特開 2016-202172 疑似膵島の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2016-202172(P2016-202172A)

(43)【公開日】2016年12月8日

(54)【発明の名称】疑似膵島の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20161111BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20161111BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20161111BHJP

   A61P 5/48 20060101ALI20161111BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20161111BHJP

   A61L 27/00 20060101ALI20161111BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20161111BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12M3/00

   A61P3/10

   A61P5/48

   A61K35/545

   A61L27/00 V

   C12N5/07

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2016-81442(P2016-81442)

(22)【出願日】2016年4月14日

(31)【優先権主張番号】特願2015-84360(P2015-84360)

(32)【優先日】2015年4月16日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】申請有り

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度、国立研究開発法人科学技術振興機構 研究成果展開事業 センター・オブ・イノベーションプログラム『活力ある生涯のためのＬａｓｔ ５Ｘ イノベーション』委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(71)【出願人】

【識別番号】000141897

【氏名又は名称】アークレイ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100105407

【弁理士】

【氏名又は名称】高田 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(72)【発明者】

【氏名】岩田 博夫

(72)【発明者】

【氏名】小長谷 周平

(72)【発明者】

【氏名】平野 邦生

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C081

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC01

4B029GA03

4B029GB09

4B065AA90X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065BA21

4B065BB03

4B065BB20

4B065BB23

4B065BB31

4B065BB34

4B065BC32

4B065BC34

4B065BC46

4B065BD07

4B065BD45

4B065CA44

4C081AB11

4C081AB35

4C081CD34

4C081EA02

4C081EA03

4C081EA11

4C087AA03

4C087BB51

4C087BB64

4C087CA04

4C087MA67

4C087NA14

4C087ZC35

(57)【要約】

【課題】簡易な操作で、多能性細胞を、膵島前駆細胞または膵島細胞へと高効率で分化誘導させ、移植医療などに適した実用的な疑似膵島を製造する方法を提供すること。
【解決手段】細胞培養ウェル内に、1500個〜5000個/ウェルの多能性細胞を播種し、前記多能性細胞の所定サイズの凝集体を作製する工程と、
前記凝集体を前記細胞培養ウェル内で非接着状態で培養し、膵島前駆細胞または膵島細胞を含む細胞へと分化させる工程と、
を含む、疑似膵島の製造方法。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞培養ウェル内に、1500個〜5000個/ウェルの多能性細胞を播種し、前記多能性細胞の所定サイズの凝集体を作製する工程と、
前記凝集体を前記細胞培養ウェル内で非接着状態で培養し、膵島前駆細胞または膵島細胞を含む細胞へと分化させる工程と、
を含む、疑似膵島の製造方法。

【請求項2】

前記ウェルが半球状の底部を有する、請求項１に記載の疑似膵島の製造方法。

【請求項3】

前記ウェルの容積が0.001μl/well〜10μl/wellである、請求項１または請求項２に記載の疑似膵島の製造方法。

【請求項4】

前記ウェルがハイドロゲルで構成されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の疑似膵島の製造方法。

【請求項5】

複数のウェルにおいて凝集体のサイズを略均一化して分化工程を行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の疑似膵島の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞を膵島細胞へと効率よく分化誘導させる疑似膵島の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

糖尿病、特に1型糖尿病の治療手段として膵臓移植や膵島移植が有効であるが、臓器提供数の少なさや、免疫拒絶を阻害するための免疫抑制剤を服用する必要がある点などが大きな課題となっている。一方で、人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの多能性幹細胞から膵島細胞を分化誘導する研究がマウスやヒトに由来する細胞を用いて広くなされている。

【0003】

特許文献１は、TGF-βなどの刺激因子を用いて内胚葉細胞、特に膵島細胞を誘導する手法を示している。しかし、この文献では細胞の運命を内胚葉系列、特に膵島細胞へと誘導するのに必要な刺激因子は示されているが、誘導時の細胞集団の形態を平面構造に維持するのか、立体的な凝集塊にするのかについては示されておらず、また、その際の細胞集団の大きさの制御方法などについては示されていない。

【0004】

特許文献２には、正に帯電したナノサイズの繊維又は粒子からなるマトリックス上で胚性幹細胞（ES細胞）又はiPS細胞を培養し、支持細胞を用いずに膵島細胞を多能性幹細胞から誘導する方法が示されている。しかし、凝集体を形成させることについての記載や示唆は無い。

【0005】

非特許文献１では、ヒト多能性幹細胞から膵島細胞を分化誘導した後に、細胞凝集体を形成させて擬似膵島を作製する方法が示されている。また当該擬似膵島を移植することで糖尿病モデルマウスの糖尿病状態が改善されたことが示されている。この文献では、培養皿底面上に細胞を接着培養した状態で分化誘導を進め、その過程の途中で細胞集団を培養皿底面から解離して非接着培養（浮遊培養）することで凝集体を形成させている。しかし、凝集体形成は浮遊培養中の偶発的な細胞集団同士の接着に依存するため、その大きさは制御不可能である。

【0006】

特許文献３では、細胞が接着できないヒドロゲル基材によって凹部を構成し、そこへ播種された細胞に凝集塊を形成させる方法及びデバイスが示されている。しかし、この文献では、多能性幹細胞からの分化誘導への応用方法は示されていない。

【0007】

特許文献４では、表面改質によって細胞接着を阻害した培養皿中で細胞凝集塊を形成させる手法、及び凝集塊の大きさに寄与する因子として播種細胞密度や培養液中の血清濃度が挙げられている。培養皿底面において細胞接着が生じうる領域を制限することで、結果的に生成される凝集塊の大きさを制限する手法が挙げられている。しかし、この文献では、分化誘導への応用方法は示されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第8859286号明細書

【特許文献2】特開2011-115161号公報

【特許文献3】特許第5039715号明細書

【特許文献4】特開2007-135593号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】DIABETES, VOL. 61, AUGUST 2012, 2016-2029

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

上記の通り、従来、膵島細胞を多能性幹細胞から誘導する方法が試みられてきたが、効率や品質などの点で、実用的な疑似膵島を得るには不十分であった。また、操作が煩雑であった。
したがって、本発明は、簡易な操作で、多能性細胞を、膵島前駆細胞または膵島細胞へと高効率で分化誘導させ、移植医療などに適した実用的な疑似膵島を製造する方法を提供することを課題とする。
なお、本明細書中、「疑似膵島」は、生体の膵臓から摘出される膵島に対して、生体外において幹細胞から作製された組織を指す。擬似膵島は、少なくともインスリン分泌細胞をその内部に含み、例えば、細胞塊構造をとる。擬似膵島としては、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの幹細胞から作製されるものが挙げられるが、生体に含まれる幹細胞などその他の多能性幹細胞から作製されるものも、「疑似膵島」に含まれる。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記課題を解決するために、本発明は、細胞培養ウェル内(例えば、直径200μm〜800μm、深さ400μm〜1000μm)に、1500個〜5000個/ウェルの多能性細胞を播種し、前記多能性細胞の所定サイズの凝集体を作製する工程と、形成された前記凝集体を前記細胞培養ウェル内で非接着状態で培養し、経時的に培養液組成を適宜変更することで膵島前駆細胞または膵島細胞を含む細胞塊へと分化させる工程と、を含む、疑似膵島の製造方法、を提供する。本発明は、例えば、前記ウェルが半球状の底部を有するウェルを用いて実現でき、複数のウェルにおける凝集体のサイズを略均一化して分化工程を行うことが可能となる。本発明は、例えば、ハイドロゲル製マイクロウェルプレートを好適に使用できる。

【発明の効果】

【0012】

本発明の方法によれば、従来法に比して簡易な操作で、多能性細胞を、膵島前駆細胞または膵島細胞へと高効率で分化誘導させることができる。具体的には、播種細胞数を制御し、均一な大きさの細胞凝集体を作製し、１つのウェル内に１つの細胞凝集体を保持した状態で（すなわち、別の細胞凝集体とは接触しない状態で）分化誘導を行うことで、細胞凝集体の大きさを一定の範囲に制御して均一な分化誘導効率を実現できる。すなわち、本発明の方法によれば、凝集体の中心部に酸素や栄養分が浸透しやすいので高い細胞生存率を実現できる。また、凝集体間の接触を避けつつ１つのウェル内に１つの細胞凝集体を保持し、この細胞凝集体の状態で分化誘導することで、分化誘導過程での望まない時期に細胞を剥離する必要がなく、さらには、所定期間分化培養後に細胞を回収し凝集体化する必要がなくなり操作が簡略化される、分化誘導の最終段階まで培養液の交換作業のみとなるため、自動化に対応できる、分化誘導効率を接着培養を利用する従来の手法よりも改善できる、立体的構造を形成して進行する生体の発生により近いと考えられるため、従来技術よりも成体膵島に近い性質を持った膵島細胞を誘導できる可能性がある、という利点がある。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本発明の方法に使用しうる培養器の一態様を示す図。

【図2】実施例におけるiPS細胞の膵島細胞への分化誘導条件を示す図。

【図3】（Ａ）分化誘導過程での凝集体の形態及びアガロースウェルプレートから回収した細胞凝集体の形態を示す写真。（Ｂ）分化誘導過程における細胞凝集体の直径の分布を示すグラフ。

【図4】分化誘導3日目（ａ）と分化誘導20日目（ｂ）の凝集体の免疫染色の結果を示す写真。

【図5】分化誘導34日目に得られた凝集体を用いてインスリン分泌を調べた結果を示す図。

【図6】細胞凝集体作製時の播種細胞数による生存率の違いを示す図（写真）。

【図7】凝集体培養と接着培養で誘導初期段階における胚体内胚葉細胞への分化効率を比較した結果を示す図（フローサイトメトリー;FACS）。

【図8】凝集体培養と接着培養で誘導後期段階における膵島細胞への分化効率を比較した結果を示す図（FACS）。

【図9】凝集体培養と接着培養で誘導後期段階における膵島細胞への分化効率を比較した結果を示す図（RT-PCR）。いずれも左が接着培養、右が凝集体培養の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

（多能性幹細胞）
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、少なくとも本発明で使用される膵島前駆細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、多能性生殖幹細胞（「mGS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞である。

【0015】

iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem
Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et
al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。

【0016】

体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞
、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。疑似膵島作製に使用するiPS細胞を、疑似膵島を適用する患者本人由来の体細胞から作製することで、免疫拒絶が生じない移植用膵島を作製できる可能性が高いと期待されている。

【0017】

（培養器）
本発明の方法において使用される培養器は、1500個〜5000個/ウェルの細胞、好ましくは2000個〜3000個/ウェルの細胞を播種し、凝集体を形成させることのできるサイズの培養ウェルを有する。本発明の方法は、例えば、容積が、0.001μl/well〜10μl/wellの培養ウェルを用いて実現でき、また、例えば、0.001〜1μl/wellの培養ウェルを用いて実現でき、さらに例えば、0.005μl/well〜0.5μl/well の培養ウェルを用いて実現でき、さらに例えば、0.01μl/well〜0.5μl/wellの培養ウェルを用いて実現でき、さらに例えば、0.01μl/well〜0.1μl/wellの培養ウェルを用いて実現できる。また、例えば、細胞が底部に沈んで凝集体を形成しやすい形状、例えば、底部が底に向かって膨らんだ半球状の培養ウェルや、円柱状で底部が半球状になっている形状を有する培養ウェルを用いて実現できる。このような培養ウェルの直径は、例えば、200μｍ〜800μｍであり、また、例えば、400〜800μｍである。また、このような培養ウェルの深さは、例えば、400μｍ〜1000μｍであり、また、例えば、400〜800μｍである。また、上記のような形状のウェルを複数有するマルチウェルの培養器を用いて、多数の疑似膵島を得ることができる。

【0018】

培養器は、非接着培養を行うため、培養表面が細胞の非接着処理されているものでもよいが、細胞を非接着状態で培養できるような素材でできていることが好ましい。そのような素材としては、三次元構造を有する細胞毒性のない親水性素材が好ましく、さらには、培養状態を観察しやすくするために透明の素材であることが好ましい。より具体的には、ハイドロゲルが好ましい。

【0019】

ハイドロゲルを作製するのに用いる材料としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリ-2- ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ-2- ヒドロキシエチルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸などの合成高分子の化学架橋体や放射線照射による架橋体、さらに、上記高分子を構成するモノマーの共重合体の架橋体など、ハイドロゲルを形成することのできる各種合成高分子材料を挙げることができる。また、天然高分子であるアガロース、アルギン酸、デキストラン、セルロースなどの多糖やその誘導体、また、ゼラチンやアルブミンなどのタンパクやその誘導体の架橋体なども用いることができる。

【0020】

（培養方法）
本発明の培養方法の一態様について説明する。
まず、あらかじめ接着状態で培養しておいた多能性幹細胞を、培養皿より剥離し、単一細胞に解離させる。この工程は、例えば、トリプシンなどの酵素を用いて行うことができる。そして、単一細胞に解離させられた多能性幹細胞を培地に懸濁し、1500個〜5000個/ウェルの細胞濃度になるように培養容器へ播種する。そして、この状態で一定期間、例えば、12〜36時間静置することで、凝集体を形成させる。

【0021】

なお、凝集体を形成させる際に使用する培地は、多能性幹細胞の培養に使用される一般的な培地を使用することができるが、培地にはRho-associated coiled-coil forming kinase (ROCK)阻害剤を添加することが好ましい。凝集体を形成させる際の培養条件は通常の細胞培養と同様の条件でよいが、培養温度は35〜39℃が好ましく、37℃がより好ましい。培養はO₂濃度約5〜20％、CO₂濃度約5％の通常の条件で行うことが好ましい。培養時間は凝集体が形成される時間であれば特に制限されないが、例えば、10〜30時間である。

【0022】

次に、所定サイズ、例えば、直径100μm〜500μmの凝集体を形成した多能性幹細胞に、培養液組成を変えることで分化刺激を与え、膵島前駆細胞または膵島細胞を含む細胞塊へと分化させる。
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地に必要な分化誘導因子を添加することで調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、MCDB 131 培地、E8培地、mTeSR1培地およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のウシ胎児血清(FBS)の血清代替物)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール、ITS−サプリメントなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、B27-サプリメント、N2-サプリメント、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有しうる。

【0023】

多能性幹細胞を膵島前駆細胞または膵島細胞に分化させる工程では、生体内での膵発生の過程を模倣するように、培養液の組成を経時的に変化させるとよい。
このような方法としては、例えば、以下の文献に記載された方法や、これを適宜修正した方法を用いることができる。
[非特許文献２] Rezania A, Bruin JE, Riedel MJ, Mojibian M, Asadi A, Xu J, Gauvin
R, Narayan K, Karanu F, O'Neil JJ, Ao Z, Warnock GL, Kieffer TJ. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes 2012;61:2016-2029.
[非特許文献３] Rezania A, Bruin JE, Arora P, Rubin A, Batushansky I, Asadi A, O'Dwyer S, Quiskamp N, Mojibian M, Albrecht T, Yang YH, Johnson JD, Kieffer TJ. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2014;32:1121-1133.
[非特許文献４] Hrvatin S, O'Donnell CW, Deng F, Millman JR, Pagliuca FW, DiIorio
P, Rezania A, Gifford DK, Melton DA. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 3038-3043 (2014)
[非特許文献５] Pagliuca FW, Millman JR, Gurtler M, Segel M, Van Dervort A, Ryu JH, Peterson QP, Greiner D, Melton DA. Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell. 2014;159:428-439.
例えば、初期の段階で、Activin AやWnt3aを加えることが好ましく、その後レチノイン酸、ヘッジホッグシグナル阻害剤（例えばSANT-1やCyclopamine-KAAD）、線維芽細胞増殖因子を加えることも好ましい。
また、分化の過程では、生体内での膵発生の過程を模倣して、機能的な膵島を得るために、未分化性を維持して増殖を促進する物質や、増殖を抑制して分化を促進する物質、生体内の膵臓で発現するタンパク質、インスリン分泌を促進する物質等を、適切な時期に加えてもよい。かかる物質としては、GSK-3β（Glycogen Synthase Kinase 3β）阻害剤（例えばCHIR99021）、ALK阻害剤（例えばSB431542）、Notchシグナル阻害剤（例えばDAPT）、TGFβ阻害剤（例えばLDN193189）、AMPK及びBMPシグナル阻害剤（例えばDorsomorphin）、PKC活性化剤（例えばPdbu）、インスリン様増殖因子-1、上皮成長因子、肝細胞成長因子、グルカゴン様ペプチド-1、市販のサプリメント等が挙げられる。

【0024】

培養は凝集体がインスリン産生細胞を十分含有するようになる時期まで継続すればよいが、例えば、分化刺激開始より、20〜40日間、好ましくは25〜35日間の培養期間が例示さ
れる。
培養温度は35〜39℃が好ましく、37℃がより好ましい。培養はO₂濃度約5〜20％、CO₂濃度約5％の通常の条件で行うことが好ましい。
培地は定期的に交換することが好ましく、毎日交換することがより好ましい。なお、培養を微小ウェルを有するマイクロプレートで行うときは、マイクロプレートをシャーレなどの上に置き、シャーレの中に培地を入れてマイクロプレートのウェル内に培地が浸透するようにしてもよい。このようにすることで培地交換も容易に行うことができる。
培養液の供給方法としては、１日から数日ごとにピペット等を用いて新しい培養液に交換する方法、または、培養基板を流路内に設置して、液体ポンプによって培養液を一定速度で基板上供給する方法、または、ポンプを所定時間作動させて培養液を基板上に供給し、その後一定時間静置する方法、等、適宜の方法を用いることができる。

【0025】

分化工程では、複数の培養ウェルのそれぞれに培養された凝集体のサイズを略均一化して行うことが好ましい。凝集体のサイズは、分化誘導開始時において、直径が、例えば、100μm〜500μmであり、100μm〜400μmであることが好ましく、200μm〜400μmであることがより好ましく、200μm〜350μmであることがさらに好ましく、250μm〜350μmであることがいっそう好ましい。凝集体は、分化誘導開始後において、当該培養ウェル内で、当該分化誘導開始時のサイズの０．５〜２倍を維持することが好ましく、０．８〜１．５倍を維持することがより好ましい。

【0026】

本発明の方法で得られる「疑似膵島」は、人工的に形成された細胞凝集体であって、少なくともグルカゴンを分泌するα細胞と、インスリンを分泌するβ細胞と、ソマトスタチンを分泌するδ細胞とを含み、生体内の膵島と類似した三次元構造を有するものをいう。好ましくは、グルコース応答性のインスリン分泌能を有する。膵島細胞にα細胞、β細胞、及びδ細胞が含まれることは、例えば、それぞれ、グルカゴン、インスリン、及びソマトスタチンに対する抗体を用いる免疫染色で確認できる。β細胞は、Cペプチドに対する抗体を用いた免疫染色で検出することもできる。Cペプチドは、インスリンの前駆体であるプロインスリンが、酵素によって分解されてインスリンとなる際に生成されるペプチドである。β細胞は、ジチゾン染色によって検出してもよい。
疑似膵島は、少なくともグルカゴンを分泌するα細胞と、インスリンを分泌するβ細胞と、ソマトスタチンを分泌するδ細胞とを含む膵島細胞を含むが、さらに、pancreatic polypeptide(PP)分泌細胞や膵島前駆細胞を含んでもよい。本明細書において「膵島前駆細胞」は、その後、膵島細胞へと分化していく細胞をいう。膵島前駆細胞は、例えば、PDX1（pancreas duodenal homeobox gene 1）陽性、及びPTF1a（pancreas transcription factor 1a）陽性の細胞とすることができる。また、NKX6.1陽性であることを指標としてもよい。PDX1陽性且つNKX6.1陽性、又は、PTF1a陽性且つNKX6.1陽性であることを指標としてもよい。

【0027】

本発明の方法で得られた疑似膵島は、糖尿病患者に対する移植医療に好適に使用できる。また、本発明に係る膵島細胞の製造方法は、糖尿病（特に1型糖尿病）患者由来の人工多能性幹細胞にも適用することができる。これにより得られる膵島細胞は、糖尿病発症機構の解明や、新薬の探索など、様々な研究に有用である。

【実施例】

【0028】

以下、本発明について実施例を参照して説明するが、本発明の態様は以下の態様には限定されない。

【0029】

１．アガロースマイクロウェルの準備
マイクロティシューズ社の3D Petri Dishを用い、メーカーのプロトコル（http://www.funakoshi.co.jp/contents/5556）を参考にしてアガロースマイクロウェル作製した。
具体的には、以下の手順でアガロースマイクロウェルを作製した。
小さな細胞凝集体用には、ウェル直径400μm、256 well/plateの鋳型を使用した。また、大きな細胞凝集体用(3000 cells/well以上)には、ウェル直径800μm、81 well/plateの鋳型を使用した。

【0030】

まず、鋳型に加温したアガロース溶液（2.5％アガロース/生理食塩水）を流し込む。
次に、室温で冷却し、アガロースがゲル化したら、アガロースマイクロウェルを鋳型から取り外す。
アガロースマイクロウェルを細胞培養用の12 well plateに移し、周囲に培地(DMEM/F12)を添加し、アガロースマイクロウェルを浸漬させる。
一晩以上インキュベータ（37℃、5%CO₂）に入れ、アガロースプレートを周りの培地と平衡化させる。
これにより、直径400μｍ、深さ800μｍの円柱部と、半球状の底部を有するウェルを256個有するアガロースマイクロウェルが得られた（大きな凝集体用は直径800μｍ、深さ800μｍのウェルを81個）。
図１にアガロースマイクロウェルとウェルの形状を示す。

【0031】

２．凝集体形成及び分化誘導
iPS細胞（253G1 Riken Cell Bankより入手）をGeltex（Life Technologies社）でコートされた培養容器を用い、E8培地（Life Technologies社）で３〜４日間培養した。
７０〜８０％コンフルエントの状態でTrypLE（Life Technologies社）を用いて細胞を剥がし、単一細胞に分離した。細胞を10μMのY-27632（ROCK阻害剤：和光純薬）を含むE8培地に懸濁し、上記で調製した12 well plateのウェル上に設置した256ウェルのアガロースマイクロウェルプレートに、2500細胞／ウェル、1250細胞／ウェルまたは5000細胞／ウェルで播種した。
10分間静置して細胞を底に沈ませたのち、アガロースプレートの周りに培地(E8培地＋ROCK阻害剤)を添加し、プレートごと浸漬させた。37℃、5%CO₂の条件で２４時間培養して細胞を凝集させたのち、図２の手順で分化誘導を行った。具体的には、下記のごとく、経時的に培地組成を変化させた。培地を毎日吸い出し、交換した。なお、分化誘導直前の凝集体のサイズは、約200〜350μmである。なお、図３の播種直後、Day 0、Day 3、Day 10およびDay 20の下段の画像の縮尺は、共通である。

【0032】

第１段階（３日間）
RPMI＋1.2g/L NaHCO₃、0.1% fat-free BSA、1/5000 ITS supplement 、3μM CHIR99021、100ng/mL Activin A（CHIR99021は初日の培地にのみ加えた）。
第２段階（３日間）
DMEM/F12＋0.1% fat-free BSA＋1/5000 ITS supplement ＋50ng/mL FGF-7
第３段階（４日間）
DMEM＋1% B27 supplement＋50ng/mL FGF-7＋0.25μM SANT-1＋0.5μM LDN193189＋2μM
レチノイン酸
第４段階（３日間）
DMEM＋1% B27 supplement＋0.25μM SANT-1＋0.5μM LDN193189＋0.2μM PdBu（phorbol 12,13-dibutyrate）
第５段階（７日間）
DMEM＋1% B27 supplement＋1μM Alk5 inhibitor＋0.25μM LDN193189
第６段階（１４日間）
DMEM＋1% B27 supplementまたはDMEM＋10％FBS

【0033】

３．結果
図３（Ａ）に分化誘導過程における細胞凝集体の様子（上）及び分化34日後にアガロー
スプレートから回収した細胞凝集体の形態（下）を示す。これにより、凝集体は分化初期は直径が大きくなり、その後、徐々に直径が小さくなり、よりコンパクトに凝集していくことがわかる。また、図３（Ｂ）に分化誘導過程における細胞凝集体の直径の分布を示す。凝集体の直径は、分化誘導開始時点（Day0）では約２５０〜３５０μｍで、分化誘導開始から３日後(Day3)では約３５０〜４７５μｍ、１０日後(Day10)では約２５０〜４００μｍ、２０日後(Day20)では約１７５〜３５０μｍ、３４日後(Day34)では約２００〜３２５μｍと、変動した。

【0034】

図４には、分化誘導3日目（ａ）と分化誘導20日目（ｂ）の凝集体の免疫染色の結果を示す。培養３日目には、90%程度の効率で胚体内胚葉(SOX17,FOXA2陽性)へ分化し、培養20日目には、インスリンを産生する膵島細胞へ分化していることが分かった。

【0035】

また、分化誘導34日目に得られた凝集体を用いて、インスリン分泌を調べたところ、糖の濃度に依存したインスリン分泌が確認できた（図５）。

【0036】

図６には、細胞初期濃度を、1250細胞／ウェル、2500細胞／ウェル、又は5000細胞／ウェルとした時の、分化誘導18日目に得られた膵島細胞凝集体について、細胞生存アッセイを行った結果を示す。生細胞をCalcein-AM（商品名）で染色し、死細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。
その結果、1250細胞／ウェルで播種した時は凝集体のほとんどの細胞が死滅し、5000細胞／ウェルで播種した時は凝集体中央部で細胞の死滅が多く見られた。一方、2500細胞／ウェルで播種した時は凝集体中央部での細胞の死滅はほとんど見られなかった。
この結果から、細胞数が少ないと分化誘導の途中で多くの細胞が死滅し、逆に凝集体が大きすぎると、中央部まで酸素や栄養素が行き届かなくなり、凝集体中心部の細胞の生存率や分化効率が低下することが分かり、高活性の膵島細胞を得るには細胞の播種濃度が一定の範囲であることが重要であるということが分かった。

【0037】

次に、凝集体培養での分化（本発明の方法）と接着培養での分化（比較例）について、分化誘導初期段階（3日目）における胚体内胚葉細胞への分化効率を比較した。図７に、胚体内胚葉細胞マーカーであるSOX17とFOXA2についてのFACSの結果を示す。この結果から、凝集体培養での分化の方が胚体内胚葉細胞への分化効率がよいことが分かった。

【0038】

また、凝集体培養での分化（本発明の方法）と接着培養での分化（比較例）について、誘導後期段階（20日目）における膵島細胞への分化効率を比較した。図８に、膵島細胞マーカーであるPDX1とC-peptideについてのFACSの結果を示す。この結果から、凝集体培養での分化の方が膵島細胞への分化効率がよいことが分かった。

【0039】

また、同様に、本発明の方法で得られた膵島（分化20日後）と接着培養で分化させて得られた膵島（比較例：分化20日後）について、定量RT-PCRで、膵島マーカー遺伝子の発現を調べた。結果を図９に示す。その結果、インスリン（INS）、グルカゴン（GCG）、ソマトスタチン（SST）、PDX1、NGN3、PTF1A、Nkx6.1、Nkx2.2のいずれも本発明の方法で得られた膵島の方が発現量が多く、凝集体培養での分化の方が膵島細胞への分化効率がよいことが分かった。
なお、データには示さないが、接着培養で分化させて得られた膵島では外分泌マーカーの発現も増えていることが分かった。

【0040】

以上より、本発明によれば、播種細胞数を制御し、均一な大きさの細胞凝集体を作製し、１つのウェル内に１つの細胞凝集体を保持した状態で（すなわち、別の細胞凝集体とは接触しない状態で）分化誘導を行うことで、従来の接着培養での分化誘導と比較して、より効率よく膵島細胞が誘導できることが分かる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】