特開 2016-183148 熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-183148(P2016-183148A)

(43)【公開日】2016年10月20日

(54)【発明の名称】熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/185 20060101AFI20160926BHJP

   A61K 8/46 20060101ALI20160926BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20160926BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20160926BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160926BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160926BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20160926BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/185

   A61K8/46ZNA

   A61Q19/00

   A61Q19/08

   A61P17/00

   A61P43/00 105

   C12Q1/68 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】2

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2016-53294(P2016-53294)

(22)【出願日】2016年3月17日

(31)【優先権主張番号】特願2015-64374(P2015-64374)

(32)【優先日】2015年3月26日

(33)【優先権主張国】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000002819

【氏名又は名称】大正製薬株式会社

(72)【発明者】

【氏名】山下 真代

(72)【発明者】

【氏名】武藤 周子

(72)【発明者】

【氏名】南雲 潤一郎

(72)【発明者】

【氏名】小田原 美樹子

(72)【発明者】

【氏名】吉村 知久

(72)【発明者】

【氏名】真邉 知佳

【テーマコード（参考）】

4B063

4C083

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA05

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QR32

4B063QR62

4B063QR77

4B063QS25

4C083AB032

4C083AB311

4C083AC791

4C083AC792

4C083CC02

4C083DD08

4C083DD22

4C083DD23

4C083DD31

4C083EE11

4C206AA01

4C206AA02

4C206JA08

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA83

4C206NA14

4C206ZA89

(57)【要約】

【課題】
本発明は、優れた熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤を提供することを課題とする。
【解決手段】
タウリンを含有し、ｐＨが７より大きい熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タウリンを含有し、ｐＨが７より大きい熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤。

【請求項2】

タウリンの配合量が０．５質量％以上である請求項１に記載の熱ショックタンパク質及び/又はセラミド産生促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タウリンを含有しｐＨが７より大きい熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

熱ショックタンパク質は温熱や紫外線、化学物質などの種々のストレスによって誘導されるタンパク質である。熱ショックタンパク質にはタンパク質の変性を抑制するとともに、変性したタンパク質の修復および分解を促進する作用があり、上述の種々のストレスによるダメージから組織を保護している（非特許文献１）。しかし、加齢とともに熱ショックタンパク質の合成能力は減少するため、熱ショックタンパク質の発現を促進する生薬抽出物を含有する熱ショックタンパク質誘導剤等が提案されている（特許文献１−３）。

【0003】

また、セラミドはスフィンゴ脂質の一つであり、角層中では皮膚の保湿やバリア機能に重要な役割を果たしている。乾燥肌、アトピー性皮膚炎、荒れ肌等の皮膚疾患においては、セラミドの代謝が妨げられ、角層中のセラミド量が減少し、皮膚の保湿やバリア機能の低下等を引き起こしていることが数多く報告されている。

【0004】

表皮細胞におけるセラミド産生を促進し角層中のセラミド量を増加させることで、皮膚の保湿能やバリア能を高めることができる。これにより、角層中のセラミド量低下に伴う皮膚疾患、例えば、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、荒れ肌等の予防・改善等に有用であると考えられる。これまでに、いくつかの植物抽出物が表皮細胞のセラミド産生を促進して角層中のセラミド量を増加させ、皮膚の保湿能・バリア能を高めることが知られている（特許文献４、非特許文献２）。

【0005】

タウリン（２−アミノエタンスルホン酸）は、分子量１２５．１５の単純な化学構造をもつ含硫アミノ酸で、タンパク質を構成するアミノ酸とは異なり、ビタミン類やホルモンのような作用、さらには脳神経系、循環系、肝胆系をはじめとした様々な薬理作用を示すことが知られている。タウリンにより熱ショックタンパク質コード遺伝子の発現が促進されること（特許文献５）、及びセラミドの発現が促進されることが報告されている（非特許文献３）。しかし、実際に生体の皮膚において熱ショックタンパク質及び/又はセラミドの産生促進を誘導するためには、角層表面から適用し、角層の下層にある顆粒層以下の細胞に作用する必要がある。上述したような熱ショックタンパク質及び/又はセラミドの産生促進作用を有する物質の報告は表皮角化細胞の単層培養系若しくは基底膜側からの適用における試験結果であり、生体への適用が可能か否かは不明である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００８−２１４１９５号公報

【特許文献2】特開２０１０−１２５８号公報

【特許文献3】特開２０１１−１９０２００号公報

【特許文献4】特開２０１１−７９７５４号公報

【特許文献5】特開２０１０−１５０２５８号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Cell １９９４；７８：３６５−７２

【非特許文献2】International Journal of Cosmetic Science ２０１２；３４：１７−２２

【非特許文献3】Journal of Cosmetic Science ２００６；５７：１−１０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、優れた熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、形態的にヒト皮膚構造に類似し、基底層・有棘層・顆粒層・角層を有するヒト３次元培養表皮モデルを用いて、タウリンの作用を検討したところ、通常タウリンが外用剤として用いられる弱酸性〜中性付近のｐＨを示す水溶液では熱ショックタンパク質産生促進作用が認められないことを見出した。しかし、タウリンを含有する水溶液のｐＨを７より大きく調製することで意外にも熱ショックタンパク質産生促進作用が顕著に表れることを見出した。さらに、ｐＨを７より大きく調製することでタウリンのセラミド産生促進作用も顕著に亢進されることを見出した。

【0010】

すなわち本発明は以下の通りである。
（１）タウリンを含有し、ｐＨが７より大きい熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤。
（２）タウリンの配合量が０．５質量％以上である請求項１に記載の熱ショックタンパク質及び/又はセラミド産生促進剤。

【発明の効果】

【0011】

タウリンを含有するｐＨが７より大きい水溶液が、中性〜弱酸性のｐＨでは作用のない濃度において、熱ショックタンパク質及び/又はセラミドの産生を劇的に促進する作用を有することを見出した。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の態様は、タウリンを含有し、ｐＨが７より大きい熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤である。

【0013】

タウリンの配合量はｐＨが７より大きいアルカリ性領域で効果的に熱ショックタンパク質産生促進作用及び/又はセラミド産生促進作用を発揮させるという観点から、０．５質量％以上が好ましい。より好ましくは０．５質量％以上、３質量％未満、さらに好ましくは０．５質量%以上、１質量%以下である。

【0014】

本発明の熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤のｐＨは７より大きく、より好ましくは７．５〜１０であり、さらに好ましくは８〜１０である。

【0015】

熱ショックタンパク質は分子量の違いにより、ＨＳＰ９０ファミリー、ＨＳＰ７０ファミリー、ＨＳＰ６０ファミリー及び低分子ＨＳＰファミリーに分類される。ＨＳＰ７０−１ＡはＨＳＰ７０ファミリーのうち最初に同定されたアイソフォームである。細胞内では低レベルで恒常的に発現しているが、熱ショックなどのストレスに応答して発現が増加する。ＨＳＰ７０は細胞の防御因子としても知られており、虚血再潅流障害や、癌、慢性心不全などの疾患でＨＳＰ７０の発現が増加していることが報告されている。本発明の熱ショックタンパク質はＨＳＰ７０ファミリーが好ましく、さらに好ましくはＨＳＰ７０−１Ａである。

【0016】

セラミドはスフィンゴ脂質の一つであり、角層中では皮膚の保湿やバリア機能に重要な役割を果たしている。セラミドの合成はパルミトイルＣｏＡとＬ−セリンの縮合反応で始まる。この反応はセラミド合成の律速段階であり、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）により触媒される。生成されたセラミドは、一旦グルコシルセラミドまたはスフィンゴミエリンとして蓄積された後、細胞外に排出される。その後、角質細胞間でグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ1及びＧＢＡ２）またはスフィンゴエミリナーゼにより再度セラミドに変換され、他の細胞間脂質とともにラメラ構造を構築する。

【0017】

本発明によれば、表皮角化細胞の熱ショックタンパク質及び／又はセラミドの産生を促進し得る新規な剤を提供することが出来るため、例えば、当該作用に起因した、保湿効果及び／又は保護効果及び／又は老化防止効果を有するための医薬品、医薬部外品として、また皮膚に塗布される化粧品として好適に用いることができる。

【0018】

本発明の表皮角化細胞の熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤は、公知の方法により製剤化することができ、例えば液剤、ローション剤、乳剤、軟膏剤、クリーム剤、水性ゲル剤、エアゾール剤などの各種製剤として、皮膚に適用することができる。

【0019】

これら製剤化の際には、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品）や化粧品等に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ｐＨ調整剤等を加えることができる。

【実施例】

【0020】

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
試験例１ 熱ショックタンパク質産生促進
ヒト３次元培養表皮モデル（Ｊ−ＴＥＣ製）をアッセイ培地にて、２４穴（１穴２cm^２）のプレートを用いて、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養を開始した。翌日にヒト３次元培養表皮モデルの角層側から、試験物質を５０μL添加し、１５分間静置した後に試験物質を吸引除去し、再びＣＯ_２インキュベータにアッセイプレートを戻した。試験物質は水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１０）、炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）、タウリン３％水溶液（ｐＨ４．９）、タウリン３％水溶液（水酸化ナトリウムにてｐＨ１０に調製）、タウリン１％水溶液（水酸化ナトリウムにてｐＨ７に調製）。６時間後に、ＣＯ_２インキュベータからアッセイプレートを取り出し、ヒト３次元培養表皮モデルをRNA Stabilization Reagentに浸漬し回収した。回収したヒト３次元培養表皮モデルからＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲシステムを用いてＨＳＰ７０ファミリーのひとつであるＨＳＰ７０−１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）のｍＲＮＡの測定を行なった。また、標的ＨＳＰＡ１Ａの相対的な発現を決定するためのハウスキーピング遺伝子として働く、肝臓グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ１Ａ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡを内部標準として測定した。用いたプライマー配列は以下の通りである。

【0021】

HSPA１A-F：５’-GGATAACGGCTAGCCTGAGGAG-３’（配列番号１）
HSPA１A-R：５’-CTGGGAAGCCTTGGGACAAC-３’（配列番号２）
GAPDH-F：５’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-３’（配列番号３）
GAPDH-R：５’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-３’（配列番号４）

【0022】

その結果、対照群（試験物質非添加群）を１００％発現に相当するように正規化すると、タウリン３％水溶液（ｐＨ１０）では３６１％もしくは２２０％のＨＳＰＡ１Ａ発現促進作用が認められたが、水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１０）、炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）、タウリン３％水溶液（ｐＨ４．９）、タウリン１％水溶液（ｐＨ７）においてはその発現促進作用は認められなかった（表１、２）。結果は３例の平均値±標準偏差を示す。

【0023】

以上の結果から、タウリンを含有し、ｐＨを７より大きく調製した水溶液はヒト３次元培養表皮モデルに作用して熱ショックタンパク質の産生を促進する効果を有することが明らかとなった。また、タウリンを含有し、弱酸性〜中性付近のｐＨを示す水溶液では熱ショックタンパク質の産生を促進する効果が認められないことが明らかとなった。

【0024】

【表1】

【0025】

【表2】

【0026】

試験例２ 熱ショックタンパク質産生促進
ヒト３次元培養表皮モデル（Ｊ−ＴＥＣ製）をアッセイ培地にて、２４穴（１穴２cm^２）のプレートを用いて、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養を開始した。翌日にヒト３次元培養表皮モデルの角層側から、試験物質を５０μL添加し、１５分間静置した後に試験物質を吸引除去し、再びＣＯ_２インキュベータにアッセイプレートを戻した。試験物質はタウリン０．５％水溶液、タウリン１％水溶液、タウリン３％水溶液（水酸化ナトリウムにてｐＨ７、８、９、１０に調製）。６時間後に、ＣＯ_２インキュベータからアッセイプレートを取り出し、ヒト３次元培養表皮モデルをRNA Stabilization Reagentに浸漬し回収した。回収したヒト３次元培養表皮モデルからＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲシステムを用いてＨＳＰ７０ファミリーのひとつであるＨＳＰ７０−１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）のｍＲＮＡの測定を行なった。また、標的ＨＳＰＡ１Ａの相対的な発現を決定するためのハウスキーピング遺伝子として働く、肝臓グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ１Ａ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡを内部標準として測定した。用いたプライマー配列は以下の通りである。

【0027】

HSPA１A-F：５’-GGATAACGGCTAGCCTGAGGAG-３’（配列番号１）
HSPA１A-R：５’-CTGGGAAGCCTTGGGACAAC-３’（配列番号２）
GAPDH-F：５’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-３’（配列番号３）
GAPDH-R：５’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-３’（配列番号４）

【0028】

その結果、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ７）を１００％発現に相当するように正規化すると、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ８）では１２３％、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ９）では１３５％、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ１０）では１３７％のＨＳＰＡ１Ａ発現促進作用が認められた（表３）。タウリン１％水溶液（ｐＨ７）を１００％発現に相当するように正規化すると、タウリン１％水溶液（ｐＨ８）では１４７％、タウリン１％水溶液（ｐＨ９）では１３２％、タウリン１％水溶液（ｐＨ１０）では１２２％のＨＳＰＡ１Ａ発現促進作用が認められた（表４）。また、タウリン３％水溶液（ｐＨ７）を１００％発現に相当するように正規化すると、タウリン３％水溶液（ｐＨ９）では１２４％、タウリン３％水溶液（ｐＨ１０）では１４８％のＨＳＰＡ１Ａ発現促進作用が認められた（表５）。結果は３例の平均値±標準偏差を示す。

【0029】

以上の結果から、タウリンを含有し、ｐＨを７より大きくに調製した水溶液はヒト３次元培養表皮モデルに作用して熱ショックタンパク質の産生を促進する効果を有することが明らかとなった。

【0030】

【表3】

【0031】

【表4】

【0032】

【表5】

【0033】

試験例３ セラミド産生促進
ヒト３次元培養表皮モデル（Ｊ−ＴＥＣ製）をアッセイ培地にて、２４穴（１穴２ｃｍ^２）のプレートを用いて、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養を開始した。翌日にヒト３次元培養表皮モデルの角層側から、試験物質を５０μL添加し、１５分間静置した後に試験物質を吸引除去し、再びＣＯ_２インキュベータにアッセイプレートを戻した。試験物質はタウリン３％水溶液（ｐＨ４．９）、タウリン３％水溶液（水酸化ナトリウムにてｐＨ１０に調製）、タウリン０．５％水溶液（水酸化ナトリウムにてｐＨ７、８、９、１０に調製）。１時間後に、ＣＯ_２インキュベータからアッセイプレートを取り出し、ヒト３次元培養表皮モデルをRNA Stabilization Reagentに浸漬し回収した。回収した３次元培養表皮モデルからＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲシステムを用いてＧＢＡ２のｍＲＮＡの測定を行なった。また、標的ＧＢＡ２の相対的な発現を決定するためのハウスキーピング遺伝子として働く、肝臓グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ１Ａ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡを内部標準として測定した。用いたプライマー配列は以下の通りである。

【0034】

GBA２-F：５’-GTCCCTGATAAATCCAGTGTGCAGT-３’（配列番号５）
GBA２-R：５’-TGGAAGCCCTCCCAAGTCAG-３’（配列番号６）
GAPDH-F：５’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-３’（配列番号３）
GAPDH-R：５’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA-３’（配列番号４）

【0035】

その結果、タウリン３％水溶液（ｐＨ４．９）を１００％発現に相当するように正規化すると、タウリン３％水溶液（ｐＨ１０）ではＧＢＡ２ １３０%（表６）の発現促進作用が認められた。また、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ７）を１００％発現に相当するように正規化すると、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ８）では１４２％、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ９）では１２２％、タウリン０．５％水溶液（ｐＨ１０）では１０７％のＧＢＡ２発現促進作用が認められた（表７）。表６の結果は２例の平均値を示す。表７の結果は３例の平均値±標準偏差を示す。

【0036】

以上の結果から、タウリンを含有し、ｐＨを７より大きく調製した水溶液はヒト３次元培養表皮モデルに作用してセラミドの産生を促進する効果を有することが明らかとなった。

【0037】

【表6】

【0038】

【表7】

【産業上の利用可能性】

【0039】

本発明により、優れた熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤を提供することが可能となった。また、本発明が提供する保湿効果及び／又は保護効果及び/又は老化防止効果を有する熱ショックタンパク質及び／又はセラミド産生促進剤の提供を通じて、医薬品、化粧品産業等の発展が期待される。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]