特開 2017-108742 低温抵抗性に優れたラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９及びこれを用いたアイスクリームの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-108742(P2017-108742A)

(43)【公開日】2017年6月22日

(54)【発明の名称】低温抵抗性に優れたラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９及びこれを用いたアイスクリームの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20170526BHJP

   A23G 9/32 20060101ALI20170526BHJP

   A23G 9/44 20060101ALI20170526BHJP

   A23G 9/52 20060101ALI20170526BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 AZNA

   A23G9/02

【審査請求】有

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2016-243722(P2016-243722)

(22)【出願日】2016年12月15日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0179391

(32)【優先日】2015年12月15日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2016-0169129

(32)【優先日】2016年12月13日

(33)【優先権主張国】KR

(71)【出願人】

【識別番号】501401593

【氏名又は名称】ロッテ コンフェクショナリー カンパニー リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】307013857

【氏名又は名称】株式会社ロッテ

(74)【代理人】

【識別番号】100102875

【弁理士】

【氏名又は名称】石島 茂男

(74)【代理人】

【識別番号】100106666

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 英樹

(72)【発明者】

【氏名】リー ミリン

(72)【発明者】

【氏名】ヨーン セォクミン

【テーマコード（参考）】

4B014

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B014GB18

4B014GG11

4B014GG14

4B014GG18

4B014GK03

4B014GK12

4B014GL07

4B014GL10

4B014GP12

4B065AA30X

4B065AC03

4B065CA41

(57)【要約】

【課題】原乳から分離した低温抵抗性に優れたラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株を提供する。
【解決手段】本発明は低温抵抗性に優れた新規の乳酸菌であるラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株、及び前記菌株を添加して製造したアイスクリームに関するもので、前記菌株は、冷凍前後、冷凍と解凍の繰り返し、冷凍中の温度変化などの極限環境でも生育安定性を持ち、低温ショックタンパク質（ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現量に優れた低温耐性菌株であり、アイスクリームに適用できる。
【選択図】 図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

低温抵抗性に優れたラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株。

【請求項2】

前記菌株は、−２０℃の温度で急速冷凍されるとき、冷凍前に比べて冷凍後の生菌数の安定性に優れていることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。

【請求項3】

前記菌株は、−２０℃の温度の冷凍と２５℃の温度の解凍が繰り返される温度変化の条件で、初期生菌数に比べ、冷凍及び解凍の繰り返し後の生菌数安定性に優れていることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。

【請求項4】

前記菌株は、−２０℃の温度と−１０℃の温度とが繰り返される冷凍中の温度変化の条件で、初期生菌数に比べ、繰り返される冷凍温度変化後の生菌数の安定性に優れていることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。

【請求項5】

前記菌株は、低温ショックタンパク質（ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）発現量が高いことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の菌株。

【請求項6】

ラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株及び菌体液を含む、乳酸菌アイスクリーム。

【請求項7】

前記アイスクリームは、菌株及び菌体液１重量％を含む、請求項６に記載の乳酸菌アイスクリーム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は低温抵抗性に優れた新規の乳酸菌であるラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株、及び前記菌株を添加して製造したアイスクリームに関するもので、より詳しくは前記ＬＲＣＣ５３０９菌株は冷凍前後、冷凍及び解凍の繰り返し、冷凍中の温度変化などの極限環境でも生育の安定性を有し、低温ショックタンパク質（ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現量に優れた低温耐性菌株であって、アイスクリームに適用可能である。

【背景技術】

【0002】

アイスクリームは暑い夏季に老若男女の誰でも好む食品であって、原乳、乳加工品又は果物などを原料にし、これに他の食品又は食品添加物などを加えた後、冷凍して硬化したものを意味する。特に、原乳又は乳加工品でアイスクリームを製造したものにおいて、アイスクリームのエネルギー量の構成成分組成は牛乳と非常に似ているが、脂肪は約２〜４倍多く、タンパク質は約−１０〜１０％多く、炭水化物は約４倍多くなり、アイスクリームのタンパク質含量が３４〜３６％である無脂乳固形分が含有されており、このタンパク質はアミノ酸で構成され、トリプトファン又はリシンのような必須アミノ酸が豊かであると知られている。このようなアイスクリームの主原料は牛乳で、乳脂肪と乳固形分の供給源となり、甘味成分として砂糖、水飴、ブトウ糖などが使われ、これらはアイスクリームの組織（きめ）形成に大きく寄与し、添加剤として使われる乳化剤及び安定剤は配合物の気泡形成能を良くし、組織を柔らかくし、光沢を付与する役目をする。特に、アイスクリームの味を決定するために添加される香料及び食用色素類としてはバニラ香料が最も一般的に使われ、その次にチョコレート、イチゴ、オレンジ、パイナップルなどであり、さらにこれらと一緒にクルミ、松の実、ピーナッツなどが一緒に添加されることもある。しかし、このようなアイスクリームは、性状、味、香りの独特の嗜好性を強調したあげく合成香料、合成着色料、高カロリー原料を使うため、肥満などの多くの短所を伴っている。

【0003】

したがって、アイスクリームの生産消費量が急増するとともにウェルビーイングのイメージとして新しい栄養性を追い求める消費者の嗜好に応えることができる機能性アイスクリームの開発が持続的に要求されており、近年にはアイスクリームに乳酸菌を添加した製品が多様に開発されている。

【0004】

乳酸菌は微生物のうちで一番有益な種類のもので、長年の時間にわたって発酵乳製品を中心として人類の生活に直間接的に密接に関係している。現在、乳酸菌は代表的なプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）菌株で、腸内微生物の均衡を改善することで宿主である人に有益に作用する菌株であり、多様な効能が検証されている。特に、整腸作用を助けて下痢や便秘を予防し、有害細菌の生長を抑制して腸癌や老化を防止し、消化機能の増進、抗コレステロール作用、抗アレルギー作用及び便秘予防効能が報告されている。したがって、このような乳酸菌をアイスクリームに適用すれば、味とともにウェルビーイング及び健康機能性のイメージを一緒に付与することが可能であろう。

【0005】

乳酸菌アイスクリームの一般的な製造工程を見ると、甘味料、乳製品、油又は脂肪、乳化剤、安定剤などの原料を添加し、９０℃で２０秒間殺菌した後、５℃以下に冷却させ、冷却後に乳酸菌を適正菌数に合わせて添加することになる。この時に添加される乳酸菌はほとんどが外国から輸入した製品であり、このような乳酸菌を発酵に用いて発酵乳にするかあるいは凍結乾燥した原料を使うことになる。しかし、このような乳酸菌の場合、乳酸菌添加後、アイスクリームを完成させる工程で、急速冷凍工程を経る。この冷凍工程で多数の乳酸菌が活性を失うことになるか死滅すると知られている。

【0006】

冷凍中に乳酸菌が死滅する現象に対して現在まで知られている原因としては、冷凍時に水分が凍りながら形成される氷結晶（Ｉｃｅ Ｃｒｙｓｔａｌ）又はアイスピック（Ｉｃｅ Ｐｉｃｋ）と冷凍時の菌体内の酵素タンパク質の変性などが報告されている。一般に、微生物の保存時には、このような冷凍ストレスに対する安定性向上のために保存剤としてグリセロール又はＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）などを使っており、通常１５〜２０重量％を使うが、アイスクリーム製造時に保存剤を２％以上使えば、製造時に物性又は官能に大きな問題が伴う。したがって、乳酸菌固有の活性を維持しながらもアイスクリーム製造時の原価に負担とならない、乳酸菌を添加してアイスクリームを製造する方法が要求されている。

【0007】

これに関連し、大韓民国公開特許第２０１２−８９５３０号はラクトバシラスプランタラムＳＹ９９に関するもので、適用可能な食品の一例としてアイスクリームを開示しているものの、実質的にラクトバシラスプランタラムＳＹ９９が低温抵抗性があってアイスクリーム中でも安定的に生育することができるかは確認されない。

【0008】

本発明者らは、乳酸菌アイスクリーム製造時に添加される乳酸菌の生菌数を安定的に維持することができる方法として、冷凍時に乳酸菌に加わるストレスに対する耐性が強い乳酸菌を探索しようとした。具体的に、冷凍時に菌体内で発現して菌体内の酵素などに保護作用をするものとして知られている低温ショックタンパク質（ＣＳＰｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）発現量が高い乳酸菌を一緒に探索しようとした。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】大韓民国公開特許第２０１２−８９５３０号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｆｏｎｓｅｃａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７２（１０）：６４７４−６４８２，２００６

【非特許文献2】Ｄｅｒｚｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８４（１９）：５５１８−５５２３、２００２

【非特許文献3】Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９：２０９２，１９８７

【非特許文献4】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：２８３， １９９０

【非特許文献5】Ｔｅａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８８：１０９０７， １９９１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

したがって、本発明は原乳から分離した低温抵抗性に優れたラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株を提供することにその目的がある。

【0012】

また、本発明はラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株及び菌体液を含む乳酸菌アイスクリームを提供することにその目的がある。

【0013】

本発明の目的は以上で言及した目的に制限されない。本発明の目的は以下の説明でより明らかになり、特許請求の範囲に記載された手段及びその組合せによって実現可能であろう。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明は、前記目的を達成するために下記のような構成を含む。

【0015】

本発明は、低温抵抗性に優れたラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株を提供する。
また、本発明は、前記菌株は、−２０℃の温度で急速冷凍されるとき、冷凍前に比べて冷凍後の生菌数安定性に優れていることを特徴とする菌株である。
また、本発明は、前記菌株は、−２０℃の温度の冷凍と２５℃の温度の解凍が繰り返される温度変化の条件で、初期生菌数に比べ、冷凍及び解凍の繰り返し後の生菌数安定性に優れている菌株である。
また、本発明は、前記菌株は、−２０℃の温度と−１０℃の温度とが繰り返される冷凍中の温度変化の条件で、初期生菌数に比べ、繰り返される冷凍温度変化後の生菌数の安定性に優れている菌株である。
また、本発明は、前記菌株は、低温ショックタンパク質（ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）発現量が高い菌株である。
また、本発明は、ラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株及び菌体液を含む、乳酸菌アイスクリームである。
また、本発明は、前記アイスクリームは、菌株及び菌体液１重量％を含む乳酸菌アイスクリームである。
そして本発明は、前記菌株は、−２０℃の温度に冷凍されるときに、冷凍後の生菌数が冷凍前の生菌数に対して半数以上である菌株である。
また、本発明は、前記菌株は、−２０℃の温度の冷凍と２５℃の温度の解凍とが二回繰り返されるときに、最後の解凍後の生菌数が最初の冷凍前の生菌数に対して３０％以上である菌株である。
また、本発明は、前記菌株は、−２０℃の温度に降温された後−１０℃の温度に昇温される温度変化を二回繰り返すときに、最後の昇温後の生菌数が、最初の降温前の生菌数に対して半数以上である菌株である。

【発明の効果】

【0016】

本発明によるラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株は、冷凍時に低温ショックタンパク質発現量に優れ、−２０℃に冷凍しても生存率が高い。即ち、冷凍時に生菌数の維持と菌体活性の維持とがされるという安定性に優れており、−２０℃に冷凍しても冷凍前の個数の半数以上が生存する。

【0017】

したがって、前記ＬＲＣＣ５３０９菌株は低温抵抗性を有するので、アイスクリームの製造時に添加すれば、乳酸菌が多量含まれたアイスクリームとして提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株の糖利用性測定結果である。

【図2】ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株の配列相同性分析結果である。

【図3】ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株と比較菌株の低温ショックタンパク質ｍＲＮＡ発現量を分析した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の実施例は、発明の要旨が変更されない限り、多様な形態に変形可能である。しかし、本発明の権利範囲が以下の実施例に限定されるものではない。

【0020】

本発明の要旨を曖昧にすることができると判断される場合、公知の構成及び機能についての説明は省略する。この明細書で、“含む”とは、特に記載がない限り、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。

【0021】

本発明は、原乳から分離され、低温ショックタンパク質発現量が高くて低温抵抗性に優れたラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株を提供する。

【0022】

ここで、低温ショックタンパク質（ＣＳＰｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は低温性微生物の低温適応に重要な役目をすると知られており、Ｊｏｎｅｓなどの研究（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９：２０９２，１９８７）によると、３７℃から１０℃に生長条件が変わったとき、約１４個の低温ショックタンパク質が生成することを明かし、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎなど（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：２８３，１９９０）は低温ショック時に生成する７．４ｋｄのタンパク質を生成する遺伝子をクローニングし、これをｃｓｐＡと名付けた。また、このｃｓｐＡタンパク質が低温ショックの下で誘導された信号を伝達する調節因子であろうという研究がＴｅａｎａなどの研究（Ｔｅａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８８：１０９０７，１９９１）によって報告された。したがって、この冷凍時低温ショックタンパク質発現量が高い乳酸菌であるほど冷凍時の安定性が優秀である可能性が高く、結局生菌数の維持に有利であろう。

【0023】

また、本発明は、培養液のままで冷凍させた後、−２０℃における冷凍と２５℃における解凍を繰り返した時と、冷凍中に−２０℃と−１０℃に温度を変化させた時にも生存率が高く、生菌数の安定性が優れている新規の乳酸菌ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株を提供する。

【0024】

前述したように、一般的な乳酸菌アイスクリームは冷凍時に多数の乳酸菌が活性を失うか死滅することになるため、もともと計画した生菌数に比べて過多の数の乳酸菌を添加する方法を用いている。これはアイスクリームの原価に負担となるか、あるいは原価を低下させるために少ない数の乳酸菌のみを添加する原因となる。この場合、消費者に十分な数の乳酸菌を供給することができなくなり、よって乳酸菌固有の機能性を発揮することができなくなる原因の一つと考えられている。したがって、冷凍に対し安定性のある乳酸菌を使えば、適度な原価に相当する乳酸菌を添加しても十分な量の乳酸菌が製品内に存在する可能性が高くなると考えられる。

【0025】

そこで、本発明はラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＲＣＣ５３０９（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）菌株及び菌体液を含む乳酸菌アイスクリームを提供する。

【0026】

アイスクリームは高嗜好性にもかかわらず、添加される合成原料と高カロリー原料による肥満などの短所を有するため、一部の消費者が顔を背けてきた場合もあったが、このようなアイスクリームに乳酸菌を添加したアイスクリームの場合、ウェルビーングのイメージによって、栄養性を追い求める消費者の嗜好にも適応することが可能であろう。また、ラクトバシラスプランタラム乳酸菌の場合、植物性原料、つまりキムチや塩辛のような伝統発酵食品に主に棲息する菌の一種として知られている。このような植物性乳酸菌は腸の長さが西洋人より長い東洋人に適した乳酸菌として多く知られている実情であるので、アイスクリームに添加する場合、元気なイメージをもっと強くアピールすることができると思われる。

【0027】

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0028】

実施例１−ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９の選別

【0029】

（１）試料採取及び乳酸菌分離

【0030】

低温ショックタンパク質発現量に優れた乳酸菌の選別のために、全国各地の伝統在来市場で約１５０種のキムチ試料を採取し、ロッテフードパスツール工場（大韓民国、ガンウォンド、フェンソン）で乳牛から搾乳、移送及び集合された市乳を集合地を基準にして４４種採取した。採取した試料（１９４種）に滅菌蒸溜水を添加して希釈液を用意した後、粉砕均質機（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ、Ｐｒｏ−Ｍｅｄｉａ ＳＨ−００１、ＥＬＭＥＸ）で試料の内部を均質化した。前記希釈液を滅菌食塩水で段階別に希釈した後、０．１ｍｌを取り、これを０．００２重量％のＢＣＰ（Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ ｐｕｒｐｌｅ）と１．５重量％の寒天（Ａｇａｒ）が添加されたＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃が維持される培養器で４８時間培養した。

【0031】

培養後、黄色の環が現れるコロニー（Ｃｏｌｏｎｙ）を選別し、個体別に同じ培地に２〜３回継代培養することによって各菌株を純粋分離した。

【0032】

前記菌株を個体別にＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で４８時間再培養した後、４℃で冷蔵保管しながら使った。

【0033】

（２）耐酸性及び耐胆汁酸性の優秀菌株の選別

【0034】

前記で分離した乳酸菌の耐酸性と耐胆汁酸性を比較し、優れた菌株を選別した。一般に、耐酸性と耐胆汁酸性は、乳酸菌を摂取したとき、胃の低いｐＨに対する抵抗性と胆汁から分泌される胆汁酸に対する抵抗性を確認し、口腔から摂取した乳酸菌が小腸まで到逹する腸内到達率を確認しようとするときに用いる。したがって、耐酸性及び耐胆汁酸性と冷凍に対する安定性の直接的な連関性は確認されなかったが、低ｐＨあるいは胆汁に対する抵抗性が強いほど外部環境に対する抵抗性が強い可能性が高いと予想されたので、１次選別のための指標として用いた。

【0035】

耐酸性及び耐胆汁酸性試験のために前記分離された乳酸菌をＭＲＳ平板培地に接種し、３７℃で２４時間培養した。培養されたコロニーを一部採取してＭＲＳ液状培地に接種した後、３７℃で２４時間静置培養して種菌培養液を作成した。

【0036】

分離された乳酸菌の耐酸性試験のために、種菌培養液１％をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間培養した。収得された培養液に１０％ Ｈ₂ＳＯ₄を添加してｐＨ３．０の強酸性条件にし、２時間放置した。その後、試料を多段希釈した希釈液をＭＲＳ平板培地に塗抹し、３７℃で２４時間培養し、初期生菌数とｐＨ３．０処理後の生菌数を測定した。本発明において、耐酸性は（初期生菌数／ｐＨ処理後生菌数）の割合で示す。

【0037】

分離された乳酸菌の耐胆汁酸性試験のために、胆汁（ｂｉｌｅ）を０．１、０．３、０．５重量％で添加して作成したＭＲＳ平板培地を用意した。各ＭＲＳ平板培地に種菌培養液を接種した後、３７℃で２４時間培養して生長可否を確認した。

【0038】

それぞれの分離菌株の耐酸性と耐胆汁酸性を確認した後、耐酸性を基準にして９９％以上、生存可能な耐胆汁酸性濃度が０．５重量％以上の菌株のみを選択し、総３８種の菌株を１次選別して以後の実験に使った。

【0039】

（３）低温ショックタンパク質発現量優秀菌株の選別

【0040】

１次選別された３８種の菌株の低温ショックタンパク質発現量測定によって低温時耐性に関する比較を進めた。このために、１次選別菌株３８種をＭＲＳ平板培地で活性化させ、一定のコロニーを採取してＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で２４時間培養して培養液を作成した。作成した培養液を遠心分離し、上澄み液を除去した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて３回洗浄し、菌体のみを回収した。回収した菌体はｍＲＮＡ抽出キット（ｍＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＴＲＩＺＯＬ）で破砕してｍＲＮＡを抽出し、ナノドロップを用いてｍＲＮＡ濃度を測定した。ＤＥＰＣ溶液（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて、１次選別された３８種の菌株のｍＲＮＡ濃度を一定に調整し、用意された試料は零下８０度で維持される極低温冷凍機（Ｄｅｆｒｅｅｚｅｒ、 Ｐａｎａｓｏｎｉｃ ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）に保管した。用意されたｍＲＮＡはｃＤＮＡ合成キット（Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔｓ、＃４３６８８１３、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡに合成し、ｑＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、 Ｃａｔ Ｎｏ． ４３６７５９、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ試料を用意した。

【0041】

３８種の菌株の中で低温ショックタンパク質発現量が高いほど冷凍ストレスに安定的であると推定し、市乳から分離された菌株の一つを本発明の最終菌株として選別した。

【0042】

最終に選別された菌株はＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で４８時間培養して増殖させ、遠心分離（１０，０００ｇ、１０分）して菌体を獲得した。前記菌体をＭＲＳ液体培地：グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が４：１の割合で含まれた冷凍保管溶液（Ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に１ｍｌ添加した後、クライオチューブ（Ｃｒｙｏ−ｔｕｂｅ）に入れ、−７０℃で冷凍保管した。冷凍された菌株を以後のテストのためのスターターとして使った。

【0043】

実施例２−菌株の特徴分析及び同定

【0044】

（１）特徴分析

【0045】

選別された菌株の形態学的及び生化学的特徴を分析した。以下、表１を参照すると、前記菌株はグラム陽性、桿菌で、胞子形成能及びカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）陰性であると確認された。

【0046】

【表1】

【0047】

（２）菌株同定

【0048】

前記菌株の糖利用性をＡＰＩ ５０ ＣＨＬキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ（登録商標） Ｆｒａｎｃｅ）で分析した。以下、表２及び図１を参照すると、ラクトバシラスプランタラム標準菌株と９９．９％一致することが確認され、この時の相反する糖利用性としてはＮ−アセチル−グルコサミンが１００％違うことが確認された。したがって、正確な同定のために、１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を分析して遺伝子同定を進行することにした。

【0049】

【表2】

【0050】

前記菌株の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列は配列番号１の通りである。塩基配列分析の結果、前記菌株はラクトバシラスプランタラム菌株と最大９９％の相同性を有する。これは図２から確認することができる。

【0051】

そこで、本発明者は前記菌株を新規のラクトバシラスプランタラム菌株として同定し、ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９と名付け、韓国微生物保存センターに２０１５年１０月２８日付で寄託した（寄託番号ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ）。

【0052】

実施例３−ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株の冷凍及び解凍の繰り返しに対する安定性

【0053】

新規の乳酸菌ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株について低温冷凍及び常温解凍を繰り返したときの生菌安定性を確認しようとした。一般的なアイスクリームの場合、製造の際、原料の配合後−１０℃〜−３０℃での急速冷凍によって完成することになる。この際、極度の冷凍ストレスによって多数の乳酸菌が死滅すると推定されている。また、製造されたアイスクリームの流通中に意図に反して常温付近の温度に露出する場合がある。この場合、短時間ではあるが温度が少し上昇してから冷凍される場合が発生する。このような場合に備えるために−２０℃で冷凍したのち常温で全て溶解させてから再冷凍する場合の乳酸菌安定性を確認しようとした。

【0054】

前記実施例で述べたものと同様な方法でＭＲＳ平板培地でＬＲＣＣ５３０９菌株を活性化させた後、ＭＲＳ液状培地に接種して種菌培養液を作成した。作成した種菌培養液０．５体積％を３０ｍｌ ＭＲＳ液状培地が入っている５０ｍｌ滅菌チューブに接種し、３７℃で２４時間培養して培養液を用意した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．８±０．２）で、生菌数が１０⁷ＣＦＵ／ｍｌの水準となるように希釈することにより、冷凍−解凍繰り返し実験のための培養液を作成した。作成した培養液を−２０℃に冷凍させ、２４時間冷凍庫に放置させた後、冷凍されたサンプルの一部を採取し、サンプル採取後、２５℃に維持される培養器で２４時間放置して解凍させ、さらに一部のサンプルを採取した。これと同様な冷凍及び解凍を３回繰り返し、初期冷凍直前に採取したサンプル内の生菌数と冷凍及び解凍を１回繰り返すごとに生菌数を測定した。ＬＲＣＣ５３０９菌株の明らかな効能の究明のための比較菌株としては、ラクトバシラスデルブルッキーエスエスピーブルガリクスＡＴＣＣ１１８４２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１１８４２）、ラクトバシラスデルブルッキーエスエスピブルガリクスＫＣＴＣ３６３５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＫＣＴＣ３６３５）、ラクトバシラスプランタラムＫＣＣＭ４０７０８（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＫＣＣＭ４０７０８）などを用い、前述した方法と同様に冷凍−解凍の繰り返し実験を進めた。また、本発明のラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株と前記比較菌株の冷凍−解凍繰り返し時の生菌数を分析して下記表３に示した。

【0055】

【表3】

【0056】

前記表３によると、本発明によるＬＲＣＣ５３０９菌株は、冷凍−解凍繰り返し実験でも大きな有意差なしに生菌数がそのまま維持されるが、比較菌株ＡＴＣＣ１１８４２及びＫＣＣＭ４０７０８の場合は、約１０分の１に生菌数が減少し、ＫＣＴＣ３６３５の場合は１０００分の１程度に生菌数が減少したことが確認された。

【0057】

したがって、ＬＲＣＣ５３０９菌株が冷凍時にも非常に安定的に生菌数を維持し、３回程度の冷凍−解凍繰り返し時にも乳酸菌数に大きな変化なしに維持されることを確認することができる。
表３から、ＬＲＣＣ５３０９菌株の冷凍−解凍を２回行った後の生菌数は、最初の冷凍前の生菌数の１／(１０の０．５２乗)倍（＝０．３０２）であり、３０％以上である。

【0058】

実施例４−ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株の冷凍温度変化による安定性

【0059】

ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株の冷凍中に冷凍温度に変化を与えた場合の生菌数安定性を確認しようとした。一般に、国内のアイスクリーム流通は、消費者に販売されるまで通常アイスショーケースに保管されて陳列される場合が多く、この場合は−１８℃程度を維持することになる。しかし、この温度は通常ショーケースの下端部を基準にして設定される温度であり、外部との接触が多いショーケースの上端部は通常この温度より高い温度を維持することになる。また、気温が高い夏季の場合、ショーケースが開かれるか新製品が補充される都度、アイスクリーム個体別に保管温度が随時変わることになる。アイスクリームの保管温度が変わる都度、内部の氷結晶が解凍と冷凍を繰り返すことになり、結果的に乳酸菌に持続的に打撃を加えることになる原因の一つであると推定されている。このような場合に備えるために、アイスクリーム保管温度を−２０℃と−１０℃に繰り返し変更する場合の乳酸菌安定性を確認しようとした。

【0060】

前記実施例で述べたものと同様な方法で、ＬＲＣＣ５３０９菌株と比較菌株をＭＲＳ平板培地で活性化させた後、ＭＲＳ液状培地に接種して種菌培養液及び種培養液を作成した。作成した培養液を０．１Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．８±０．２）で、生菌数が１０⁷ＣＦＵ／ｍｌの水準になるように希釈することで、冷凍温度変化繰り返し実験のための培養液を作成した。作成した培養液の一部をサンプルとして採取した後、−２０℃で２４時間冷凍させ、−１０℃で２４時間放置した。前記と同様な方法で３回繰り返し、初期冷凍直前に採取したサンプル内の生菌数と３回繰り返し後、つまり６日後のサンプル内の生菌数を測定した。

【0061】

本発明のラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株と前記比較菌株の冷凍温度変化後の生菌数を分析して下記表４に示した。

【0062】

【表4】

【0063】

前記表４によると、実施例３と同様に、冷凍温度に変化を与えた時にもＬＲＣＣ５３０９菌株は大きな有意差なしに生菌数が維持されることを確認し、比較菌株ＡＴＣＣ１１８４２とＫＣＣＭ４０７０８の場合は、約１０分の１に生菌数が減少することを確認した。ＫＣＴＣ３６３５の場合、１００分の１程度に生菌数が減少したことが確認され、実施例３と同様に、冷凍温度変化によって多少安定性が落ちることを確認することができる。
表４から、ＬＲＣＣ５３０９菌株の温度変化後の６日目の生菌数は、最初の冷凍前の生菌数の１／(１０の０．２５乗)倍（＝０．５６２３）であり、半数以上である。

【0064】

実施例５−ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株の低温ショックタンパク質ｍＲＮＡ発現量の確認

【0065】

本発明のＬＲＣＣ５３０９菌株の低温ショックタンパク質ｍＭＲＡ発現量の確認のために、前記実施例１と同様な方法で実験を進めた。比較菌株としては、前記実施例３及び４と同様に、ＡＴＣＣ１１８４２、ＫＣＴＣ３６３５、ＫＣＣＭ４０７０８を用いた。

【0066】

ＬＲＣＣ５３０９菌株と比較菌株３種の低温ショックタンパク質ｍＲＮＡ発現量を分析した結果は図３に示した。図３に示したように、他の菌株の発現量に比べてＬＲＣＣ５３０９の発現量が一番著しいことが確認された。これは、低温ショックを受けたとき、それに対する抵抗を高めるための低温ショックタンパク質の発現量が高いという意味であり、結局低温ショックにおける安定性が他の菌株に比べて高いことを推定することができる。

【0067】

したがって、ＬＲＣＣ５３０９菌株を用いてアイスクリームを製造する場合、高い菌株安定性が確保可能であると思われる。

【0068】

実施例６−ラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株を用いたアイスクリームの製造

【0069】

本発明のラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株は、前記実施例で述べたように、冷凍−解凍繰り返しと冷凍温度変化の際に生菌数安定性に優れ、低温ショックタンパク質ｍＲＮＡ発現量が高いことが確認された。したがって、ＬＲＣＣ５３０９菌株を用いて実際のアイスクリームを製造したときの生菌数安定性を確認しようとした。

【0070】

ＬＲＣＣ５３０９菌株及び前記実施例の比較菌株をＭＲＳ平板培地に接種して活性化し、ＭＲＳ液体培地を用いて種菌培養した後、８００ｍｌのＭＲＳ液体培地が入っている１Ｌガラス瓶に０．５体積％となるように接種し、３７℃で４８時間培養した。培養の終わった培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）し、菌体のみを回収し、０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した。３回以上洗浄した菌体は、最初の培地体積の２０分の１である４０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液に添加した後、懸濁することで乳酸菌の菌体液を用意した。

【0071】

適正濃度の糖類、油及び脂肪、乳固形分、乳化剤、安定剤を精製水に混合して基本（ｂａｓｅ）ミックスを製造し、６０℃に加温させてから均質機で脂肪球の大きさを２μｍ以下に分散させた後、９０℃で２０秒間殺菌を実施し、５℃以下に冷凍させた。ミックス温度が５℃である時点で前記製造した乳酸菌の菌体液１重量％と適正濃度の香料を投入し、１２時間以上５℃以下の温度でエージングさせた後、フリーザー（Ｆｒｅｅｚｅｒ）によって空気含有量（ｏｖｅｒｒｕｎ）が３０〜４０％となるように凍結させた。同様な方法でＬＲＣＣ５３０９と比較菌株が添加されたアイスクリームをそれぞれ１ｋｇ以上製造し、乳酸菌分析のために約８５ｇずつ分けて入れた後、零下２０度で保管した。アイスクリーム内の乳酸菌安定性分析のために急速冷凍前のサンプルと急速冷凍後のサンプルを採取し、零下２０度で４週間保管しながら１週間に１回ずつ乳酸菌数分析を行った。

【0072】

本発明のＬＲＣＣ５３０９菌株と比較菌株３種の菌体液内の乳酸菌数及びアイスクリーム製造後の乳酸菌数の測定結果を下記表５に示し、急速冷凍前及び急速冷凍後、４週間の乳酸菌数も一緒に示した。

【0073】

【表5】

【0074】

前記表５によると、比較菌株の場合、冷凍時に生菌数が多少減少することが確認され、特にＫＣＴＣ３６３５の場合は、急速冷凍時に約１０００分の１未満(１／(１０の３．１０乗))に菌数が減少したことが確認され、ＡＴＣＣ１１８４２は急速冷凍時に生菌数が１０分の１程度に減少し、ＫＣＣＭ４０７０８は４分の１近くに減少することが確認された。一方、ＬＲＣＣ５３０９菌株の場合、ここでは９割以上であり、最低でも急速冷凍時の生菌数は冷凍前の半数以上という安定性を有しており、また、及び４週経過時の生菌数に有意差がなかった。これは冷凍時に優れた安定性を維持することができる能力によるものであると思われる。
表５から、ＬＲＣＣ５３０９菌株の最初の冷凍後の生菌数は、最初の冷凍前の生菌数の１／(１０の０．０１乗)倍（＝０．９７７）であり、半数以上である。

【0075】

したがって、本発明のラクトバシラスプランタラムＬＲＣＣ５３０９菌株を用いてアイスクリームを製造する場合、最初添加される濃度に比べ、大部分の乳酸菌が安定に冷凍されることが確認された。これは、乳酸菌アイスクリーム製造時にコスト節減及び製品品質向上に寄与することになると予想される。

【0076】

以上、本発明について詳細に説明した。ただ、本発明の権利範囲はこれに限定されずに、以下の特許請求範囲によって決定される。

【受託番号】

【0077】

寄託機関：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１７８１Ｐ
受託日付：２０１５１０２８

【配列表フリーテキスト】

【0078】

TGTCCGGATT TATTGGGCGT AAAGCGAGCG CAGGCGGTTT TTTAAGTCTG ATGTGAAAGC 60
CTTCGGCTCA ACCGAAGAAG TGCATCGGAA ACTGGGAAAC TTGAGTGCAG AAGAGGACAG 120
TGGAACTCCA TGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGATATATGG AAGAACACCA GTGGCGAAGG 180
CGGCTGTCTG GTCTGTAACT GACGCTGAGG CTCGAAAGTA TGGGTAGCAA ACAGGATTAG 240
ATACCCTGGT AGTCCATACC GTAAACGATG AATGCTAAGT GTTGGAGGGT TTCCGCCCTT 300
CAGTGCTGCA GCTAACGCAT TAAGCATTCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTGAAAC 360
TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGAAGCTAC 420
GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATACT ATGCAAATCT AAGAGATTAG ACGTTCCCTT 480
CGGGGACATG GATACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT 540
TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTATTA TCAGTTGCCA GCATTAAGTT GGGCACTCTG 600
GTGAGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT 660
TATGACCTGG GCTACACACG TGCTACAATG GATGGTACAA CGAGTTGCGA ACTCGCGAGA 720
GTAAGCTAAT CTCTTAAAGC CATTCTCAGT TCGGATTGTA GGCTGCAACT CGCCTACATG 780
AAGTCGGAAT CGCTAGTAAT CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAATACGTT CCCGGGCCTT 840
GTACACACCG CCCGTCACAC CATGAGAGTT TGTAACACCC AAAGTCGGTG GGGTAACCTT 900
TTAGGAACCA GCCGCCTAAG GTGGGACAGA TGATTAGGGT GAAGTCGTAA CAAGGGTAAC 960

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]