＡを製造するための代替的な方法の提供が至急必要とされている。

【0006】

近年では、微生物により多くのＰＨＡを生成させるためにＰＨＡ生成微生物の遺伝子改変を行う方法が開発されている。特許文献３では、遺伝子をノックアウトすることで遺伝子改変が行われ、ＰＨＡ生成のための中間体にＰＨＡ合成酵素に対して競合的に作用する微生物が開示されている。この微生物により、中間体に作用するＰＨＡ合成酵素を妨げる酵素（微生物）を枯渇させることによって、中間体をＰＨＡに転化させることが可能となる。

【0007】

別の方法として、野生型ではＰＨＡを生成することができない大腸菌等の微生物にＰＨＡ合成酵素を導入する方法が知られている（非特許文献１８）。この方法では、大腸菌ＬＳ１２９８株においてデカノエートを炭素源として使用した場合に、最大で細胞乾燥重量（ＣＤＷ）の約１５％のＰＨＡの蓄積が観察されている。

【0008】

さらに別の方法では、ＰＨＡデポリメラーゼ遺伝子のノックアウトによってＰＨＡの生成量を増加させており、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０を用いた場合のＰＨＡの収量は約４ｇ／Ｌ（ＣＤＷ）であり、最大でＣＤＷの８０％となっている（非特許文献１９）。

【0009】

しかしながら、これらの微生物によるＰＨＡの生成量は、ＰＨＡの生成に必要な資源と比較して依然として相対的に少ない。また、遺伝子改変された微生物の使用を制限している国もあり、これらの微生物の使用において問題が生じる。これらの国では、特に、ＰＨＡを高い収量で生成できる野生型の（遺伝子改変されていない）微生物が有利である。

【0010】

ＰＨＡを生成するほとんどの微生物は、ＰＨＡの生成のための炭素源として飽和脂肪酸しか使用することができない。炭素原子数が６〜約２０の分子鎖長を有する直鎖脂肪酸等の通常の基質から生成するＰＨＡは、通常、−３０〜−５０℃の範囲のポリマーのガラス転移温度を有する。そのため、得られるＰＨＡの有用性は、このようなガラス転移温度に適した用途に制限される。ＰＨＡに取り込むために、対応する微生物に使用することができる基質の範囲を広げることができれば、そのような微生物を使用して得られるＰＨＡの特性を大きく多様化することができる。特に、微生物が入手可能であって、炭素源を取り込み様々な特性を有するＰＨＡを生成することが可能な場合には、ＰＨＡを従来の石油化学系プラスチックの代替として使用できる用途の範囲が大きく変化することになる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許第４，８７６，３３１号

【特許文献2】米国特許第５，２９２，８６０号

【特許文献3】欧州特許出願公開第１ ９１３ １３５ Ａ１号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｐｅｏｐｌｅｓ， １９９６， Ｃｈｅｍｔｅｃｈ． ２６： ３８−４４

【非特許文献2】Ｌｅｍｏｉｇｎｅ ＆ Ｒｏｕｋｈｅｌｍａｎ， １９２５， Ａｎｎ． Ｄｅｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ５２７−５３６

【非特許文献3】ｄｅＳｍｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５４： ８７０−８７８

【非特許文献4】Ｗａｌｌｅｎ ＆ Ｒｏｈｗｅｄｅｒ， １９７４， Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ８： ５７６−５７９

【非特許文献5】Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ ＆ Ｗｉｅｓｅ， １９９２， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３７： ６９１−６９７

【非特許文献6】Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３６： ５０７−５１４

【非特許文献7】Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９４， ４０： ７１０−７１６

【非特許文献8】Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． １６： １１５−１１９

【非特許文献9】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４２： ９０１−９０９

【非特許文献10】Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４５： ３６３−３７０

【非特許文献11】Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４６： ２６１−２６７

【非特許文献12】Ｂｒａｎｄｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． １１： ４９−５５

【非特許文献13】Ａｍｏｓ ＆ ＭｃＩｎｅｒｅｙ， １９９１， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５５： １０３−１０６

【非特許文献14】Ｈｒａｂａｋ， １９９２， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １０３： ２５１−２５６

【非特許文献15】Ｃｈｏｉ ＆ Ｌｅｅ， １９９７， Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ． １７： ３３５−３４２

【非特許文献16】Ｓｔｅｉｎｂuｃｈｅｌ， １９９１， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｐｐ． １２３−２１３

【非特許文献17】Ｌｅｅ， １９９６， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４９： １−１４

【非特許文献18】Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １５７： １５５−１６２

【非特許文献19】Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎ． １００： ２２６５−２２７０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、上述した課題に対処するものである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明は、Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ、３８１２４ ブラウンシュヴァイク、ドイツ）にＤＳＭ２６１９８として寄託されているシュードモナス属の遺伝子改変されていない（野生型）微生物を提供する。
本発明のシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６は、基質として石油Ｔ１３８（１％）を使用して、炭化水素、ディーゼル及び石油で汚染された異なる土（カナダ及びオーストラリアで採取）から得られた集積培養物から単離した。上記微生物は、予期せぬことに、ＰＨＡを高い収量で生成し、例えば、芳香族部分及び／又は不飽和部分を含む通常とは異なる基質をＰＨＡに取り込むことができることが判明した。

【0015】

最適化した条件下では、上記微生物は、４３重量％のＰＨＡ含有量を有する、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）で２２ｇ／Ｌを超えるバイオマス（９ｇ／ＬのＰＨＡ総収量に対応）を生成した。

【0016】

また、本発明は、中鎖ＰＨＡ及び／又は長鎖ＰＨＡの製造方法であって、炭素源を含む培地内において、ＤＳＭＺにＤＳＭ２６１９８として寄託されているシュードモナス属微生物を培養し、前記微生物から前記ＰＨＡを単離することを含む方法に関する。

【0017】

また、本発明の別の態様は、前記方法によって得られ、好ましくは不飽和部分及び／又は芳香族部分を含むＰＨＡ並びに中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法における上記微生物の使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】Ｃ−Ｙ培地内において、異なる流加条件（１Ａ及び１Ｂ：２７ｍＭのＣ１１：１、２Ａ及び２Ｂ：２７＋２７ｍＭのＣ１１：１、３Ａ及び３Ｂ：５４ｍＭのＣ１１：１）で培養したシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。３０℃、２００ｒｐｍで７２時間培養した後、ＰＨＡ抽出のために細胞を回収し、ＴＥＭのために１ｍＬのサンプルを調製した。

【図2】１０−ウンデセノエートを基質として使用したシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６の半回分発酵を示す。（Ａ）はバイオマス及びＰＨＡの生成速度を示し、（Ｂ）はアンモニウム消費量を示し、（Ｃ）はＯＤ_{５５０ｎｍ}測定値を示す。数値は２回の測定の平均値である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明において使用する「中鎖ＰＨＡ」とは、炭素原子数が５〜１３のヒドロキシル酸単位（（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸単位）を意味する。「長鎖ＰＨＡ」とは、１モノマーあたり少なくとも１４個の炭素原子を含むＰＨＡを意味する。

【0020】

本願発明者は、研究過程において、本発明の発酵用の培地が微生物のＰＨＡ生産性に大きな影響を与えることを見出した。複数の産生培地を試験した結果、０．１％酵母抽出物で変性したＭＭ培地（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５： ７０８４−７０９０を参照）に、炭素源として１０−ウンデセノエートを添加した培地で培養した場合にＰＨＡ生産性が最も低かった。
同一条件下において、Ｒ２Ａ培地（Ｒｅａｓｏｎｅｒ ＆ Ｇｅｌｄｒｅｉｃｈ（１９８５， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４９： １−７））を使用した場合にはＰＨＡ収量が有意に増加し、Ｃ−Ｙ培地（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６０： １２４５−１２５４））を使用した場合に最も高いＰＨＡ収量が得られた。この培地を使用した場合のＰＨＡ収量は、ＭＭ培地を使用した場合のＰＨＡ収量の４倍を超えた。
従って、本発明を実施する際には、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．に記載されたＣ−Ｙ培地を使用することが好ましい。

【0021】

バイオマス及びＰＨＡの収量をさらに向上させるために、培地中の窒素（Ｎ）及び炭素（Ｃ）含有量を変更した。Ｃ−Ｙ培地（５ｍＭ硫酸アンモニウム及び２７ｍＭ １０−ウンデセノエート）を使用する場合を好ましい標準条件として、窒素源及び炭素源について２種類の異なる濃度で評価を行った。窒素源濃度及び炭素源濃度を２倍に増加させ、Ｃ／Ｎモル比を３０に維持することにより、ＰＨＡ収量をさらに２倍を超えて増加させることができた。従って、本発明の別の好適な実施形態では、窒素源濃度及び炭素源濃度を増加させた変性Ｃ−Ｙ培地を使用する。

【0022】

本発明の方法において、ＰＨＡの製造のために使用する炭素源は特に限定されない。本発明の方法では、ＰＨＡの製造のために通常使用される炭素源を本発明の微生物と共に使用することができ、例えば、グリセリン、糖、ピルビン酸エステル、炭素原子数が４〜２０の脂肪酸、特に好ましくは炭素原子数が８〜１８の脂肪酸等の従来の脂肪酸を使用することができる。
なお、脂肪酸又はそれらの混合物を炭素源として使用した場合に最も高い収量（ｍｇ／Ｌ）のＰＨＡが得られている。従って、本発明の好ましい方法では、少なくとも１種の炭素原子数が４〜２０の脂肪酸、好ましくは炭素原子数が８〜１８の脂肪酸を含む炭素源を使用する。本発明において使用する好ましい飽和脂肪酸は、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ノナン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステリアン酸及びアラキン酸である。

【0023】

また、本発明の微生物には、オレイン酸や１０−ウンデセン酸等の不飽和脂肪酸を基質として使用することができる。従って、本発明の実施形態では、炭素源として１以上の不飽和部分、好ましくは１つの不飽和部分を含む脂肪酸を使用することが好ましい。
代表的な不飽和脂肪酸としては、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエノン酸及びウンデセン酸が挙げられる。

【0024】

また、本発明の微生物であるシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６は、芳香族部分を含むカルボン酸をＰＨＡに取り込むことができる。従って、本発明に係る好ましい方法では、炭素源は芳香族部分を含む少なくとも１種のカルボン酸を含むことができる。カルボン酸は、上述した脂肪酸と組み合わせて使用してもよく、単独の基質として使用してもよい。

【0025】

芳香族部分を含むカルボン酸は、好ましくは脂肪酸であり、より好ましくはω−アリール置換脂肪酸であり、最も好ましくはω−フェニル置換脂肪酸である。前記脂肪酸は、脂肪酸鎖に４〜１０個の炭素原子を含むことが好ましい。そのような脂肪酸の好ましい例としては、４−フェニル酪酸、５−フェニル吉草酸、６−フェニルヘキサン酸、７−フェニルヘプタン酸、８−フェニルオクタン酸、９−フェニルオクタン酸及び１０−フェニルデカン酸が挙げられる。予期せぬことに、発酵に使用する濃度のカルボン酸は微生物に対して無毒であることが判明した。

【0026】

芳香族部分を含むカルボン酸と脂肪酸の混合物を使用する場合には、芳香族部分を含むカルボン酸は、少なくとも１種の炭素原子数が４〜１４の脂肪酸との混合物として使用し、混合物の約５〜４５％を占めることが好ましい。芳香族部分を含むカルボン酸の濃度が上記の範囲よりも高い場合には、芳香族部分を含むカルボン酸が炭素源混合物の約５〜４５％を占める場合と比較して、ＰＨＡ生成量（ｇ／Ｌ、重量％）の点においてＰＨＡの収量が大きく低下する。芳香族部分を含むカルボン酸の濃度が上記範囲である場合には、総ＰＨＡ生成量及び細胞乾燥重量に対する含有量の両方の点においてＰＨＡの収量は芳香族部分を含むカルボン酸を使用しない発酵と同等である。

【0027】

上述したカルボン酸に加えて、ツベルクロステアリン酸又は７−メチル−７−ヘキサデカン酸等の分岐状カルボン酸をＰＨＡに取り込むこともできる。

【0028】

好適な実施形態において、分岐状カルボン酸は、好ましくは少なくとも４個の炭素原子、さらに好ましくは少なくとも５個の炭素原子によってカルボン酸部分と隔てられた炭素原子において分岐し、カルボン酸部分に近い炭素原子は無置換であることが好ましい。

【0029】

培地中の炭素源は、上述した炭素源の１種のみを含んでいてもよく、上述したカルボン酸の２種以上の混合物を含んでいてもよい。好ましくは、少なくとも１種の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸と、少なくとも１種の１以上の不飽和部分を含むカルボン酸との混合物を使用する。この場合、各炭素源を別々に添加するか、各炭素源を混合物として添加することができる。発酵において２種以上の炭素源、特に、カルボン酸を含む飽和、不飽和及び芳香族部分の混合物を使用する利点は、得られるＰＨＡの特性を正確に微調整することができることである。

【0030】

また、炭素源の混合物は、発酵の開始時にのみ添加するか、発酵時に数回にわたって添加するか、発酵時に連続的に流加することができる。炭素源の混合物を連続的に流加する場合には、実質的な組成ドリフトを生じることなく（すなわち、発酵開始時に形成されたＰＨＡは、発酵中に形成されたＰＨＡと同一の組成を有する）、炭素源をＰＨＡに取り込むことができるという利点が得られる。従って、本発明の方法では、炭素源を連続的に流加することが好ましい。

【0031】

本発明の方法がフラスコ振盪法又は回分法である場合には、培地中の炭素／窒素（Ｃ／Ｎ）比は、約２０〜４５の範囲であることが好ましく、さらに約２５〜３５の範囲であることが好ましい。Ｃ／Ｎ比が２０未満又は４５を超える場合には、Ｃ／Ｎ比が好ましい範囲である場合と比較してＰＨＡ収量が低かった。

【0032】

本発明の一実施形態では、炭素源は、培養の開始時に培養混合物に一括添加する。炭素源を例えば２回（培養開始時と培養中）に分けて添加した場合には、炭素源を一括添加した場合と比較してＰＨＡの収量（ｇ／Ｌ、重量％）が一般的に低かった。

【0033】

フラスコ振盪法又は回分法を使用する場合には、炭素源は、培養混合物中の炭素源の濃度が約２０〜６０ｍＭの範囲、特に約４５〜５５ｍＭの範囲となるように培養混合物に添加することが好ましい。培養混合物中の炭素源の濃度が２０ｍＭ未満となるように炭素源を添加した場合には、炭素源の濃度を上記範囲として発酵させた場合と比較してＰＨＡの収量が低かった。炭素源の濃度が６０ｍＭを超えると、培養環境が微生物に対して毒性となり、増殖に悪影響を与える。

【0034】

本発明の方法のさらなる重要なパラメータは培地中の窒素含有量である。すなわち、窒素は微生物のための重要な栄養分であり、ＰＨＡの生成には炭素が過剰であり、例えば窒素が不足する条件が通常有利である。本発明の好ましい方法では、硫酸アンモニウム又は水酸化アンモニウム等のアンモニウム塩を窒素源として使用する。

【0035】

本発明の好ましい方法では、培地中のアンモニウムイオン（ＮＨ_４^＋）濃度は、約８〜３０ｍＭの範囲であることが好ましく、特に約１０〜２０ｍＭの範囲であることが好ましい。なお、微生物の増殖とＰＨＡの生成に最も大きな影響を与えるのは窒素源の実際の濃度ではなく、Ｃ／Ｎ比である。

【0036】

微生物は酸素を消費してカルボン酸を３−ヒドロキシカルボン酸に転化させるため、発酵中の酸素濃度も本発明において重要である。本発明を実施する際には、培地中の酸素分圧（ｐＯ_２）を約２５〜４５％にすることが好ましく、約３０％に維持することがより好ましい。なお、％はモル％であり、酸素分圧は培地に溶解した気体の全量に基づいて算出する。

【0037】

本発明では、培養時間は特に限定されない。当業者には明らかなように、培養の間、ＰＨＡの生成量はある段階で最大に達し、その後ＰＨＡ含有量は低下するか、変化しない。当業者は、微生物においてＰＨＡの蓄積量が最大となる時間を容易に決定することができると思われる。
回分法においては、約４０時間経過後であって約１００時間経過前にＰＨＡ蓄積量が最大に達した。従って、培養は４８〜９６時間行うことが好ましく、６０〜８４時間行うことがより好ましく、約７２時間行うことが最も好ましい。

【0038】

本発明の微生物において、ＰＨＡ生成のための最適な温度は約３０℃である。従って、本発明の方法は、約１５〜４５℃で行うことが好ましく、約２０〜４０℃の温度で行うことがより好ましい。

【0039】

本発明の一実施形態では、上述した回分法とは異なり、発酵開始後に指数的に増加する量の炭素を添加する半回分法によって培地に炭素源を供給する。指数的に増加する炭素量の算出からのパラメータは以下の式に基づいて算出した。

【0040】

【数1】

【0041】

式中、Ｆ（ｔ）は培養時の炭素源の流量であり、Ｖ_０は培養物の量であり、Ｙ_ｘ／ｓはバイオマスの収量であり、Ｘ_０は回分培養後の初期バイオマスであり、μ_ｓｅｔは所望の比増殖速度であり、Ｓ_０は供給材料中の基質濃度である。

【0042】

本発明の方法におけるμ_ｓｅｔは、約０．０５〜０．１ｈ^−１の範囲であることが好ましく、約０．０６〜０．０８５ｈ^−１の範囲であることがより好ましい。

【0043】

上述した半回分法により、最大収量に達するまでの発酵時間を大きく減少させることができ、最適なＰＨＡ濃度に達するまでの発酵時間を約４０〜４８時間の範囲まで減少させることができた。これは、約７２時間後に最適なＰＨＡ濃度が得られる従来の回分法に対する大きな利点である。

【0044】

上述した方法では、指数的に増加する量の炭素源を添加する前に、炭素源を培地に添加した後、炭素源が完全に消費される時間にわたって培養を維持する回分段階によって発酵を開始させることが好ましい。本発明を実施する際には、初期回分段階は約１２〜２２時間行うことが好ましい。半回分法の初期段階は約１２〜１５時間行うことが好ましい。

【0045】

半回分法では、炭素源の初期添加において、培地中の炭素源濃度を約１０〜２０ｍＭの範囲とすることが好ましく、約１２〜１７ｍＭの範囲とすることがより好ましい。この範囲は、指数的な流加の工程を開始する前に最適な初期培養が行われるように決定したものである。

【0046】

回分法又は半回分法における発酵混合物の撹拌速度は、酸素圧力を上記範囲に維持するために十分な撹拌速度であれば特に限定されない。適当な撹拌速度は発酵条件に応じて異なるが、通常は約２００〜１４００ｒｐｍの範囲である。

【0047】

予期せぬことに、本発明の微生物は、最初に形成された複数のＰＨＡ顆粒を発酵時に単一の顆粒に融合させることが判明した。

【0048】

ＰＨＡを微生物から単離する際には、非塩素化溶媒、好ましくは炭素原子数が３〜８のケトンでＰＨＡを抽出することが好ましい。非塩素化溶媒には、クロロホルムやジクロロメタン等の従来の塩素化溶媒と比較して、廃棄物処理の手間及びコストを大きく減少できるという利点がある。本発明の実施において使用することができるケトンとしては、アセトン、２−メチルエチルケトン、ジエチルケトン、２−メチルプロピルケトン等が挙げられる。ＰＨＡの単離に使用するために最も好ましいケトンはアセトンである。

【0049】

ＰＨＡは、約６０℃未満で抽出することが好ましく、約２０〜４０℃の温度で抽出することがより好ましい。予期せぬことに、本発明の微生物を上記の温度範囲で抽出することによって、より高い温度で抽出した場合と実質的に同一のＰＨＡ収量が得られることが判明した。これは、高い炭素濃度における単一のＰＨＡ顆粒の形成並びに発酵過程の終了時に観察される微生物の細胞壁の崩壊の直接的な結果であると考えられる。
従って、本発明の微生物では、従来の微生物の発酵における複数の顆粒と比較してＰＨＡが溶媒に容易に接触する。また、約０．５〜５時間の抽出後に、実質的に同一の収量の抽出されたＰＨＡを得ることができた。従って、溶媒による抽出は、約１〜３時間行えばよく、約１時間行うことがより好ましい。

【0050】

本発明の別の態様は、上述した方法によって得られるＰＨＡに関する。上述した方法では、芳香族部分及び／又は不飽和部分を含むカルボン酸を取り込むことを含む。上述した方法によって得られるＰＨＡが、５〜２０モル％の飽和モノマー、３０〜７０モル％の不飽和モノマー及び２０〜６０モル％の芳香族モノマーを含むことがより好ましい。

【0051】

また、本発明の別の態様は、中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法における上述した微生物の使用に関する。上記方法の好適な実施形態は、上述した中鎖ＰＨＡ又は長鎖ＰＨＡの製造方法に関して上述した好適な実施形態と同じである。

【0052】

また、本発明の別の態様は、遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）に寄託番号ＪＮ６５１４１９（ｐｈａＣ１）又はＪＮ２１６８８４（ｐｈａＣ２）として寄託されているＰＨＡ合成酵素又はその類似体の、ＰＨＡの製造のための使用に関する。ＰＨＡ合成酵素又はその類似体は、単独又はそれらの混合物として使用することができる。
本発明における「類似体」とは、ＰＨＡ合成酵素と少なくとも約８０％の配列相同性を有し、より好ましくは少なくとも約９０％の配列相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９５％の配列相同性を有し、最も好ましくは少なくとも約９８％の配列相同性を有するものであって、適切な条件下でＰＨＡを合成し、不飽和カルボン酸及び／又は芳香族部分を含むカルボン酸をＰＨＡに取り込むことができる点においてＰＨＡ合成酵素と同等な特性を有するペプチド又はタンパク質を意味する。好適な実施形態である前記使用としては、１以上の不飽和炭素−炭素二重結合及び芳香族部分（好ましくはフェニル部分）を含むＰＨＡの製造のための使用がある。

【実施例】

【0053】

以下、実施例によって本発明についてさらに説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【0054】

実施例１

【0055】

ＰＨＡの製造に最適な培地を選択するために、５００ｍＬフラスコ（培養物：１００ｍＬ）内において、１０−ウンデセノエート（２７ｍＭ）を炭素源として使用して、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６を３種類の異なる培地（ＭＭ＋０．１％ＹＥ培地、Ｒ２Ａ培地、Ｃ−Ｙ培地）中において３０℃、２００ｒｐｍで培養した。

【0056】

【表1】

【0057】

Ｃ−Ｙ培地を使用した場合に最も良い結果が得られた。この場合のバイオマス及びＰＨＡの蓄積はそれぞれ１．６９ｇ／Ｌ及び４８．８重量％であった。

【0058】

実施例２

【0059】

バイオマス及びＰＨＡの収量を向上させるために、窒素（Ｎ）及び炭素（Ｃ）含有量を変更した。実験は、２００ｍＬの培養物を入れた１Ｌフラスコ内において３０℃、２００ｒｐｍで行った。２種類の異なる窒素源濃度（Ｎ及び２Ｎ）及び炭素源濃度（２７ｍＭ及び５４ｍＭ）について評価した。Ｃ−Ｙ培地中における窒素源濃度及び炭素源濃度の標準条件としては、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の濃度を０．６６ｇ／Ｌ（５ｍＭ）（Ｎ）とし、炭素源の濃度を２７ｍＭとした。２Ｎの場合には、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の濃度を１．３２ｇ／Ｌ（１０ｍＭ）とした。

【0060】

【表2】

【0061】

表２から明らかなように、５４ｍＭのＣ１１：１及び１．３２ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を使用した場合に最も良い結果が得られ、窒素源濃度及び炭素源濃度を２倍に増加させ、Ｃ／Ｎモル比を３０に維持することにより、ＰＨＡの収量は２倍に増加した。

【0062】

２７ｍＭのＣ１１：１、２７＋２７ｍＭのＣ１１：１又は５４ｍＭのＣ１１：１と０．６６ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_２を使用した発酵によって得られたサンプルを顕微鏡で観察した。図１は、初期段階及び７２時間の培養後における顆粒形成に対する炭素源の影響を示す。２７ｍＭの基質を培養物に供給した場合には数個の顆粒（図１の１Ａ及び１Ｂ）が観察されたが、炭素源濃度がより高い場合（図１の２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂ）には、細胞のほとんどは細胞質空間全体を占める単一の大きな顆粒のみを含んでいた。観察された形態は、顆粒のサイズが細胞の融解に寄与する可能性を示唆している。

【0063】

また、顆粒形成に対する窒素源濃度の影響も調べた。１．３２ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を使用した場合には、１細胞あたりに複数の大きな顆粒が観察され、微生物細胞は、初期発酵段階で通常のＣ−Ｙ培地で培養したものより良好に見えた。全体として、良好なＰＨＡの蓄積が観察され、画像は表２に示す量的結果と良好に一致していた。７２時間の培養時における顆粒形成過程の変化は、顆粒のサイズが後半の工程におけるＰＨＡの回収に明確な影響を及ぼし得ることを示唆している。

【0064】

実施例３

【0065】

２０ｍＬのＣ−Ｙ培地を入れた１００ｍＬフラスコ内において、異なる基質を使用してシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６を３０℃、２００ｒｐｍで培養し、ＰＨＡ構造に対する補助基質の影響を調べた。１０−ウンデセノエートを使用したＰＨＡ生成を対照として使用し、２種類の異なる芳香族基質（５−フェニルバレレート（５−ＰｈｅＶａｌ）及び８−フェニルオクタノエート（８−ＰｈｅＯｃｔ））及び不飽和／芳香族基質の組み合わせを評価した（表３）。

【0066】

微生物細胞に対する毒性について、芳香族基質について最初に試験を行った。表３は、単一の炭素源としての５−フェニルバレレート又は８−フェニルオクタノエート内で培養した場合に微生物が増殖し、ＰＨＡが蓄積できたことを示している。しかしながら、５−フェニルバレレート又は８−フェニルオクタノエートを使用した場合にはＰＨＡの収量はそれぞれ１５〜１８重量％及び７重量％と低かった。芳香族基質を１０−ウンデセノエート（１４ｍＭ又は２７ｍＭ）と共に使用した場合には、ＰＨＡの収量は４０〜５０重量％に増加した。

【0067】

【表3】

【0068】

５−フェニルバレレートを１０−ウンデセノエート（２７ｍＭ）と組み合わせて使用した場合には、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６は２〜５％の芳香族モノマーを含むＰＨＡポリマーを蓄積した。上記数値は低いものだが、得られたポリマーの熱的特性における大きな変化が観察された。

【0069】

ＮＭＲ分光法及びＧＣ−ＭＳによってＰＨＡを調べた。結果を表４に示す。

【0070】

【表4】

【0071】

ＮＭＲ分析結果は、１０〜１２％の飽和モノマー（３−ヒドロキシオクタノエート及び３−ヒドロキシデカノエート）の存在を示している。これらの飽和モノマーの存在は、微生物がβ−酸化に加えて他の代謝経路（例えば、脂肪酸のデノボ合成）を使用してポリヒドロキシアルカン酸を合成した結果であることが考えられる。２ｍＭの５−フェニルバレレートを１０−ウンデセノエートと共に流加にて使用した場合には、芳香族モノマーの相対的な割合は２６モル％に達し、５ｍＭの５−フェニルバレレートを使用した場合には、芳香族モノマーの相対的な割合は５３モル％に増加した。

【0072】

５ｍＭの８−フェニルバレレートを１０−ウンデセノエートと共に流加にて使用した場合には、芳香族モノマーの割合は２３モル％、不飽和モノマーの割合は６５モル％、飽和（Ｃ８：０及びＣ１０：０）モノマーの割合は１２モル％となった。

【0073】

生成したＰＨＡのさらなる分析データを表５に示す。

【0074】

【表5】

【0075】

異なる基質の組み合わせを使用してシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６によって生成されたポリマーは同様な分子量分布を示した。ただし、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６ Ｃ１１：１（１４ｍＭ）＋５ＰｈｅＶａｌ（５ｍＭ）の場合には、分子量は有意に低くなり、ＰＤＩは最も高かった。表６に示すＤＳＣ分析結果も、分析した残りのＰＨＡポリマーと比較した場合に上記ポリマーの異なる挙動を示唆している。

【0076】

【表6】

【0077】

実施例４

【0078】

Ｃ−Ｙ培地又はＣ−Ｙ（２Ｎ）培地内において、オレイン酸（１％）を基質として使用してシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６を培養した。Ｃ−Ｙ（２Ｎ）培地を使用した場合に最大のバイオマス（ＣＤＷ：４．５ｇ／Ｌ）及びＰＨＡ（２．１ｇ／Ｌ）の収量が得られたが、ＰＨＡの蓄積（〜５０重量％）は両方の条件において同様だった。

【0079】

ＧＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分析によれば、得られたＰＨＡポリマーは、８モル％の３ＯＨＣ６：０、４４．２モル％の３ＯＨＣ８：０、２４．５モル％の３ＯＨＣ１０：０、１０．７モル％のＣ３ＯＨＣ１２：０及び１２．６モル％の３ＯＨＣ１４：１（３ＯＨＣ＝３−ヒドロキシカルボン酸、１４：１の最初の数字（１４）は総炭素原子数であり、１４：１の２番目の数字（１）は二重結合の数である）からなるものだった。上記ポリマーのその他の特性を表７に示す。

【0080】

【表7】

数値はＧＰＣ（ユニバーサルキャリブレーション）で測定した。Ｍ_ｐ：ピーク最大値の分子量、Ｍ_ｎ：数平均分子量、Ｍ_ｗ：質量平均分子量、ＰＤＩ：多分散指数、Ｔ_ｇ：ガラス転移温度、Ｔ_ｇ，ｃ：冷却温度、Δｃ_ｐ：Ｔｇにおける熱容量の変化、Ｔ_ｄ：融点、ΔＨ_ｄ：融解エンタルピー。全てのデータは、２回目の加熱又は１回目の冷却時にＤＳＣによって得た。

【0081】

実施例５

【0082】

Ｃ−Ｙ（２Ｎ）培地内において、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６を半回分法で培養した（撹拌速度：４００ｒｐｍ、空気流量：３Ｌ／分、酸素分圧（ｐＯ_２）：３０％（培地に溶解し全気体に対する値、カスケード制御を使用して維持））。動力学的パラメータを算出し、０．０７５ｈ^−１のμ_ｓｅｔを選択した。ＮＨ_４^＋を流加するために外部ポンプを使用した。計算に従って、炭素源が完全に消費されるように初期回分操作を１５時間まで行った後、４４時間の指数的な流加を行った。

【0083】

１５時間の初期培養によって炭素源は完全に消費され（ＨＰＬＣ分析で検出）、指数的な流加を開始した。培養物はすぐに反応し、高い代謝活性のために酸素の需要が増加した。撹拌速度を最大（９００ｒｐｍ）まで増し、純酸素を供給した。培養過程の最後まで空気に混合する純酸素の割合を増加させる必要があり、２８モル％に達した。

【0084】

バイオマス及びＰＨＡの生成に関するデータを表８にまとめた。表８に示すデータは、４０時間の培養後に微生物の増殖が停止したが、蓄積は継続したことを示しており、窒素消費に関して生じ得る問題を示唆している。

【0085】

【表8】

【0086】

ＰＨＡ（重量％）の蓄積は発酵の初期段階でより高く、発酵過程にわたって４５〜６０重量％に達した。注目すべきことに、上記培養条件下では、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６は増殖するよりも多くのＰＨＡ（７．４１ｇ／Ｌ）の合成を行い、ＰＨＡを含まない残りのバイオマスは約４．５ｇ／Ｌだった。

【0087】

実施例６

【0088】

実施例５と実質的に同様の条件により、Ｃ−Ｙ（２Ｎ）培地内において、シュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６を改良した半回分法で培養した（撹拌速度：４００ｒｐｍ、空気流量：３Ｌ／分、ｐＯ_２：カスケード制御を使用して３０％に固定）。動力学的パラメータを再度算出し、０．０７５ｈ^−１のμ_ｓｅｔに固定した。１４時間の初期回分発酵では２．５ｇ／ＬのＣ１１：１を使用して回分培養を行い、その後４５時間の指数的な流加を行った。

【0089】

１４時間の初期培養によって炭素源は完全に消費され（ＨＰＬＣ分析で検出）、指数的な流加を開始した。回分培養における増殖過程は予想よりも早く、１０時間の培養後終了した。指数的な流加を開始した直後に培養物は反応し、必要な撹拌及び高い代謝活性による酸素消費量が劇的に増加した。撹拌速度を１４００ｒｐｍまで増加させ、ｐＯ_２を３０％に維持するために６０％の純酸素を含む混合気体が必要だった。

【0090】

アンモニウムの流加はポリマーの蓄積に直接的な影響を与えた。ＰＨＡの蓄積は、最も増殖する段階（２４〜３６時間の培養時）で大きく減少した（図２Ａ、参照）。培地内のアンモニウム含有量を約４００ｍｇ／Ｌ（約２２ｍＭ）に維持して微生物を増殖させた（図２Ｂ）。３６時間の培養後にＰＨＡの蓄積が再び開始した。これはアンモニウム消費量の減少によって示された。

【0091】

４２時間の培養後、気泡形成の増加が観察された。培養を４５時間で終了した。微生物によって生成されたＰＨＡを単離したところ、細胞乾燥重量は２２．５ｇ／Ｌであり、ＰＨＡ収量は８．９ｇ／Ｌだった。

【0092】

実施例７

【0093】

ＰＨＡ回収におけるＰＨＡ顆粒合体の影響を溶媒抽出法によって評価した。２種類の異なる溶媒（アセトン及びクロロホルム）内において、異なる抽出温度（室温及び８０℃）及び異なる抽出時間（１時間及び３時間）によりＰＨＡの抽出を行った。（ｉ）細胞質に沿って分布する複数の顆粒形成及び（ｉｉ）微生物細胞全体を占める単一の大きな顆粒の形成において観察される２種類の異なる形態を評価するために、２種類の異なる培養条件を選択した。

【0094】

Ｃ−Ｙ培地内において、２種類の異なる炭素源濃度（（ａ）２７ｍＭのＣ１１：１、（ｂ）２７＋２７ｍＭのＣ１１：１（２４時間の培養後に２７ｍＭのＣ１１：１を添加））においてシュードモナス属微生物ＩＰＢ−Ａ３６を３０℃、２００ｒｐｍで培養した。７２時間の培養後に細胞を採取し、凍結乾燥した後、上述した異なる抽出条件で抽出した。４０ｍｇの凍結乾燥バイオマス試料を抽出管に入れ、対応する溶媒に再懸濁させて抽出した。ＰＨＡ回収率を表９にまとめた。

【0095】

【表9】

【0096】

各抽出条件下において、クロロホルムを抽出溶媒として使用した場合に最も高いＰＨＡ回収率が得られた。２７ｍＭのＣ１１：１を炭素源とした場合：４４〜４８％、２７＋２７ｍＭのＣ１１：１を炭素源とした場合：５８〜６０％であった。

【0097】

クロロホルム（３時間、８０℃）による典型的な抽出におけるＰＨＡ回収率を最大（１００％）とみなし、２種類の顆粒形態間に何らかの差があるか否かを評価するための相対的なＰＨＡ回収率を算出するための対照とした。抽出時間にかかわらず、クロロホルムによる室温での抽出は、２種類の顆粒形態間でわずかな差（約５％）を示した。２７ｍＭのＣ１１：１を使用した場合（複数の顆粒）の相対的なＰＨＡ回収率は９５％であり、２７＋２７ｍＭのＣ１１：１を使用した場合（単一の大きな顆粒）の相対的なＰＨＡ回収率は１００％だった。クロロホルムを８０℃で使用した場合には、相対的なＰＨＡ回収率（相対％）の差はみられなかった。アセトンを溶媒として使用した場合には、クロロホルム（９５〜１００相対％）を使用した場合よりも相対的なＰＨＡ回収率は低く（８５〜９５相対％）、２種類の顆粒形態間でわずかな差（５〜８相対％）が検出された。相対的なＰＨＡ回収率の５〜８％の上昇がみられた。

【図1】

【図2】

【外国語明細書】

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