特開 2016-13104 抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、キット、診断方法、治療用組成物、治療方法、核酸、ベクター、キメラ抗原受容体及びＴ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-13104(P2016-13104A)

(43)【公開日】2016年1月28日

(54)【発明の名称】抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、キット、診断方法、治療用組成物、治療方法、核酸、ベクター、キメラ抗原受容体及びＴ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20151228BHJP

   C12N 15/02 20060101ALI20151228BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20151228BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20151228BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20151228BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20151228BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20151228BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20151228BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20151228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20151228BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20151228BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20151228BHJP

   A61K 35/26 20150101ALI20151228BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20151228BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20151228BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20151228BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N15/00 C

   C07K16/28

   C07K14/725

   C07K19/00

   C12N5/00 202L

   C12Q1/04

   C07K16/46

   A61K39/395 G

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P43/00 171

   A61K35/26

   A61K35/12

   G01N33/574 D

   C12P21/08

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2014-137238(P2014-137238)

(22)【出願日】2014年7月2日

(71)【出願人】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(71)【出願人】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(72)【発明者】

【氏名】中西 照幸

(72)【発明者】

【氏名】亘 敏広

(72)【発明者】

【氏名】加納 塁

(72)【発明者】

【氏名】藪 健史

(72)【発明者】

【氏名】水野 拓也

【テーマコード（参考）】

4B024

4B063

4B064

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024AA11

4B024BA43

4B024BA63

4B024CA04

4B024CA07

4B024DA02

4B024GA05

4B024GA11

4B024HA15

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR72

4B063QR77

4B063QS33

4B063QX02

4B064AG27

4B064CA19

4B064CA20

4B064CC24

4B064DA05

4B064DA14

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA92Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA43

4B065CA46

4C085AA13

4C085AA14

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA02

4C087BB43

4C087BB63

4C087BB70

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045EA51

4H045EA54

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】イヌの生きた細胞や組織を用いてＣＤ２０陽性細胞の解析ができる、モノクローナル抗体又は抗体断片、これらをコードする核酸及びベクター、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断用キット及び診断方法、治療用組成物及び治療方法、上記の抗体の抗原反応ドメインを有するキメラ抗原受容体、当該キメラ抗原受容体をコードする核酸及びベクター、上記キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞並びに当該Ｔ細胞を用いたイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供する。
【解決手段】イヌＣＤ２０の細胞外領域に対するモノクローナル抗体又は抗体断片、これらをコードする核酸及びベクター、イヌＢ細胞性リンパ腫診断用キット及び診断方法、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物及び治療方法、キメラ抗原受容体、これをコードする核酸及びベクター、上記キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

イヌＣＤ２０の細胞外領域に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。

【請求項2】

ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、
ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項3】

ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項２に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項4】

配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列又は配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、
配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列又は配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項5】

配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項４に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項6】

キメラ抗体又はイヌ化抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌＢ細胞性リンパ腫診断用キット。

【請求項8】

イヌ由来の生体試料に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを反応させる工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断方法。

【請求項9】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物。

【請求項10】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを、イヌに投与する工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法。

【請求項11】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。

【請求項12】

請求項１１に記載の核酸を発現可能に保持するベクター。

【請求項13】

抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及びＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインを有する、キメラ抗原受容体であって、前記抗原結合ドメインが、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインである、キメラ抗原受容体。

【請求項14】

請求項１３に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。

【請求項15】

請求項１４に記載の核酸を発現可能に保持するベクター。

【請求項16】

請求項１３に記載のキメラ抗原受容体を発現したＴ細胞。

【請求項17】

請求項１６に記載のＴ細胞を、イヌに投与する工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、イヌＢ細胞性リンパ腫診断用キット、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断方法、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法、上記の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸、ベクター、キメラ抗原受容体及びＴ細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ２０は、細胞膜を４回貫通する膜タンパク質であり、形質細胞を除く後期ＰｒｏＢ細胞から免疫芽球様Ｂ細胞までの幅広い成熟段階のＢ細胞に発現する。ＣＤ２０の機能やリガンドは不明であるが、Ｂ細胞の活性化、増殖分化の制御に関係し、シグナル伝達に関わっていると推測されている。また、細胞内へのＣａ^２＋の流入に関与することが示唆されている。ヒトでは、多くのＢ細胞性リンパ腫において発現し、９０％以上のＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞の表面に発現することが知られている。

【0003】

現在、イヌの死亡原因の上位に癌が含まれている。特に、リンパ腫の中でもＢリンパ腫が多く、イヌＢ細胞性リンパ腫は、イヌの代表的な悪性血液疾患となっている。イヌＢ細胞性リンパ腫は、ＣＤ２０の過剰発現を特徴とし、従来の抗癌剤療法では完治が難しい疾病である。

【0004】

ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体は、ヒトでは１９８０年に作製され、その後、認識する抗原部位の異なる多くの抗体が作製されている。中でも、リツキシマブはＣＤ２０陽性細胞にアポトーシスを誘導することから、抗癌剤耐性のヒトＢ細胞リンパ腫に対して優れた治療効果を示す。

【0005】

ヒトにおいては、リツキシマブ等のＣＤ２０の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体が抗体医薬として用いられている。しかしながら、これらの抗体は種特異性が高く、イヌのＣＤ２０の細胞外領域には反応しない。したがって、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療には用いることができない。

【0006】

現在市販されている抗ヒトＣＤ２０抗体は、イヌの固定した組織中のＣＤ２０に交差反応する。このため、イヌの病理組織学的解析には、市販の抗ヒトＣＤ２０抗体が用いられているのが現状である。しかしながら、上述したように、抗ヒトＣＤ２０抗体は、イヌＣＤ２０の細胞外領域を認識しないため、イヌの生きた細胞の表面に発現したＣＤ２０には反応しない。

【0007】

イヌの生体組織を用いた、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析、蛍光顕微鏡観察等により、ＣＤ２０陽性細胞の動態や形態を解析するためには、イヌの生きた細胞表面のＣＤ２０を認識する抗体が必要である。このため、イヌＣＤ２０に対して良好な反応性を示すモノクローナル抗体の作製が試みられてきた（例えば、非特許文献１を参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】科学研究費補助金研究成果報告書、課題番号：１９７８０２３２、平成２１年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、非特許文献１に記載の抗体は、反応性が十分であるとはいえなかった。そこで、本発明は、イヌの生きた細胞や組織を用いた、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等による、ＣＤ２０陽性細胞の動態や形態の解析に用いることができる、モノクローナル抗体又はそのフラグメントを提供することを目的とする。本発明はまた、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断用キット及び診断方法を提供することを目的とする。本発明はまた、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物及びイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供することを目的とする。本発明はまた、上記の抗体又はそのフラグメントをコードする核酸及びベクターを提供することを目的とする。本発明はまた、上記の抗体又は抗体フラグメントの抗原反応ドメインを有するキメラ抗原受容体、当該キメラ抗原受容体をコードする核酸及びベクター、上記キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞並びに当該Ｔ細胞を用いたイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は以下の通りである。
（１）イヌＣＤ２０の細胞外領域に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（２）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（３）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（２）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（４）配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列又は配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列又は配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメント。
（５）配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（４）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（６）キメラ抗体又はイヌ化抗体である、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメント。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌＢ細胞性リンパ腫診断用キット。
（８）イヌ由来の生体試料に、（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを反応させる工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断方法。
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物。
（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを、イヌに投与する工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
（１２）（１１）に記載の核酸を発現可能に保持するベクター。
（１３）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及びＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインを有する、キメラ抗原受容体であって、前記抗原結合ドメインが、（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインである、キメラ抗原受容体。
（１４）（１３）に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
（１５）（１４）に記載の核酸を発現可能に保持するベクター。
（１６）（１３）に記載のキメラ抗原受容体を発現したＴ細胞。
（１７）（１６）に記載のＴ細胞を、イヌに投与する工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、イヌの生きた細胞や組織を用いた、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等による、ＣＤ２０陽性細胞の動態や形態の解析に用いることができる、モノクローナル抗体又はそのフラグメントを提供することができる。また、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断用キット及び診断方法を提供することができる。また、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物及びイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供することができる。また、上記の抗体又はそのフラグメントをコードする核酸及びベクターを提供することができる。また、上記の抗体又は抗体フラグメントの抗原反応ドメインを有するキメラ抗原受容体、当該キメラ抗原受容体をコードする核酸及びベクター、上記キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞並びに当該Ｔ細胞を用いたイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】（ａ）は、ＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。

【図2】（ａ）は、免疫沈降及びウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。（ｂ）は、ウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。

【図3】免疫沈降及びウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。

【図4】（ａ）は、ＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

［抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体又は抗体ラグメント］
１実施形態において、本発明は、イヌＣＤ２０の細胞外領域に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供する。

【0014】

抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。ｓｃＦｖのリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号２３）等のペプチドが挙げられる。

【0015】

本実施形態の抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、イヌＣＤ２０の細胞外領域に良好に結合することができることから、イヌの生きた細胞や組織を用いた、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等による、ＣＤ２０陽性細胞の動態や形態の解析に用いることができる。

【0016】

抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、例えば、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。

【0017】

抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、イヌＣＤ２０の細胞外領域に対する反応性を有している限り、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及びＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。ここで、重鎖可変領域又は軽可変領域のＣＤＲ１〜３における数個とは、５個、４個、３個又は２個を意味する。

【0018】

また、抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。

【0019】

抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、イヌＣＤ２０の細胞外領域に対する反応性を有している限り、配列番号７の２０〜１３８番目の残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８の２１〜１２７番目の残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。ここで、重鎖可変領域又は軽可変領域における数個とは、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個を意味する。

【0020】

また、抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、キメラ抗体又はイヌ化抗体であってもよい。ここで、キメラ抗体とは、抗体の定常領域部分が、他の動物由来の抗体の定常領域部分に置き換えられた抗体をいう。ここで、他の動物由来の抗体としては、イヌ抗体が好ましい。また、イヌ化抗体とは、可変領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみがラット等の非イヌ動物抗体由来であり、ＣＤＲ以外の可変領域中のフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域がイヌ抗体由来であるものをいう。キメラ抗体又はイヌ化抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよいが、例えばＩｇＧであることが好ましい。

【0021】

イヌに非イヌ抗体を投与すると、異種抗原に対する免疫応答が惹起され、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用が生じる場合がある。これに対し、抗体の定常領域部分がイヌ抗体に置き換えられたキメラ抗体又はイヌ化抗体であれば、このような副作用が低減されるため、イヌに投与することができる。

【0022】

抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等の酵素；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン、アレクサフルオロ４８８、アレクサフルオロ６４７等の蛍光物質；トリチウム、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１等の放射性核種；ビオチン；ストレプトアビジン等が挙げられる。

【0023】

［イヌＢ細胞性リンパ腫診断用キット］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌＢ細胞性リンパ腫診断用キットを提供する。

【0024】

上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、イヌの生きた細胞の表面に発現したＣＤ２０に対して良好な反応性を示す。したがって、本実施形態のキットは、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断に好適に用いられる。

【0025】

本実施形態のキットの抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、非標識であってもよいし、標識されていてもよい。また、溶液状態で提供されてもよいし、凍結乾燥された粉末状態で提供されてもよい。抗体又は抗体フラグメントが非標識である場合には、例えば、標識された２次抗体を使用して、細胞の表面に発現したＣＤ２０を検出することができる。

【0026】

本実施形態のキットは、抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントの他に、抗体が酵素標識されていた場合の当該酵素の発色基質等を含んでいてもよい。また、抗体や発色基質を希釈するための緩衝液等を含んでいてもよい。

【0027】

［イヌＢ細胞性リンパ腫の診断方法］
１実施形態において、本発明は、イヌ由来の生体試料に、上記した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを反応させる工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断方法を提供する。

【0028】

本実施形態の診断方法について以下に説明する。まず、例えば、対象のイヌから少量の生体組織を採取する。生体組織としては、例えば血液が挙げられる。続いて、例えば、市販のリンパ球比重分離液を使用して、血液からリンパ球を分離する。続いて、回収したリンパ球（以下、「末梢リンパ球」という場合がある。）に上記抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを混合し、反応させる。その後、未反応の抗体を洗浄除去し、必要であれば標識された２次抗体を反応させて、更に未反応の２次抗体を洗浄除去する。その後、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等を行い、ＣＤ２０陽性細胞の動態や形態を観察し、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断を行う。

【0029】

本実施形態の診断方法では、イヌの生きた細胞を使用することができ、細胞の固定操作も不要であるため、より正確かつ簡便にイヌＢ細胞性リンパ腫の診断を行うことができる。

【0030】

［イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物を提供する。抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントは、薬剤と結合されていてもよい。薬剤としては、抗癌剤、放射性核種等が挙げられる。

【0031】

上述したように、多くのＢ細胞性リンパ腫細胞の表面には、ＣＤ２０が過剰発現している。そこで、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントをＢ細胞性リンパ腫に罹患したイヌに投与すると、Ｂ細胞性リンパ腫細胞の表面のＣＤ２０に結合する。その結果、抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）活性、アポトーシス誘導等の機構により、当該Ｂ細胞性リンパ腫細胞を殺傷することができる。

【0032】

また、抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントに抗癌剤や放射性核種を結合させたものを、Ｂ細胞性リンパ腫に罹患したイヌに投与すると、Ｂ細胞性リンパ腫細胞にターゲティングして、抗癌剤や放射線の作用によりＢ細胞性リンパ腫細胞を殺傷することもできる。

【0033】

したがって、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする組成物は、Ｂ細胞性リンパ腫の治療用組成物として有用である。

【0034】

本実施形態の治療用組成物は、抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを主成分とする。抗体又は抗体フラグメント以外の成分としては、水等の溶媒、界面活性剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、無水クエン酸、ｐＨ調整剤等の薬学的に許容可能な添加物が挙げられる。治療用組成物は、静脈注射用又は点滴用であってもよい。治療用組成物は、液体で供給されてもよく、粉末で供給され、使用前に水や緩衝液等で溶解するように構成されていてもよい。

【0035】

［抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを使用したイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントを、イヌに投与する工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供する。

【0036】

本実施形態の治療用組成物の投与量及び投与間隔としては、例えば、抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントが１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度投与される量を、１週間に１回程度の間隔で投与することが挙げられる。投与方法としては、静脈注射、点滴等が挙げられる。

【0037】

［抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供する。このような核酸としては、例えば、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の重鎖可変領域遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の軽鎖可変領域遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の重鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の軽鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の重鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の重鎖可変領域遺伝子に非ラット抗体重鎖定常領域の一部又は全長が連結された遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の軽鎖可変領域遺伝子に非ラット抗体重鎖定常領域の一部又は全長が連結された遺伝子、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする遺伝子等が挙げられる。

【0038】

上記の重鎖可変領域遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列の９７〜４５３番目の残基からなる重鎖可変領域遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、配列番号１０に記載の９９〜４１９番目の残基からなる軽鎖可変領域遺伝子であってもよい。

【0039】

また、上記の重鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が、非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。ここで、非ラット抗体としては、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ヒト等の抗体が挙げられ、特にイヌ抗体であることが好ましい。

【0040】

本実施形態の核酸は、上述した抗イヌＣＤ２０抗体の重鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子と、抗イヌＣＤ２０抗体の軽鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子との組み合わせであることが好ましい。ここで、重鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。また、同様に、軽鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。

【0041】

［抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体又は抗体フラグメントの発現ベクター］
１実施形態において、本発明は、上述した抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を発現可能に保持するベクターを提供する。本実施形態のベクターにより、上述した核酸を発現させ、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体断片を作製することができる。ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば、大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ、動物細胞発現用のｐＣＭＶ、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。

【0042】

［イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体］
１実施形態において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及びＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインを有する、キメラ抗原受容体であって、前記抗原結合ドメインが、上述の抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインである、キメラ抗原受容体を提供する。

【0043】

キメラ抗原受容体とは、腫瘍免疫回避機構に打ち勝つために考案された人工Ｔ細胞受容体のことである。癌の治療において、患者のＴ細胞にキメラ抗原受容体を遺伝子導入し、そのＴ細胞を体外で増幅培養した後に患者に輸注するという、遺伝子改変Ｔ細胞療法が検討されている。

【0044】

キメラ抗原受容体は、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをＮ末端側に有し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ζ鎖をＣ末端側に有する融合タンパク質を基本構造とする、人工Ｔ細胞受容体の総称である。

【0045】

キメラ抗原受容体を発現させたＴ細胞は、ｓｃＦｖ領域で腫瘍抗原を認識した後、その認識シグナルを、Ｃ末端側のζ鎖を通じてＴ細胞内に伝達するため、細胞傷害（ＣＴＬ）活性及び増殖能が高い。

【0046】

Ｔ細胞の活性化を更に増強するために、ｓｃＦｖとζ鎖の間に共刺激分子（ＣＤ２８、４−１ＢＢの一方又は双方）を組み込んだキメラ抗原受容体も検討されている。

【0047】

本実施形態において、抗原結合ドメインとは、抗原分子と結合する抗体分子上の部位を意味する。抗原結合ドメインとしては、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む部位が挙げられ、例えば、上述した抗イヌＣＤ２０抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖ等が挙げられる。ここで、リンカーとしては、例えば（ＧＧＧＧＳ）_３等が挙げられる。

【0048】

本実施形態のキメラ抗原受容体の膜貫通ドメインとしては、Ｔ細胞受容体ζ鎖の膜貫通ドメイン等が挙げられる。また、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとしては、Ｔ細胞受容体ζ鎖のシグナル伝達ドメイン等が挙げられる。キメラ抗原受容体は、更にＣＤ２８の一部、又は４−１ＢＢの一部を含んでいてもよい。

【0049】

［イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体をコードする核酸］
１実施形態において、本発明は、上述したキメラ抗原受容体をコードする核酸を提供する。

【0050】

本実施形態において、上述した抗原結合ドメインを構成する重鎖可変領域をコードする遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列の９７〜４５３番目の残基からなる重鎖可変領域遺伝子であってもよい。また、上述した抗原結合ドメインを構成する軽鎖可変領域をコードする遺伝子は、配列番号１０に記載の９９〜４１９番目の残基からなる軽鎖可変領域遺伝子であってもよい。

【0051】

また、重鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。また、軽鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が、非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。ここで、非ラット抗体としては、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ヒト等の抗体が挙げられ、特にイヌ抗体であることが好ましい。

【0052】

［イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体の発現ベクター］
１実施形態において、本発明は、上述したイヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体をコードする核酸を発現可能に保持するベクターを提供する。本実施形態のベクターを、対象のイヌから抽出したＴ細胞に導入して発現させることにより、ＣＤ２０発現細胞に対する細胞傷害（ＣＴＬ）活性が高いＴ細胞を作製することができる。

【0053】

ベクターとしては、例えば、動物細胞発現用のｐＣＭＶ、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。

【0054】

［イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞］
１実施形態において、本発明は、上述したイヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞を提供する。

【0055】

本実施形態のＴ細胞は、例えば次のようにして作製することができる。まず、対象のイヌから血液を採取する。続いて、例えば、市販のリンパ球比重分離液を使用して、血液からリンパ球を分離する。続いて、回収したリンパ球に上述したイヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体の発現ベクターを導入して発現させる。

【0056】

回収したリンパ球は、イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体の発現ベクターを導入する前に、例えば、抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン（ＩＬ）−２の存在下で培養し、Ｔ細胞を活性化することが好ましい。また、イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体の発現ベクターは、遺伝子導入効率の観点から、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターであることが好ましい。

【0057】

遺伝子導入後のＴ細胞は、イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現する。イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞は、１〜４週間培養した後に、対象のイヌに導入することができる。イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞は、対象のイヌに導入する前に凍結保存してもよい。

【0058】

本実施形態のＴ細胞は、上述した抗イヌＣＤ２０抗体又は抗体フラグメントの抗原結合特性を有しており、抗原プロセシングと無関係に、非ＭＨＣ拘束的に、イヌＣＤ２０発現細胞を攻撃することができる。したがって、主要な腫瘍免疫回避機構に打ち勝つことができる。したがって、本実施形態のＴ細胞は、イヌＢ細胞性リンパ腫の強力な治療剤として有用である。

【0059】

［イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞を使用したイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法］
１実施形態において、本発明は、上述したイヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞を、イヌに投与する工程を含む、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供する。

【0060】

Ｔ細胞を投与する前に、対象のイヌに予めシクロフォスファミド又はフルダラビンを投与し、イヌ体内のＴ細胞を減少させておくことが好ましい。これにより、投与したイヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体がイヌの体内で増殖しやすくなる。

【0061】

投与された、イヌＣＤ２０特異的キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞は、イヌ体内でＣＤ２０発現細胞に遭遇した際に、抗原結合ドメインで細胞表面のＣＤ２０を認識し、その認識シグナルを、Ｃ末端側のζ鎖を通じてＴ細胞内に伝達し活性化する。その結果、Ｔ細胞の細胞質内に蓄えられていたパーフォリン・グランザイム等の細胞傷害性タンパク質を放出することによって、ＣＤ２０発現細胞にアポトーシスを誘導する。

【0062】

本実施形態の治療方法によれば、このような機構により、イヌＢ細胞性リンパ腫を治療することができる。

【実施例】

【0063】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0064】

〔実験例１〕
［抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体の作製］
（イヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株の樹立）
すでに報告されているイヌＣＤ２０ ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、健常イヌ浅頸リンパ節由来ｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、イヌＣＤ２０ ｃＤＮＡをクローニングした。

【0065】

続いて、イヌＣＤ２０ ｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、ラット腎臓由来細胞株であるＮＲＫ細胞株に遺伝子導入後、ネオマイシン存在下で培養し、イヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株を樹立した。

【0066】

（ラットの免疫及びハイブリドーマの作製）
従来、遺伝子情報を基に作製した抗原については、大腸菌等を用いて作成した組み換えタンパク質を免疫抗原として主に用いられてきた。しかし、組み換えタンパク質を免疫して得られたほとんどの抗体は、目的の分子の１次構造を認識することができても、細胞表面に発現した場合の３次元構造を認識することができない。

【0067】

そこで、本発明者らはラット腸骨リンパ節法によるラットの免疫を行った。より具体的には、上述したイヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株を、ＮＲＫ細胞株と同系のラットに免疫した。これにより、ＮＲＫ細胞株の細胞表面に発現した非自己のイヌＣＤ２０のみを認識する抗体が得られると考えられた。

【0068】

イヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株を、アジュバントであるＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ社）と混合し、Ｗｉｓｔａｒラット（日本エスエルシー株式会社）のフットパッドに投与し、初回免疫７日後及び１４日後にブーストを行った。続いて、最終免疫から３日後に、膝下リンパ節及び鼡径リンパ節を採取し、リンパ球を回収した。続いて、回収したリンパ球及びマウスミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を細胞融合した。得られた細胞を、ＨＡＴ培養液で培養して、リンパ球とマウスミエローマ細胞とが融合したハイブリドーマを選択した。

【0069】

（ハイブリドーマのスクリーニング）
得られたハイブリドーマの培養上清中の抗体を、イヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株と反応させ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。２次抗体としては、蛍光標識された抗ラットＩｇＧ抗体を使用した。

【0070】

更に、候補のハイブリドーマの培養上清中の抗体を、イヌ末梢リンパ球と反応させ、ＦＡＣＳにより、反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。

【0071】

有望なハイブリドーマについて、限界希釈法によりクローニングを行い、ハイブリドーマ細胞株Ｃｌｏｎｅ１２を得た。

【0072】

〔実験例２〕
［ＦＡＣＳ及びＲＴ−ＰＣＲによる抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体の解析］
ハイブリドーマ細胞株Ｃｌｏｎｅ１２が産生するモノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２を、イヌ末梢リンパ球と反応させ、ＦＡＣＳによりＣＤ２０の発現を解析した。

【0073】

図１（ａ）は、ＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。２６．５％のリンパ球がＣＤ２０陽性（図１（ａ）中、「ＣＤ２０^＋」と示す。）であった。

【0074】

続いて、ＣＤ２０陰性細胞（図１（ａ）中、「ＣＤ２０⁻」と示す。）及びＣＤ２０陽性細胞をＦＡＣＳのソーティング機能により分取した。それぞれの細胞画分について、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＤ２０のｍＲＮＡの発現を検討した。陽性対象として、アクチンのｍＲＮＡの発現を検討した。ＣＤ２０遺伝子の増幅用プライマーには、Ｐ−ＣＤ２０Ｆ（配列番号１１）及びＰ−ＣＤ２０Ｒ（配列番号１２）を使用した。また、アクチン遺伝子の増幅用プライマーには、Ｐ−ａｃｔｉｎＦ（配列番号１３）及びＰ−ａｃｔｉｎＲ（配列番号１４）を使用した。

【0075】

図１（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。ＣＤ２０陰性細胞では、ＣＤ２０のｍＲＮＡの発現が認められなかったのに対し、ＣＤ２０陽性細胞では、ＣＤ２０のｍＲＮＡの発現が認められた。この結果は、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２が、イヌの生きた細胞表面のＣＤ２０を認識することを示す。

【0076】

また、図１（ａ）のＦＡＣＳの結果において、ＣＤ２０陰性細胞とＣＤ２０陽性細胞のピークが明確に分かれていることから、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２は非常に良好な反応性を示すことが明らかとなった。

【0077】

〔実験例３〕
［イヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株を用いた免疫沈降及びウエスタンブロットによる抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体の解析］
上述したイヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株に導入されたイヌＣＤ２０遺伝子には、Ｔ７タグが連結されている。したがって、イヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株が発現するＣＤ２０タンパク質は、抗Ｔ７抗体を用いて検出することができる。

【0078】

イヌＣＤ２０安定発現ＮＲＫ細胞株の破砕物５００μｇを、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２ ３μｇ／ｍＬと反応させた後、プロテインＧセファロースビーズで免疫沈降した。続いて、遠心した沈殿をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗Ｔ７抗体を用いたウエスタンブロット解析により検出した。

【0079】

図２（ａ）は、免疫沈降及びウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。その結果、ＣＤ２０の分子量に匹敵する３５ｋＤａ付近に陽性のバンドを見出した（図２（ａ）、レーン４）。また、陰性対照として、以下の３つのサンプルを同様に解析した。
（陰性対照１）モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２の代わりにアイソタイプコントロール（ラットＩｇＧ２ｂ）３μｇ／ｍＬを使用したもの（図２（ａ）、レーン３）。
（陰性対照２）イヌＣＤ２０を導入していないＮＲＫ細胞株の破砕物５００μｇを、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２ ３μｇ／ｍＬと反応させた後、プロテインＧセファロースビーズで免疫沈降し、続いて、遠心した沈殿をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗Ｔ７抗体を用いたウエスタンブロット解析により検出したもの（図２（ａ）、レーン２）。
（陰性対照３）モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２の代わりにアイソタイプコントロール（ラットＩｇＧ２ｂ）３μｇ／ｍＬを使用した点以外は、陰性対照２と同様の検討を行ったもの（図２（ａ）、レーン１）。

【0080】

また、陽性対照として、図２（ａ）のレーン１〜４でサンプルとして用いた各ＮＲＫ細胞株の破砕物を、免疫沈降せずにウサギ抗Ｔ７抗体を用いたウエスタンブロット解析により検出した。結果を図２（ｂ）に示す。

【0081】

その結果、陰性対照１〜３においては、イヌＣＤ２０のバンドは検出されなかった。以上の結果は、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２が、イヌのＣＤ２０を認識することを更に補強するものである。

【0082】

〔実験例４〕
［イヌ末梢リンパ球を用いた免疫沈降及びウエスタンブロットによる抗イヌＣＤ２０モノクローナル抗体の解析］
イヌ末梢リンパ球の破砕物５００μｇを、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２ ３μｇ／ｍＬと反応させた後、プロテインＧセファロースビーズで免疫沈降した。続いて、遠心した沈殿をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ヒトＣＤ２０ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析により検出した。

【0083】

図３は、免疫沈降及びウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。その結果、ＣＤ２０の分子量に匹敵する３５ｋＤａ付近に陽性のバンドを見出した（図３、レーン２）。また、陰性対照として、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２の代わりにアイソタイプコントロール（ラットＩｇＧ２ｂ）３μｇ／ｍＬを使用して同様の検討を行った（図３、レーン１）。その結果、陰性対照においては、イヌＣＤ２０のバンドは検出されなかった。

【0084】

以上の結果は、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２が、イヌのＣＤ２０を認識することを更に補強するものである。

【0085】

〔実験例５〕
［ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２陽性細胞とＢ細胞との関連の検討］
（ＦＡＣＳ及びＲＴ−ＰＣＲ）
ハイブリドーマ細胞株Ｃｌｏｎｅ１２が産生するモノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２を、イヌ末梢リンパ球と反応させ、ＦＡＣＳによりＣＤ２０及びＢ細胞マーカーであるＣＤ２１の発現を解析した。

【0086】

図４（ａ）は、ＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。ＣＤ２０陽性ＣＤ２１陽性細胞が７．４％、ＣＤ２０陽性ＣＤ２１陰性細胞が１５．８％、ＣＤ２０陰性ＣＤ２１陽性細胞が２２．６％存在していた。

【0087】

続いて、ＣＤ２０陽性ＣＤ２１陽性細胞（図４（ａ）中、「Ａ」と示す。）、ＣＤ２０陽性ＣＤ２１陰性細胞（図４（ａ）中、「Ｂ」と示す。）及びＣＤ２０陰性ＣＤ２１陽性細胞（図４（ａ）中、「Ｃ」と示す。）をＦＡＣＳのソーティング機能により分取した。それぞれの細胞画分について、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＤ２０及びＣＤ２１のｍＲＮＡの発現を検討した。陽性対象として、アクチンのｍＲＮＡの発現を検討した。ＣＤ２０遺伝子の増幅用プライマーには、Ｐ−ＣＤ２０Ｆ（配列番号１１）及びＰ−ＣＤ２０Ｒ（配列番号１２）を使用した。また、ＣＤ２１遺伝子の増幅用プライマーには、Ｐ−ＣＤ２１Ｆ（配列番号１５）及びＰ−ＣＤ２１Ｒ（配列番号１６）を使用した。また、アクチン遺伝子の増幅用プライマーには、Ｐ−ａｃｔｉｎＦ（配列番号１３）及びＰ−ａｃｔｉｎＲ（配列番号１４）を使用した。

【0088】

図４（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。画分Ａ及びＢの細胞では、ＣＤ２０のｍＲＮＡの発現が認められたのに対し、画分Ｃの細胞では、ＣＤ２０のｍＲＮＡの発現が認められなかった。また、画分Ａ及びＣの細胞では、ＣＤ２１のｍＲＮＡの発現が認められたのに対し、画分Ｂの細胞では、ＣＤ２１のｍＲＮＡの発現が認められなかった。以上の結果は、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２が、イヌの生きた細胞表面のＣＤ２０を認識することを更に補強するものである。また、モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２は、イヌ末梢リンパ球中のＢ細胞の一部と反応し、リンパ球細胞表面上のＣＤ２０分子を認識することが明らかとなった。

【0089】

〔実験例６〕
［モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２をコードする遺伝子の塩基配列解析］
ハイブリドーマＣｌｏｎｅ１２から調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより抗体重鎖可変領域遺伝子を増幅し、シークエンス用ベクターｐＧＥＭ−ｅａｓｙ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）にクローン化し、塩基配列を解析した。抗体重鎖可変領域遺伝子増幅用プライマーには、Ｐ−Ｈ_ＶＦ１（配列番号１７）、Ｐ−Ｈ_ＶＦ２（配列番号１８）及びＰ−Ｈ_ＶＲ（配列番号１９）を使用した。モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２の重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号９に示す。また、重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７に示す。また、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１〜３に示す。

【0090】

同様に、ハイブリドーマＣｌｏｎｅ１２から調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより抗体軽鎖可変領域遺伝子を増幅し、シークエンス用ベクターｐＧＥＭ−ｅａｓｙ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）にクローン化し、塩基配列を解析した。抗体軽鎖可変領域遺伝子増幅用プライマーには、Ｐ−Ｌ_ＶＦ１（配列番号２０）、Ｐ−Ｌ_ＶＦ２（配列番号２１）及びＰ−Ｌ_ＶＲ（配列番号２２）を使用した。モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｃｌｏｎｅ１２の軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示す。また、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４〜６に示す。

【産業上の利用可能性】

【0091】

本発明によれば、イヌの生きた細胞や組織を用いた、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等による、ＣＤ２０陽性細胞の動態や形態の解析に用いることができる、モノクローナル抗体又はそのフラグメントを提供することができる。また、イヌＢ細胞性リンパ腫の診断用キット及び診断方法を提供することができる。また、イヌＢ細胞性リンパ腫の治療用組成物及びイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供することができる。また、上記の抗体又はそのフラグメントをコードする核酸及びベクターを提供することができる。また、上記の抗体又は抗体フラグメントの抗原反応ドメインを有するキメラ抗原受容体、当該キメラ抗原受容体をコードする核酸及びベクター、上記キメラ抗原受容体を発現したＴ細胞並びに当該Ｔ細胞を用いたイヌＢ細胞性リンパ腫の治療方法を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]