特開 2016-193846 プロテアーゼ活性促進用物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-193846(P2016-193846A)

(43)【公開日】2016年11月17日

(54)【発明の名称】プロテアーゼ活性促進用物

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/97 20060101AFI20161021BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20161021BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20161021BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161021BHJP

   A61K 36/18 20060101ALI20161021BHJP

   A61K 36/61 20060101ALI20161021BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20161021BHJP

   A61P 17/00 20060101ALN20161021BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20161021BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/97

   A61Q19/08

   A61Q19/00

   A61P43/00 111

   A61P43/00 121

   A61K36/18

   A61K36/61

   A23L1/30 B

   A61P17/00

   A61K131:00

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2015-73642(P2015-73642)

(22)【出願日】2015年3月31日

(71)【出願人】

【識別番号】398028503

【氏名又は名称】株式会社東洋新薬

(74)【代理人】

【識別番号】100149032

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 敏明

(72)【発明者】

【氏名】長崎 歩

(72)【発明者】

【氏名】鍔田 仁人

(72)【発明者】

【氏名】高垣 欣也

【テーマコード（参考）】

4B018

4C083

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018MD48

4B018MD52

4B018ME10

4B018MF01

4C083AA111

4C083CC01

4C083EE12

4C088AB12

4C088AB57

4C088AC04

4C088BA08

4C088CA01

4C088MA07

4C088NA05

4C088NA14

4C088ZA89

4C088ZC19

4C088ZC75

(57)【要約】

【課題】
本発明の目的は、比較的低濃度でありながらプロテアーゼの活性を促進することができる、天然物由来成分を有効成分として含有する組成物又は剤を提供することにある。
【解決手段】
上記目的は、パパイヤ及びカムカムベリーを含有する、化粧用組成物、プロテアーゼ活性促進用組成物及びプロテアーゼ活性促進剤により解決される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

パパイヤ及びカムカムベリーを含有する化粧用組成物。

【請求項2】

パパイヤ及びカムカムベリーを含有するプロテアーゼ活性促進用組成物。

【請求項3】

パパイヤ及びカムカムベリーを含有するプロテアーゼ活性促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロテアーゼ活性促進作用を示す組成物及び剤に関する。

【背景技術】

【0002】

プロテアーゼはタンパク質やペプチドなどにおけるペプチド結合を加水分解することを触媒する酵素の総称である。プロテアーゼは、触媒作用によって大きく２つに分類され、タンパク質やペプチドなどの分子の内部のペプチド結合を加水分解してペプチドを遊離することを触媒するものがエンドプロテーゼ（プロテイナーゼ）であり、該分子のアミノ基末端又はカルボキシル基末端からペプチド結合を加水分解することによりアミノ酸を遊離することを触媒するものがエキソプロテアーゼである。

【0003】

プロテアーゼは、生体内では食物性タンパク質及びペプチドを分解することによる栄養吸収、不要なタンパク質の分解、タンパク質の活性調節など、生体の恒常性に大きな役割を担っている。

【0004】

また、プロテアーゼは、生体外では皮膚の老化症状との関係で重要な役割を担う。皮膚における表皮角質層は、生体の最外層に位置し、外界の刺激から生体を防御する機能を有する。基底層で分裂した表皮細胞は、形態を変化させながら順次外層に押し上げられ、最終的に脱離することにより、新陳代謝を繰り返している。しかしながら、加齢や紫外線などの環境ストレス、炎症による角化亢進などにより、表皮細胞の新陳代謝のサイクルが乱れることにより、肌にシミやくすみ、シワ・小ジワ、肌荒れなどが生じることや張りが無くなることなどの老化症状が見られる場合がある。表皮細胞は、デスモソームとよばれるタンパク質により互いに結合しており、表皮角質層に存在するプロテアーゼの働きにより落屑する。プロテアーゼは、デスモソームを分解することにより、表皮細胞の新陳代謝を促進して、皮膚の老化症状を抑制する。

【0005】

上記のように、生体内外で重要な役割を担うプロテアーゼの活性を促進するものとして、ヤグルマギク、ガジュマル、キイチゴ、グレープフルーツ、セイヨウキズタ、サンザシ、ナツメ及びキバナオランダセンニチを有効成分とするプロテアーゼ活性促進剤が知られている（特許文献１を参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００８−０８１４４１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかし、特許文献１に記載のプロテアーゼ活性促進剤は、プロテアーゼ活性促進作用が十分ではない。特に、特許文献１に記載のプロテアーゼ活性促進剤は、活性を促進させるべきプロテアーゼに対して、非常に高濃度の有効成分を要するものである。

【0008】

そこで、本発明は、比較的低濃度でありながらプロテアーゼの活性を促進することができる、天然物由来成分を有効成分として含有する組成物及び剤を提供することを発明が解決しようとする課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題について鋭意研究を積み重ね、種々の物質についてプロテアーゼの活性促進性を調べてみた結果、驚くべきことに低濃度のカムカムベリーをパパイヤと組み合わせると、パパイヤ単独よりも格別顕著にプロテアーゼ活性促進作用が見られることを見出した。そして、プロテアーゼ活性促進用組成物及びプロテアーゼ活性促進剤として、パパイヤとカムカムベリーとを含有する組成物及び剤を創作することに成功した。本発明は、かかる知見や成功例に基づいて完成された発明である。

【0010】

したがって、本発明によれば、パパイヤ及びカムカムベリーを含有する化粧用組成物が提供される。

【0011】

本発明の別の側面によれば、パパイヤ及びカムカムベリーを含有するプロテアーゼ活性促進用組成物が提供される。

【0012】

本発明の別の側面によれば、パパイヤ及びカムカムベリーを含有するプロテアーゼ活性促進剤が提供される。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、パパイヤ及びカムカムベリーを含有するものであることにより、比較的低濃度でありながら、プロテアーゼの活性を促進することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、実施例に記載のパパイヤ抽出物及びカムカムベリー果実粉末の組み合わせによるたん白消化力を測定した結果を示した図である。グラフは平均値を、バーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の詳細について説明する。
本発明は、パパイヤ及びカムカムベリーを有効成分として含有することによりプロテアーゼ活性促進作用を示す、化粧用組成物、プロテアーゼ活性促進用組成物及びプロテアーゼ活性促進剤である。本明細書では、本発明を総称して、「本発明の組成物及び剤」とよぶ。

【0016】

パパイヤは熱帯アメリカ原産の果物として知られる、パパイヤ属植物であれば特に限定されず、例えば、Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａが挙げられる。また、カムカムベリーは、南アメリカの熱帯雨林原産のベリー系のフトモモ科植物であれば特に限定されず、例えば、Ｍｙｒｃｉａｒｉａ ｄｕｂｉａが挙げられる。パパイヤ及びカムカムベリーは、全体を用いてもいずれの部位を用いても良いが、種子を除く部位が好ましく用いられ、果実の種子を除く部位である果皮及び果肉部（以下、単に果実部とよぶ。）がより好ましく用いられる。

【0017】

パパイヤ及びカムカムベリーは、収穫直後のもの又は収穫後直ちに処理されたものであることが好ましい。処理までに時間を要する場合、パパイヤ及びカムカムベリーの変質を防ぐために低温貯蔵などの当業者が通常用いる貯蔵手段により貯蔵することが好ましい。

【0018】

パパイヤ及びカムカムベリーは、これらの加工物であってもよい。パパイヤ及びカムカムベリーの加工物としては、例えば、パパイヤ及びカムカムベリーの乾燥粉末、パパイヤ及びカムカムベリーの細片化物及びその乾燥粉末、パパイヤ及びカムカムベリーの搾汁及びその乾燥粉末、パパイヤ及びカムカムベリーの抽出物及びその乾燥粉末などが挙げられるが、これらに限定されない。ただし、加工、貯蔵、運搬などの容易性や使用形態の汎用性といった観点から、最終的に乾燥粉末の形態をしていることが好ましい。例えば、カムカムベリーについてはカムカムベリーの果実部の乾燥粉末が好ましく、パパイヤについてはパパイヤ抽出物及びその乾燥粉末であることが好ましい。

【0019】

例えば、パパイヤ及びカムカムベリーを乾燥粉末化するには従来公知の方法を用いることができる。そのような方法としては、パパイヤ及びカムカムベリーに対して、乾燥処理及び粉砕処理を組み合わせた方法を用いることができる。乾燥処理及び粉砕処理はいずれを先に行ってもよいが、乾燥処理を先に行うことが好ましい。乾燥粉末化は、この方法に、さらに必要に応じて殺菌処理などの処理から選ばれる１種又は２種以上の処理を組み合わせてもよい。また、粉砕処理を行う回数は１回又は２回以上の処理を組み合わせてもよいが、粗粉砕処理を行った後に、より細かく粉砕する微粉砕処理を組み合わせることが好ましい。

【0020】

殺菌処理は当業者に通常知られている処理であれば特に限定されないが、例えば、温度、圧力、電磁波、薬剤などを用いて物理的又は化学的に微生物を殺滅させる処理であるということができる。乾燥処理及び粉砕処理に追加して殺菌処理を行う場合、殺菌処理は、乾燥処理の後か、粉砕処理の前又は後に行われることが好ましい。

【0021】

乾燥処理は特に限定されないが、例えば、パパイヤ及びカムカムベリーの水分含量が１０％以下、好ましくは５％以下となるように乾燥する処理が挙げられる。乾燥処理は、例えば、熱風乾燥、高圧蒸気乾燥、電磁波乾燥、凍結乾燥などの当業者に公知の任意の方法により行われ得る。加熱による乾燥は、例えば、４０℃〜１４０℃、好ましくは８０℃〜１３０℃にて加温によりパパイヤ及びカムカムベリーが変色しない温度及び時間で行われ得る。

【0022】

粉砕処理は特に限定されないが、例えば、クラッシャー、ミル、ブレンダー、石臼などの粉砕用の機器や器具などを用いて、当業者が通常使用する任意の方法により植物体を粉砕する処理が挙げられる。粉砕されたパパイヤ及びカムカムベリーは、必要に応じて篩にかけられ、例えば、３０〜２５０メッシュを通過するものをパパイヤ及びカムカムベリーの粉末として用いることが好ましい。粒径が２５０メッシュ通過のもの以下とすることで、さらなる加工時にパパイヤ及びカムカムベリーの粉末が取り扱いやすくなり、粒径が３０メッシュ通過以上のものとすることで、パパイヤ及びカムカムベリーの粉末と他の素材との均一な混合が容易になる。

【0023】

具体的な乾燥粉末化の方法としては、例えば、パパイヤ及びカムカムベリーを切断した後、水分含量が１０質量％以下、好ましくは５質量％以下となるように乾燥し、その後粉砕する方法が挙げられる。この他にも、例えば、パパイヤ及びカムカムベリーを切断した後、揉捻し、その後、乾燥し、粉砕する方法；パパイヤ及びカムカムベリーを乾燥し、粗粉砕した後、１１０℃以上で加熱し、さらに微粉砕する方法などが挙げられる。

【0024】

パパイヤ及びカムカムベリーを細片化する方法は特に限定されないが、例えば、スライス、破砕、細断などの当業者が植物体を細片化する際に通常使用する方法を用いることができる。細片化の一例として、スラリー化してもよい。スラリー化は、パパイヤ及びカムカムベリーをミキサー、ジューサー、ブレンダー、マスコロイダーなどにかけ、パパイヤ及びカムカムベリーをどろどろした粥状（液体と固体との懸濁液）にすることにより行う。

【0025】

パパイヤ及びカムカムベリーを搾汁する方法は特に限定されないが、例えば、パパイヤ及びカムカムベリー又はその細片化物を圧搾する方法、パパイヤ及びカムカムベリーの細片化物を遠心やろ過する方法などを挙げることができる。具体的な搾汁方法の例としては、ミキサー、ジューサーなどの機械的破砕手段によって搾汁し、必要に応じて、篩別、濾過などの手段によって粗固形分を除去することにより搾汁液を得る方法が挙げられる。

【0026】

パパイヤ及びカムカムベリーの抽出物（エキス）を得る方法は特に限定されないが、例えば、パパイヤ及びカムカムベリー又はその細片化物に、エタノール、水、含水エタノールなどの当業者が通常用いる抽出溶媒を加え、必要に応じて攪拌や加温して抽出する方法などを挙げることができる。抽出物は、必要に応じて濃縮してもよい。ただし、パパイヤ抽出物は、パパインなどのパパイヤ由来酵素を含有することが好ましい。

【0027】

パパイヤ及びカムカムベリーの抽出物を得る際に用いる抽出溶媒としては、例えば、水、有機溶媒、含水有機溶媒（含水エタノールなどの含水アルコール）が挙げられるが、これらに限定されない。水を溶媒に用いる場合には、温水又は熱水を用いてもよい。抽出に用いる有機溶媒としては、通常天然物成分を抽出するのに際して許容される有機溶媒が用いられ、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ブタン、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロエテンなどが挙げられる。これらの溶媒は１種を単独で、又は２種以上を組合せて用いられ得る。これらの溶媒の中でも、熱水、含水エタノール及び含水プロピレングリコールが好ましく用いられる。

【0028】

パパイヤ及びカムカムベリーの抽出方法は、通常天然物成分を抽出するのに際して許容される方法であれば特に限定されないが、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法などの固液抽出法が挙げられる。

【0029】

加温抽出法は、例えば、被験物質と溶媒とを接触させ、溶媒の沸点以下の温度などで処理して、被験物質に含まれる成分を溶媒に抽出する方法である。還流抽出法であってもよい。

【0030】

超臨界流体抽出法は、例えば、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて抽出を行う方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが挙げられるが、好ましくは二酸化炭素である。

【0031】

超臨界流体抽出法では、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体を分離する分離工程とを行う。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。

【0032】

エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、抽出流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類を２〜２０Ｗ／Ｖ％程度添加し、この流体を用いて超臨界流体抽出を行うことによって、目的とする抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、又は分離の選択性を増強させる方法であり、効率的なパパイヤ及びカムカムベリーの抽出物を得ることができる。

【0033】

超臨界流体抽出法は、比較的低い温度で操作できるため、高温で変質・分解する物質にも適用できるという利点、抽出流体が残留しないという利点、溶媒の循環利用が可能であるため、脱溶媒工程などが省略でき、工程がシンプルになるという利点がある。

【0034】

パパイヤ及びカムカムベリーの抽出方法は、上述の抽出法以外に、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法などにより行ってもよい。また、複数の抽出方法を組み合わせてもよい。複数の抽出方法を組み合わせることにより、種々の組成のパパイヤ及びカムカムベリーの抽出物を得ることが可能となる。

【0035】

抽出により得られたパパイヤ及びカムカムベリーの抽出物は、限外濾過、吸着性担体（ダイヤイオンＨＰ−２０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−ＬＨ２０、キチンなど）を用いたカラム法、バッチ法などにより精製を行うことが安全性の面から好ましい。

【0036】

本発明において、有効成分として用いられるパパイヤ及びカムカムベリー並びにパパイヤ及びカムカムベリーの加工物は市販されているものを用いてもよく、例えば、後述する実施例に記載されているものが挙げられる。

【0037】

本発明の組成物及び剤は、パパイヤ及びカムカムベリーを含有することにより、後述する実施例によって実証されているとおり、脂肪分を含まないよう調製されたカゼインに対するプロテアーゼ活性を促進する作用を示す。本発明の組成物及び剤におけるプロテアーゼ活性促進作用の程度は特に限定されないが、例えば、後述する実施例に記載のたん白消化力の測定によって、たん白消化力がパパイヤ抽出物単独よりも高い程度、好ましくはたん白消化力が５５，０００単位／ｇ以上、より好ましくはたん白消化力が５８，０００単位／ｇ以上、さらに好ましくはたん白消化力が６０，０００単位／ｇ以上、なおさらに好ましくは６２，０００単位／ｇ以上である。

【0038】

また、本発明の組成物及び剤は、パパイヤ及びカムカムベリーを含有することにより、プロテアーゼ活性促進作用を通じて、栄養吸収促進剤、タンパク質分解剤、タンパク質活性調節剤、皮膚老化抑制剤、皮膚外用剤などの態様を採り得る。

【0039】

本発明の組成物及び剤におけるパパイヤ及びカムカムベリーの含有量は、少なくともプロテアーゼ活性促進作用を奏し得る有効量であれば、有効成分のみからなるものであってもよい。

【0040】

パパイヤ及びカムカムベリーの含有量は特に限定されず、例えば、パパイヤ抽出物及びカムカムベリー果実粉末の質量比（［パパイヤ抽出物］：［カムカムベリー果実粉末］）が１：０．００１〜１であり、好ましくは１：０．００５〜０．５であり、より好ましくは１：０．０１〜０．２である。

【0041】

パパイヤ及びカムカムベリーの含有量の総量は、１日あたりの使用量として下限値をパパイヤ及びカムカムベリーの乾燥質量で、例えば、５ｍｇ以上、好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは１５ｍｇ以上となるように設定することができる。また、１日あたりの使用量として上限値をパパイヤ及びカムカムベリーの乾燥質量で、例えば、２，０００ｍｇ以下、好ましくは１，５００ｍｇ以下、より好ましくは１，０００ｍｇ以下となるように設定することができる。

【0042】

具体的には、有効成分の含有量は、１日あたりの使用量としてパパイヤ及びカムカムベリーの乾燥質量で、５〜５，０００ｍｇであり、好ましくは１０〜２，０００ｍｇである。ただし、本発明の組成物及び剤がプロテアーゼ活性促進作用を有する他の物質を含有する場合は、それに合わせてパパイヤ及びカムカムベリーの含有量を減らすなど適宜調整できる。

【0043】

本発明の組成物及び剤は、有効成分に加えて、適宜選択したその他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、例えば、種々の賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、添加剤、化粧品原料、医薬品原料などを挙げることができる。その他の成分の含有量は、本発明の組成物及び剤の利用形態などに応じて適宜選択することができる。

【0044】

本発明の組成物及び剤は、プロテアーゼ活性促進作用を示すことを目的とした種々の形態で利用することができ、例えば、経口用又は非経口用の形態とすることができる。本発明の組成物及び剤は、その形態に応じて、そのまま経口的又は非経口的に使用してもよいし、パパイヤ及びカムカムベリーを溶解するための溶媒などに溶解して経口的又は非経口的に使用してもよい。

【0045】

本発明の組成物及び剤の形態は特に限定されず、任意の形態とすることができる。経口用の組成物及び剤の形態としては、例えば、経口的な使用に適した形態、具体的には、顆粒状、粉末状、タブレット状、チュアブル状、カプセル状、液状、シロップ状などが挙げられる。

【0046】

非経口用の組成物及び剤の形態としては、例えば、非経口的な使用に適した形態、具体的には、ローション状、クリーム状、リキッド状、ファンデーション状、ミスト状、エマルション状、スプレー状、ムース状、ジェル状などが挙げられる。

【0047】

本発明の組成物及び剤の包装形態は特に限定されず、剤形などに応じて適宜選択できるが、例えば、ＰＴＰなどのブリスターパック；ストリップ包装；ヒートシール；アルミパウチ；プラスチックや合成樹脂などを用いるフィルム包装；バイアルなどのガラス容器；アンプルなどのプラスチック容器などが挙げられる。

【0048】

本発明の組成物及び剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、期待される作用効果が奏される限り特に限定はなく、ヒト以外の動物に対して適用することができる。本発明の組成物及び剤の使用者は特に限定されず、例えば、健常者であってもよいが、プロテアーゼによる生理活性が期待される者であることが好ましく、４０歳以上の中高年者がより好ましい。本発明の組成物及び剤の使用頻度は特に限定されず、例えば、１週間に１度以上であり、好ましくは１週間に２度以上である。

【0049】

本発明の組成物及び剤におけるパパイヤ及びカムカムベリーの配合量は、その投与形態や剤形などによって適宜設定することができ、特に限定されない。例えば、パパイヤ及びカムカムベリーの総配合量は、全体を１００質量部として、下限値は乾燥質量で、０．０００１質量部以上、０．００１質量部以上、好ましくは０．００３質量部以上と設定することができ、上限値は乾燥質量で、例えば、１００質量部以下、好ましくは５０質量部以下、より好ましくは１０質量部以下と設定することができる。

【0050】

本発明の組成物及び剤は、有効成分に加えて、プロテアーゼ活性促進作用を示す第２の生理活性成分を含有することができる。このような第２の生理活性成分としては、これまでに知られているプロテアーゼ活性促進作用を示すものであれば特に限定されない。例えば、特許文献１に記載のプロテアーゼ活性促進作用を示す組成物や剤の有効成分が挙げられる。パパイヤ及びカムカムベリー並びに第２の生理活性成分を含有することにより、本発明の組成物及び剤は、相乗的なプロテアーゼ活性促進作用を示す組成物及び剤であり得る。第２の生理活性成分は、１種又は２種以上の成分であり得る。第２の生理活性成分の配合量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜調整される。

【0051】

本発明の組成物及び剤の製造方法は特に限定されず、使用態様に応じて当業者に知られる一般的な製造方法に準じて製造される。例えば、顆粒状や固形状のものについては、パパイヤ抽出物及びカムカムベリー果実粉末をそのまま又は上記のその他の成分や第２の生理活性成分と同時又は数段階に分けて混和したものを、流動層造粒法、攪拌造粒法、押出造粒法などの造粒方法に従って造粒して顆粒状とし、さらに打錠機などを用いる常法に従って圧縮成形することによって錠状に成形できる。

【0052】

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

【実施例】

【0053】

パパイヤ抽出物及びカムカムベリー果実粉末を含有する組成物が、格別顕著なプロテアーゼ活性促進作用を有することを以下のとおりに実証した。

【0054】

（１）被験物質
被験物質として市販のパパイヤ抽出物（タンパク質分解力価：ＮＦＰＵ／ｍｇ≧６，０００）及びカムカムベリー果実粉末を用いた。

【0055】

（２）チロシン検量線の作成
チロシンを１０５℃で３時間乾燥させた後、０．５００ｇを正確に量り、０．２Ｎ 塩酸を加えて溶解し、正確に５００ｍｌとしたものを、チロシン標準溶液とした。このチロシン標準溶液 １００μｌ、２００μｌ、３００μｌ及び４００μｌを正確に量り、０．２Ｎ 塩酸で１０ｍｌにメスアップして、検量線試液とした。

【0056】

０．２Ｎ 塩酸及び検量線試液の各溶液 ２ｍｌに０．５５Ｍ 炭酸ナトリウム ５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎｅ試薬 １ｍｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ここで、Ｆｏｌｉｎｅ試薬はタングステン酸ナトリウム ５ｇとリンモリブテン酸 １ｇを純水 ５０ｍｌに溶解し、リン酸 ２．５ｍｌを加え還流抽出後、２００ｍＬにメスアップすることによって調製した。試験は繰返し数２で実施した。

【0057】

９６ウェルプレートに２００μｌずつ移し、６６０ｎｍにおけるそれぞれの吸光度Ａ_０、Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３及びＡ_４を測定した。ここで、Ａ_０、Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３及びＡ_４のチロシン濃度は、それぞれ０、１０、２０、３０及び４０μｇ／ｍｌである。

【0058】

測定値について、縦軸に吸光度差（Ａ_ｎ−Ａ_０）、横軸に各溶液のチロシン濃度（μｇ／ｍｌ）をとり、検量線を作成した。得られた検量線から吸光度差１．０００に対するチロシン量（［Ｆ］μｇ／ｍｌ）を算出した。

【0059】

（３）たん白消化力の測定
カゼイン溶液は次のようにして調製した。すなわち、カゼイン（ウシ乳由来（Ｈａｍｍａｒｓｔｅｎ処方）；和光純薬工業社） 約１ｇを精密に量り、１０５℃で２時間インキュベートした後、乾燥重量を測定した。得られた乾燥カゼイン １．２０ｇ相当を精密に量り、０．０５Ｍ リン酸一水素二ナトリウム １６０ｍｌを加え、水浴中で加温して溶解した（４０℃、約１５分）。１Ｍ 塩酸を用いてｐＨ７．５に調製し、超純水で２００ｍｌにメスアップすることにより、カゼイン溶液を調製した。

【0060】

タンパク沈殿溶液として、０．１１Ｍ トリクロロ酢酸、０．２２Ｍ 酢酸ナトリウム及び０．３３Ｍ 酢酸を含有する溶液を調製した。

【0061】

酵素希釈溶液として、０．０１Ｍ ＮａＣｌ、０．００２Ｍ 酢酸カルシウム及び０．００２Ｍ 硫酸カルシウムを含有する溶液を調製した。

【0062】

カゼイン溶液 ５ｍｌを３７℃で１０分間インキュベートし、被験試料溶液 １ｍｌを加え、ただちに振り混ぜた。得られた溶液を３７℃で１０分間インキュベートし、タンパク沈殿溶液 ５ｍｌを加え、３７℃、３０分間でインキュベートした後、ひだ折りにしたろ紙（Ｎｏ．５Ｂ：φ１１０ｍｍ；アドバンテック社）を用いてろ過した。

【0063】

また、ブランクとして試料溶液 １ｍｌにタンパク沈殿溶液 ５ｍｌを加えて混合後、カゼイン溶液 ５ｍｌを添加したものを調製し、３７℃、３０分間でインキュベートした後、ひだ折りにしたろ紙（Ｎｏ．５Ｂ：φ１１０ｍｍ）を用いてろ過した。

【0064】

ろ液 ２ｍｌに０．５５Ｍ 炭酸ナトリウム ５ｍｌ及びＦｏｌｉｎｅ試薬 １ｍｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。９６ウェルプレートにインキュベート後の溶液を２００μＬずつ移し、６６０ｎｍの吸光度（Ａ_Ｔ）を測定した。また、ブランクにおける吸光度をＡ_Ｂとした。

【0065】

得られた吸光度に基づいて、以下の式を用いてたん白消化力を算出した：
たん白消化力（単位／ｇ）＝（Ａ_Ｔ−Ａ_Ｂ）×Ｆ×（反応溶液の量）×（１／１０）×（１／Ｗ）
Ｆ：チロシン検量線より求めた吸光度差が１．０００のときのチロシン量（μｇ／ｍｌ）
反応溶液：カゼイン溶液＋被験試料溶液＋タンパク沈殿溶液
Ｗ：反応溶液中の試料の量（ｇ）

【0066】

（４）試験１：パパイヤ抽出物の濃度検討
パパイヤ抽出物を２００ｍｇ／ｍＬとなるように酵素希釈溶液に溶解し、０．０１２８、０．０６４、０．３２、１．６、８及び４０ｍｇ／ｍＬに希釈して被験試料溶液を得た（公比５）。この被験試料溶液を用いて、たん白消化力を測定した。

【0067】

試験に適切なパパイヤ抽出物濃度を検討するため、０．０１２８〜２００ｍｇ／ｍＬに調製した被験試料溶液を用いて試験を実施した（ｎ＝１）。測定結果を表１に示す。表１が示すとおり、たん白消化力は０．３２ｍｇ／ｍＬにおいて最も高くなり、１．６ｍｇ／ｍＬ以上では、濃度依存的に低くなった。よって、以下の試験に用いるパパイヤ抽出物濃度は０．３２ｍｇ／ｍＬとした。

【0068】

【表1】

【0069】

（５）試験２：パパイヤ抽出物及びカムカムベリー果実粉末のたん白消化力
以下に調製したパパイヤ抽出物溶液と各濃度のカムカムベリー果実粉末溶液とを等量混合し、被験試料溶液とした。パパイヤ抽出物溶液は、パパイヤ抽出物を６．４ｍｇ／ｍＬとなるように酵素希釈溶液に溶解し、６４０μｇ／ｍＬに希釈した。カムカムベリー果実粉末溶液は、カムカム果実粉末を６．４ｍｇ／ｍＬとなるように酵素希釈溶液に溶解し、２．５６、６．４、１２．８及び６４μｇ／ｍＬとなるように希釈した。

【0070】

パパイヤ抽出物溶液 ３２０μｇ／ｍＬとカムカムベリー果実粉末溶液とを組み合わせた被験試料溶液についてたん白消化力を測定した（ｎ＝３）。試験結果を図１に示す。驚くべきことに、パパイヤ抽出物溶液と組み合わせるべきカムカムベリー果実粉末溶液の濃度が１．２８及び３．２μｇ／ｍＬの場合はパパイヤ抽出物溶液単独の場合と同等又はそれ以下であったが、カムカムベリー果実粉末溶液の濃度が６．４μｇ／ｍＬ以上である場合、パパイヤ抽出物溶液単独の場合より約１．２倍のたん白消化力が得られた。これらの結果からは、パパイヤ抽出物とカムカムベリー果実粉末とを組み合わせることによって、相加的よりもむしろ相乗的にたん白消化力が向上することが示された。

【0071】

参考文献：
（１）中央薬事審議会第５２３号通知による活性測定法；食品製造用プロテアーゼおよびパパイン製剤のタンパク消化力測定法の検討
（２）日本公定書協会編：改訂かぜ薬・解熱鎮痛薬試験法（付録２）〜胃腸薬の制酸力・ｐＨ試験法及び消化力試験法とその解説〜

【産業上の利用可能性】

【0072】

本発明によれば、プロテアーゼ活性促進作用を有するパパイヤ及びカムカムベリーの含有物が得られ、プロテアーゼによる生理活性を期待する者にとって有益な一般飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品、その他の健康飲食品、医薬用部外品、化粧品、医薬品として利用できる。

【図1】