特開 2016-165254 大腸菌由来アルコール脱水素酵素ｙｑｈＤの改変タンパク質およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-165254(P2016-165254A)

(43)【公開日】2016年9月15日

(54)【発明の名称】大腸菌由来アルコール脱水素酵素ｙｑｈＤの改変タンパク質およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/04 20060101AFI20160819BHJP

   C12P 7/02 20060101ALI20160819BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160819BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160819BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/04 EZNA

   C12P7/02

   C12N15/00 A

   C12N1/21

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2015-47250(P2015-47250)

(22)【出願日】2015年3月10日

(71)【出願人】

【識別番号】000002901

【氏名又は名称】株式会社ダイセル

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】工藤 基徳

(72)【発明者】

【氏名】石井 純

(72)【発明者】

【氏名】林 素子

(72)【発明者】

【氏名】近藤 昭彦

【テーマコード（参考）】

4B024

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B024AA03

4B024BA08

4B024BA80

4B024CA06

4B024CA20

4B024DA06

4B024EA04

4B024GA11

4B024HA01

4B050CC04

4B050DD02

4B050LL05

4B064AC02

4B064BJ01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CB18

4B064CC24

4B064CD05

4B064DA16

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA05

4B065CA28

(57)【要約】

【課題】本発明は、ＮＡＤＨを補酵素として反応させることができる大腸菌由来ｙｑｈＤ改変タンパク質とその用途の提供を課題とする。
【解決手段】大腸菌由来ｙｑｈＤの補酵素依存性を進化工学の手法を用いて変更することで、ＮＡＤＨ依存性であり、かつアルコール脱水素酵素活性を有する改変ｙｑｈＤタンパク質を構築した。本発明の改変タンパク質は、高価で安定性も低いＮＡＤＰＨの代わりに、比較的安価で安定性の高いＮＡＤＨを利用することができるため、広範な工業的利用が可能となる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

大腸菌の野生型ｙｑｈＤ（配列番号：３８）の３４位から４１位のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有する、ｙｑｈＤ改変タンパク質、又はその機能的同等物。

【請求項2】

前記ｙｑｈＤ改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性が、野生型ｙｑｈＤが有するＮＡＤＨに対する活性よりも高い、請求項１記載のｙｑｈＤ改変タンパク質、又はその機能的同等物。

【請求項3】

前記ｙｑｈＤ改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性が、ＮＡＤＰＨに対する活性よりも高い、請求項１または２記載のｙｑｈＤ改変タンパク質、又はその機能的同等物。

【請求項4】

大腸菌の野生型ｙｑｈＤの３４位から４１位以外のアミノ酸が少なくとも１つ以上他のアミノ酸に置換されており、かつ、アルコール脱水素酵素活性がアミノ酸の置換前の改変タンパク質から維持されている、請求項１〜３のいずれか一項記載の改変タンパク質。

【請求項5】

配列番号：２６又は２８により特定されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項記載の改変タンパク質。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項に記載されるｙｑｈＤ改変タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項7】

配列番号：２７又は２９からなる、請求項６記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

請求項６又は７に記載されるポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項9】

発現ベクターである、請求項８記載のベクター。

【請求項10】

請求項９記載の発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌。

【請求項11】

（１）請求項１０記載の形質転換した大腸菌を培養する工程、
（２）該培養した大腸菌を、プロピオンアルデヒドおよびＮＡＤＨを含有する緩衝液に懸濁する工程、及び
（３）（２）において調製した懸濁液を、通常の反応温度で反応させる工程
を含む、１−プロパノールの生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、大腸菌由来アルコール脱水素酵素ｙｑｈＤの改変タンパク質、当該改変体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびこれらを利用した１−プロパノールを生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

精密化学のビルディングブロックとしてアルコールが使用できることから、バイオアルコール生産は特に望ましい技術として産業上位置づけられている。バイオアルコールの生産性向上および副生物生成の減少を実現するため、代謝工学が発展を続けているものの、バイオアルコールの収率は、しばしばＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨのような補酵素の酸化還元バランスに制約を受けるため、バイオアルコールの生産性を向上させるためには、この酸化還元バランスを改善することが必要である。

【0003】

バイオアルコールの生合成において、アルコールは、最終段階においてアルデヒドからＮＡＤＰＨ依存の脱水素酵素によって変換されるが、組換え菌に組込まれた酵素活性は、菌体内における酸化還元バランスに影響し、その結果、バイオアルコールの生産量の減少を引き起こしてしまう（非特許文献１）。

【0004】

細胞内におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの酸化還元を保つ手段としては、タンパク質工学手法を用いることができ、これを用いれば、脱水素酵素の補酵素に対する特異性を変更することができることが知られている。その結果、脱水素酵素の補酵素として、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの両者を利用できるようにすることも可能である。それゆえ、脱水素酵素の改良は、バイオアルコール生産における重要な課題である。

【0005】

大腸菌のアルコール脱水素酵素ｙｑｈＤは、野生型の場合ＮＡＤＰ（Ｈ）を補酵素として利用し、バイオアルコール生産工程の下流において、脱水素酵素として広く用いられている（非特許文献１、２）。大腸菌由来のｙｑｈＤは、高い安定性と広い基質特異性を持つため、工業的な応用の観点からは、極めて魅力的な酵素である（非特許文献３）。

【0006】

ｙｑｈＤのタンパク質立体構造は、２００４年にＸ線結晶構造解析で明らかとなっている（非特許文献４）。

【0007】

ｙｑｈＤは、サブユニットの分子量が４１ｋＤａであるホモ２量体であり、Ｆｅ^2＋依存のアルコール脱水素酵素のスーパーファミリーに属している。ｙｑｈＤのサブユニットは、N末端側の補酵素結合ドメインとC末端の触媒ドメインとの、２つのドメインを有している。この２つのドメイン間の触媒部位の割れ目で、脱水素反応が起きている。Ｚｎ²⁺は、３つの活性なアミノ酸残基（Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｈｉｓ）に四面体上に配置されており、このＺｎ²⁺が基質の脱水素化反応を促進する。この酵素のＸ線結晶構造は、工学的ツールにおいて使用可能な合理的タンパク質の構造として使用されている（非特許文献５〜８）。

【0008】

進化工学や合理的デザインといったタンパク質工学は、酵素活性の改善や、リガンドまたは基質に対する特異性を改変する手段として、これまでにも用いられている（非特許文献８〜１０）。

【0009】

エラープローンＰＣＲによって作成されたｙｑｈＤの変異株のライブラリから、ＮＡＤＰ（Ｈ）に高い活性を持つ変異体（Ａｓｐ９９Ｇｌｎ変異体、Ａｓｎ１４７Ｈｉｓ変異体）が見つかっている（非特許文献１１）。

【0010】

近年、コンピュータシミュレーション技術、分子動力とドッキングシミュレーションといった技術もまた、合理的なタンパク質デザインのために利用可能な手段として発展している（非特許文献１２、１３）。

【0011】

Ｘｉｕらの報告によれば、Klebsiella pneumonia由来の酵素におけるＮＡＤＰＨ依存性の補酵素特異性を、コンピュータによるタンパク質デザインの手法を用いて弱めることに成功している（非特許文献１４、１５）。当該報告によると、ＮＡＤＰ（Ｈ）に結合する部分のリン酸基に近接する残基であるＡｓｐ４１が、補酵素の依存性のカギとなる役割を持つことが明らかとされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Zeng et al., Curr Opin Biotechnol. 2011 Dec;22(6):749-57

【非特許文献2】Jensen et al., AMB Express. 2012 Aug 17;2(1):44

【非特許文献3】Jarboe, Appl Microbiol Biotechnol. 2011 Jan;89(2):249-57

【非特許文献4】Sulzenbacher et al., J Mol Biol. 2004 Sep 10;342(2): 489-502

【非特許文献5】Wiegert et al., J Biol Chem. 1997 May 16;272(20):13126-33

【非特許文献6】Richter et al., Engineering in Life Sciences, 11 (2011), 26-36

【非特許文献7】Moon et al., Appl Environ Microbiol. 2012 May;78 (9):3079-86

【非特許文献8】Andreadeli et al., FEBS J. 2008 Aug;275(15):3859-69

【非特許文献9】Chen, Trends Biotechnol. 2001 Jan;19(1):13-4

【非特許文献10】Leemhuis et al., IUBMB Life. 2009 Mar;61(3):222-8

【非特許文献11】Li et al., Progress in Natural Science，2008，18(12): 1519-1524

【非特許文献12】Machielsen et al., Engineering in Life Sciences Volume 9, Issue 1, pages 38-44, 2009

【非特許文献13】Brinkmann-Chen et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jul 2;110(27):10946-51

【非特許文献14】Ma et al., J Microbiol Biotechnol. 2013 Dec;23 (12) :1699-707.

【非特許文献15】Ma et al., J Biotechnol. 2010 Apr 15;146(4):173-8

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

大腸菌由来アルコール脱水素酵素ｙｑｈＤは高い安定性と広い基質特異性を持つため、工業的な応用に有用な酵素ではあるものの、これまでは高価で安定性も低いＮＡＤＰＨを補酵素として利用せざるを得ないため、大腸菌由来ｙｑｈＤの工業的利用は限られていた。そこで、本発明は、比較的安価で安定性の高いＮＡＤＨをその補酵素として利用できるｙｑｈＤの改変タンパク質の提供をその課題とし、また、当該改変体を用いた１−プロパノールの効率的な生産方法の提供をその課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。具体的には、ｙｑｈＤの補酵素依存性を進化工学の手法を用いて改変した。まず、ＮＡＤＰ（Ｈ）のアデノシンのリボース残基にある２'-リン酸基とｙｑｈＤの結合部位を変異株のライブラリを作成するために選択した。ニトロブルーテトラゾリウム/フェナジンメトサルフェート法(nitroblue tetrazolium/phenazine methosulfate protocol)を用いて、１−プロパノールに対するＮＡＤ＋依存活性からライブラリのスクリーニングを実施した。約２５００個のクローンから４個の変異株を選択した。ｙｑｈＤ変異株の構造的なモデルに基づいて、Ｐｈｅ３７がこれらの変異株の補酵素依存性の鍵となることを予測した。更に、ｙｑｈＤ変異株の変異解析から３７番目の残基によってＮＡＤＨの依存性が制御されていることを示した。

【0015】

本発明者らは上記の如く、ＮＡＤＨ依存性であり、かつアルコール脱水素酵素活性を有する改変ｙｑｈＤタンパク質を構築することで、本発明を完成させた。

【0016】

即ち本発明は、以下のタンパク質、並びに当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターを用いて形質転換した大腸菌、及び当該形質転換した大腸菌を利用して効率的に１−プロパノールを生産する方法に関する。

【0017】

本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１１〕を提供するものである。
〔１〕大腸菌の野生型ｙｑｈＤ（配列番号：３８）の３４位から４１位のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有する、ｙｑｈＤ改変タンパク質、又はその機能的同等物、
〔２〕前記ｙｑｈＤ改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性が、野生型ｙｑｈＤが有するＮＡＤＨに対する活性よりも高い、〔１〕記載のｙｑｈＤ改変タンパク質、又はその機能的同等物、
〔３〕前記ｙｑｈＤ改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性が、ＮＡＤＰＨに対する活性よりも高い、〔１〕または〔２〕記載のｙｑｈＤ改変タンパク質、又はその機能的同等物、
〔４〕大腸菌の野生型ｙｑｈＤの３４位から４１位以外のアミノ酸が少なくとも１つ以上他のアミノ酸に置換されており、かつ、アルコール脱水素酵素活性がアミノ酸の置換前の改変タンパク質から維持されている、〔１〕〜〔３〕のいずれか記載の改変タンパク質、
〔５〕配列番号：２６又は２８により特定されるアミノ酸配列からなる、〔１〕〜〔３〕のいずれか記載の改変タンパク質、
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載されるｙｑｈＤ改変タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
〔７〕配列番号：２７又は２９からなる、〔６〕記載のポリヌクレオチド、
〔８〕〔６〕又は〔７〕に記載されるポリヌクレオチドを含む、ベクター、
〔９〕発現ベクターである、〔８〕記載のベクター、
〔１０〕〔９〕の発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌、
〔１１〕（１）〔１０〕の形質転換した大腸菌を培養する工程、
（２）該培養した大腸菌を、プロピオンアルデヒドおよびＮＡＤＨを含有する緩衝液に懸濁する工程、及び
（３）（２）において調製した懸濁液を、通常の反応温度で反応させる工程
を含む、１−プロパノールの生産方法。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、大腸菌のｙｑｈＤ野生型（配列番号：３８）の３４位から４１位のアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有する改変ｙｑｈＤタンパク質を提供する。

【0019】

本発明の改変タンパク質の一つの好ましい態様は、大腸菌（Escherichia coli）由来のｙｑｈＤ（配列番号：３８）において、３４位から４１位のアミノ酸配列を、
（１）ＬＴＳＤＬＴＧＰ（配列番号：２４）へと置換したもの（配列番号：２６、以下、「変異体３４ F37D」、「mut 34 F37D」とも称する）、
（２）ＩＶＴＤＳＧＣＳ（配列番号：２５）へと置換したもの（配列番号：２８、以下、「変異体４１ F37D」、「mut 41 F37D」とも称する）、
（３）ＧＴＩＬＬＶＹＳ（配列番号：２０）へと置換したもの（配列番号：３０、以下、「変異体１」、「mut 1」とも称する）、
（４）ＬＴＳＦＬＴＧＰ（配列番号：２１）へと置換したもの（配列番号：３２、以下、「変異体３４」、「mut 34」とも称する）、
（５）ＩＶＴＦＳＧＣＳ（配列番号：２２）へと置換したもの（配列番号：３４、以下、「変異体４１」、「mut 41」とも称する）、及び
（６）ＶＡＴＡＬＰＤＷ（配列番号：２３）へと置換したもの（配列番号：３６、以下、「変異体４６」、「mut 46」とも称する）が挙げられる。

【0020】

これらの改変タンパク質は、その酵素活性を有する限り、３４位から４１位のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などの変異を有していてもよい。このような変異は、当業者であれば人為的に導入することもでき、また、自然界において偶然に生じることもあり得る。本発明の改変タンパク質には、これら双方の変異体が含まれる。本発明の改変タンパク質において許容される、変異するアミノ酸数は通常５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内）である。なお、本発明において、「機能的同等物」とは、本発明の改変タンパク質においてアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入などの改変を有するものであって、かつ、置換、欠失、付加および／または挿入前の改変タンパク質が有する酵素活性を保持するものをいう。

【0021】

一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。

【0022】

本発明の改変タンパク質は、当業者に周知の分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて調製することができる。例えば、大腸菌由来yqhD遺伝子について、公知の方法において部位特異的変異の導入を行い、本発明の改変タンパク質をコードするインサート配列を作成し、次に、大腸菌などの適切な宿主において改変タンパク質を過剰発現させるために用いられる発現ベクターに当該インサート配列を組込むことで、宿主内で改変タンパク質を過剰発現させ、その後、公知のタンパク質精製方法を利用して精製することにより、容易に調製することができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。

【0023】

本発明の改変タンパク質は、好ましくは、そのＮＡＤＨに対する活性が、野生型ｙｑｈＤが有するＮＡＤＨに対する活性よりも高いタンパク質である。

【0024】

本発明において、「改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性が、野生型ｙｑｈＤが有するＮＡＤＨに対する活性よりも高い」とは、野生型ｙｑｈＤが有するＮＡＤＨに対する活性と比較してその活性比が、１よりも大きいことをいう。ＮＡＤＨに対する活性において、本発明の改変タンパク質と野生型との活性比は、通常、少なくとも２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上、さらにより好ましくは６以上の活性比を有することをいう。

【0025】

本発明の改変タンパク質および野生型ｙｑｈＤのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨへの酵素活性は、当業者によって一般的に行われる方法によって測定することができる。例えば、酵素活性は、適切な緩衝液中に、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋、適切な基質、および酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの増加にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加により測定することができる。１Ｕは、1分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの増加を触媒する酵素量とすることができる。

【0026】

本発明の改変タンパク質は、好ましくは、当該改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性が、当該改変タンパク質のＮＡＤＰＨに対する活性よりも高いタンパク質である。

【0027】

本発明において、「当該改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性が、当該改変タンパク質のＮＡＤＰＨに対する活性よりも高い」とは、本発明の改変タンパク質が有するＮＡＤＨに対する活性が、当該改変タンパク質の有するＮＡＤＰＨに対する活性よりも大きいことをいう。本発明の改変タンパク質のＮＡＤＨに対する活性は、ＮＡＤＰＨに対する活性に対して、通常、少なくとも２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは５倍以上、さらにより好ましくは６倍以上であることをいう。

【0028】

本発明の改変タンパク質のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨへの活性については、当業者によって一般的に行われる方法によって測定することができる。例えば、以下の方法を例示することができる。培養後、菌体は４，５００ｒｐｍ、２０分で卓上遠心機(クボタ)で集菌することができる。菌は１ｍＭジチオスレイトールとバグバスター(メルクミリポア)を含む１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ7．０)で溶菌する。ｙｑｈＤ変異体の活性は２０μＬの溶解物に２０μＬの、０．２ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、１００ｍＭプロピオンアルデヒドとなるように加え、5回程度ピペッテイング混合して、３０℃で２分間インキュベートして分析する。また、Bradford法によって酵素濃度を推定することができる。

【0029】

また、本発明は、ｙｑｈＤ改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のｙｑｈＤ改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば配列番号：３９に記載された大腸菌由来ｙｑｈＤをコードするＤＮＡに、当業者によって一般的に行われる部位特異的変異導入法を用いて塩基置換を導入することによって得ることができる。

【0030】

また、本発明は、このようにして得られた本発明のｙｑｈＤ改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、公知のベクターに挿入することによって作製されるベクターを提供する。

【0031】

本発明における「ベクター」とは、予め連結された他の核酸を輸送することができ、また、宿主ＤＮＡ中への自己複製または組み込みができる核酸分子を意味する。例としては、プラスミド、コスミド、またはウィルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0032】

本発明におけるベクターには、発現ベクターが含まれる。発現ベクターとは、適当な宿主細胞に導入すると、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をいう。適当な発現ベクターは、当業者によく知られており、真核細胞および/または原核細胞で複製可能なもの、または宿主細胞のゲノムに組み込まれるものを含む。本発明に用いることができる発現ベクターの例としては、例えば、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドであり、特にｐＳＥ４２０Ｕが挙げられるが、これらに限定されない。

【0033】

また、本発明は、ｙｑｈＤ改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された大腸菌に関する。大腸菌の形質転換体の作製のための手順および宿主に適合したベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。

【0034】

また、本発明は、以下の工程を含む、１−プロパノールの効率的な生産方法に関する：
（１）形質転換した大腸菌を培養する工程、
（２）該培養した大腸菌を、プロピオンアルデヒドおよびＮＡＤＨを含有する緩衝液に懸濁する工程、及び
（３）（２）において調製した懸濁液を、通常の反応温度で反応させる工程
を含む、１−プロパノールの生産方法。

【0035】

本発明における「形質転換した大腸菌を培養する工程」とは、当該形質転換した大腸菌が適切に増殖できるものである限り、あらゆる工程を適用することが可能である。形質転換された大腸菌を適切に培養する工程は、当業者には良く知られており、その例としては、例えば、適切な抗生物質等を含むＬＢ培地中において、３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養する工程などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、本発明において「通常の反応温度」とは、４℃〜５０℃、より好ましくは２０℃〜４０℃を意味する。

【0036】

また、本発明における「緩衝液」は、本発明の酵素反応が妨げられない限り、どのような溶液であってもよく、好ましい緩衝液の例としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

【実施例】

【0037】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔実施例１〕大腸菌由来ｙｑｈＤ遺伝子プラスミドの作成
野生型ｙｑｈＤ遺伝子（配列番号：３９）は、大腸菌Ｋ−１２株の遺伝子からＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）とプライマー１、２(配列番号：１、２、表１)を用いて増幅した。

【0038】

【表1】

【0039】

ＰＣＲ産物はＮｄｅＩとＰａｃＩで消化し、ｐＳＥ４２０Ｕ（WO 2006-132145）に導入した。このプラスミドは大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル(タカラバイオ)に形質転換した。組み換えたプラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で集め、ＤＮＡ配列解析を用いてその配列情報を確認した。

【0040】

ＤＮＡライブラリの調製
変異株ライブラリは、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ ＤＮＡポリメラーゼを用い、インバースＰＣＲ法(９４℃ １０秒、５７℃ ３０秒、６８℃ ４分を２０サイクル)で構築した。ｙｑｈＤを含むｐＳＥ４２０をテンプレートとして用い、プライマーとしては、表１に示されるｙｑｈＤ ｒｏｎｄｏｍ１ ＲおよびｙｑｈＤ ｒｏｎｄｏｍ１ Ｆ（配列番号：３、４）を使用した。鋳型のプラスミドは、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化した。３７℃、１６時間の消化後、インバースＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。ＤＮＡ断片はｅｌｅｃｔｒｏｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で環化した。組み換えプラスミド(１μｌ)は５０μｌの１０−βエレクトロコンピテント セル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に加え、エレクトロポレーション(２．０ｋＶ, ２００ｏ−ｍｕ, ２５μｆ)で形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上に植えられた。

【0041】

ハイスループットのスクリーニング方法
スクリーニングはＮｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ （ＮＢＴ）/ ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）法の改良法で実施した。

【0042】

ＰＭＳの存在化でＮＢＴは、脱水素酵素反応から生成したＮＡＤＨと反応し、５７０ｎｍに吸収を持つ青紫のフォルマザンを生成する。各コロニーは２ｍＬの９６穴プレート(深)に１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地(２００μＬ)に植え継がれた。各プレートには９２サンプルとｐＳＥ４２０ＵベクターとｙｑｈＤを導入したｐＳＥ４２０Ｕベクターを含む２つの陰性対照サンプルを収容した。

【0043】

プレートは１２５０ｒｐｍ、３０℃、１６時間で、プレート振とう機（ＭｏｄｅｌＩＳＦ−１−Ｗ、タイテック)で培養した。培地(４０μＬ)を３６０μＬの新しいＬＢ培地、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．４ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオカラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む新しい９６穴プレートに移した。そのプレートを１２５０ｒｐｍ、３０℃、２４時間で培養した。培養後、菌体は４，５００ｒｐｍ、２０分で卓上遠心機 (クボタ)で集菌した。菌は１ｍＭジチオスレイトールとバグバスター(メルクミリポア)を含む１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ８．０)で溶菌した。その後、プレートは室温で２２０ｒｐｍ、６０分で遠心し、溶解液を４，５００ｒｐｍ、３０分の遠心で集菌した。ｙｑｈＤ変異体の活性は２０μＬの溶解物に１８０μＬの、０．２ｍＭ ＮＡＤ＋、１００ｍＭ １−プロパノール、０．２ｍＭ ＮＢＴ及び０．０２ｍＭ ＰＭＳを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、分析した。反応率はマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を用いて、２５℃、５７０ｎｍの青紫のフォルマザンの吸収で分析した。活性のある変異株からのプラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔで集め、ＤＮＡ配列を確認した。

【0044】

変異株の酵素活性
大腸菌ＪＭ１０９株は、１００μg/ｍＬアンピシリンを含む１０ｍＬ ＬＢ培地中で、３７℃、２００ｒｐｍ、１２時間で培養し、その１．０％（ｖ／ｖ）の培養液を新しいＬＢ培地に植えついだ。培養後、培養液の６６０ｎｍでの吸光度が０．９となった時、タンパク質は０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることで誘導された。菌体は遠心で集め、１０ｍＬのリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)に懸濁し、超音波処理(照射３０秒、５回、照射間隔１０秒)で破砕した。破砕液の上清は遠心分離、１０，０００ｒｐｍ、３０分で集めた。タンパク質濃度はブラッドフォード試薬(バイオラッド社)を使用し、マイクロプレートリーダーで、５９５ｎｍの吸光度を測定することで分析した。変異株からのタンパク質の発現を確認するためにSDS-PAGEを使用した。酵素活性は３０℃でＮＡＤＰＨの酸化を３４０ｎｍの吸光度を測定することで分析した(日立 Ｕ２０１０分光器)。なお、反応液の組成および分析時の温度等は以下の通りである：
・１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
・１ｍＭ ＺｎＣｌ₂
・１．５ｍＭ propione aldyhyde
・ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度(０−０．１５ｍＭ)
・３０℃

【0045】

ランダムなライブラリからの活性のある変異体の選択
ランダムなライブラリの作成のため、本発明者らは、ランダム配列を含むプライマー（配列番号：３および４、表１）を用い、ｙｑｈＤの３４−４１位をランダム化した。おおよそ２，５００個の細菌のクローンが得られた。得られたクローンに対して、ＮＢＴ／ＰＭＳ活性法により、ＮＡＤ＋を用いた１−プロパノールに対する加水分解活性をチェックした。

【0046】

変異体１、３４、４１、４６の結果を表２に示した。４個の変異体における補酵素依存性は、基質としてプロピオンアルデヒドでチェックした。変異体３４はＮＡＤＨの依存性であり、野生株に比べて６．６倍活性が上昇した。

【0047】

【表2】

【0048】

各変異体における改変ＤＮＡと改変アミノ酸を表３に示す。

【0049】

【表3】

【0050】

〔実施例２〕mut ３４、mut ４１から更なる変異体の選択
本発明者らは、mut ３４とmut ４１に含まれるフェニルアラニン（Ｐｈｅ３７）が、その大きな立体障害によってＮＡＤＰ（Ｈ）の結合部位を妨害し、これらの変異体の補酵素依存性の調整部位として働いていると予想した。本発明者らは、３７位のアミノ酸を系統的に変異させ、相対酵素活性を測定した。インバースＰＣＲ法を用いて部位特異的突然変異を実施した。単一の変異ＰＣＲ反応は、鋳型のプラスミドとプライマー３（配列番号：３、表１）とプライマー４から１７（配列番号：４から１７、表１）の溶液５０μＬ中で実行した。反応混合物はＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに形質転換した。変異株は、配列確認用のプライマー（配列番号：１２、１３）を用いてＤＮＡ配列を確認した。作成された変異株の補酵素依存性を測定した結果を表４に示す。

【0051】

【表4】

【0052】

この結果、３７位のフェニルアラニンからアスパラギン酸への変異は、変異体のＮＡＤＰＨへの活性を減少し、ＮＡＤＨへの活性を大きく増加させることを見出した。

【0053】

ＮＡＤＨを補酵素とした変異株による1−プロパノールの製造
実施例１で選択した変異体および実施例２でさらに選択した変異体はそれぞれ実施例１に記載した方法で培養し、集菌した菌体をプロピオンアルデヒドとＮＡＤＨを含有するリン酸緩衝液に懸濁し、３０℃で反応させると、ほぼ定量的に１−プロパノールが生産された。生成されたプロパノールは、通常の方法でガスクロマトグラフにより検出できた。

【産業上の利用可能性】

【0054】

本発明により提供される大腸菌由来ｙｑｈＤの改変タンパク質は、比較的安価かつ安定性の高いＮＡＤＨをその補酵素として利用することができるため、工業的な利用範囲が拡大される。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]