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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2016-220595(P2016-220595A)
(43)【公開日】2016年12月28日
(54)【発明の名称】放射線照射食品の識別方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20060101AFI20161205BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 AZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】11
(21)【出願番号】特願2015-109066(P2015-109066)
(22)【出願日】2015年5月28日
(71)【出願人】
【識別番号】591031430
【氏名又は名称】株式会社千代田テクノル
(74)【代理人】
【識別番号】100080458
【弁理士】
【氏名又は名称】高矢 諭
(74)【代理人】
【識別番号】100076129
【弁理士】
【氏名又は名称】松山 圭佑
(74)【代理人】
【識別番号】100089015
【弁理士】
【氏名又は名称】牧野 剛博
(72)【発明者】
【氏名】清水 喜久雄
(72)【発明者】
【氏名】松尾 陽一郎
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA17
4B063QA18
4B063QQ16
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR42
4B063QR50
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS03
4B063QS25
4B063QS28
4B063QS34
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】比較的安価な装置を用いて、洗浄された食品に対しても検査が可能であり、産地などの影響を受けない高精度の検査を可能にする。【解決手段】食品中からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ合成反応に適用可能な鋳型ＤＮＡ量を定量して、放射線によるＤＮＡの損傷程度から放射線照射の有無を判定する。この際に、定量ポリメラーゼ連鎖反応法によるＤＮＡ合成反応を用いて、特定のＤＮＡ断片を選択的に増幅させることができる。更に、複数種類のプライマーセットを用いて複数の増幅開始位置を指定することができる。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
食品中からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ合成反応に適用可能な鋳型ＤＮＡ量を定量して、放射線によるＤＮＡの損傷程度から放射線照射の有無を判定することを特徴とする放射線照射食品の識別方法。
【請求項2】
前記鋳型ＤＮＡを定量する際に、定量ポリメラーゼ連鎖反応法によるＤＮＡ合成反応を用いて、特定のＤＮＡ断片を選択的に増幅させることを特徴とする請求項１に記載の放射線照射食品の識別方法。
【請求項3】
前記定量ポリメラーゼ連鎖反応法でＤＮＡ断片を増幅する際に、増幅開始位置を指定するプライマーの配列が、哺乳動物が保存しているリボソームやミトコンドリアのＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項２に記載の放射線照射食品の識別方法。
【請求項4】
前記定量ポリメラーゼ連鎖反応法でＤＮＡ断片を増幅する際に、複数種類のプライマーセットを用いて複数の増幅開始位置を指定することを特徴とする請求項２又は３に記載の放射線照射食品の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、放射線照射食品の識別方法に係り、特に、ＤＮＡ鎖切断を指標とすることにより、比較的安価な装置を用いて、洗浄された食品に対しても検査が可能であり、産地などの影響を受けない高精度の検査を可能にする放射線照射食品の識別方法に関する。
【背景技術】
【0002】
殺菌や鮮度保持を目的として食品に数キログレイレベルの放射線を照射する場合がある。放射線が照射された食品を放射線照射食品（以下、単に照射食品とも称する）という。海外で主に用いられ、日本では発芽抑制の為のジャガイモへの照射を除き、食品への放射線照射は食品衛生法で禁止されている。従って、特に輸入等で海外から国内に持ち込まれた食品のうち、照射による滅菌が禁止されている物について、放射線照射の有無を検査する必要がある。
【0003】
そこで、平成１９年７月６日に食安発０７０６００２号「放射線照射された食品の検知法（ＴＬ試験法）」が通知され、輸入モニタリング検査が開始された。また、平成２４年９月１０日に食安発第０９１０第１号「放射線照射された食品検知法」が通知され、放射線照射食品検知法に電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法が追加された。これらの手法を用いて、放射線照射食品であるか否かが調べられている。これらの方法の原理と使用方法について以下に述べる。
【0004】
（１）ＥＳＲ法放射線を照射すると、物質内に電子とホールが生成される。初期状態では、これらが周囲の物質と反応し、ラジカル化容易な物質に次々と変換されて、より安定なラジカルが蓄積する。ＥＳＲ法を用いると、これら放射線由来のラジカルによるＥＳＲ信号が放射線量に比例して現れる。ＥＳＲ法では、この信号を放射線照射食品検知に利用している（非特許文献１、特許文献１参照）。
【0005】
（２）熱ルミネッセンス（ＴＬ）法珪酸塩などの電気の伝導性の悪い物質に放射線を照射すると、その物質がイオン化しても、自由に電子が移動できないために、電子と電子孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｈｏｌｅ）が対になって生成され、それが物質内に捕捉される。これを加熱して、この電子が自由に動けるだけの運動エネルギーを与えると、電子はその捕捉された場所から移動して電子孔に捕捉され、光を放出する。そこで、このＴＬ法では、この光を温度上昇の関数として観測し、照射の有無を評価している。実際には食品サンプルに付着している結晶性の鉱物分を溶媒で抽出し、測定サンプルとして使用する（非特許文献２、特許文献２参照）。
【0006】
（３）光刺激ルミネッセンス（ＰＳＬ）法赤外線の照射による励起で食品から発生する可視光領域の光（発光）と食品への放射線照射の履歴との間に関係があることを利用して、放射線照射の有無を判別する（非特許文献３参照）。このＰＳＬ法では、食品そのものを用いることができるため、ＴＬ法のような前処理は不要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２００６−２４２８７０号公報
【特許文献2】特開２００７−４７１３２号公報
【特許文献3】特開２００６−２３２８９号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Miyahara, M., et. al.“Identification of Irradiation of Boned Chicken by Determination of o-Tyrosine and Electron Spin Resonance Spectrometry”, J. Health Sci.,48（1）pp.79-82（２００２）
【非特許文献2】藤沼賢司他「熱ルミネッセンス（ＴＬ）法による照射食品の検知について」 東京都健康安全研究センター研究年報 第５８号pp.139-144（２００７）
【非特許文献3】後藤典子他「照射食品の光ルミネッセンス法による検知」東京都立産業技術研究所研究報告 第８号pp.39-42（２００５）
【非特許文献4】宮原誠、食品照射，３７巻pp.29-47（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、いずれの方法も装置が高価で、動作に熟練が必要であるという共通の問題点を有していた。
【0010】
又、ＥＳＲ法には、（ｉ）ラジカルのスペクトルの形状がサンプル毎に異なる場合があり、磁気異方性、混在する常時性金属により影響を受ける、（ii）ラジカルの寿命が存在するために、検体の保管期間（１〜２か月）によっては信号が検出されないこともある、等の問題点を有していた。
【0011】
又、ＴＬ法及びＰＳＬ法は、強度が経時的に弱くなり、検体の保管期間（１〜２か月）によっては信号が検出されないこともある、という問題点を有していた。特にＴＬ法では、（ｉ）ＴＬの発光量が、含まれる珪酸塩などの鉱物成分によるので、その鉱物を構成する成分により、一定の発光量が得られるわけではなく、特に産地等の影響を受けやすい、（ii）香辛料の場合、ブレンドされるなどして非照射のものと照射のものとが混合されると判定できなくなる、（iii）５０度以上の高温で保存されるとその時点でＴＬ発光が起こり、検出が困難となる等の問題点も有していた。
【0012】
更に、従来法では、測定の対象となるラジカル及び珪酸塩が食品内もしくは表面に保存されていることが条件であった。これらは長期の保管や洗浄によって失われた場合、正しく照射の有無を評価することはできない。又、ＥＳＲ法やＴＬ／ＰＳＬ法では、高価な装置（５００万円〜１０００万円／１システム）が必要であり、放射線照射食品の検査を行う機関が限定的であった。
【0013】
一方、ＤＮＡを利用したコメットアッセイ法やＤＮＡフラグメントＥＬＩＳＡ法も研究されているが、高精度の検査は困難であった（非特許文献４、特許文献３参照）。
【0014】
本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、比較的安価な装置を用いて、洗浄された食品に対しても検査が可能であり、産地などの影響を受けない高精度の検査を可能にすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0015】
今回発明した手法は、ＤＮＡを評価対象としたものである。ＤＮＡは食品を構成する細胞中に含まれるものであり、洗浄等によって失われることがない。また、食肉類や香辛料のように、加工前の食品は、その製品としての性質上、状況は新鮮に保たれており、細胞は保存されていると考えられる（燻製製品などは除く）。ここからＤＮＡを抽出して、放射線による鎖切断を評価することにより、放射線照射の有無を判定することができる。
【0016】
本発明は、このような点に着目してなされたもので、食品中からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ合成反応に適用可能な鋳型ＤＮＡ量を定量して、放射線によるＤＮＡの損傷程度から放射線照射の有無を判定することにより前記課題を解決するものである。
【0017】
ここで、前記鋳型ＤＮＡを定量する際に、定量ポリメラーゼ連鎖反応法によるＤＮＡ合成反応を用いて、特定のＤＮＡ断片を選択的に増幅させることができる。
【0018】
又、前記定量ポリメラーゼ連鎖反応法でＤＮＡ断片を増幅する際に、増幅開始位置を指定するプライマーの配列を、哺乳動物が保存しているリボソームやミトコンドリアのＤＮＡ配列とすることができる。
【0019】
又、前記定量ポリメラーゼ連鎖反応法でＤＮＡ断片を増幅する際に、複数種類のプライマーセットを用いて複数の増幅開始位置を指定することができる。
【発明の効果】
【0020】
従来法では、測定の対象となるラジカルや珪酸塩が食品内もしくは表面に保存されていることが条件であったが、これらは長期の保管や洗浄によって失われた場合、正しく放射線照射の有無を評価することはできなかった。今回発明した手法は、ＤＮＡを評価対象としたものである。ＤＮＡは食品を構成する細胞に含まれるものであり、洗浄等によって失われることがないので、洗浄された食品に対しても検査が可能となる。
【0021】
又、産地や系統が異なっても、系統間で共通なＤＮＡを標的とするため、産地等の影響を受けない。
【0022】
更に、ＥＳＲ法やＴＬ／ＰＳＬ法では高価な装置（５００万円〜１０００万円／１システム）が必要であったが、今回発明した手法は、用いる装置が安価（２００万円〜３００万円／１システム）であり、従来法と比較して、安価に実施することが可能である。
【0023】
又、従来法と比較して操作が簡便で、熟練を必要とせず、検査に必要な試薬等を検査キットとしてパッケージ化することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＰＣＲ法の原理を示す図
【図2】リアルタイムＰＣＲ法を示す図
【図3】ＤＮＡ増幅曲線の概念図
【図4】同じく検量線とＣｔ値を示す概念図
【図5】本発明の原理を示す線図
【図6】プライマーの決定手順の例を示す流れ図
【図7】プライマー設計のガイドラインを示す図
【図8】プライマーを決定するために溶解中の牛肉サンプルを示す図
【図9】同じくアガロースゲル電気泳動の結果を示す図
【図10】リアルタイムＰＣＲによる候補プライマーの性能確認結果の例を示す図
【図11】ＤＮＡ合成に必要な試薬とパッケージ化される領域を示す図
【図12】本発明の実施形態の手順を示す流れ図
【図13】本発明の効果を説明するための、ＰＣＲ法によるＣＡＲＤ１５遺伝子の増幅の様子を示す図
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実施例に記載した内容により限定されるものではない。又、以下に記載した実施形態及び実施例における構成要件には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のもの、いわゆる均等の範囲のものが含まれる。更に、以下に記載した実施形態及び実施例で開示した構成要素は適宜組み合わせてもよいし、適宜選択して用いてもよい。
【0026】
本発明は、食品中からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ合成反応に適用可能な鋳型ＤＮＡ量を定量し、放射線によるＤＮＡの損傷程度から放射線照射の有無を判定する。ＤＮＡ合成反応に適用可能な鋳型ＤＮＡ量を定量するために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて連鎖反応的にＤＮＡを増幅する定量ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）法を用いる。
【0027】
このＰＣＲ法では、図１に原理を示す如く、増幅しようとするＤＮＡとその両端の配列に相補的な一対のＤＮＡプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、３段階の温度変化をｎサイクル繰り返すことによって標的ＤＮＡを２ｎ倍に増幅する。温度変化の第１段階（９４〜９６℃）で、標的二本鎖ＤＮＡを熱変性して一本鎖とし、第２段階（５５〜６０℃）でプライマーを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせ、第３段階（７２〜７４℃）で伸長反応を進める。１サイクルで標的ＤＮＡは２倍になる。従って理論的にはｎサイクルの反応で標的ＤＮＡは２ｎ倍に増幅されるので、２０サイクルでは約１００万倍に増幅されることになる。実際には数１００万倍まで増幅することができる。
【0028】
このＰＣＲ法によれば、ヒトのゲノム（３０億塩基対）のような非常に長大なＤＮＡ分子の中から、自分の望んだ特定のＤＮＡ断片（数百から数千塩基対）だけを選択的に増幅させることができる。しかも極めて微量なＤＮＡ溶液（１ｎｇ／１μｌ）で目的を達成できる。又、増幅に要する時間が２時間程度と短い。更に、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる等の特徴を有する。
【0029】
又、図２に示すように、ＰＣＲ時に、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ）を加えて反応を行い、サイクル毎の蛍光量を測定することで、ＰＣＲによる増幅を経時的（リアルタイム）に測定することができる（リアルタイムＰＣＲ）。ここから増幅率に基づいて鋳型となるＤＮＡの定量を行なうことができる。
【0030】
ＰＣＲでは、１サイクルごとにＤＮＡが２倍、２倍、・・と指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達する。ＰＣＲ増幅産物量が蛍光検出できる量に達すると増幅曲線が立ち上がり始め、指数関数的にシグナルが上昇した後、図３に例示する如く、プラトーに達する。初発のＤＮＡ量が多いほど、ＰＣＲ増幅産物量は早く検出可能な量に達するので、増幅曲線が早いサイクルで立ち上がる。よって、段階希釈したスタンダードサンプルを用いてリアルタイムＰＣＲを行うと、初発ＤＮＡ量が多い順番に等間隔で並んだ増幅曲線が得られる。ここで、適当なところに閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定すると、閾値と増幅曲線が交わる点：Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）が算出される。
【0031】
Ｃｔ値と初期鋳型量の間には直線関係があり、図４のような検量線を作成することができる。未知サンプルについてもスタンダードサンプルと同様にＣｔ値を算出し、この検量線に当てはめれば、初期鋳型量を評価することができる。すなわち、Ｃｔ値とは、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表わす。
【0032】
このようにポリメラーゼ連鎖反応による増幅率は、サンプルの鋳型ＤＮＡの量に比例する。ＤＮＡ鎖の損傷があった場合、ポリメラーゼ連鎖反応は阻害される。初期ＤＮＡ濃度を統一し、吸収線量を変化させたサンプルを用いれば、ＤＮＡ増幅はＤＮＡ鎖の損傷度合に逆比例するはずである。以上の原理より、放射線照射を受けた生体のＤＮＡを用いて、放射線照射の有無を判断・検査可能である。
【0033】
以上のように、ＰＣＲ法は、極めて微量なＤＮＡ溶液から特定のＤＮＡ断片（数百から数千塩基対）だけを選択的に増幅させ、初期の鋳型ＤＮＡ量を評価するものである。ここで、ＰＣＲ反応を繰り返した場合の増幅率は、サンプルの鋳型ＤＮＡの量に比例するため、図５に示す如く、増幅率から未損傷の鋳型ＤＮＡの量、即ちＤＮＡの損傷量を評価することができる。即ち、ＤＮＡが正常な場合は、図５（Ａ）に例示する如く、ＰＣＲ反応を繰り返すと正常に増幅されていくのに対して、ＤＮＡが損傷され断片化されていると、図５（Ｃ）に例示する如く、ＰＣＲ反応を繰り返してもＤＮＡは殆ど増幅されない。
【0034】
ＰＣＲ法による照射食品の検出には、増幅開始位置を指定するプライマーが必要となる。妥当な検出のためには、適切なプライマーの選択が求められる。適切なプライマーは、例えば図６に示すような手順に従って決定することができる。
【0035】
即ち、まずステップ１００で、注目するＤＮＡ配列を選択する。
【0036】
具体的には、例えばＮＣＢＩデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から、目的とする動物（実施例の場合はウシ）のＤＮＡ配列データを取得する。本実施例では、品種によらず配列が保存されていると考えられるミトコンドリアのＤＮＡを選択した。
【0037】
次いで、ステップ１１０で、プライマーを設計する。
【0038】
プライマーの設計は、例えばＰＣＲプライマー設計ツールＰｒｉｍｅｒ３（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）を用いて行うことができる。
【0039】
リアルタイムＰＣＲを効率的に行うには、反応性の良いプライマーを設計することが重要である。そこで、図７に例示するガイドラインに沿って、増幅効率が良く、非特異的反応が起こらないプライマーを設計する。
【0040】
次いで、ステップ１２０で、プライマーの性能確認（第１段階）を行う。
【0041】
具体的には、候補のプライマーを合成し、実用に問題ないかの確認を行う。複数種の食用牛肉（流通しているもの、本実施例では国産牛肉、欧州産牛肉）のＤＮＡに対し、ＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ増幅可能かどうか確認する。
【0042】
実施例では、サンプル１：国産牛肉、サンプル２：欧州産牛肉それぞれのサンプル５ｇに対し、ＤＮＡ抽出・精製をキアゲン社製のキットＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを用いて行った。
【0044】
図９に結果を示す。設計した候補プライマー（レーンＢ）を用いてＤＮＡを増幅できることを確認した。ここでレーンＡは、ウシＤＮＡを増幅することが既知で、ウシＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行うために用いられる市販のプライマー（陽性対照）であり、レーンＢの候補プライマー配列は、次の通りである。Primer-forward：GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCA
Primer-reverse：CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG
【0045】
次いで、ステップ１３０に進み、プライマーの性能確認（第２段階）を行った。
【0046】
即ち、ステップ１２０の確認をクリアしたプライマー候補に対し、リアルタイムＰＣＲを実際に行い、妥当性を確認する。リアルタイムＰＣＲのグラフを確認することで、グラフのカーブが理想的である、すなわち適切なＣｔ値（閾値）を評価できるかを担保することが重要である。
【0048】
設計した候補プライマーＢは、ウシＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行うために用いられる市販のプライマーＡと比較して、同等のＤＮＡ増幅（ほぼ同一のＣｔ値を算出）を可能とすることを確認できた。
【0049】
次いで、ステップ１４０に進み、プライマーの蓄積を行う。
【0050】
本発明においては、複数のプライマーセットを整備しておくことは重要である。市販品のほかに、ステップ１００〜１４０の手順で、実用可能なプライマーを複数整備することができる。なお、豚、鶏などについても同様にプライマーの作成が可能である。
【0051】
プライマーの配列としては、哺乳動物が一般的に保存しているリボソーム及びミトコンドリアのＤＮＡ配列として選択することができる。
【0052】
又、リアルタイムＰＣＲ法での通常の実験では１種類のプライマーを用いて特定の領域のＤＮＡ領域を合成するが、本実施形態では複数種類のプライマーセットを用いる。これはＰＣＲ法の原理から、同時に複数のプライマーセットを用いることで、複数の領域を増幅することができるからである。複数のプライマーセットを用いた場合、ＤＮＡ合成を行う領域を拡大することで、ＤＮＡ損傷の認識感度の向上が期待できる。
【0053】
本実施形態においては、従来法と比較して操作が簡便で、熟練を必要としないため、図１１に示す如く、検査に必要な試薬など（例えばプライマー１２、ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）１４、精製水１６）を、検査キット１０としてパッケージ化することも可能である。
【実施例】
【0054】
本手法の流れは、図１２に示すように、食品サンプルからのＤＮＡ抽出・生成（ステップ２００）、ＤＮＡ量の定量（ステップ２１０）、ＤＮＡ増幅（ＰＣＲ法）（ステップ２２０）、データ解析（ステップ２３０）の４段階に分けられる。このうちステップ２１０〜２３０について、モデル実験の例を以下に示す。
【0055】
モデル実験ＤＮＡ量の定量（ステップ２１０）
ＤＮＡのモデルとして哺乳動物（ここでは牛）のミトコンドリアのＤＮＡ、ＣＡＲＤ１５を用いた。分光光度計により０．１ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、この溶液１μｌをサンプルとした。
【0056】
模擬的な放射線照射として、大阪大学産業科学研究所のいわゆる「ミレニアム」線源を用い、γ線照射を行った。線量は１０Ｇｙ、１００Ｇｙである。
【0057】
ＤＮＡ増幅（ステップ２２０）次の条件でＰＣＲ反応を行った。反応溶液１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動により分画し、核酸染色溶液である臭化エチジウムにより蛍光染色を行った後、バンドを検出した。
【0058】
データ解析（ステップ２３０）臭化エチジウムによる蛍光染色によって得られたＣＡＲＤ１５遺伝子の画像を図１３に示す。図１３から明らかなように、吸収線量が少ないとＰＣＲ反応のサイクル数が増えるに従ってバンドの画像が明るくなるのに対して、吸収線量が増えるとＰＣＲ反応のサイクル数が多くなってもバンドの画像があまり明るくならず、照射した線量の増加に伴い、ＰＣＲ増幅が阻害されていることが分かる。これはγ線の照射により鋳型となるＤＮＡ鎖に損傷が起こり、ＰＣＲ反応が阻害された結果である。放射線照射によるＤＮＡ鎖切断量は吸収線量に比例し、切断量を反映すると考えられる。この結果は、ＤＮＡ鎖切断を指標とした照射食品の識別は可能であることを示している。
【0059】
なお、前記実施形態においては、ＤＮＡ増幅に際してアガロースゲル電気泳動を利用して分画していたが、分画方法は、これに限定されず、核酸染色溶液も臭化エチジウムに限定されない。ＤＮＡ合成反応もＰＣＲ法によるものに限定されない。
【符号の説明】
【0060】
１０…検査キット１２…プライマー
１４…ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）
１６…精製水