知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ エクソンモービル リサーチ アンド エンジニアリング カンパニーの特許一覧
特開2017-123852脱水素酵素の発現によって脂肪酸合成を改善するための細胞系および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2017-123852(P2017-123852A)
(43)【公開日】2017年7月20日
(54)【発明の名称】脱水素酵素の発現によって脂肪酸合成を改善するための細胞系および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20170623BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20170623BHJP
C12N 1/12 20060101ALI20170623BHJP
C12N 9/02 20060101ALN20170623BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20170623BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
C12N1/20 A
C12N1/12
C12N9/02
C12N9/16
【審査請求】有
【請求項の数】42
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
【全頁数】94
(21)【出願番号】特願2017-22740(P2017-22740)
(22)【出願日】2017年2月10日
(62)【分割の表示】特願2015-508935(P2015-508935)の分割
【原出願日】2012年12月5日
(31)【優先権主張番号】13/453,235
(32)【優先日】2012年4月23日
(33)【優先権主張国】US
(71)【出願人】
【識別番号】390023630
【氏名又は名称】エクソンモービル リサーチ アンド エンジニアリング カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＥＸＸＯＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＯＭＰＡＮＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100194423
【弁理士】
【氏名又は名称】植竹 友紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，ロバート，シー．
(72)【発明者】
【氏名】コパースミス，ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】プラカシュ，プラチー
(72)【発明者】
【氏名】アケッラ，スリビジャ
(72)【発明者】
【氏名】セシャドリ，レカ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050DD02
4B050LL05
4B065AA83X
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA13
4B065CA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】光合成微生物により脂肪を製造する方法の提供。【解決手段】脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およびチオエステラーゼをコードする前記非天然遺伝子が発現される条件下、適した培養培地中に、前記脱水素酵素をコードする前記非天然遺伝子および前記チオエステラーゼをコードする前記非天然遺伝子を含む組換え前記光合成微生物の培養物を提供することを含み、前記培養物は、前記非天然脱水素酵素をコードする前記遺伝子を含まない点を除いてすべての点で同一である対照微生物を含む前記培養物が製造するものよりも、多い量の前記脂質を製造し、亦、前記脱水素酵素をコードする前記非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物は、前記非天然脱水素酵素をコードする前記遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長及び／又は増殖速度を有する、脂質を製造する光合成微生物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脂質を製造する微生物を培養する方法であって、
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のための少なくとも１種の遺伝
子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およ
び脂質の製造のためのポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む組
換え微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべて
の点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し
、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、非天然脱水素酵
素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有す
る、方法。
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のための少なくとも１種の遺伝
子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およ
び脂質の製造のためのポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む組
換え微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべて
の点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し
、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、非天然脱水素酵
素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有す
る、方法。
【請求項2】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非
リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素
、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸
脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法
。
リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素
、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸
脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法
。
【請求項4】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して、少なくとも５０％
の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
、請求項４に記載の方法。
の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方
法。
法。
【請求項7】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９またはその
活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも
８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも
８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項9】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列
番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ま
しくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の
方法。
番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ま
しくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の
方法。
【請求項10】
脱水素酵素が、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項11】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３およ
びその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少な
くとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
びその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少な
くとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、組換え微生物に対して内因性である、請求項１０
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項13】
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アク
ナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphor
a）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、
ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（B
otryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetocero
s）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム
属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、
クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファ
エラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナ
ス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、
エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属
（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フ
ランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gl
oeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafete
ria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリ
ス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Mon
oraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsi
s）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nep
hrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オク
ロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oo
cystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロ
レラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeod
actylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（
Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococ
cus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュー
ドネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリ
ス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema
）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス
属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）
およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項
１から１２のいずれか一項に記載の方法。
ナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphor
a）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、
ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（B
otryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetocero
s）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム
属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、
クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファ
エラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナ
ス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、
エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属
（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フ
ランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gl
oeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafete
ria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリ
ス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Mon
oraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsi
s）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nep
hrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オク
ロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oo
cystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロ
レラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeod
actylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（
Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococ
cus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュー
ドネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリ
ス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema
）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス
属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）
およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項
１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属
（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）
、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロ
カプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カ
マエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロ
コッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナ
リウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（C
yanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シ
アノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シ
リンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsi
s）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミ
エラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema
）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオ
セイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iye
ngariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）
、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Mi
crocystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノス
トック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillator
ia）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プ
レウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロ
ロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ
属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）
、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieri
a）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca
）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サー
モシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、ト
リコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（
Xenococcus）からなる群から選択されるラン藻の種である、請求項１から１２のいずれか
一項に記載の方法。
（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）
、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロ
カプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カ
マエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロ
コッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナ
リウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（C
yanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シ
アノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シ
リンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsi
s）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミ
エラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema
）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオ
セイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iye
ngariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）
、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Mi
crocystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノス
トック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillator
ia）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プ
レウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロ
ロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ
属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）
、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieri
a）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca
）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サー
モシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、ト
リコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（
Xenococcus）からなる群から選択されるラン藻の種である、請求項１から１２のいずれか
一項に記載の方法。
【請求項15】
組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、請求項１３または請求項１４のい
ずれかに記載の方法。
ずれかに記載の方法。
【請求項16】
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含む組換え微生物であって、脂質の製造
に関与している酵素をコードする少なくとも第２の非天然遺伝子をさらに含み、酵素が、
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾ
イルチオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アシル−ＣｏＡシンセター
ゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクター
ゼ、ワックスシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デカルボニラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡ
Ｔ、ＰＡＰおよびＤＧＡＴからなる群から選択され、
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生
物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え微生物。
に関与している酵素をコードする少なくとも第２の非天然遺伝子をさらに含み、酵素が、
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾ
イルチオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アシル−ＣｏＡシンセター
ゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクター
ゼ、ワックスシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デカルボニラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡ
Ｔ、ＰＡＰおよびＤＧＡＴからなる群から選択され、
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生
物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え微生物。
【請求項17】
脂質が、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドである、請求項１６に記載の組換
え微生物。
え微生物。
【請求項18】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１６または請求項１７のいず
れかに記載の組換え微生物。
れかに記載の組換え微生物。
【請求項19】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非
リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素
、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸
脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１８に記載の組換え微生物。
リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素
、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸
脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１８に記載の組換え微生物。
【請求項20】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項21】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して少なくとも５０％の
同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求
項２０に記載の組換え微生物。
同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求
項２０に記載の組換え微生物。
【請求項22】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の
組換え微生物。
組換え微生物。
【請求項23】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９およびその活性断片からなる群
に対して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸
配列を含む、請求項２２に記載の組換え微生物。
に対して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸
配列を含む、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項24】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微
生物。
生物。
【請求項25】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６お
よびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なく
とも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
よびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なく
とも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
【請求項26】
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アク
ナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphor
a）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、
ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（B
otryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetocero
s）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム
属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、
クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファ
エラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナ
ス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、
エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属
（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フ
ランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gl
oeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafete
ria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリ
ス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Mon
oraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsi
s）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nep
hrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オク
ロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oo
cystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロ
レラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeod
actylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（
Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococ
cus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュー
ドネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリ
ス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema
）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス
属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）
およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項
１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
ナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphor
a）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、
ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（B
otryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetocero
s）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム
属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、
クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファ
エラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナ
ス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、
エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属
（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フ
ランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gl
oeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafete
ria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリ
ス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Mon
oraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsi
s）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nep
hrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オク
ロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oo
cystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロ
レラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeod
actylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（
Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococ
cus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュー
ドネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリ
ス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema
）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス
属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）
およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項
１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項27】
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属
（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）
、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロ
カプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カ
マエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロ
コッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナ
リウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（C
yanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シ
アノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シ
リンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsi
s）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミ
エラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema
）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオ
セイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iye
ngariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）
、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Mi
crocystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノス
トック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillator
ia）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プ
レウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロ
ロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ
属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）
、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieri
a）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca
）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サー
モシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、ト
リコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（
Xenococcus）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいず
れか一項に記載の組換え微生物。
（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）
、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロ
カプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カ
マエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロ
コッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナ
リウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（C
yanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シ
アノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シ
リンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsi
s）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミ
エラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema
）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオ
セイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iye
ngariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）
、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Mi
crocystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノス
トック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillator
ia）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プ
レウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロ
ロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ
属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）
、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieri
a）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca
）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サー
モシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、ト
リコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（
Xenococcus）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいず
れか一項に記載の組換え微生物。
【請求項28】
配列番号２９に対して、少なくとも６５％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の
同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分
子。
同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分
子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照本願は、２０１２年１２月４日に作製された、配列表テキストファイル「６１０３７５
２７＿ｌ．ｔｘｔ」、ファイルサイズ８４キロバイト（ＫＢ）として本明細書と同時に提
出されたアミノ酸配列および／または核酸配列の参照を含有する。前記の配列表は、３７
Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（ｉｉ）に準拠した、その全文が参照により本明細書に組
み込まれる。
【0002】
本発明は、いくつかの実施形態では、光合成微生物における代謝経路の操作に関する。具体的には、本発明は、脂肪酸、脂肪酸誘導体および／または脂質の合成のための経路の
操作に関する。本発明はまた、バイオ燃料を含めた種々の生成物のために使用され得る光
合成微生物において脂肪酸生成物などの脂質を製造するための、方法、微生物および核酸
分子に関する。
【背景技術】
【0003】
化石燃料は、腐敗した動植物から形成された有機物質の埋蔵されている可燃性の地質堆積物が、何億年もかけて地殻中で熱および圧力に対する曝露によって原油、石炭、天然ガ
スまたは重油に変換されたものの総称である。化石燃料は、有限の再生不能な資源である
。
【0004】
グローバル経済によってエネルギー需要が高まったことにより、炭化水素の費用にかかる圧力がさらに強くなっている。エネルギーの他にも、プラスチックおよび化学メーカー
を含めた多数の産業が、その製造プロセスの原料として炭化水素の利用可能性に大きく依
存している。既存の供給源に取って代わる費用効率の高いものがあれば、エネルギーおよ
びこれらの原料費にかかる上昇圧力を軽減するのに寄与することができよう。この目的を
果たすために、費用効率の高い強化されたバイオプロセスによる高エネルギー燃料の微生
物生産に主な努力が集中している。しかし、可燃性生成物を作製するための発酵ベースの
アプローチなどの化石燃料製造のいくつかの代替法は、サトウキビ、イネ、トウモロコシ
などの炭水化物が豊富な原料を大量に使用することに頼っている。可燃性燃料を製造する
ためのこのような資源の使用は、原料に対する市場圧力を高め、世界の食糧供給の価格を
釣り上げるという望ましくない結果となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
脂肪酸は、長いアルキル鎖からなり、自然界の石油に相当し、化学的機能およびエネルギー貯蔵機能の両方のために細胞によって使用される一次代謝産物である。これらのエネ
ルギーが豊富な分子は、今日、燃料から油脂化学物質にわたる多様な製品のために植物油
および動物油から単離される。この重要なクラスの化学物質を得るためのよりスケーラブ
ルで制御可能な経済的方法があれば、再生可能なエネルギー源の開発にとって有益となろ
う。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、本発明は、脂質を製造する方法であって、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物の培養物を提供すること、および非天然遺伝子が発現される条
件下で微生物が増殖するのを可能にすることを含み、培養物が少なくとも１種の脂質を製
造する、方法を提供する。好ましくは、培養物は、対照微生物が、非天然脱水素酵素をコ
ードする遺伝子を発現しない点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を発現する組換え微生
物とすべての点で同一である対照微生物の対照培養物によって製造される脂質の量よりも
多い量の脂質を製造する。脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を発現し、脂質を製造す
る組換え微生物は、非天然脱水素酵素遺伝子を発現しない対照微生物よりも高い増殖速度
を有し得る。組換え微生物によって製造される脂質は、任意の脂質であり得、好ましくは
、脂肪酸生成物、例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドであり得る。さら
に、組換え微生物は、脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードするさらなる非天然
遺伝子を含み得る。非天然脱水素酵素遺伝子を発現する組換え微生物は、適した培養培地
、例えば、組換え微生物の成長および／または増殖を支援する培養培地で培養され得る。
この方法は、培養物から少なくとも１種の脂質を単離することをさらに含み得る。
【0007】
また、特定の態様では、脂質を製造する微生物の繁殖および／または増殖速度を改善する方法が本明細書において提供され、この方法は、脂質を製造する微生物において脱水素
酵素をコードする組換え核酸分子を発現させること、および微生物の繁殖を支援する条件
下で微生物を培養することを含み、微生物の繁殖および／または増殖速度は、同一条件下
で培養され、対照微生物が脱水素酵素をコードする組換え核酸分子を発現しない点を除い
て、組換え微生物とすべての点で同一である対照微生物のものよりも高い。さらに、微生
物は、脂質の合成に関与する１種または複数のポリペプチドをコードする少なくとも１種
のさらなる非天然遺伝子を含み得る。
【0008】
非天然遺伝子または組換え核酸分子によってコードされる脱水素酵素は、酸化反応においてＮＡＤＰを使用し得る脱水素酵素であり得る。さらに、またはあるいは、非天然遺伝
子は、宿主微生物に対して異種（異なる種から誘導される）または同種（同じ種から誘導
される）である脱水素酵素をコードし得、特定の態様では、非天然遺伝子は、宿主微生物
における過剰発現のために操作された内因性遺伝子であり得る。種々の例では、脱水素酵
素は、アルデヒド脱水素酵素（例えば、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素または
非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．９）を含む
）、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホ
グルコン酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ
酸酵素であり得る。例えば、組換え微生物は、いくつかの例では、配列番号４、配列番号
６または配列番号７のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少
なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも
７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％ま
たは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るアルデヒド脱水素酵
素をコードする非天然遺伝子を含み得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、メ
チルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いくつかの
例では、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少
なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも
７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、
少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むメチ
ルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、脱水素酵素
は、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得、いくつかの例では、配列番号２、配列番
号２９、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少
なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも
７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、
少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−
２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、６
−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコ
ン酸脱水素酵素は、いくつかの例では、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３
のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少な
くとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８
０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％
の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0009】
非天然脱水素酵素遺伝子を含む微生物は、真菌、細菌または不等毛藻であり得、例えば、微細藻類またはラン藻などの光合成微生物であり得る。例えば、微生物は、アクナンテ
ス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、
アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエ
ケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botry
ococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）
、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属
（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、ク
ロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエ
ラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス
属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エ
リプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（
Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フラ
ンセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloe
othamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteri
a）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス
属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monor
aphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis
）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Neph
rochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロ
モナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocy
stis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレ
ラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodac
tylum）、ファガス（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Plat
ymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus
）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュード
ネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス
属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、シゾクラミデラ属（Schizochlam
ydella）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカ
ス属（Stichococcus）、テトラクロレラ属（Tetrachlorella）、テトラセルミス属（Tetr
aselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）またはボ
ルボックス属（Volvox）の種である微細藻類であり得る。あるいは、微生物は、ラン藻で
あり得、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス
属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizom
enon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジ
ア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）
、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococc
idiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバ
クテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属
（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シ
リンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindro
spermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermoca
rpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリ
ア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeoba
cter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピ
ルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（L
eptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコ
レウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（My
xosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス
属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium
）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プ
ロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロ
スリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア
属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、ス
ピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、ス
ティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechoco
ccus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynec
hococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium
）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）の種であり得る。
【0010】
本発明の光合成宿主微生物は、例えば、培養培地において炭素の実質的に唯一の供給源として無機炭素を用いて、脂質の製造のために光独立栄養的に培養され得る。微生物は、
培養培地中に無機炭素、例えば、ＣＯ２とともに提供されてもよく、および／または炭酸
塩が、培養期間の間、培養物に供給されてもよい。
【0011】
光合成微生物であり得る、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、脂肪酸生成物またはトリグリセリドなどの脂質の製造に関与するポリペプチドをコード
する第２の非天然遺伝子をさらに含み得る。限定されない例として、脂質の製造に関与す
るポリペプチドは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトラン
スアシラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、
アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシルベンゾイルチオエステラーゼ、脂質分解
活性を有するポリペプチド、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ
、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカル
ボキシラーゼ、デカルボニラーゼ、グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰ
ＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジ
ン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）またはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラー
ゼ（ＤＧＡＴ）であり得る。組換え微生物は、例えば、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪ア
ルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカンまたはアルケンなどの脂肪酸誘
導体を製造し得るか、またはトリグリセリドを製造し得、そのいずれも、特定の例では、
脂質の製造に関与する遺伝子で形質転換されていない場合には、微生物によって天然に製
造されない脂質であり得る。例えば、組換え微生物は、チオエステラーゼをコードする第
２の非天然遺伝子を含み得、脂肪酸生成物、例えば、遊離脂肪酸または脂肪酸誘導体を製
造し得る。脂肪酸生成物は、Ｃ８〜Ｃ１４の、例えば、Ｃ１２〜Ｃ１８などのＣ１２〜Ｃ
２４の少なくとも１種のアシル鎖を含み得る。
【0012】
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子および脂質の製造に関与する脂質ポリペプチドをコードする第２の非天然遺伝子を含む組換え微生物は、脱水素酵素をコードする非
天然遺伝子を含まない点を除いて、組換え微生物とすべての点で同一である対照微生物よ
りも高い増殖速度を有し得る。例えば、非天然脱水素酵素遺伝子および脂質生合成のため
のポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、脱水素酵素遺伝子が発
現され、組換え微生物が脂質を製造する培養期間の間、高い増殖速度を有し得る。組換え
微生物は、光合成微生物であり得、特定の例では、組換え微生物が、少なくとも１種の脂
質、例えば、特定の例では、光合成微生物によって天然に製造されない脂肪酸生成物であ
り得る脂肪酸生成物などを製造する光独立栄養条件下で培養された場合に非天然脱水素酵
素遺伝子を含まないか、または発現しない対照微生物よりも高い増殖速度を有し得る。
【0013】
また、組換え光合成微生物が、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含み、培養物が、脱水素酵素をコー
ドする非天然遺伝子を欠く点を除いてすべての点で同一である微生物の同一培養物によっ
て製造されるものよりも多量の脂質を製造する、適した培養培地中に組換え光合成微生物
を含む培養物が本明細書において提供される。さらに、またはあるいは、非天然脱水素酵
素遺伝子を含む微生物の培養物は、３、４、５または６日培養した後に、脱水素酵素をコ
ードする非天然遺伝子を欠く点を除いて、すべての点で同一である微生物の同一培養物に
よって到達される培養密度よりも高い光学濃度に到達し得る。培養物は、例えば、培養培
地が、実質的に唯一の炭素源として無機炭素を含有する光独立栄養培養物であり得る。培
養物は、第１の非天然遺伝子を欠く組換え微生物を含む点を除いて、すべての点で同一で
ある培養物と比較して、少なくとも１０％多く、少なくとも２５％多く、少なくとも５０
％多く、少なくとも７５％多く、少なくとも１００％、少なくとも２００％多く、少なく
とも３００％多く、少なくとも４００％多く、少なくとも５００％多く、少なくとも７０
０％多くまたは少なくとも８００％多くの脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドを
製造し得る。
【0014】
本明細書における方法のいずれかにおいて使用される組換え微生物は、本明細書において開示されるような任意の脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、例えば、脱水
素酵素は、アルデヒド脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、非リン酸化型グリ
セルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホス
ホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素であり得る。例え
ば、脱水素酵素は、アルデヒド脱水素酵素であり得、いくつかの例では、配列番号４、配
列番号６または配列番号７のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０
％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少な
くとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９
５％または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。あるいは、またはさらに、微生物
は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いく
つかの例では、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列またはその活性断片に対
して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するメチルマロン酸セ
ミアルデヒド脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、微生物は、Ｄ−２−ヒド
ロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いくつかの例では、配列番号２
、配列番号２９、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列またはその活性断片に
対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、
少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくと
も９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＤ−２−ヒド
ロキシ酸脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、微生物は、６−ホスホグルコ
ン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコン酸は、いくつ
かの例では、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列またはその
活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくと
も６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％
、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0015】
方法は、培養物から少なくとも１種の（on）脂質を単離することをさらに含み得る。脂質は、細胞、培地または全培養物から単離され得る。また、本明細書において提供される
方法または組換え微生物のいずれかによって製造される脂質も本明細書において提供され
る。脂質は、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエス
テル、アルカン、アルケン、リン脂質、ガラクト脂質もしくはトリグリセリドのいずれか
またはいずれかの組合せであり得る。脂質は、１２から２４個の間の炭素原子、例えば、
１２から１８個の炭素原子などの８から２４個の炭素原子を含有する少なくとも１種のア
シル鎖を含み得る。
【0016】
いくつかの態様では、本発明は、配列番号３、配列番号９、配列番号１、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１７に対して少なくとも５０％同一である第１のヌクレオ
チド配列を含む第１の組換え核酸分子を含む組換え光合成微生物に関し、核酸分子は、脱
水素酵素をコードする。組換え光合成微生物は、少なくとも、脂肪酸生成物の製造のため
に操作され得、脂質の合成に関与するポリペプチドをコードする第２の組換え核酸分子ま
たはヌクレオチド配列を含み得る。例えば、光合成微生物は、例えば、ラン藻であり得る
光合成微生物によって天然に製造されない、遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセ
リドの合成に関与するポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含み得る。例
えば、光合成微生物は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする組換えヌクレオチ
ド配列を含み得、遊離脂肪酸または脂肪酸誘導体を製造し得る。例示的な例では、アシル
−ＡＣＰチオエステラーゼは、高等植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはその変異
体、例えば、配列番号２１のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼなどであり得る。
【0017】
本発明は、さらなる例では、アルデヒド脱水素酵素またはＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列を含む非天然の第１の核酸分子を含む組換え微生物を
提供し、光合成微生物は、外因性の第１の核酸分子を欠く、そうでなければ同一である微
生物によって製造されるものよりも多くの脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質を製造する。
いくつかの実施形態では、生物は、非天然アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−Ｃ
ｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、アシル−ＡＣＰレダク
ターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボニラーゼ、デカル
ボキシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスア
シラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、グリセロールリン酸アシルトランスフェ
ラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、
ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）またはジアシルグリセロールＯ−アシルトラ
ンスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）からなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１種
の第２の非天然核酸分子をさらに発現する。さらに、微生物は、第２の非天然核酸分子の
不在下では微生物によって製造されない脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質を製造
し得る。組換え微生物は、光合成微生物であり得、光独立栄養条件で第１の核酸を欠く、
そうでなければ同一である微生物によって製造されるものよりも多くの脂肪酸、脂肪酸誘
導体またはグリセロ脂質を製造し得る。いくつかの態様では、本発明は、脂肪酸生成物を
製造するのに十分な時間量の間、アルデヒド脱水素酵素またはＤ−２−ヒドロキシ酸脱水
素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含み、脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質生合成
に関与するポリペプチドをコードする第２の非天然遺伝子を含む本発明の組換え光合成微
生物を培養することを含む、脂肪酸生成物を製造する方法に関する。脂肪酸生成物は、光
合成微生物によって天然には製造されない生成物であり得る。
【0018】
また、異種プロモーター、すなわち、ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を普通は調節しないプロモーターの制御下にある同種ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え
光合成微生物も提供される。例えば、ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子は、異種の、好
ましくは、調節可能なプロモーターと作動可能に連結され得、組換え微生物のゲノム内の
非天然遺伝子座に組み込まれ得る。あるいは、異種プロモーターは、宿主ゲノム中に挿入
され、内因性ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子と作動可能に連結されるようになり得、
その結果、内因性ホスホグルコン酸（phosphhogluconate）脱水素酵素が宿主微生物にお
いて過剰発現され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、脂質（例えば、脂肪酸生成物
）の製造に関与するポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸
をさらに発現し、ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子の発現が、微生物の繁殖および／ま
たは増殖速度を、組換えホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を含まない、そうでなければ
同一である微生物に対して高める。
【0019】
いくつかの実施形態では、光合成微生物は、ラン藻である。いくつかの実施形態では、ラン藻が、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシ
ス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphaniz
omenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボル
ジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon
）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chrooco
ccidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノ
バクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス
属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、
シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylind
rospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermo
carpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレ
リア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeo
bacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロス
ピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属
（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミク
ロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属
（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプ
シス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormi
dium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）
、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロク
ロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラ
リア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）
、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）
、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synec
hococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermos
ynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodes
mium）、チコネマ属（Tychonema）およびゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から
選択される。
【0020】
本発明はまた、光合成微生物によって、遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質を製造する方法を提供する。方法は、第１の非天然核酸分子および第２の核酸分子が発現されて、
少なくとも１種の脂肪酸または脂肪酸誘導体を製造する条件下で本明細書に記載される光
合成微生物を培養することを含み得る。所望により、光合成微生物は、光栄養的に培養さ
れる。
【0021】
組換え微生物における脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現および脂質生合成のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、同一に培養される対照微生物の培養物によっ
て製造される脂肪酸の製造に対して、脱水素酵素を過剰発現する微生物の培養物による脂
肪酸生成物の製造の増大をもたらし得、対照微生物は、対照微生物が非天然脱水素酵素遺
伝子を欠く点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を発現する微生物と実質的に同一である
。いくつかの実施形態では、非天然脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を発
現する微生物の培養物によって製造された遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質
の量は、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く対照微生物の培養物によって製造される遊離脂肪
酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂質よりも、少なくとも１％、少なくとも５％、少なく
とも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％
、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なく
とも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％または少なく
とも２００％多い。微生物は、光合成微生物であり得る。
【0022】
さらに、またはあるいは、組換え微生物における脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現および脂質生合成のためのポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、非天然脱水
素酵素遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物におけるＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋
の比に対して、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の細胞内比を増大し得る。例えば、非天然脱水素
酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を発現する細胞におけるＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ
＋比は、脂質が製造されている培養期間の間、非天然脱水素酵素遺伝子を欠く、そうでな
ければ同一である対照微生物のＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋比よりも、少なくとも１％、少な
くとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％
、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なく
とも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１
５０％または少なくとも２００％高いものであり得る。微生物は、光合成微生物であり得
る。
【0023】
なおさらに、またはあるいは、組換え微生物における、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子の発現および脂質生合成のためのポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、非天
然脱水素酵素遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物の繁殖および／または増殖
速度に対して、操作された微生物の繁殖速度および／または増殖速度を高め得る。例えば
、繁殖速度または増殖速度は、非天然脂質生合成遺伝子を発現するが、脱水素酵素をコー
ドする非天然遺伝子を含まない対照微生物の繁殖速度および／または増殖速度よりも、少
なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％
、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なく
とも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１０
０％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％高いものであり得る。例えば、脱水
素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質生合成のためのポリペプチドをコードする非
天然遺伝子を含む操作された微生物の培養物は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を
含まない、そうでなければ同一である微生物の培養物によって達成され得る培養物におい
て、３、４、５、６日またはそれ以上後に高い細胞密度を達成し得、培養物は、脂質を製
造する。微生物は、光合成微生物であり得る。
【0024】
本発明に従う光合成微生物によって製造される遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質の量は、培養物１リットルあたり、少なくとも２９０ｍｇ、少なくとも３３０ｍｇ、少なく
とも３７０ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも６００ｍｇ
であり得る。さらに、脂肪酸生成物を製造する方法は、光合成微生物から、または成長培
地から少なくとも１種の脂肪生成物を単離することをさらに含み得る。
【0025】
さらなる態様において、本発明は、配列番号２または配列番号２９またはその活性断片に対して少なくとも６５％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも８５％
同一である、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列を
コードする核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。コードされるポリペプチドは、脱水
素酵素活性、例えば、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性を有し得る。核酸分子は、脱
水素酵素をコードする配列とは異種であり得、調節可能、例えば、誘導性であり得るプロ
モーターをさらに含み得る。核酸分子は、ベクター中に提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株によって製造される総遊離脂肪酸を表す図である。ＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（配列番号２０）とともに、Ｂ１０ ＯＲＦ（「ｄｅｈｙｄｒｄ」；配列番号１）、ＮＢ８部分ＯＲＦ断片（配列番号５）、ＮＢ１０４ ＯＲＦ（「６−Ｐ−ｄｅ」；配列番号９）およびＮＢ１０４ ＯＲＦ全コンティグ断片（配列番号８）を発現するシネコシスティス属（Synechocystis）株は、ＣｃｌＦａｔＢ１遺伝子単独を含有していた対照株と比較して高レベルの遊離脂肪酸を製造した。
【図2】６日成長させた最後の、操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株の光学密度を表す図である。すべての株を１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導して、ＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子および脱水素酵素遺伝子を発現させた。黒色バーは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ単独を発現する株に相当する。模様の入ったバーは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子とともに、脱水素酵素として同定された単離遺伝子を含有していた株に相当する。
【図3】野生型（ＷＴ）および操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株の酸化還元状態を表す図である。ＷＴシネコシスティス属（Synechocystis）株（「６８０３」）、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現株（ＣｃｌＦａｔＢ１）およびＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子および脱水素酵素遺伝子を同時発現する株（ＣｃｌＦａｔＢ１＋Ｂ１０；ＣｃｌＦａｔＢ１＋ＮＢ１０４）のＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比が示されている。Ｄは、培養における日数を示す。
【図4】６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を示す、ＮＡＤＰＨを生成するペントースリン酸経路の一部を表す図である。
【図5】導入遺伝子の発現を誘導した６日後の、ＣｃＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を発現する（黒色バー）またはＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子およびシネコシスティス属（Synechocystis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素ｓｌｌ０３２９遺伝子（配列番号１２）を同時発現する（模様の入ったバー）シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）株による遊離脂肪酸（ＦＦＡ）製造を表す図である。株は、ＯＤ７３０＝５．０で誘導した。
【発明を実施するための形態】
【0027】
光合成生物は、ＣＯ２に由来する固定炭素並びに同様に光合成から生成するＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを使用して膜および貯蔵脂質の製造のために脂肪酸を合成する。ＮＡＤＰＨ
はまた、脱水素酵素の活性によって生成し得る。用語「脱水素酵素」は、本明細書におい
て、１つまたは複数の水素化物（Ｈ−）をＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋などのアクセプター
に移すことによる、基質の酸化を触媒する酵素を指すよう使用される。本発明は、脱水素
酵素をコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を発現し、例えば、１種または複数の脂
肪酸、１種または複数の脂肪酸誘導体および／または１種または複数のグリセロ脂質（例
えば、１種または複数のトリグリセリド）などの１種または複数の脂質を製造する組換え
微生物を提供する。組換え微生物は、いくつかの態様では、脱水素酵素をコードする非天
然遺伝子を発現しない匹敵する微生物よりも、脂質を製造しながら良好な増殖速度を実証
し、さらに、非天然脱水素酵素遺伝子を発現する組換え微生物の培養物は、対照微生物が
、非天然脱水素酵素遺伝子を発現しない点を除いて、脱水素酵素遺伝子を発現する微生物
とすべての点において同一である微生物の対照培養物によって製造されるものよりも多く
の脂質を製造し得る。組換え微生物は、組換え光合成微生物であり得る。また、脱水素酵
素をコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む微生物の培養物を提供することによ
って脂質を製造する方法も提供され、培養物は、微生物が脱水素酵素をコードする非天然
遺伝子を含まないという点を除いて、すべての点において同一である培養物よりも多くの
脂質を製造する。微生物は、光合成微生物であり得、いくつかの例では、光独立栄養的に
培養され得る。微生物は、脂質の合成に関与するポリペプチドをコードする１種または複
数の非天然遺伝子をさらに含み得る。
【0028】
定義別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語
は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味
を有する。矛盾する場合には、定義を含む本願が支配する。文脈によって別に必要とされ
ない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むもの
とする。本明細書において記載されるすべての刊行物、特許およびその他の参考文献は、
個々の刊行物または特許出願の各々が、具体的に、個別に、参照によって組み込まれるよ
う示されるかのように、すべての目的のために参照によりその全文が本明細書に組み込ま
れる。
【0029】
本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が使用され得るが、適した方法および材料は、以下に記載される。材料、方法
および例は、単に例示されており、制限であるよう意図されない。本発明のその他の特徴
および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【0030】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および語句は、以下に定義される。
【0031】
別に明確に示されない限り、本開示内容および特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数形
を含む。
【0032】
実施形態が、言葉「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて本明細書に記載される場合はいつでも、そうではなく、「からなる」および／または「から本質的になる」
という用語で記載される類似の実施形態も提供される。
【0033】
本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用されるような用語「および／または」とは、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」および「Ｂ」を含むも
のとする。
【0034】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは発現されるＲＮＡをコードする核酸分子（通常、ＤＮＡであるが、所望により、ＲＮＡ）の任意のセグメントを指すよう広く使用される
。したがって、遺伝子は、発現されるＲＮＡ（ポリペプチドコード配列または例えば、リ
ボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ
、リボザイムなどといった機能的ＲＮＡを含み得る）をコードする配列を含む。遺伝子は
、その発現に必要な、または影響を及ぼす調節配列ならびに例えば、イントロン配列、５
’または３’非翻訳配列などといったその天然状態でタンパク質またはＲＮＡをコードす
る配列と関連している配列をさらに含み得る。遺伝子は、対象の供給源からクローニング
することおよび既知または予測される配列情報から合成することを含め、種々の供給源か
ら得ることができる。
【0035】
用語「核酸」または「核酸分子」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のセグメントを指し、また、修飾された骨格を有する核酸（例えば、ペプチド核酸、ロックド
核酸）または修飾されたもしくは天然に存在しない核酸塩基も含む。核酸分子は、二本鎖
であっても、一本鎖であってもよく、遺伝子またはその一部を含む一本鎖核酸は、コーデ
ィング（センス）鎖であっても、非コーディング（アンチセンス）鎖であってもよい。
【0036】
核酸分子は、示された供給源「から誘導する」ことができ、これは、示された供給源からの核酸セグメントの単離（全体でまたは一部で）を含む。核酸分子はまた、例えば、直
接クローニング、ＰＣＲ増幅、または示されたポリヌクレオチド供給源からのもしくは示
されたポリヌクレオチド供給源と関連している配列に基づいた人工合成によって、示され
た供給源から誘導することができる。特定の供給源または種から誘導される遺伝子または
核酸分子はまた、供給源核酸分子に対して配列修飾を有する遺伝子または核酸分子を含む
。例えば、供給源（例えば、特定の参照遺伝子）から誘導される遺伝子または核酸分子は
、意図されないか、または計画的に導入されている、供給源遺伝子または核酸分子に対す
る１つまたは複数の突然変異を含み得、置換、欠失もしくは挿入を含む１つまたは複数の
突然変異が計画的に導入されている場合には、配列変更は、細胞もしくは核酸のランダム
突然変異もしくは標的突然変異によって、増幅もしくはその他の分子生物学技術によって
、または化学合成またはその任意の組合せによって導入され得る。機能的ＲＮＡまたはポ
リペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子から誘導される遺伝子または核酸分子
は、参照または供給源機能的ＲＮＡまたはポリペプチドと、またはその機能的断片に対し
て、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または
少なくとも９５％の配列同一性を有する機能的ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし得る
。例えば、機能的ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子から
誘導される遺伝子または核酸分子は、参照または供給源機能的ＲＮＡまたはポリペプチド
と、またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、
少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列
同一性を有する機能的ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし得る。
【0037】
本明細書において、「単離された」核酸またはタンパク質は、その天然環境または核酸もしくはタンパク質が天然に存在する状況から取り出されている。例えば、単離タンパク
質または核酸分子は、天然のまたは自然の環境において関連している細胞または生物から
取り出されている。単離された核酸またはタンパク質は、いくつかの例では、部分的また
は実質的に精製されている場合もあるが、単離に特定のレベルの精製が必要というわけで
はない。したがって、例えば、単離核酸分子は、天然に組み込まれている染色体、ゲノム
またはエピソームから切り出された核酸配列であり得る。
【0038】
「精製された」核酸分子もしくはヌクレオチド配列またはタンパク質もしくはポリペプチド配列は、細胞性物質および細胞成分を実質的に含まない。精製された核酸分子または
タンパク質は、例えば、バッファーまたは溶媒の域を超える化学物質を含まないものであ
り得る。「実質的に含まない」は、新規核酸分子の域を超える成分が検出可能ではないと
いうことを意味するものではない。
【0039】
用語「天然に存在する」および「野生型」とは、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在する、または野生型核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質は、天然供
給源中に存在し得、またはそれから単離され得、ヒトの操作によって意図的に修飾されて
いない。
【0040】
本明細書において、「弱毒化された」とは、量、程度、強度または力において低減されたことを意味する。弱毒化された遺伝子発現とは、問題の遺伝子の転写の、またはコード
されたタンパク質の翻訳、フォールディングもしくはアセンブリーの大幅に低減された量
および／または速度を指し得る。限定されない例として、弱毒化された遺伝子は、突然変
異された、もしくは破壊された遺伝子（例えば、部分もしくは完全欠失または挿入突然変
異によって破壊された遺伝子）または遺伝子調節配列の変更によって発現が減少した遺伝
子であり得る。
【0041】
「外因性核酸分子」または「外因性遺伝子」とは、細胞に導入された（「形質転換された」）核酸分子または遺伝子を指す。形質転換された細胞は、組換え細胞と呼ばれること
もあり、これに、さらなる外因性遺伝子（複数可）が導入され得る。核酸分子で形質転換
された細胞の子孫も、外因性核酸分子を受け継いでいる場合には「形質転換された」と呼
ばれる。外因性遺伝子は、形質転換されている細胞に対して、異なる種に由来するもの（
そのため「異種」）ものであっても、同一種に由来するもの（そのため「同種」）であっ
てもよい。「内因性」核酸分子、遺伝子またはタンパク質は、宿主中に生じるか、または
宿主によって天然に産生される天然核酸分子、遺伝子またはタンパク質である。
【0042】
用語「天然に」とは、本明細書において、宿主中に天然に生じるときに核酸配列またはアミノ酸配列を指すよう使用される。用語「非天然」は、本明細書において、宿主におい
て天然に生じない核酸配列またはアミノ酸配列を指すよう使用される。細胞から取り出さ
れ、実験室操作に付され、宿主細胞に導入または再導入された核酸配列またはアミノ酸配
列は、「非天然」と考えられる。宿主細胞に導入された合成または部分合成遺伝子は、「
非天然」である。非天然遺伝子は、宿主ゲノムにおいて組換えられている、１種または複
数の異種調節配列に作動可能に連結された、宿主微生物にとって内因性である遺伝子をさ
らに含む。
【0043】
「組換え」または「操作された」核酸分子は、ヒト操作によって変更された核酸分子である。限定されない例として、組換え核酸分子は、１）例えば、化学的または酵素的技術
を使用して（例えば、化学的核酸合成の使用によって、または核酸分子の複製、重合、消
化（エキソヌクレアーゼの、またはエンドヌクレアーゼの）、連結、逆転写、転写、塩基
修飾（例えば、メチル化を含む）、組込みまたは組換え（相同および部位特異的組換えを
含む）のための酵素の使用による）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで部分的もしくは全体的に合成さ
れた、または修飾された、２）天然には結合していない、結合されたヌクレオチド配列を
含み、３）天然に存在する核酸分子配列に対して１つまたは複数のヌクレオチドを欠くよ
う分子クローニング技術を使用して操作されている、および／または４）天然に存在する
核酸配列に対して１つまたは複数の配列変更または再編成を有するよう分子クローニング
技術を使用して操作されている任意の核酸分子を含む。限定されない例として、ｃＤＮＡ
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって作製され、リンカーが結合されているか
、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクター中に組み込まれてい
る任意の核酸分子のように、組換えＤＮＡ分子である。
【0044】
用語「組換えタンパク質」とは、本明細書において、遺伝子工学によって製造されたタンパク質を指す。
【0045】
用語組換え、操作された、または遺伝子操作されたとは、生物に適用される場合には、異種または外因性組換え核酸配列の生物への導入によって操作されている生物を指し、遺
伝子ノックアウト、標的突然変異および遺伝子置換、プロモーター置換、欠失または挿入
並びに導入遺伝子または合成遺伝子の生物への導入を含む。組換えまたは遺伝子操作され
た生物はまた、遺伝子「ノックダウン」のための構築物が導入されている生物であり得る
。このような構築物として、それだけには限らないが、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ｓｈ
ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよびリボザイム構築物が挙げられる。また、ゲノム
がメガヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼの活性によって変更された生物
も含まれる。外因性または組換え核酸分子は、組換え／遺伝子操作された生物のゲノム中
に組み込まれ得るか、その他の場合には、組換え／遺伝子操作された生物のゲノム中に組
み込まれない。本明細書において、「組換え微生物」または「組換え宿主細胞」は、本発
明の組換え微生物の後代または誘導体を含む。特定の修飾は、突然変異または環境の影響
のいずれかのために後世において起こり得るので、このような後代または誘導体は、実際
には親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書において使用されるような用語の範囲内
に依然として含まれる。
【0046】
用語「プロモーター」とは、細胞においてＲＮＡポリメラーゼと結合でき、下流（３’方向）コード配列の転写を開始できる核酸配列を指す。プロモーターは、バックグラウン
ドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメント
を含む。プロモーターは、転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタ
ンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）を含み得る。真核生物プロモーターは、常に
ではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。原
核生物プロモーターは、−１０および−３５原核生物プロモーターコンセンサス配列を含
有し得る。種々の異なる供給源に由来する、構成性、誘導性および抑制性プロモーターを
含めた多数のプロモーターが、当技術分野で周知である。代表的な供給源として、例えば
、ウイルス、哺乳類、昆虫、植物、酵母および細菌細胞種が挙げられ、これらの供給源に
由来する適したプロモーターは、容易に入手可能であるか、またはオンラインで、もしく
は、例えば、ＡＴＣＣなどの保管所ならびにその他の市販のもしくは個々の供給源から公
的に入手可能な配列に基づいて合成によって製造できる。プロモーターは、１方向性（１
方向で転写を開始する）である場合も、２方向性（いずれかの方向で転写を開始する）で
ある場合もあり得る。プロモーターは、構成性プロモーター、抑制性プロモーターまたは
誘導性プロモーターであり得る。プロモーターの限定されない例として、例えば、Ｔ７プ
ロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーターおよ
びＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導プロモーターの例として、ｌａｃプロモーター
、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）プロモーター、Ｔｅｔプロモーター（米国特許第５，４６４，７
５８号および同５，８１４，６１８号）およびエクジソンプロモーター（Noら、Proc. Na
tl. Acad. Sci.(1996年)93(8):3346〜3351頁）が挙げられる。
【0047】
用語「異種」とは、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素への言及において使用される場合には、宿主生物種以外の供給源に由来する、または宿主生物種
以外の供給源から誘導される、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵
素を指す。対照的に「同種」ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素
は、本明細書において、宿主生物種から誘導されるポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポ
リペプチドまたは酵素を意味するよう使用される。遺伝子調節配列に、または遺伝子配列
を維持または操作するために使用される補助的核酸配列（例えば、プロモーター、５’非
翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライシング部位、リ
ボソーム結合部位、内部リボソーム侵入配列、ゲノム相同性領域、組換え部位など）に言
及する場合には、「異種」とは、調節配列または補助的配列が、構築物、ゲノム、染色体
またはエピソーム中で調節または補助的核酸配列が隣接している遺伝子と天然には会合し
ていないことを意味する。したがって、その天然状態では（すなわち、遺伝子操作されて
いない生物のゲノムでは）、作動可能に連結されていない遺伝子に作動可能に連結された
プロモーターは、本明細書において、プロモーターが、連結される遺伝子と同一種から（
またはいくつかの場合には、同一生物から）誘導され得る場合であっても、「異種プロモ
ーター」と呼ばれる。
【0048】
本明細書において、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含するものとし、アミド結合（ペプチ
ド結合としても知られる）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成され
る分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または
複数）を指し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプ
チド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上
のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される任意のその他の用語が、「ポ
リペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代
わりに、またはこれらの用語のいずれかと同義的に使用され得る。
【0049】
本願は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）によって維持される、長く確立された、広範囲に参照されるデータ
ベースにおいて使用される識別子によって核酸およびポリペプチドを開示し、指す。遺伝
子または種名の後ろの括弧内に本明細書において一般的に提供される受託番号は、米国国
立衛生研究所（United States National Institutes of Health）によって維持される米
国国立生物工学情報センターウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で公的
に入手可能な配列記録の独特の識別子である。「Ｇｅｎｌｎｆｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ
」（ＧＩ）配列同定番号は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に特異的である。配列が多
少なりとも変化する場合には、新規ＧＩ番号が割り当てられる。特定のＧｅｎＢａｎｋ記
録に現れる配列の種々のＧＩ番号、バージョン番号および更新日を追跡するために、シー
クエンスリビジョンヒストリー（Sequence Revision History）ツールが入手可能である
。受託番号およびＧＩ番号に基づいて核酸もしくは遺伝子配列またはタンパク質配列を検
索することおよび得ることは、例えば、細胞生物学、生化学、分子生物学および分子遺伝
学の技術分野で周知である。
【0050】
本明細書において、核酸またはポリペプチド配列に関して、用語「同一性パーセント」または「相同性」は、最大同一性パーセントを求めて配列をアラインし、最大相同性パー
セントを達成するために、必要に応じてギャップを導入した後の、既知ポリペプチドと同
一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。
Ｎ末端またはＣ末端挿入または欠失は、相同性に影響を及ぼすと解釈されてはならず、約
３０個未満、約２０個未満または約１０個未満のアミノ酸残基のポリペプチド配列への内
部欠失および／または挿入は、相同性に影響を及ぼすと解釈されてはならない。
【0051】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列類似性検索に適合しているプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎお
よびｔｂｌａｓｔｘ（Altschul(1997年)、Nucleic Acids Res. 25、3389〜3402頁およびK
arlin(1990年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2264〜2268頁）によって使用されるア
ルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）解析によって
決定できる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、まず、クエリー配
列およびデータベース配列間でギャップを用いて、または用いずに、同様のセグメントを
考慮し、次いで、同定されるすべてのマッチの統計的有意性を評価し、最後に、有意性の
予め選択された閾値を満たすマッチのみをまとめることである。配列データベースの類似
性検索における基本的な問題の考察については、Altschul(1994年)、Nature Genetics 6
、119〜129頁を参照のこと。ヒストグラム、説明、アラインメント、予測（すなわち、デ
ータベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ、マト
リックスおよびフィルター（低複雑度）の検索パラメータは、デフォルト設定であり得る
。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって使用され
るデフォルトスコアリングマトリックスは、８５を超える長さのクエリー配列（ヌクレオ
チド塩基またはアミノ酸）に推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Henikoff(1992
年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、10915〜10919頁）である。
【0052】
ヌクレオチド配列を比較するために設計されたｂｌａｓｔｎには、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、マッチする残基の対に対するリワードスコア）対Ｎ（すなわち
、ミスマッチする残基に対するペナルティースコア）の比によって設定され、ＭおよびＮ
のデフォルト値は、それぞれ＋５および−４であり得る。４種のｂｌａｓｔｎパラメータ
は、以下のように調整され得る：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギ
ャップ伸長ペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ってどのｗｉｎｋｔｈ位置でも
ワードヒットを生成する）およびｇａｐｗ＝１６（ギャップを含むアラインメントが作製
されるウィンドウ幅を設定する）。アミノ酸配列の比較のための同等なＢｌａｓｔｐパラ
メータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝ｌおよびｇａｐｗ＝３２であり得る。ＧＣＧ
パッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮ
ＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸
長ペナルティー）を使用でき、タンパク質比較における同等設定は、ＧＡＰ＝８およびＬ
ＥＮ＝２であり得る。
【0053】
したがって、本発明のポリペプチドまたは核酸配列に言及する場合には、全長ポリペプチドまたは核酸配列または少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、
少なくとも１２５個、少なくとも１５０個もしくはそれ以上の全タンパク質のアミノ酸残
基の連続配列を含むその断片、例えば、少なくとも１個のアミノ酸残基が、挿入および置
換を含有する開示された配列のＮ末端および／またはＣ末端に、および／または開示され
た配列内のＮ末端および／またはＣ末端に挿入されているこのような配列の変異体に関し
て、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％または８５％、例えば、少なくとも８６
％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少な
くとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９
５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配
列同一性または約１００％の配列同一性が含まれる。考慮される変異体は、さらにまたは
あるいは、例えば、相同組換えもしくは部位指定もしくはＰＣＲ突然変異誘発による所定
の突然変異を含有するものならびにそれだけには限らないが、本明細書に記載されたもの
を含むその他の種の対応するポリペプチドもしくは核酸、挿入および置換を含有するポリ
ペプチドもしくは核酸のファミリーの対立変異体もしくはその他の天然に存在する変異体
ならびに／またはポリペプチドが、挿入および置換を含有する天然に存在するアミノ酸以
外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）を用いて、置換、化学的、酵素的もしく
はその他の適当な手段によって共有結合によって修飾されている誘導体を含み得る。
【0054】
本明細書において、語句「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」とは、共通の特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。個々のアミノ酸間の共通の特
性を定義するために機能的方法は、同種生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正
規化された頻度を解析することである（Schulz(1979)Principles of Protein Structure,
Springer-Verlag）。このような解析に従って、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換し
、従って、全体的なタンパク質構造に対する影響において互いに最も似ているアミノ酸の
群が、定義され得る（Schulz(1979)Principles of Protein Structure, Springer-Verlag
）。この方法で定義されたアミノ酸群の例として、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌ
ｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓを含む「荷電／極性群」；Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒ
ｐを含む「芳香族または環状群」ならびにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍ
ｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＣｙｓを含む「脂肪族群」を挙げることができる。各群内に
、亜群も同定され得る。例えば、荷電／極性アミノ酸の群は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉ
ｓを含む「正電荷を有する亜群」；ＧｌｕおよびＡｓｐを含む「負電荷を有する亜群」お
よびＡｓｎおよびＧｌｎを含む「極性亜群」を含む亜群に細分され得る。別の例では、芳
香族または環状群は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐを含む「窒素環亜群」ならびにＰｈｅ
およびＴｙｒを含む「フェニル亜群」を含む亜群に細分され得る。別のさらなる例では、
脂肪族群は、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含む「大きな脂肪族の非極性亜群」；Ｍｅｔ
、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＣｙｓを含む「脂肪族のわずかに極性の亜群」ならびにＧｌｙお
よびＡｌａを含む「小さい残基の亜群」を含む亜群に細分され得る。保存的な突然変異の
例として、それだけには限らないが：正電荷が維持され得るようなＬｙｓのＡｒｇとの、
または逆も同様；負電荷が維持され得るようなＧｌｕのＡｓｐとの、または逆も同様；遊
離−ＯＨが維持され得るようなＳｅｒのＴｈｒとの、または逆も同様；および遊離−ＮＨ
２が維持され得るようなＧｌｎのＡｓｎとの、または逆も同様といった上記の亜群内のア
ミノ酸のアミノ酸置換が挙げられる。「保存的変異体」とは、参照ポリペプチド（例えば
、配列が刊行物または配列データベースにおいて開示されているか、または配列が核酸シ
ークエンシングによって決定されているポリペプチド）の１個または複数のアミノ酸を、
共通の特性を有する、例えば、上記で描写されたような同一アミノ酸群または亜群に属す
るアミノ酸と置き換えるよう置換されている１個または複数のアミノ酸を含むポリペプチ
ドである。
【0055】
本明細書において、「発現」は、少なくともＲＮＡ産生のレベルでの遺伝子の発現を含み、「発現生成物」は、得られた生成物、例えば、ポリペプチドまたは発現された遺伝子
の機能的ＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロ
ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムなど）を含む。用語「増大された発現」は、ｍＲＮＡ産
生の増大および／またはポリペプチド発現の増大を促進するための遺伝子発現における変
更を含む。「増大された産生」は、天然産生またはポリペプチドの酵素活性と比較される
、ポリペプチド発現の量における増大、ポリペプチドの酵素活性のレベルにおける増大、
または両方の組合せを含む。
【0056】
用語「分泌された」とは、本発明の組換え微生物または方法によって製造されたポリペプチドまたは脂肪酸生成物の、細胞膜周辺腔または細胞外環境への移動を含む。「増大さ
れた分泌」は、例えば、天然に存在する分泌のレベルと比較して、少なくとも１％、２％
、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％または少なくとも２０％、３
０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００
％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％または
それ以上である、天然に存在する分泌量を超える分泌を含む。
【0057】
微生物における遺伝子の発現に影響を及ぼすために、微生物または宿主細胞内へ特定の核酸分子または特定のポリヌクレオチド配列が、「挿入」例えば、付加、組込み、取り込
みまたは導入される、微生物を操作する態様が、本明細書において含まれる。例えば、対
象の微生物は、プロモーターなどの発現制御配列とともに、またはともなわずに対象の特
定の遺伝子を特定のゲノム遺伝子座に挿入するか、またはプロモーターを宿主微生物の遺
伝子座中に挿入して、遺伝子座での特定の遺伝子または遺伝子のセットの発現に影響を及
ぼすための部位指定相同組換えによって操作され得る。
【0058】
本発明のさらなる態様は、特定のポリヌクレオチド配列の発現の部分的な、実質的なまたは完全な欠失、サイレンシング、不活化または下方調節を含む。遺伝子は、部分的に、
実質的に、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化され得るか、またはその発現は
、コードするポリペプチドによって実施される活性、例えば、酵素の活性に影響を及ぼす
よう下方調節され得る。遺伝子は、遺伝子の機能および／または発現を破壊する核酸配列
の挿入（例えば、ウイルス挿入、トランスポゾン突然変異誘発、メガヌクレアーゼ操作、
相同組換えまたは当技術分野で公知のその他の方法）によって、部分的に、実質的にまた
は完全に欠失、サイレンシング、不活化または下方調節され得る。用語「排除する」、「
排除」および「ノックアウト」は、用語「「欠失」、「部分欠失」、「実質的な欠失」ま
たは「完全な欠失」と同義的に使用され得る。特定の実施形態では、対象の微生物は、対
象の特定の遺伝子をノックアウトするための部位指定相同組換えによって操作され得る。
さらにその他の実施形態では、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）構築物
は、対象の特定の遺伝子を部分的に、実質的にまたは完全にサイレンシングする、不活化
するまたは下方調節するために使用され得る。
【0059】
特定の核酸分子または特定のポリヌクレオチド配列のこれらの挿入、欠失またはその他の修飾は、「遺伝子修飾（複数可）」または「形質転換（複数可）」を包含すると理解さ
れ得、その結果、微生物または宿主細胞の得られた株が「遺伝的に修飾される」または「
形質転換される」と理解され得る。
【0060】
本明細書において、「上方調節された」または「上方調節」は、対象の遺伝子または核酸分子の発現または酵素の活性の増大、例えば、上方調節されていない、そうでなければ
同一である遺伝子または酵素における発現または活性と比較した、遺伝子発現または酵素
活性の増大を含む。
【0061】
本明細書において、「下方調節された」または「下方調節」は、対象の遺伝子または核酸分子の発現または酵素の活性の低減、例えば、下方調節されていない、そうでなければ
同一である遺伝子または酵素における発現または活性と比較した、遺伝子発現または酵素
活性の低減を含む。
【0062】
用語「Ｐｆａｍ」とは、Ｐｆａｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって維持され、ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／（Ｗｅｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ）；ｐｆａｍ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）；ｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／（Ｊａｎｅｌｉ
ａ Ｆａｒｍ、Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；
ｐｆａｍ．ｊｏｕｙ．ｉｎｒａ．ｆｒ／（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ
ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ）；およびｐｆａｍ．ｃｃｂｂ．ｒ
ｅ．ｋｒを含めた、いくつかの資金提供を受けたワールドワイドウェブサイトで利用可能
な、タンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの多くの収集物を指す。Ｐｆａｍの
最新リリースは、ＵｎｉＰｒｏｔタンパク質データベースリリース１５．６、Ｓｗｉｓｓ
−Ｐｒｏｔリリース５７．６およびＴｒＥＭＢＬリリース４０．６の混合物をベースとす
るＰｆａｍ ２６．０（２０１１年１１月）である。Ｐｆａｍドメインおよびファミリー
は、多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して同定される
。Ｐｆａｍ−Ａファミリーまたはドメイン割り当ては、タンパク質ファミリーの代表的な
メンバーを使用する精選されたシードアラインメントによって作製される高品質割り当て
であり、シードアラインメントに基づいて隠れマルコフモデルをプロファイルする（特に
断りのない限り、Ｐｆａｍドメインまたはファミリーに対するクエリーされたタンパク質
のマッチは、Ｐｆａｍ−Ａマッチである）。次いで、ファミリーに属するすべての同定さ
れた配列を使用して、ファミリーの全アラインメントを自動的に作製する（Sonnhammer(1
998年)Nucleic Acids Research 26、320〜322頁；Bateman(2000年) Nucleic Acids Resea
rch 26、263〜266頁；Bateman(2004年) Nucleic Acids Research 32、Database Issue、D
138〜D141頁；Finn(2006年) Nucleic Acid Research Database Issue 34、D247〜251頁；
Finn(2010年) Nucleic Acids Research Database Issue 38、D211〜222頁）。例えば、上
記の参考ウェブサイトのいずれかを使用してＰｆａｍデータベースにアクセスすることに
よって、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３また
はより高いバージョン、ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／）を使用して、タンパク
質配列をＨＭＭに対してクエリーできる。クエリーされたタンパク質を、ｐｆａｍファミ
リーにあると（または特定のＰｆａｍドメインを有すると）同定する有意なマッチは、ビ
ットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上であるものである。期待値（ｅ値）も、ク
エリーされたタンパク質をＰｆａｍ中に含めるための、またはクエリーされたタンパク質
が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを決定するための基準として使用され得、低
いｅ値（１．０よりもかなり低い、例えば、０．１未満または０．０１以下）は、マッチ
が機会によるものであるという低い可能性を表す。
【0063】
本明細書において、「長い鎖長の」脂肪酸またはアシル−ＡＣＰとは、１４個超の炭素の鎖長を有する脂肪酸またはアシル−ＡＣＰであり、「中程度の鎖長」の脂肪酸またはア
シル−ＡＣＰは、８〜１４個の炭素の鎖長を有する脂肪酸またはアシル−ＡＣＰである。
【0064】
「基質選択性」とは、酵素が最も活性である基質（単数または複数）を指す。例えば、異なるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、異なる程度の鎖長特異性を有し得、ＡＣＰか
ら特定の長さの脂肪酸を切断するための酵素の「選択性」と呼ばれることもあり、チオエ
ステラーゼは、通常、１種または複数のその他の鎖長の脂肪酸の切断においてはより少な
い活性を有しながら、特定の鎖長の脂肪酸の切断において最も活性である。
【0065】
本明細書において、用語「脂肪酸生成物」は、遊離脂肪酸、モノ−、ジ−またはトリグリセリド、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル（それだけには限らないが
、ワックスエステルを含む）および炭水化物（それだけには限らないが、アルカンおよび
アルケンを含む）を含む。
【0066】
本明細書において同義的に使用されるような「繁殖速度」または「複製速度」は、所与の培養物の倍加時間を測定することによって微生物において一般に測定される。微生物の
繁殖速度を測定する方法は当技術分野で周知である。例えば、繁殖（細胞数の増大）また
は増殖（細胞数の増大ならびに細胞の大きさおよび／または細胞内容物の増大）の速度を
測定するために、光学濃度（ＯＤ）測定値が期間にわたってとられ得る。あるいは、懸濁
液中の微生物の濃度は、血球算定器または同様の装置を使用して、所与の容量の培養物中
の細胞の濃度が決定され得る。種々の時間で複数のデータ点を取ることによって、培養物
中の細胞の繁殖または複製速度を評価できる。一定時間にわたる培養密度の増大（例えば
、ＯＤによって測定される）は、繁殖および／または増殖を示す。
【0067】
脂肪酸生成物を産生するための代謝経路本明細書において開示される組換え微生物によって産生される脂質は、遊離脂肪酸を含
めた脂肪酸生成物ならびに限定するものではないが、モノ、ジまたはトリグリセリド；脂
肪アルデヒド；脂肪アルコール；脂肪酸エステル（それだけには限らないが、ワックスエ
ステルを含む）および炭水化物（それだけには限らないが、アルカンおよびアルケンを含
む）を含めた、脂肪酸から誘導され、および／または細胞によって産生される脂肪酸のア
シル鎖を組み込む生成物であり得る。脂肪酸生合成経路は、原核生物において、また真核
生物の藻類および高等植物の葉緑体において高度に保存されており、中心代謝生成物アセ
チル−ＣｏＡから出発する。脂肪酸生合成は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣ
Ｃａｓｅ）によって触媒されるアセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの変換によって開
始される。次いで、マロニル−ＣｏＡは、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ
（大腸菌（E. coli）におけるＦａｂＤ）によって触媒されて、マロニル−ＡＣＰに変換
される。次いで、マロニル−ＡＣＰが、酵素複合体脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）によって
触媒されて、アシル−ＡＣＰに変換される。脂肪酸シンターゼ複合体は、まず、β−ケト
アシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（例えば、大腸菌（E. coli）のＦａｂＨ）によって触
媒されて、マロニル−ＡＣＰをアセチル−ＡＣＰとともに縮合することによる伸長サイク
ルを開始する。ＦａｂＨ反応によって形成されるβ−ケトアシル−ＡＣＰ（３−ケトアシ
ル−ＡＣＰ）は、３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＦａｂＧ）によってβ
−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ（３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ）に還元される。次いで、
β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰが、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ脱水酵素（例えば、Ｆ
ａｂＡ、ＦａｂＺ）によって作用されて、トランス−２−エノイル−ＡＣＰを形成し、こ
れが、順に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＦａｂＩ、ＦａｂＫ、ＦａｂＬ）
によって還元されて、２炭素伸長されたアシル−ＡＣＰ生成物を形成する。その後のサイ
クルは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩまたはＩＩ（例えば、ＦａｂＢまたはＦａ
ｂＦ）によって触媒されるマロニル−ＡＣＰのアシル−ＡＣＰとの縮合によって開始され
る。縮合、還元、脱水および還元のサイクルが反復され、各サイクルは、アシル鎖が、ト
ランスアシラーゼによって別の分子（例えば、グリセロール３−リン酸）に移されるか、
葉緑体におけるＦａｔＡまたはＦａｔＢなどのチオエステラーゼによってＡＣＰから切断
されて、遊離脂肪酸を形成するまで、マロニル−ＡＣＰから２個の炭素を付加する。
【0068】
植物葉緑体とは異なり、ラン藻類は、遊離脂肪酸を産生せず、大腸菌（E. coli）およびその他の従属栄養細菌とは異なり、ラン藻類は、アシル−ＣｏＡを産生しない（Kaczma
rzyk and Fulda(2010年) Plant Physiol. 152:1598〜1610頁）。アシル鎖がアシルキャリ
アタンパク質に共有結合によって結合される脂肪酸伸長後に、ラン藻類のアシルトランス
フェラーゼは、アシル鎖をグリセロール骨格に移し、膜脂質を製造する。
【0069】
それだけには限らないが、ラン藻などの微生物において遊離脂肪酸を製造するために、それだけには限らないが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、アシル
−ＣｏＡチオエステラーゼをコードする遺伝子またはヒドロキシベンゾイルチオエステラ
ーゼをコードする遺伝子などの外因性または組換えチオエステラーゼ遺伝子を発現させて
もよい。微生物において脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、ワックスエステル、アルカン
またはアルケンなどの脂肪酸誘導体を製造するために、アシル−チオエステル中間体（例
えば、アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰ）を所望の最終生成物（例えば、アルコール
、アルデヒド、アルカン、アルケンまたはワックスエステル）に変換するための１種また
は複数の酵素を、所望により、チオエステラーゼをコードする外因性または組換え遺伝子
、所望により、アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする外因性遺伝子と組み合わせて宿
主細胞中に導入してもよい。例えば、脂肪アルデヒドおよび／またはアルカンが、所望の
最終生成物である場合は、アルデヒド形成性脂肪アルデヒドレダクターゼ（例えば、アル
デヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、１．２．１．４２または１．２．１．５０；
米国特許第６，１４３，５３８号も参照のこと）をコードする遺伝子を導入して、アシル
−ＣｏＡを脂肪アルデヒドに還元してもよく；さらに、またはあるいは、アルデヒド形成
性アシル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＷＯ２００９／１４０６９６またはＷＯ２０１
１／０６６１３７に開示されるような）またはカルボン酸レダクターゼ遺伝子（例えば、
ＷＯ２０１０／１３５６２４およびＷＯ２０１０／０４２６６４を参照のこと）を導入し
て、遊離脂肪酸を脂肪アルデヒドに還元してもよい。あるいは、またはさらに、脂肪アル
コールオキシダーゼ（例えば、１．１．３．２０）または脂肪アルコール脱水素酵素（例
えば、１．１．１．１６４）をコードする遺伝子を導入して、脂肪アルコールを脂肪アル
デヒドに変換してもよい。脂肪アルデヒドは、所望により、脂肪アルデヒドデカルボニラ
ーゼをコードする遺伝子（例えば、４．１．９９．５）の導入によって、アルカンにさら
に処理してもよい。脂肪アルコール、アルケンおよび／またはワックスエステルが、所望
の最終生成物である場合には、アルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼをコードする
遺伝子（例えば、アルコール形成アシル−ＣｏＡレダクターゼ、１．２．１．５０）を宿
主細胞に導入してもよい。さらに、脂肪アルデヒドレダクターゼ遺伝子を導入して、脂肪
アルデヒドを脂肪アルコールに還元してもよい。脂肪アルコールを、脂肪アルコール脱水
酵素をコードする１種または複数の遺伝子の導入によって、アルケンにさらに処理しても
よい。ワックスエステルを含めた脂肪酸エステルは、アルコールの脂肪酸アシルチオエス
テルとの縮合を触媒するポリペプチド、例えば、アシルトランスフェラーゼおよびワック
スシンターゼをコードする遺伝子を導入することによって形成され得る。
【0070】
いくつかの例では、アシル−ＡＣＰの脂肪アルコールへの変換は、脂肪アルデヒドの合成によって起こり得、宿主細胞において発現されたアシルレダクターゼ（例えば、アルデ
ヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼまたはアルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクタ
ーゼ）は、まず、アシル−ＡＣＰを脂肪アルデヒドに還元する。例えば、特定の実施形態
では、宿主細胞は、内因性脂肪アルデヒド形成性レダクターゼを過剰発現するように操作
され得る（例えば、脂肪アルデヒド形成性レダクターゼ遺伝子の付近にプロモーターおよ
び／またはエンハンサー転写制御エレメントを挿入することによって）。その他の実施形
態では、宿主細胞は、外因性脂肪アルデヒド形成性レダクターゼを発現するように操作さ
れ得る。宿主細胞は、脂肪アルデヒドを脂肪アルコールに還元する脂肪アルデヒドレダク
ターゼまたはアルコール脱水素酵素をコードする外因性遺伝子をさらに含み得る。
【0071】
ワックスエステルは、ワックスエステルシンターゼをコードする遺伝子を導入して、脂肪アルコールの脂肪酸アシルチオエステルとの縮合を触媒することによって形成され得る
。ワックスエステルシンターゼは、例えば、クラスＥＣ２．３．１．２６（長鎖アルコー
ルＯ−脂肪アシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．３．１．２０（ジアシルグリセロール
アシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．３．１．５１（アシルトランスフェラーゼ）また
は２．３．１．７５（ワックスエステルシンターゼ／アシル−ＣｏＡジアシルグリセロー
ルアシルトランスフェラーゼ）の酵素であり得る。
【0072】
例えば、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリド（「ＴＡＧ」）などのグリセロ脂質の製造には、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む
本明細書に開示されるような組換え微生物は、それだけには限らないが、グリセロールリ
ン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェ
ラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）またはジアシルグリ
セロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）を含めたグリセロ脂質の製造に関与
する酵素をコードする非天然遺伝子をさらに含み得る。
【0073】
脱水素酵素本発明は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み、少なくとも１種の脂肪酸生成
物を産生する組換え微生物を提供する。例えば、本明細書に開示される組換え微生物は、
脱水素酵素をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を用いて形質転換されてもよい。あ
るいは、またはさらに、組換え微生物は、脱水素酵素をコードする内因性核酸配列を含み
得、内因性脱水素酵素遺伝子の発現を調節するために少なくとも１種の調節配列が微生物
のゲノム中に挿入されている。さらに、微生物は、１種または複数の外因性遺伝子を用い
て形質転換され得、および／または脂肪酸生成物などの脂質の製造に関与する１種または
複数の内因性遺伝子を過剰発現するように操作され得る。
【0074】
本明細書において開示される組換え微生物において発現され得る脱水素酵素として、制限するものではないが、アルデヒド脱水素酵素（アルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１
．３）、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１６）、メチルマロン酸
セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２７）、ラクトアルデヒド脱水素酵素（Ｅ
Ｃ１．２．１．２２）、ベンズアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２８）、非リン
酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．９）、ＮＡＤＰ依
存性（リン酸化）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１３）
、δ−１−ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素（ＥＣ１．５．１．１２）、アセトアル
デヒド脱水素酵素（ＥＣ：１．５．１．１０）およびグルタミン酸セミアルデヒド脱水素
酵素（ＥＣ：１．５．１．４１）を含む）、２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（例えば、イソ
クエン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、コハク酸脱水素酵素、αケ
トグルタル酸脱水素酵素）、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、例えば、Ｄ−２−ヒドロ
キシイソカプロン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素、バンコ
マイシン耐性タンパク質Ｈ、Ｄ−２−ホスホグリセリン酸脱水素酵素およびＤ−乳酸脱水
素酵素（１．１．１．２８））、リンゴ酸酵素（１．１．１．４０）、グルコース−６−
リン酸脱水素酵素（１．１．１．４９）、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（１．１．１
．４３、１．１．１．４４）、グルタミン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素および
ソルビトール脱水素酵素が挙げられる。種々の例では、本発明の微生物中に導入される、
または過剰発現される非天然遺伝子によってコードされる脱水素酵素は、アルコール脱水
素酵素ではない。さらなる例では、本発明の微生物中に導入される、または過剰発現され
る非天然遺伝子によってコードされる脱水素酵素は、ピルビン酸脱水素酵素またはリン酸
化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．１２）ではない場合が
ある。脱水素酵素の活性のアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、Wynnら(1997
年) Lipids 32:605〜610頁；Graupnerら(2000年)J. Bacteriol. 182:3688〜3692頁；Berr
ios-Riveraら(2002年) Metabolic Engineering 4:217〜229頁；Shinodaら(2005年)J. Bio
l. Chem. 280:17068〜17075頁；DomenechおよびFerrer(2006年) Biochim. Biophys. Acta
1760:1667〜1674頁；LoおよびChen(2010年)Mol. Biotechnol 46:157〜167頁）。
【0075】
ＮＡＤＨを生じる脱水素酵素も、本発明の方法および微生物において使用するために考慮されるが、ＮＡＤＰＨを生成する脱水素酵素が特に興味深い。例えば、ＮＡＤＨは、宿
主細胞にとって天然であり得るＮＡＤＰＨ−ＮＡＤ＋トランスヒドロゲナーゼと呼ばれる
こともあるＮＡＤＰＨ：ＮＡＤ＋酸化還元酵素（Ｂ特異的）の活性によって、細胞におい
てＮＡＤＰＨに変換され得るか（例えば、ＵＳ２００５／０１９６８６６を参照のこと）
またはＮＡＤＰＨ−ＮＡＤ＋トランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、宿主微生物
中に導入されてもよい。
【0076】
ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元しながらリンゴ酸のピルビン酸への不可逆的脱炭酸を触媒する、リンゴ酸脱水素酵素（オキサロ酢酸脱炭酸化）（ＮＡＤＰ（＋））またはＮＡＤ
Ｐ−リンゴ酸酵素としても知られるリンゴ酸酵素（ＥＣ１．１．１．４０）が、非天然遺
伝子の発現によって組換え宿主細胞において産生され得る脱水素酵素の一例である。リン
ゴ酸酵素をコードする非天然遺伝子は、任意の生物から誘導されるものであり得、宿主微
生物に関して異種であっても、同種であってもよい。本明細書に開示されるような微生物
において非天然遺伝子によってコードされ得るリンゴ酸酵素の限定されない例として、１
９．２のギャザリングカットオフよりも大きなビットスコアを有する、Ｐｆａｍ ＰＦ０
０３９０（リンゴ酸酵素、Ｎ末端ドメイン）に入る、および／または２３．５のギャザリ
ングカットオフよりも高いビットスコアを有する、Ｐｆａｍ ＰＦ０３９４９（リンゴ酸
酵素ＮＡＤ結合ドメイン）に入るポリペプチドが挙げられる。リンゴ酸酵素の結晶構造は
、Yangら（Protein Sci. 11: 332〜341頁(2002年)）によって報告されている。リンゴ酸
酵素の限定されない例として、ムコール・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）（
ＡＢＭ４５９３３、ＡＡＯ２６０５３．１）、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassios
ira pseudonana）（ＸＰ＿００２２９０５５０）、ファエオダクチルム・トリコルヌツム
（Phaeodactylum tricornutum）（ＸＰ＿００２１７７８９０）、オストレオコッカス・
ルシマリヌス（Ostreococcus lucimarinus）（ＸＰ＿００１４２０８４９）、リシナス・
コムニス（Ricinus communis）（ＸＰ＿００２５２６５０７）、オリザ・サティバ（Oryz
a sativa）（ＮＰ＿００１０６４９９８）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（
ＡＥＥ３６２９４）、クロレラ・バリアビリス（Chlorella variabilis）（ＥＦＮ５３６
６２）、ヒト（Homo sapiens）（ＮＰ＿００２３８６）、コナミドリムシ（Chlamydomona
s reinhardtii）（ＸＰ＿００１６９６２４０）、シネコシスティス属（Synechocystis）
種ＰＣＣ６８０３（ＢＡＡ１６６６３）、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcysti
s aeruginosa）（ＹＰ＿００１６５５８００）および「ノストック・アゾラエ（Nostoc a
zollae）」（ＹＰ＿００３７２０９４４）に由来するものが挙げられる。制限するもので
はないが、本明細書において提供される微生物において非天然遺伝子によってコードされ
るリンゴ酸酵素は、これらのリンゴ酸酵素または配列データベースに列挙されるようなそ
の他のもの、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修
飾された変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％また
は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するリンゴ酸酵素活性を有するポリペプチ
ドであり得る。例えば、本明細書に提供される組換え微生物は、リンゴ酸酵素として同定
されるポリペプチドに対して、またはその活性断片に対して少なくとも９５％の同一性を
有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含み得る。
【0077】
グルコース−６リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９）は、本明細書において提供されるような微生物における非天然遺伝子の発現によって製造され得るペントースリン酸
経路のＮＡＤＰＨ生成性酵素である。グルコース−６リン酸をコードする遺伝子は、植物
、動物または真菌、不等毛藻、藻類、細菌もしくはラン藻を含めた微生物から誘導される
ものであり得る。例えば、脱水素酵素は、２１．７のギャザリングカットオフよりも大き
なビットスコアを有する、Ｐｆａｍ ＰＦ００４７９「グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ＮＡＤ結合ドメイン」に入る、および／または１９．５のギャザリングカットオフよ
りも大きなビットスコアを有する、Ｐｆａｍ、ＰＦ０２７８１「グルコース−６−リン酸
脱水素酵素、Ｃ末端ドメイン」に入るポリペプチドであり得る。本明細書において提供さ
れるような微生物によって発現され得るグルコース−６−リン酸脱水素酵素の限定されな
い例として、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３（ＢＡＡ１７４５
１）、シネココッカス属（Synechococcus）種ＢＬ１０７（ＺＰ＿０１４６８２９７）、
プロクロロコッカス・マリナス（Prochlorococcus marinus）株ＡＳ９６０１（ＹＰ＿０
０１００９５７１）、リングビア属（Lyngbya）種ＰＣＣ８１０６（ＺＰ＿０１６２０４
１４）、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）ＣＣＭＰ１３３５（
ＥＥＤ９２５５０）、ミクロモナス属（Micromonas）種ＲＣＣ２９９（ＸＰ＿００２５０
８５０５）；オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）（ＸＰ＿００３０７９
５７３）、グリシン・マックス（Glycine max）（ＸＰ＿００３５３３０３２）、ブドウ
（Vitis vinifera）（ＸＰ＿００２２６６９３０）、イネ（Oryza sativa Japonica Grou
p）（ＡＡＱ０２６７１）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＮＰ＿０００３９３；ＮＰ
＿０３２０８８）およびヒト（Homo sapiens）（ＮＰ＿０００３９３）のグルコース−６
−リン酸脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供され
る操作された微生物において非天然遺伝子から発現され得るグルコース−６−リン酸脱水
素酵素は、その保存的変異体を含めた、これらのグルコース−６−リン酸脱水素酵素また
は配列データベースに列挙されるようなその他のものに対して、少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する
グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得、そのＮ末端およ
び／またはＣ末端切断型または修飾された変異体であり得る。例えば、本明細書において
提供されたような組換え微生物は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素として同定される
ポリペプチドに対して、またはその活性断片に対して少なくとも９５％の同一性を有する
グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。
【0078】
ペントースリン酸経路の別のＮＡＤＰＨ生成酵素として、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素がある。本明細書において「ホスホグルコン酸脱水素酵素」または「６−ホスホグル
コン酸脱水素酵素」（ＥＣ１．１．１．４３またはＥＣ１．１．１．４４）は、ＮＡＤＰ
＋の存在下でのリブロース−５−リン酸への６−ホスホグルコン酸の脱炭酸還元を触媒す
る酵素を指す。触媒作用の結果として、ＮＡＤＰ＋は、ＮＡＤＰＨに還元される。本発明
は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および好ましくは、脂質
の製造のためのタンパク質をコードする少なくとも１種のさらなる遺伝子を含む組換え微
生物を含む。本発明の組換え微生物によって発現される６−ホスホグルコン酸脱水素酵素
は、植物、動物または真菌、不等毛藻、藻類、細菌またはラン藻を含めた微生物に由来す
るものであり得る。本明細書において開示されるように、６−ホスホグルコン酸脱水素酵
素をコードする非天然遺伝子の発現は、宿主微生物による脂肪酸生合成を増強し得る。本
明細書において開示される微生物および方法において有用であり得るホスホグルコン酸脱
水素酵素として、Ｐｆａｍ ＰＦ０３４４６「６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のＮＡＤ
結合ドメイン」（ギャザリングカットオフ２１．０）に入る、好ましくは、Ｐｆａｍ Ｐ
Ｆ００３９３「６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、Ｃ末端ドメイン」（ギャザリングカッ
トオフ２０．４）に入る６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が挙げられる。６−ホスホグル
コン酸脱水素酵素の結晶構造は公開されている（例えば、Adamsら(1994年)Structure 2:6
51〜658頁）。本明細書において提供されるような操作された微生物において非天然遺伝
子によってコードされ得るホスホグルコン酸脱水素酵素の例として、それだけには限らな
いが、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３（ＢＡＡ１０１０５）、
シアノセイス属（Cyanothece）種ＰＣＣ７８２２（ＡＤＮ１４９７２）、ノストック・ア
ゾラエ（Nostoc azollae）０７０８（ＡＤＩ６３５６６）、シネココッカス属（Synechoc
occus）種ＰＣＣ７００２（ＹＰ＿００１７３３４９０）、シロイヌナズナ（Arabidopsis
thaliana）（ＡＥＤ９４７０５）、グリシン・マックス（Glycine max）（ＢＡＡ２２８
１２）、ヨーロッパアカマツ（Pinus sylvestris）（ＡＤＰ０３０６０）、カイコ（Bomb
yx mori）（ｇｂ ＤＡＡ２１２８３）、ウシ（Bos taurus）（ＤＡＡ２１２８３）、サ
ッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（ＡＡＡ５３６３７）、アス
ペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）ＮＩＨ２６２４（ＥＡＵ３３６１２）、
肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）ＳＰ−ＢＳ２９３（ＥＦＬ６９８４１）、大腸菌
（Escherichia coli）（ＡＡＧ３５２３７）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素およびそ
の変異体が挙げられる。さらに、またはあるいは、本明細書において開示されるような微
生物は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３またはその活性断片に対して少なく
とも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０
％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または
少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む６−ホスホグルコン酸
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。配列番号１０のポリペプチドに対して
相同性を有するアミノ酸配列を有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素の限定されない例
として、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）種ＡＴ７（ＺＰ＿０２１８５８９４）
の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、アナエロコッカス・バギナリス（Anaerococcus vag
inalis）ＡＴＣＣ５１１７０の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５４７３３９
８）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）の６−ホスホ
グルコン酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５６４６９１２）およびクロストリジウム・ベイジェリ
ンキ（Clostridium beijerinckii）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素様タンパク質ＮＣ
ＩＭＢ８０５２（ＹＰ＿００１３０９３１５）が挙げられる。配列番号１３のポリペプチ
ドに対して相同性を有するアミノ酸配列を有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素の限定
されない例として、シアノセイス属（Cyanothece）種ＰＣＣ８８０１（ＹＰ＿００２３７
２４３５）、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）ＮＩＥＳ−８
４３（ＹＰ＿００１６５６５３６）、シネココッカス属（Synechococcus）種ＰＣＣ７０
０２（ＹＰ＿００１７３３４９０）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira plat
ensis）株パラカ（Paraca）（ＺＰ＿０６３８３６３２）、ノストック属（Nostoc）種Ｐ
ＣＣ７１２０（ＮＰ＿４８９３１５）、オシラトリア属（Oscillatoria）種ＰＣＣ６５０
６（ＺＰ＿０７１１０１６８）およびサーモシネココッカス・エロンガツス（ThermoSyne
chococcus elongatus）ＢＰ−１（ＮＰ＿６８１３６６）の６−ホスホグルコン酸脱水素
酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供される操作された微
生物において非天然遺伝子から発現され得る６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、同定さ
れるホスホグルコン酸脱水素酵素のその保存的変異体を含めて、またＮ末端および／また
はＣ末端切断型または修飾された変異体を含めて、上記で言及されたホスホグルコン酸脱
水素酵素または刊行物もしくは配列データベースにおいて列挙されるようなその他のもの
に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９
５％アミノ酸配列同一性を有するホスホグルコン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
であり得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子は、本明細書において提
供されるような、または配列データベースにおいて同定される６−ホスホグルコン酸脱水
素酵素またはそのＮ末端および／もしくはＣ末端切断型変異体（例えば、参照酵素の葉緑
体輸送ペプチドを欠く、あるいは、参照酵素には存在しない付加された葉緑体輸送ペプチ
ドを有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素）、その保存的変異体またはその修飾された
変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する６−ホスホグルコン酸脱水素酵素
をコードし得る。
【0079】
実施例において実証されるように、組換え微生物による脂質産生を改善するために、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子もまた、本発明の組換え微生物において発
現され得る。「アルデヒド脱水素酵素」とは、本明細書において、アルデヒドのカルボン
酸への酸化を触媒する酵素を指す。本明細書において開示される微生物および方法におい
て有用なアルデヒド脱水素酵素として、Ｐｆａｍ ＰＦ００１７１「アルデヒド脱水素酵
素ファミリー」（ギャザリングカットオフ２３．０）に入るアルデヒド脱水素酵素が挙げ
られ、ＥＣ１．２．１．３のアルデヒド脱水素酵素、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素
（ＥＣ１．２．１．１６）、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１
．２７）、ラクトアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．２２）、ベンズアルデヒド脱
水素酵素（ＥＣ１．２．１．２８）、非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水
素酵素（ＥＣ１．２．１．９）、ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素
酵素（ＥＣ１．２．１．１３）、δ−１−ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素（ＥＣ１
．５．１．１２）、アセトアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ：１．５．１．１０）およびグル
タミン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ：１．５．１．４１）が挙げられる。アルデヒ
ド基質は、例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、バレ
ルアルデヒド、イソバレルアルデヒド、ベンズアルデヒド、グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸または別のアルデヒドであり得る。アルデヒド脱水素酵素の結晶構造の一例は、Di C
ostanzoら(2007年) J. Mol. Biol. 366:481〜493頁に提供される。本発明の微生物および
方法において有用なアルデヒド脱水素酵素は、ＮＡＤＰ＋を補因子として使用できるアル
デヒド脱水素酵素であり得る（例えば、LoおよびChen(2010年) Mol Biotechnol 46:157〜
167頁）。アルデヒド脱水素酵素の限定されない例として、バチルス・リケニフォルミス
（Bacillus licheniformis）（ＹＰ＿０８９９３７）、バチルス・ステアロサーモフィル
ス（Bacillus stearothermophilus）ＳＩＣ１（ＹＰ＿６８８８２３）、大腸菌（E. coli
）（ＮＰ＿２８７８８８）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
（ＮＰ＿０１５２６４）、ヒト（Homo sapiens）（ＮＰ＿０００６８０）、ハツカネズミ
（Mus musculus）（ＡＡＢ３２７５４）のアルデヒド脱水素酵素ならびにストレプトコッ
カス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（Ｑ５９９３１）、トウモロコシ（Zea ma
ys）（ＮＰ＿００１１０５５８９）およびエンドウマメ（Pisum sativum）（Ｐ８１４０
６）のＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（deydrogenase）が挙
げられる。さらに、またはあるいは、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を
含む本明細書において開示されるような微生物は、配列番号４、配列番号６または配列番
号７に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少
なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同
一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし得る。配列番号４、配列番号６
および配列番号７のアミノ酸配列に対して相同性を有するアルデヒド脱水素酵素の例とし
て、制限するものではないが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis
）ベルリナー（berliner）血清型（ＺＰ＿０４１１０１１０８）；バチルス・チューリン
ゲンシス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ２００（ＺＰ＿０４０７０８７９）；バチル
ス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ４２２２（ＺＰ＿０４０６４
２０１）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）クルスタキ（kurs
taki）血清型（ＺＰ＿０４１１３８６３）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）Ａ
ＴＣＣ１０８７６（ＺＰ＿０４３１６４８２）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacill
us thuringiensis）ヒュアゾンゲンシス（huazhongensis）血清型（ＺＰ＿０４０８３４
４５）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）（ＺＰ＿０３２２８８０８）、バチル
ス・セレウス（Bacillus cereus）１７２５６０Ｗ（ＺＰ＿０４３０５１６４）、バチル
ス・サイトトキシカス（Bacillus cytotoxicus）ＮＶＨ３９１−９８（ＹＰ＿００１３７
４３２７）；バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＷＳＨ−００２（ＡＥＮ
８９９９０）；バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）Ｒｏｃｋ３−１７（ＺＰ＿
０４１５６１２７）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＨ６２１（ＺＰ＿０４
２９３９７７）およびバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）株アル
・ハカム（Al Hakam）（ＹＰ＿８９４００９）のアルデヒド脱水素酵素を含めた、バチル
ス属（Bacillus）種に由来するアルデヒド脱水素酵素が挙げられる。制限するものではな
いが、本明細書において提供される操作された微生物において非天然遺伝子から発現され
得るアルデヒド脱水素酵素は、同定されたアルデヒド脱水素酵素の保存的変異体を含めて
、またＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めて、上記で言及
されたアルデヒド脱水素酵素のいずれかまたは刊行物もしくは配列データベースにおいて
列挙されたその他のものまたはその活性断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９
０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アルデ
ヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。いくつかの例では、本発明におい
て有用な核酸分子は、本明細書において提供されるような、または配列データベースにお
いて同定されるアルデヒド脱水素酵素またはそのＮ末端および／またはＣ末端切断型変異
体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアルデヒド脱水素酵素をコードし得る
。
【0080】
いくつかの例では、宿主微生物中に導入されたか、または過剰発現される遺伝子によってコードされるアルデヒド脱水素酵素は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（Ｅ
Ｃ１．２．１．２７）であり得る。メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素の結晶構造
は、Dubourgら(2004年) Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 60:1435〜1437頁にお
いて見られる。メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素の限定されない例として、ラッ
ト（Rattus norvegicus）（ＡＡＡ４１６３８）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseud
omonas aeruginosa）（ＡＡＡ２５８９１）；ヒト（Homo sapiens）（ＣＡＢ７６４６８
）；ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）Ｃ５
６−ＹＳ９３（ＹＰ＿００４５８８３３３）；ハンセニエラ属（Hanseniella）種「Ｈａ
ｎ２」（ＡＣＹ４５２９８）；タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）（ＸＰ＿００３
６０８３７２）；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＥＣ０６２８６）；アシ
ネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）６０１４０５９（ＺＰ＿０８４
４２９６０）；およびロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ
４（ＢＡＨ３４６６３）のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が挙げられる。ある
いは、またはさらに、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む、本明細書
に開示されるような微生物は、配列番号１８または配列番号１９に対して、またはその活
性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６
５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含
むメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードし得る。配列番号１８または配列番
号１９に対して相同性を有するメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素の限定されない
例として、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）１９４２（ＹＰ＿００
３９７５４２６；ＡＤＰ３４４９５）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheni
formis）ＡＴＣＣ１４５８０（ＹＰ＿０８１３２３；ＡＡＵ２５６８５）、パエニバチル
ス・デンドリティフォルミス（Paenibacillus dendritiformis）Ｃ４５４（ＺＰ＿０９６
７６６３６）、パエニバチルス・テラエ（Paenibacillus terrae）ＨＰＬ−００３（ＹＰ
＿００５０７５５４６；ＡＥＴ５９３２３）、バチルス・クラウシー（bacillus clausii
）ＫＳＭ−Ｋ１６（ＹＰ＿１７３９２５；ＢＡＤ６２９６４）、リステリア菌（Listeria
monocytogenes）ＦＳＬ Ｆ２−２０８（ＥＦＲ８５８２７）、リステリア・マーシー（
Listeria marthii）ＦＳＬ Ｓ４−１２０（ＺＰ＿０７８６９６５７；ＥＦＲ８８８４７
）およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius
）ＬＡＡ１（ＺＰ＿０３４９５１８１；ＥＥＤ０６１２５）のメチルマロン酸セミアルデ
ヒド脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供されるよ
うな操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされるアルデヒド脱水素酵素
は、これらのメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素のいずれかまたは配列データベー
スにおいて列挙されたその他のもの、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／また
はＣ末端切断型または修飾された変異体に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、
少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、メチルマロン
酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本発明にお
いて有用な核酸分子は、本明細書において列挙されるようなポリペプチドに対して、また
は刊行物もしくは配列データベースにおいて同定される別のアルデヒド脱水素酵素に対し
て、またはその活性断片に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するメチルマロン
酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードし得る。
【0081】
本明細書において開示されるような微生物は、あるいは、またはさらに、非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．２．１．９）である、ＮＡＤ
Ｐ＋を必要とするグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（非リン酸化）と呼ばれる
こともあるアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。非リン酸化型グ
リセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の結晶構造は、Lorentzenら(2004年)J. Mol. B
iol. 341:815〜828頁に提供されている。本明細書において提供されるような微生物にお
いて組換え核酸分子によってコードされ得る非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン
酸脱水素酵素の限定されない例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＮＰ
＿１８０００４）、クロレラ・バリアビリス（Chlorella variabilis）（ＥＦＮ５０６３
７）、グリシン・マックス（Glycine max）（ＸＰ＿００３５４９５５０）、ミナトカモ
ジグサ（Brachypodium distachyon）（ＸＰ＿００３５７４５４０）、モロコシ（Sorghum
bicolor）（ＸＰ＿００２４４４４１６）、トウモロコシ（Zea mays）（ＡＣＦ８４５７
５）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）（ＸＰ＿００１７５３７８４）、
オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ostreococcus lucimarinus）（ＸＰ＿００１４１８
４４５）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）（ＺＰ＿０４１９６０２２．１）お
よびイヌカタヒバ（Selaginella moellendorffii）（ＸＰ＿００２９８１５８７．１）か
ら誘導されるものが挙げられる。制限するものではないが、本明細書において提供される
ような操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされる非リン酸化型グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素は、その保存的変異体を含めた、またそのＮ末端お
よび／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、これらの非リン酸化型グリ
セルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のいずれかまたは配列データベースにおいて列挙
されるようなその他のものに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも
９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、非リン酸化型グリセルア
ルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本発明
において有用な核酸分子は、本明細書において提供されるようなポリペプチドまたはその
Ｎ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体に対して、または配列表もし
くはデータベースにおいて同定される別の非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素に対して、またはその活性断片に対して、少なくとも８５％または少なくとも
９０％の配列同一性を有する非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を
コードし得る。いくつかの場合には、本発明において有用な核酸分子は、本明細書におい
て提供され、配列表もしくはデータベースにおいて同定されるようなポリペプチドに対し
て、少なくとも９５％の配列同一性を有するアルデヒド脱水素酵素をコードする。
【0082】
本明細書において提供されるような組換え微生物における非天然遺伝子の発現によって製造され得るさらに別の種類の脱水素酵素として、例えば、Ｄ−２−ヒドロキシイソカプ
ロン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素酵素、バンコマイシン耐性
タンパク質Ｈ、Ｄ−２−ホスホグリセリン酸脱水素酵素またはＤ−乳酸脱水素酵素などの
Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素）があ
る。「Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素」とは、本明細書において、α−ヒドロキシカル
ボン酸のα−ケトカルボン酸への、例えば、乳酸化合物のピルビン酸化合物への酸化を触
媒する酵素を指す。このプロセスでは、ＮＡＤ（Ｐ）＋が、還元されて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
が生じる。多数のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、ＮＡＤ＋を補因子として好むが、
その他のものがＮＡＤＰ＋を補因子として使用することがわかっている（Domenechおよび
Ferrer(2006年)Biochim Biophys Acta1760:1667〜1674頁）。Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水
素酵素の結晶構造の一例を、Denglerら(1997年)J. Mol. Biol 267:640〜660頁に見出すこ
とができる。本明細書において開示される微生物および方法において有用なＤ−２−ヒド
ロキシ酸脱水素酵素として、Ｐｆａｍ ＰＦ０２８２６「Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵
素ファミリー」（ギャザリングカットオフ２５．１）に入るＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素
酵素が挙げられる。Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素の限定されない例として、ハロフェ
ラックス・メディテラネイ（Haloferax mediterranei）（ＡＢＢ３０００４）、エンテロ
コッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（ＡＡＢ０５６２６）、ハロアーキュ
ラ・マリスモルツイ（Haloarcula marismortui）ＡＴＣＣ４３０４９（ＡＡＶ４７４６７
）、バチルス属（Bacillus）種２ Ａ ５７ ＣＴ２（ＺＰ＿０８００８４１２）、スト
レプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ２０９６（ＡＢＦ３６
０１５．１）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）亜種プラン
タルム（plantarum）ＮＣ８（ＥＨＳ８１９８７．１）、スタフィロコッカス・アウレウ
ス（staphylococcus aureus）亜種アウレウス（aureus）Ｓ０３８５（ＣＡＱ５０９９０
．１）、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）次亜種トリフォリ（t
rifolii）ＷＳＭ２３０４（ＡＣＩ５７７６６．１）、ノストック・パンクチフォルメ（N
ostoc punctiforme）ＡＴＣＣ２９１３３（ＹＰ＿００１８６９１２５）、ミクロモナス
属（Micromonas）種ＲＣＣ２９９（ＡＣＯ７０３６５）、ファエオダクチルム・トリコル
ヌツム（Phaeodactylum tricornutum）ＣＣＡＰ１０５５／１（ＸＰ＿００２１８３６７
５）、オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）（ＸＰ＿００３０８１９９２
）およびネッタイシマカ（Aedes aegypti）（ＥＡＴ４３１２１）のＤ−２−ヒドロキシ
酸脱水素酵素ならびにアカパンカビ（Neurospora crassa）（ＣＡＣ１８２５）のギ酸脱
水素酵素が挙げられる。あるいは、またはさらに、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコ
ードする非天然遺伝子を含む本明細書において開示されるような微生物は、配列番号２、
配列番号２９、配列番号１５または配列番号１６に対して、またはその活性断片に対して
、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なく
とも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０
％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードする非天然遺伝子を含み得る。例えば、配列番号２または配列番号２９に対し
て、少なくとも少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８
０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一
性を有するアミノ酸配列、例えば、配列番号２または配列番号２９に対して少なくとも８
５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸
配列などを含む、脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含む核酸分子が本明細書において提供される。あるいは、本明細書において提供されるよ
うな核酸分子は、配列番号１５または配列番号１６に対して少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を含む脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含
み得る。
【0083】
配列番号２または配列番号２９に対して相同性を有するＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素の限定されない例として、ポリモーフム・ギルバム（Polymorphum gilvum）ＳＬ００３
Ｂ−２６Ａ１（ＹＰ＿００４３０２７０２）、スタッピア・アグレガタ（Stappia aggreg
ata）ＩＡＭ １２６１４（ＺＰ＿０１５４５６６６；ＥＡＶ４５５９５）、マリノモナ
ス属（Marinomonas）種ＭＷＹＬ１（ＹＰ＿００１３４２１３３、ＡＢＲ７２１９８）、
ラブレンジア・アレクサンドリー（Labrenzia alexandrii）ＤＦＬ−１１（ＺＰ＿０５１
１５５８４、ＥＥＥ４６１８３）；デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans
）ＳＰＨ−１（ＹＰ＿００１５６６６４９、ＡＢＸ３８２６４）、バークホルデリア属（
Burkholderia）種ＣＣＧＥ１００１（ＹＰ＿００４２３０８６１；ＡＤＸ５７８０１）、
ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ＡＴＣＣ１７０２９（ＹＰ
＿００１０４４９５９；ＡＢＮ７８１８７）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobac
ter sphaeroides）ＡＴＣＣ１７０２５（ＹＰ＿００１１６８２５１；ＡＢＰ７０９４６
）；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ＷＳ８Ｎ（ＺＰ＿０８
４１５４１９；ＥＧＪ２０２１５）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter spha
eroides）ＫＤ１３１（ＹＰ＿００２５２０５４１；ＡＣＭ０３４６８）およびバークホ
ルデリア属（Burkholderia）種Ｃｈｌ−１（ＺＰ＿０６８３９７４３；ＥＦＧ７２５７３
）のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が挙げられる。制限するものではないが、本明細書
において提供されるような操作された微生物において非天然遺伝子によってコードされる
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／また
はＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、これらの非リン酸化Ｄ−２−ヒドロキ
シ酸脱水素酵素のいずれかまたは配列データベースにおいて列挙されるその他のものに対
して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％
のアミノ酸配列同一性を有するＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチ
ドであり得る。例えば、本発明において有用な核酸分子は、配列番号２、配列番号２９に
対して、または本明細書において列挙されたポリペプチドに対して、少なくとも８５％ま
たは少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または刊行物もしくは配列データベース
において同定される別のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素に対して、もしくはその活性断
片に対して、少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸
配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明
において有用な核酸分子は、本明細書において提供されるような、または配列データベー
スにおいて同定されるポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤ−
２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明において有用な
核酸分子は、配列番号２または配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。
【0084】
本明細書における組換え微生物および方法において有用なさらなるＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素として、配列番号１５または配列番号１６に対して相同性を有
するもの、例えば、それだけには限らないが、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clos
tridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ ８０５２（ＹＰ＿００１３０９３１６）、エンテロ
コッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２（ＺＰ＿０５６４８１９９）
；エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ＡＴＣＣ１２７５
５（ＺＰ＿０８１４５０１１）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）種ＡＴ７（Ｚ
Ｐ＿０２１８５８９３）およびエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）
Ｅ１６３６（ＺＰ＿０６６９５３４５）のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が挙げられる
。制限するものではないが、本明細書において提供されるような操作された微生物におい
て非天然遺伝子によってコードされるＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、その保存的変
異体ならびにそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、
これらの非リン酸化Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素のいずれかまたは刊行物もしくは配
列データベースにおいて列挙されるようなその他のものに対して、少なくとも８５％、少
なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、Ｄ−２−ヒドロ
キシ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであり得る。例えば、本発明において有用な
核酸分子は、配列番号１５、配列番号１６に対して、または配列表またはデータベースに
おいて同定される別のＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素に対して、またはその活性断片に
対して少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明において
有用な核酸分子は、本明細書において提供されるような、または配列データベースにおい
て同定されるポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤ−２−ヒド
ロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。いくつかの例では、本発明において有用な核酸分子
は、配列番号１５または配列番号１６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードし得る。
【0085】
あるいは、またはさらに、イソクエン酸脱水素酵素遺伝子は、本明細書において提供されるような組換え微生物において発現され得る。本発明の微生物によって発現され得るイ
ソクエン酸脱水素酵素の例として、制限するものではないが、カンジダツス・レジエラ・
インセクチコラ（Candidatus Regiella insecticola）ＬＳＲ１（ＥＦＬ９２７９４）、
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ＣＤＣ１５５１（ＡＡＫ４７７８６）；ブラッタ
バクテリウム属（Blattabacterium）種（クリプトセルクス・プンクトゥラトゥス（Crypt
ocercus punctulatus））株Ｃｐｕ（ＡＥＵ０９３１７）、トレポネーマ・アゾトニュー
トリシウム（Treponema azotonutricium）ＺＡＳ−９（ＡＥＦ８０１４２）、スタフィロ
コッカス・シュードインターメディウス（Staphylococcus pseudintermedius）ＥＤ９９
（ＡＤＸ７６３７９）、パエニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa）Ｅ６８
１（ＡＤＭ６９４２６）、大腸菌（Escherichia coli）ＩＨＥ３０３４（ＡＤＥ９１７９
４）、アシジチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）Ａ
ＴＣＣ２３２７０（ＡＣＫ８０９５６）、コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burneti
i）ＲＳＡ３３１（ＡＢＸ７８６６９）、バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholde
ria pseudomallei）１１０６ａ（ＡＢＯ０５９６６）、バークホルデリア・マレイ（Burk
holderia mallei）ＮＣＴＣ１０２４７（ＡＢＯ０５９６６）、バークホルデリア・マレ
イ（Burkholderia mallei）ＮＣＴＣ１０２２９（ＡＢＮ０２９３５）、バークホルデリ
ア・マレイ（Burkholderia mallei）ＳＡＶＰ１（ＡＢＭ５２８０３）、マイコバクテリ
ウム・アビウム（Mycobacterium avium）１０４（ＡＢＫ６６７７１）およびエロモナス
・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）亜種ハイドフィラ（hydrophila）ＡＴＣＣ７
９６６（ＡＢＫ３８３６８）のイソクエン酸脱水素酵素が挙げられる。いくつかの例では
、本発明において有用な核酸分子は、その保存的変異体ならびにそのＮ末端および／また
はＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、本明細書において提供されるような、
配列データベースにおいて同定されるポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なく
とも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するイソクエン酸脱水素酵素をコー
ドし得る。
【0086】
非天然核酸分子によってコードされ得るグルタミン酸脱水素酵素として、限定されない例として、カエノセファルス・アセラツス（Chaenocephalus aceratus）（Ｐ８２２６４
）、ウシ（Bos taurus）（ＮＰ８７２５９３）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana
）（ＮＰ＿１９７３１８）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）（ＸＰ＿００３６
１８９７２）、クロレラ・バリアビリス（Chlorella variabilis）（ＥＦＮ５７９４３）
、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）（ＸＰ＿００１７０２２７０）、ロド
ピレルラ・バルティカ（Rhodopirellula baltica）ＳＨ １（ＮＰ＿８６７５３８）クテ
ドノバクター・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）ＤＳＭ ４４９６３（ＺＰ＿
０６９６７７３８）またはロゼイフレクサス属（Roseiflexus）種ＲＳ−１（ＹＰ＿００
１２７６０６２）のグルタミン酸脱水素酵素、あるいは、その保存的変異体および／また
はそのＮ末端および／またはＣ末端切断型または修飾された変異体を含めた、本明細書に
おいて提供される、もしくは配列データベースにおいて同定されるポリペプチドに対して
、少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有するグルタミン酸脱水素酵素
を挙げることができる。
【0087】
微生物および宿主細胞本発明は、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を発現する組換え微生物を提供し、組
換え微生物は、脂質を産生し、脱水素酵素を発現する組換え微生物の培養物は、対照培養
物の微生物が脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、脱水素酵素を
発現する微生物の培養物と同一である対照培養物が製造するよりも多量の脂質を製造する
。組換え微生物は、例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体および／またはグリセロ脂質の製造の
ための酵素をコードする非天然遺伝子などの、脂質の製造のための少なくとも１種のさら
なる非天然遺伝子をさらに含み得る。いくつかの例では、脱水素酵素をコードする非天然
遺伝子および脂質の合成に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む微生物
は、対照微生物が脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点を除いて、非天然脱
水素酵素遺伝子および脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を発
現する微生物に対してすべての点で同一である対照微生物が有するよりも高い繁殖および
／または増殖速度を有する。例えば、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質（
例えば、脂肪酸生成物）合成物の製造のためのポリペプチドをコードする非天然遺伝子を
含む本明細書において開示されるような組換え微生物の培養物は、３、４、５、６日また
は７日以上の培養後に、対照微生物が脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない点
を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子および脂質の製造に関与するポリペプチドをコードす
る非天然遺伝子を発現する微生物とすべての点において同一である対照微生物によって達
せられる細胞密度よりも高い細胞密度に達し得る。例えば、非天然脱水素酵素遺伝子およ
び脂質の製造に関与するポリペプチドをコードする非天然遺伝子を発現する組換え微生物
の培養は、脂質、例えば、脂肪酸生成物が製造される培養条件下で、非天然脱水素酵素遺
伝子を欠く微生物の対照培養物よりも高い細胞密度に達し得る。脂肪酸生成物は、宿主微
生物によって天然に製造されない（すなわち、脂質の製造に関与する非天然遺伝子を欠く
宿主微生物によって製造されない）脂質であり得る。
【0088】
本発明の組換え微生物または宿主細胞は、制限するものではないが、真菌、不等毛藻、藻類、真正細菌、古細菌、緑色非硫黄細菌、紅色非硫黄細菌またはラン藻類を含めた原核
生物または真核生物起源のものであり得る。組換え宿主細胞は、それだけには限らないが
、光合成生物であり得る。光合成生物として、高等植物（すなわち、維管束植物）、コケ
植物、藻類および光合成細菌が挙げられる。用語「藻類」は、ラン藻類（ラン藻綱（Cyan
ophyceae））、緑色藻類（緑藻綱（Chlorophyceae））、黄緑色藻類（黄緑藻綱（Xanthop
hyceae））、黄金色藻類（黄金藻綱（Chrysophyceae））、褐色藻類（褐藻綱（Phaeophyc
eae））、赤色藻類（紅藻綱（Rhodophyceae））、珪藻類（珪藻綱（Bacillariophyceae）
）および「ピコプランクトン」（プラシノ藻綱（Prasinophyceae）および真正眼点藻綱（
Eustigmatophyceae））を含む。また、用語藻類には、分類学的綱、渦鞭毛藻綱（Dinophy
ceae）、クリプト藻綱（Cryptophyceae）、ユーグレナ藻綱（Euglenophyceae）、灰色藻
綱（Glaucophyceae）およびプリムネシウム藻綱（Prymnesiophyceae）のメンバーも含ま
れる。微細藻類は、顕微鏡を用いてのみ、単一生物として見られ得る単細胞藻類またはコ
ロニー藻類である。微細藻類は、真核生物および原核生物藻類（例えば、ラン藻類）の両
方を含む。
【0089】
本明細書において使用するための藻類は、制限するものではないが、微細藻類、例えばそれだけには限らないが、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphip
rora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アス
テロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodin
ella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus
）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（C
hlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium
）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（C
hrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Cryp
thecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュ
ナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emili
ania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、
ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria
）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハ
ロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属
（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractiniu
m）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノク
ロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochlo
ris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツ
スチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogoniu
m）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブ
ロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、
ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス（Phagus）、ピコクロラム属（Picoc
hlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プ
レウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属
（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属
（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、
シゾクラミデラ属（Schizochlamydella）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ
属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラクロレラ属（Tetrachlore
lla）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリ
ジエラ属（Viridiella）またはボルボックス属（Volvox）の種などを含む。例えば、宿主
微生物は、珪藻類であり得、アンフォラ属（Amphora）、カエトセロス属（Chaetoceros）
、シクロテラ属（Cyclotella）、フラギラリア属（Fragilaria）、ナビクラ属（Navicula
）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）またはタラシオシーラ属（Thalassiosira）
からなる群から選択される属であり得る。あるいは、いくつかの例では、宿主株は、ナノ
クロロプシス属（Nannochloropsis）もしくはエリプソイドン属（Ellipsoidon）の種など
のユースティグマトファイト属（eustigmatophyte）またはそれだけには限らないが、ク
ロレラ属（Chlorella）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、シュードクロレラ属（Pse
udochlorella）、スセネデスムス属（Scenedesmus）またはテトラセルミス属（Tetraselm
is）の種などの緑色藻類であり得る。
【0090】
あるいは、組換え微生物は、ラン藻類の種であり得る。今日までに、例えば、種々のアカリオクロリス属（Acaryochloris）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、ラン藻、シア
ノセイス属（Cyanothece）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、ミクロキスティス属
（Microcystis）、ノストック属（Nostoc）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）
、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）およびサ
ーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）の種のゲノムを含めた３０種を超えるラ
ン藻ゲノムが完全に配列決定されており、例えば、ラン藻類レプトリンビア属（Leptolyn
gbya）種の株ＢＬ０９０２、アナバエナ属（Anabaena）（ノストック属(Nostoc)）種ＰＣ
Ｃ７１２０、アナバエナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）ＡＴＣＣ２９４１３、
ノストック・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）ＡＴＣＣ２９１３３、ノストック
属（Nostoc）種ＰＣＣ７４２２、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０
３、シネココッカス・エロンガツス（Synechococcus elongatus）ＰＣＣ７９４２、シネ
ココッカス・エロンガツス（Synechococcus elongatus）ＰＣＣ７００２などを含めた、
多数のラン藻の種が分子生物学の技術を使用して操作されている（Tatonら(2012年)PLoS
One Vol.7、Iss. 1 e30910；Ruffing(2011年) Bioengineered Bugs 2:136〜149頁）。本
明細書において提供される組換え微生物は、限定されない例として、以下の属のラン藻類
:アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Ana
baenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）
、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（
Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロ
コッカス属（Chroococcus）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシ
ディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム
属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobi
um）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセ
イス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンド
ロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、
デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属
（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グ
ロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス
属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengarie
lla）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リン
ビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcys
tis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック
属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、
フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロ
カプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属
（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Ps
eudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイ
トネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、
スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シ
ネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネ
ココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデ
スミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenoco
ccus）のいずれかのものであり得る。例えば、組換え光合成微生物は、シネココッカス属
（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）またはサーモシネココッカス
属（Thermosynechococcus）種であり得る。あるいは、組換え光合成微生物は、シアノビ
ウム属（Cyanobium）、シアノセイス属（Cyanothece）またはシアノバクテリウム属（Cya
nobacterium）の種であり得るか、さらにあるいは、組換え光合成微生物は、グロエオバ
クター属（Gloeobacter）、リンビア属（Lyngbya）またはレプトリンビア属（Leptolyngb
ya）の種であり得る。
【0091】
組換え微生物は、本明細書において開示される任意の脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。いくつかの例では、微生物は、ＮＡＤＰＨ生成性脱水素酵素、例えば、
ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（非リン酸化）（ＥＣ１．２
．１．９）、リンゴ酸酵素、イソクエン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素または６−ホスホグルコン酸脱水素酵素などをコードする非
天然遺伝子を発現する。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、アルデヒド脱水素酵
素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素またはＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素を
コードする遺伝子を発現し得る。特定の例では、本明細書において提供されるような組換
え微生物は、異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１０、配列番号１１、
配列番号１３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８、配列番号１９、配
列番号１５、配列番号１６、配列番号２または配列番号２９のアミノ酸配列に対して、少
なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％少なくとも６５％、少なくとも７
０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％、例えば、少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％
、少なくとも９９％または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードする核酸配列を含む非天然核酸分子を含み得る。
【0092】
例えば、組換え微生物は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素または６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、例えば、本明細書において開示される任意のものなどといったペントー
スリン酸経路の脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコン酸
脱水素酵素は、原核生物または真核生物の任意の生物から誘導されるものであり得、例え
ば、宿主微生物と同一種に由来し得、非天然遺伝子は、内因性６−ホスホグルコン酸脱水
素酵素遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを遺伝子操作することによって過剰発
現される、導入された遺伝子または内因性遺伝子であり得る。あるいは、またはさらに、
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１０、配列番号１１に対して、またはその
活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくと
も６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％
、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得
る。例えば、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１０または配列番号１１に対
して、またはその活性断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも
９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％ま
たは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１３に対して、またはその活性断片に対し
て、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。例えば、６
−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、配列番号１３に対して、またはその活性断片に対して
、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なく
とも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含み得る。宿主微生物は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする
非天然遺伝子に加えて、脂質生合成、例えば、脂肪酸生成物の合成に関与するポリペプチ
ドをコードする少なくとも１種のさらなる非天然遺伝子をさらに含み得る。非天然６−ホ
スホグルコン酸脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生合成遺伝子を含む組換え宿主微生物
の培養物は、対照微生物が、非天然６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子を含まない点
を除いて、組換え宿主微生物とすべての点で同一である対照微生物の培養物によって製造
されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造し得る。さらに、６−ホスホグルコン酸脱水
素酵素をコードする非天然遺伝子および脂肪酸生成物の合成に関与するポリペプチドをコ
ードする非天然遺伝子を含む組換え宿主微生物は、高い繁殖および／または増殖速度を有
し得、および／または脂肪酸生成物が製造されている培養条件下で対照微生物によって達
せられ得るものよりも高い細胞密度に達し得る。特定の例では、組換え微生物の培養物に
よって多量に製造された脂質は、脂質製造のための非天然遺伝子の発現の不在下では微生
物によって製造されない脂肪酸生成物である。
【0093】
さらなる例では、組換え微生物は、それだけには限らないが、本明細書において開示される任意のものを含めた、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。
アルデヒド脱水素酵素は、原核生物または真核生物の任意の生物から誘導されるものであ
り得、例えば、宿主微生物と同一種に由来し得、非天然遺伝子は、内因性アルデヒド脱水
素酵素遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを遺伝子操作することによって過剰発
現される導入された遺伝子または内因性遺伝子であり得る。種々の例示的な例では、アル
デヒド脱水素酵素は、配列番号４、配列番号６または配列番号７に対して、またはその活
性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも
６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５
％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み
得る。例えば、アルデヒド脱水素酵素は、配列番号４、配列番号６または配列番号７に対
して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少
なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含み得る。アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む宿
主微生物は、脂質生合成、例えば、脂肪酸生成物の合成に関与するポリペプチドをコード
するさらなる非天然遺伝子をさらに含み得る。非天然アルデヒド脱水素酵素遺伝子および
非天然脂質生合成遺伝子を含む組換え宿主微生物の培養物は、対照微生物が、非天然アル
デヒド脱水素酵素遺伝子を含まない点を除いて、組換え宿主微生物とすべての点において
同一である対照微生物の培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造
し得る。さらに、アルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂肪酸生成物の
合成に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む組換え宿主微生物は、
高い繁殖および／または増殖速度を有し得、および／または脂肪酸生成物が製造されてい
る培養条件下で対照微生物によって達せられるものよりも高い細胞密度に達し得る。特定
の例では、組換え微生物によって多量に製造された脂質は、脂質製造のためのポリペプチ
ドをコードする非天然遺伝子の発現の不在下では、微生物によって製造されない脂肪酸生
成物である。
【0094】
例えば、アルデヒド脱水素酵素は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素であり得、宿主微生物は、それだけには限らないが、本明細書において開示される任意のものなど
のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。例え
ば、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素は、配列番号１８または配列番号１９に対
して、またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも
６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸
配列を含み得る。いくつかの例では、宿主微生物は、配列番号１８または配列番号１９に
対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少
なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有
するメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。
【0095】
さらなる例では、組換え微生物は、それだけには限らないが、本明細書において開示される任意のものなどの、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含
み得る。Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素は、原核生物または真核生物の任意の生物から
誘導されるものであり得、宿主微生物と同一種に由来し得、非天然遺伝子は、内因性Ｄ−
２−ヒドロキシ酸脱水素酵素遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを遺伝子操作す
ることによって過剰発現される導入された遺伝子または内因性遺伝子であり得る。種々の
例では、微生物は、配列番号２または配列番号２９に対して、またはその活性断片に対し
て、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％少なくとも８５％、少なくとも９０
％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ
酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む。例えば、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵
素は、配列番号２または配列番号２９に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％ま
たは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少な
くとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらなる例
では、微生物は、配列番号１５または配列番号１６に対して、またはその活性断片に対し
て、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキ
シ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む。例えば、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素
酵素は、配列番号１５または配列番号１６に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％
または少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少
なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。Ｄ−２−
ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む宿主微生物は、脂質生合成、例
えば、脂肪酸生成物の合成に関与しているポリペプチドをコードするさらなる非天然遺伝
子をさらに含み得る。非天然Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素遺伝子および非天然脂質生
合成遺伝子を含む組換え宿主微生物の培養物は、対照微生物が、非天然Ｄ−２−ヒドロキ
シ酸脱水素酵素遺伝子を含まない点を除いて、組換え宿主微生物とすべての点において同
一である対照微生物の培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造し
得る。さらに、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂肪酸
生成物の合成に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む組換え宿主微
生物は、脂肪酸生成物が製造されている培養条件下で対照微生物によって達せられるもの
よりも高い繁殖および／または増殖速度を有し得、および／またはより高い細胞密度に達
し得る。組換え微生物によって多量に製造された脂質は、いくつかの例では、脂質製造の
ためのポリペプチドをコードする非天然遺伝子の発現の不在下では、微生物によって製造
されない脂肪酸生成物であり得る。
【0096】
特定の限定されない例では、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および微生物によって普通は製造されない（例えば、脂肪酸生成物の製造に関与しているポリペプチドをコー
ドする非天然遺伝子を用いて形質転換されていない場合には、宿主微生物として使用され
る微生物の種または株によって製造されない）脂肪酸生成物の製造に関与しているポリペ
プチドをコードするさらなる非天然遺伝子を含む組換え微生物は、組換え光合成微生物で
あり得、組換え光合成微生物の培養物は、対照培養物の組換え光合成微生物が、脱水素酵
素をコードする非天然遺伝子を含まないか、または発現しない点を除いて、すべての点で
同一である対照培養物によって製造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造する。例
えば、宿主微生物は、例えば、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エ
ステル（例えば、脂肪酸アルキルエステル）またはワックスエステルを天然に製造しない
真核生物微細藻類の一種であり得、脱水素酵素遺伝子および脂肪酸生成物の製造のための
遺伝子を用いて形質転換された組換え宿主微生物は、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪
アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステルまたはワックスステルのうち１種また
は複数を製造できる。あるいは、宿主微生物は、例えば、遊離脂肪酸、脂肪アルコール、
アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステルまたはトリグリセリドを天然に
は製造しないラン藻類の一種であり得、脱水素酵素遺伝子および脂肪酸生成物の製造のた
めの遺伝子を用いて形質転換された組換え宿主微生物は、遊離脂肪酸、脂肪アルコール、
アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステルまたはトリグリセリドのうち１
種または複数を製造できる。
【0097】
好ましくは、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含む光合成微生物の培養物は、脱水素酵素をコー
ドする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である光合成微生物の培養物によって製
造されるものよりも多量の脂肪酸生成物を製造する。例えば、脱水素酵素をコードする非
天然遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を含
む光合成微生物の光独立栄養培養物は、好ましくは、脱水素酵素をコードする非天然遺伝
子を欠く、そうでなければ同一である光合成微生物の光独立栄養培養物によって製造され
るものよりも多量の脂肪酸生成物を製造できる。さらに、またはあるいは、組換え光合成
微生物の培養物は、例えば、無機（非還元）炭素を、脂肪酸生成物の製造のための炭素供
給源として使用して、光独立栄養条件下で脂質を製造しながら、高い細胞密度に達し得る
。
【0098】
脂肪酸生成物の製造のための遺伝子修飾本明細書において提供されるような組換え微生物は、例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体（
例えば、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカ
ンまたはアルケン）またはグリセロ脂質（例えば、トリグリセリド）などの脂質を製造す
るように操作され得る。例えば、組換え微生物は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、ア
シル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、脂質分解活性
を有するポリペプチド、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、カ
ルボン酸レダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラーゼ、
グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、リゾホスファチジン酸アシ
ルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）また
はジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）のうち１種または複
数をコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含み得る。
【0099】
種々の限定されない例示的な例では、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキ
シベンゾイルチオエステラーゼおよび遊離脂肪酸の製造のための、または脂肪酸から生成
した脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカンも
しくはアルケンの製造のための脂質分解活性を有するポリペプチドのうち１種または複数
を含み得る。組換え微生物は、例えば、本明細書において開示される任意のものなどアシ
ル−ＡＣＰチオエステラーゼ、例えば、高等植物ＦａｔＢチオエステラーゼなどをコード
する非天然遺伝子を含み得る。例示的実施例では、微生物は、タバコソウ属（Cuphea）ア
シル−ＡＣＰチオエステラーゼまたはその変異体をコードする非天然遺伝子、例えば、配
列番号２１に記載のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含み得る。組換え微生物は、微細
藻類、例えば、ラン藻であり得る。
【0100】
あるいは、またはさらに、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、脂肪アルデヒドの製造のために非天然アシルレダクターゼ遺伝子を、所望により、脂肪アルデヒドを
アルカンに変換するデカルボニラーゼを含み得る。アルデヒド形成性アシルレダクターゼ
は、アシル−ＡＣＰレダクターゼまたはアシル−ＣｏＡレダクターゼであり得る。なおあ
るいは、またはさらに、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、脂肪アルコール
の製造のためのアシルレダクターゼ遺伝子を、所望により、脂肪アルコールをワックスエ
ステルに変換するワックスシンターゼを含み得る。アルコール形成性アシルレダクターゼ
は、アシル−ＡＣＰレダクターゼまたはアシル−ＣｏＡレダクターゼであり得る。ワック
スシンターゼは、所望により、アシル−ＡＣＰを基質として使用できるワックスシンター
ゼであり得る。組換え微生物は、アシル−ＣｏＡシンセターゼをさらに含み得るか、また
はアシルレダクターゼおよび／またはワックスシンターゼまたはアシルトランスフェラー
ゼなどの酵素が、アシル−ＡＣＰを基質として使用できる例では、アシル−ＣｏＡシンセ
ターゼをコードする非天然遺伝子を含まない場合もある。特定の例では、脂肪酸誘導体の
製造のために使用される組換え微生物は、アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはアシル−Ａ
ＣＰチオエステラーゼのいずれかをコードする遺伝子を天然には含まず、アシル−ＣｏＡ
シンセターゼまたはアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのいずれかまたは両方をコードする
外因性（すなわち、導入された）遺伝子をさらに含まない、ラン藻の一種である。
【0101】
あるいは、またはさらに、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、それだけには限らないが、ＤＧＡＴ、ＬＰＡＡＴまたはＧＰＡＴなどのアシルトランスフェラーゼを
コードする非天然遺伝子を含み得、所望により、さらに、またはあるいは、ＰＡＰをコー
ドする非天然遺伝子を含み得る。
【0102】
具体的には、それだけには限らないが、以下の例を含めた、コードされるポリペプチドが、酵素のクラスの活性を有する所与のクラスの既知または疑われる酵素に対して、少な
くとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％
のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が、本明細書において
開示される構築物および微生物において使用するために含まれる。例えば、チオエステラ
ーゼ、リパーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アルデヒド形成性レダクターゼ、アルコ
ール形成性レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラ
ーゼ、ワックスシンターゼ、アシルトランスフェラーゼまたは本明細書において提供され
る微生物および方法において有用な輸送体をコードする核酸配列は、同定されたチオエス
テラーゼ、リパーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アルデヒド形成性レダクターゼ、ア
ルコール形成性レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキ
シラーゼ、ワックスシンターゼまたはアシルトランスフェラーゼ、例えば、それだけには
限らないが、本明細書において開示されたものを含めた、データベースにおいて注釈がつ
けられた配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の
アミノ酸配列同一性を有し得る。
【0103】
チオエステラーゼ例えば、脱水素酵素をコードする１種または複数の組換え遺伝子の発現系に加えて、宿
主微生物は、チオエステラーゼをコードする非天然遺伝子を含み得る。本明細書において
、用語「チオエステラーゼ」は、チオエステル結合に作用して、脂肪酸放出できる加水分
解酵素を含むものとする。宿主微生物は、遊離脂肪酸を製造できるか、またはチオエステ
ラーゼによって放出された脂肪酸を、脂肪アルコールまたはワックスエステルなどのその
他の生成物に変換できる。チオエステラーゼは、例えば、酵素番号３．１．２．２、３．
１．２．１４、３．１．２．１８、３．１．２．１９、３．２．１．２０、３．１．２．
２２、３．１．２．２３または３．１．２．２７に対応し得る。宿主微生物において発現
される外因性チオエステラーゼは、例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−
ＣｏＡチオエステラーゼまたはヒドロキシルベンゾイルチオエステラーゼであり得る。例
えば、遊離脂肪酸の製造のための微生物は、いくつかの実施形態では、外因性アシル−Ａ
ＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、例えば、Ｐｆａｍデータベースに対してクエ
リーされた場合に、２０．３（ＰＦ０１６４３のギャザリングカットオフ）以下のビット
スコアを有するＰｆａｍ ＰＦ０１６４３とのマッチを提供するポリペプチドをコードす
る遺伝子を用いて形質転換され得る。外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、
高等植物種に由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードし得る。高等植物から誘
導されるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子として、制限するものでは
ないが、タバコソウ属（Cuphea）の種（例えば、クフェア・カルタゲンシス（Cuphea car
thagenensis）、クフェア・ライティー（Cuphea wrightii）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受
託ＡＡＣ４９７８４）、クフェア・ランケオラータ（Cuphea lanceolata）（例えば、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＡ５４０６０）、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）、
（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ４９７８３、ＡＡＣ４９１７９）、クフェア・フッ
ケリアナ（Cuphea hookeriana）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ７２８８２、ＡＡ
Ｃ４９２６９、ＡＡＣ７２８８１、ＡＡＣ７２８８３）、クフェア・カロフィラ（Cuphea
calophylla）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＢ７１５８０）に由来するアシル−Ａ
ＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子または参照により本明細書に組み込まれる米国
特許出願公開ＵＳ２０１１／００２０８８３に開示される種々のタバコソウ属（Cuphea）
の種の遺伝子）またはその他の高等植物種に由来する遺伝子を挙げることができる。さら
なる例では、本明細書において開示される方法および培養物において使用される微生物は
、それだけには限らないが、アラビドプシス（Arabidopsis）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ
受託ＸＰ＿００２８８５６８１、ＮＰ＿１７２３２７）、ピーナッツ（Arachis hypogaea
）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＯ３８５５６）、ブラシカ属（Brassica）種（例え
ば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＡ５２０６９．１）、カメリア・オレイフェラ（Camellia o
leifera）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＣＱ５７１８９）、シンナモナム・カンフォ
ラム（Cinnamonum camphorum）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ４９１５１）、ココ
ヤシ（Cocos nucifera）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＥＭ７２５１９、ＡＥＭ７２５
２０、ＡＥＭ７２５２１）、グリシン・マックス（Glycine max）（例えば、ＧｅｎＢａ
ｎｋ受託ＡＢＤ９１７２６）、ガルシニア・マンゴスターナ（Garcinia mangostana）（
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ５１５２５）、ワタ（Gossypium hirsutum）（例えば
、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＤ０１９８２）、ヘリアンサス・アヌス（Helianthus annuus
）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＱ０８２２６）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha c
urcas）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＵ９６７４４）、マカダミア・テトラフィラ
（Macadamia tetraphylla）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＤＡ７９５２４）、アメリ
カアブラヤシ（Elaeis oleifera）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＭ０９５２４）、
ギニアアブラヤシ（Elaeis guineensis）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＤ４２２２
０）、イネ（Oryza sativa）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＢＡＡ８３５８２）、ポプラ
（Populus tomentosa）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＢＣ４７３１１）、カリホルニ
アベイ（Umbellularia californica）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＣ４９００１）
、アメリカニレ（Ulmus Americana）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ７１７３１）
およびトウモロコシ（Zea mays）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＣＧ４１２９１）など
の種に由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子またはすべて、その
全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４５５，１６７号、同５，６
５４，４９５号および同５，４５５，１６７号に、また米国特許出願公開第２００９／０
２９８１４３号および同２０１１／００２０８８３号に開示される任意のものを含み得る
。コケ類（コケ植物門（Bryophyta））、例えば、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella pa
tens）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＸＰ００１７７０１０８）などに由来するアシル−
ＡＣＰチオエステラーゼもさらに含まれる。前記の例は、使用され得るアシル−ＡＣＰチ
オエステラーゼ遺伝子の種類または特定の例に関して制限ではない。
【0104】
原核生物由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子がさらに含まれる。本明細書において提供される方法および培養物において有用な微生物によって発現され得る原核生物
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの例示的な例として、それだけには限らないが、デスル
ホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）（例えば、Ｑ３１２Ｌ
１）、エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）（例えば、ＡＣＣ９
８７０５）、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノフォルマンス（Carboxydothermus hydro
genoformans）（例えば、ＹＰ＿３５９６７０）、クロストリジウム・サーモセラム（Clo
stridium thermocellum）（例えば、ＹＰ＿００１０３９４６１）、ムーレラ・サーモア
セチカ（Moorella thermoacetica）（例えば、ＹＰ＿４３１０３６）、ゲオバクター・メ
タリレデューセンス（Geobacter metallireducens）（例えば、ＹＰ＿３８４６８８）、
サリニバクター・ルバー（Salinibacter ruber）（例えば、ＹＰ＿４４４２１０）、マイ
クロシーラ・マリナ（Microscilla marina）（例えば、ＥＡＹ２８４６４）、パラバクテ
ロイデス・ディスタソニス（Parabacteroides distasonis）（例えば、ＹＰ＿００１３０
３４２３）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（例えば、ＺＰ
＿０３９４９３９１）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（
例えば、ＹＰ＿００３０６２１７０）、ロイコノストック・メセントロイデス（Leuconos
toc mesenteroides）（例えば、ＹＰ＿８１７７８３）、オエノコッカス・オエニ（Oenoc
occus oeni）（例えば、ＺＰ＿０１５４４０６９）、マイコバクテリア・スメグマティス
（Mycobacterium smegmatis）（例えば、ABK74560）、マイコバクテリア・バンバーレニ
ー（Mycobacterium vanbaalenii）（例えば、ＡＢＭ１１６３８）、ロドコッカス・エリ
スロポリス（Rhodococcus erythropolis）（例えば、ＺＰ＿０４３８５５０７）、ロドコ
ッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）（例えば、ＹＰ＿００２７７８８２５）に由来
するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼまたは参照によりその全文が本明細書に組み込まれ
る２０１１年１２月３日に出願された、「Prokaryotic Acyl-ACP Thioesterases for Pro
ducing Fatty Acids in Genetically Engineered Microorganisms」と題された同時係属
中の本発明の譲受人に譲渡された特許出願番号第１３／３２４，６２３号中に開示される
もののいずれかが挙げられる。
【0105】
さらなる例では、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードする遺伝子は、脱水素酵素をコードする外因性核酸分子を含む宿主微生物中に導入され得る。遊離脂肪酸または脂肪
酸誘導体の製造のために微生物中に形質転換されるアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ遺伝
子は、植物、動物または微生物供給源に由来するものであり得る。例えば、大腸菌（E. c
oli）のＴｅｓＡまたはＴｅｓＢチオエステラーゼまたはその変異体、例えば、その全文
が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０７５４８３中に開示されるような
変異体に制限されないものなどのアシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードする遺伝子が
、微生物中に導入され得る。また、タンパク質ファミリーのＰｆａｍデータベースに対し
てクエリーされると、ビットスコアがギャザリングカットオフ（２０．７）以上である場
合にＰｆａｍ ＰＦ０２５５１（アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ）のメンバーとして同
定されるタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
【0106】
あるいは、またはさらに微生物は、外因性ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、例えば、外因性４−ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼまたは４−クロロベンゾエート
チオエステラーゼをコードする１種または複数の遺伝子を含み得る。遊離脂肪酸を製造す
るために微生物において有用であり得るヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼをコード
する遺伝子として、例えば、２０１１年１２月１３日に出願され、参照によりその全文が
本明細書に組み込まれる、「Genetically Engineered Microorganisms Comprising 4-Hyd
roxybenzoyl-CoA Tioesterases and Methods of Using Same for Producing Free Fatty
Acids and Fatty Acid Derivatives」と題された同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡さ
れた特許出願第１３／３２４，６０７号中に開示されるもの、バチルス属（Bacillus）種
およびゲオバチルス属（Geobacillus）種に由来する４−ヒドロキシベンゾイルチオエス
テラーゼならびにアシディフィラム属（Acidiphilium）、バルトネラ属（Bartonella）、
ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、マグネトスピリルム属（Magnetospirillum
）、バークホルデリア属（Burkholderia）、グラヌリバクター属（Granulibacter）、リ
ゾビウム属（Rhizobium）およびラブレンジア属（Labrenzia）の種などの４−ヒドロキシ
ベンゾイルチオエステラーゼまたはその組合せを挙げることができる。
【0107】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、通常、複数の異なるアシル鎖長を有するアシル−ＡＣＰ基質に対してある程度活性であり得る（例えば、基質選択を有する）が、特定のア
シル鎖長を有する１種または複数のアシル−ＡＣＰ基質に対して、その他の鎖長の基質よ
りも高い活性を有し得る。例えば、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４個の炭素のアシル鎖長を有する１種
または複数のアシル−ＡＣＰ基質に対して基質選択を有し得る。さらに、またはあるいは
、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、１種または複数の、８から１８個の炭素、例えば
、１２から１６個の炭素のアシル鎖長を有するアシル−ＡＣＰ基質を加水分解し得る。
【0108】
脂質分解活性を有するポリペプチド本発明の組換え微生物または宿主細胞は、あるいは、またはチオエステラーゼをコード
する非天然遺伝子に加えて、脂質分解活性を有する１種または複数のポリペプチドをコー
ドする１種または複数の非天然遺伝子を含み得、脂質分解活性を有するポリペプチドは、
膜脂質または貯蔵脂質、例えば、リン脂質、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロ
ール、モノアシルグリセロールなどまたはその組合せから遊離脂肪酸を製造できる。脂質
分解活性を有するポリペプチドは、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼまたは
アミダーゼであり得る。リパーゼは、それだけには限らないが、モノ、ジおよびトリアシ
ルグリセロールならびにその組合せを含めたグリセロ脂質中のエステル結合の加水分解を
触媒して、遊離脂肪酸およびアルコール放出する酵素である。
【0109】
遊離脂肪酸の製造のために微生物において脂質分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の使用は、２０１１年１２月１３日に出願され、参照によりその全文が本明細
書に組み込まれる、「Production of Free Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by
Recombinant Microorganisms Expressing Polypeptides Having Lipolytic Activity」
と題された、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／３２４，６５３号に開示
されている。脂質分解活性を有するポリペプチドは、例えば、グリセロ脂質（モノグリセ
リド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ガラクト脂質などを含む）から脂肪酸
を遊離するリパーゼであり得るか、またはアミダーゼであり得る。例えば、組換え微生物
は、リパーゼ、それだけには限らないが、ＡＢ加水分解酵素Ｐｆａｍ一家（ＣＬ００２８
）に属するＰｆａｍのメンバーであるリパーゼなどをコードする非天然遺伝子を含み得る
。例えば、脂質分解活性を有するポリペプチドをコードする非天然遺伝子は、保存された
タンパク質ドメインＣＯＧ１０７５として同定されるＬｉｐＡドメインを含むか、または
タンパク質ファミリーＰｆａｍ ＰＦ０１６７４（リパーゼ２）中に含まれるリパーゼ；
保存されたタンパク質ドメインＣＯＧ３６７５として同定されるリパーゼ３ドメインを含
むか、またはタンパク質ファミリーＰｆａｍ ＰＦ０１７６４（リパーゼ３）中に含まれ
るリパーゼをコードする非天然核酸分子；タンパク質ファミリーＰｆａｍ ＰＦ０７８１
９（ＰＧＡＰ１）中に含まれるリパーゼをコードする非天然核酸分子；またはタンパク質
ファミリーＰｆａｍ ＰＦ０３５８３、Ｐｆａｍ ＰＦ００１５１（リパーゼ）、Ｐｆａ
ｍ ＰＦ００５６１（Ａｂ加水分解酵素１）、Ｐｆａｍ ＰＦ０２２３０（Ａｂ加水分解
酵素２）、Ｐｆａｍ ＰＦ０７８５９（Ａｂ加水分解酵素３）、Ｐｆａｍ ＰＦ０８３８
６（Ａｂ加水分解酵素４）、Ｐｆａｍ ＰＦ１２６９５（Ａｂ加水分解酵素５）、Ｐｆａ
ｍ ＰＦ１２６９７（Ａｂ加水分解酵素６）、Ｐｆａｍ ＰＦ１２７１５（Ａｂ加水分解
酵素７）、Ｐｆａｍ ＰＦ０４０８３（Ａｂヒドロリパーゼ）のいずれか中に含まれるポ
リペプチドをコードする非天然核酸分子をコードし得る。さらに、組換え微生物は、脂質
分解活性を有するアミダーゼ、例えば、それだけには限らないが、２０．１のギャザリン
グカットオフよりも高いビットスコアを有するＰｆａｍ ＰＦ０１４２５（アミダーゼ）
に入り、脂肪酸の脂質からの放出を触媒できるアミダーゼなどをコードする非天然遺伝子
を含み得る。
【0110】
さらに、またはあるいは、内因性リパーゼ遺伝子の発現を誘導または増大する遺伝子調節配列を含むように操作されている組換え微生物が考慮される。例えば、微生物は、異種
プロモーターが内因性リパーゼ遺伝子のコーディング領域の上流に挿入されるように操作
され得る。異種プロモーターは、例えば、相同組換えまたは部位指定組換えを使用して、
内因性プロモーターを置換することもあり、および／または内因性リパーゼ遺伝子の発現
を調節する内因性プロモーターの上流もしくは下流に挿入されてもよい。異種プロモータ
ーは、内因性リパーゼ遺伝子の発現を増大する構成性プロモーターまたは誘導プロモータ
ーであり得る。
【0111】
しかし、所望により、さらに、脂肪酸または脂肪酸誘導体の製造のためにチオエステラーゼをコードする外因性遺伝子を含むように操作された組換え微生物は、リゾホスファチ
ジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性遺伝子をさらに含み
得、ＬＰＡＡＴは、チオエステラーゼのアシル−ＡＣＰ基質選択とは異なるチオエステラ
ーゼアシル−ＡＣＰ基質選択を有する。あるいは、遺伝子操作されたラン藻であり得る遺
伝子操作された微生物は、外因性チオエステラーゼ遺伝子の基質選択とは異なる基質選択
を有する内因性ＬＰＡＡＴ遺伝子を過剰発現し得る。ＬＰＡＡＴ遺伝子の発現によって脂
肪酸製造を増大するようラン藻類などの微生物を操作することは、２０１２年２月２４日
に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Enhanced Production of
Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by Recombinant Microorganism」と題された
、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／４０４，７１７１号
に開示されている。
【0112】
アシル−ＣｏＡシンセターゼ本発明の微生物および方法において使用される組換え核酸分子または単離核酸分子は、
所望により、アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする核酸配列を含む場合があり、アシ
ル−ＣｏＡシンセターゼは、チオエステラーゼまたはリパーゼによって生成した遊離脂肪
酸を補酵素Ａとカップリングして、アシル−ＣｏＡを提供し得、これは、多数のレダクタ
ーゼ、ワックスシンターゼおよびアシルトランスフェラーゼの基質であり、アシルトラン
スフェラーゼは、アシル−ＣｏＡ基質を使用して、アルデヒド、アルコール、ワックスエ
ステルおよびグリセロ脂質を生成し得る。アシル−ＣｏＡシンセターゼは、例えば、大腸
菌（E. coli）（ＮＰ＿４１６２１６）のＦａｄＤ（ＮＰ＿４１６３１９）もしくはＦａ
ｄＫまたは限定されない例として、ビブリオ・スプレンディダス（Vibrio splendidus）
（ＥＧＵ４４２３０）もしくはマリノバクター・アドヘレンス（Marinobacter adhaerens
）ＨＰ１５（ＡＤＰ９６８０３）のアシル−ＣｏＡシンセターゼを含めたその他の細菌種
における相同体などの原核生物アシル−ＣｏＡシンセターゼであり得る。アシル−ＣｏＡ
シンセターゼ活性を有するとわかっているか、有すると疑われる原核生物タンパク質のさ
らなる限定されない例として、それだけには限らないが、アシネトバクター属（Acinetob
acter）種ＡＤＰ１ ｆａｄＤ（ＹＰ＿０４５０２４）、ヘモフィルス・インフルエンザ
エ（Haemophilus influenza）ＲｄＫＷ２０ ｆａｄＤ（ＮＰ＿４３８５５１）、バチル
ス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）Ｃ−１２５ ＢＨ３１０３ （ＮＰ＿２４
３９６９）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ｙｈＦｌ（ＮＰ＿３８８９
０８）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆｏ−１ Ｐ
ｆｌ−４３５４（ＹＰ＿３５００８２）、コマモナス・テストステローニ（Comamonas te
stosteroni）ＫＦ−１ ＥＡＶ１５０２３（ＺＰ＿０１５２００７２）、シュードモナス
・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ｆａｄＤ１（ＮＰ＿２５１９８９）、シュー
ドモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１ ｆａｄＤ２ （ＮＰ＿２
５１９９０）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）ＣＦＮ４２ ｆａｄＤ（ＹＰ＿４
６８０２６）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomo nas palustris）Ｂ
ｉｓ Ｂ１８ ＲＰＣ＿４０７４（ＹＰ＿５３３９１９）、ラルストニア・ソラナセラム
（Rasltonia Solanacearum）ＧＭ１ １０００ ｆａｄＤ１（ＮＰ＿５２０９７８）、結
核菌（Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖ ｆａｄＤＤ３５（ＮＰ＿２１７０２１
）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖ ｆａｄＤＤ２２（ＮＰ＿２１７
４６４）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomon as Maltophilia
）Ｒ５５１−３ ＰＲＫ００５９（ＺＰ＿０１６４４８５７）が挙げられる。
【0113】
さらなる例では、アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする核酸配列は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例
えば、中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡシンセターゼＦａａ２ｐ（ＮＰ＿０１０９３１）または
ＳＣＲＧ＿０４４８３アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＥＤＶ０８８４３）またはヤロウイ
ア属（Yarrowia）脂質分解アシル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、ＣＡＧ７７８９２）な
どの真菌種から誘導されたアシル−ＣｏＡシンセターゼをコードし得る。本明細書におい
て開示される構築物および微生物において使用され得るさらなるアシル−ＣｏＡシンセタ
ーゼ遺伝子として、植物のアシル−ＣｏＡシンセターゼ、例えば、セイヨウアブラナ（Br
assica napus）（ＣＡＣ１９８７７）の長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはシロイヌ
ナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＥＥ７４３２４）の長鎖アシル−ＣｏＡシンセター
ゼまたはグリシン・マックス（Glycine max）（ＸＰ＿００３５２４９２０）のＹｎｇ−
Ｉ様アシル−ＣｏＡシンセターゼおよび藻類種のアシル−ＣｏＡシンセターゼ、例えば、
コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）（ＸＰ＿００１６９３６９２）の長鎖ア
シル−ＣｏＡシンセターゼまたはナノクロロプシス・オクラータ（Nannochloropsis ocul
ata）（例えば、ＡＤＰ０９３９１）またはクロレラ・バリアビリス（Chlorella variabi
lis）（例えば、ＥＦＮ５６５８８）のアシル−ＣｏＡシンセターゼなどが挙げられる。
昆虫（例えば、ミツバチ（Apis mellifera）例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼファミ
リーメンバー２、ミトコンドリア前駆体、ＮＰ＿００１１９３９０２）およびハツカネズ
ミ（Mus musculus）などの哺乳動物（例えば、「ＭＡＣＳ」アシル−ＣｏＡシンセターゼ
、ＥＤＬ１７１７４）を含めた動物種のアシル−ＣｏＡシンセターゼがさらに考慮される
。
【0114】
あるいは、本明細書において提供されるような組換え微生物は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、チオエステラーゼおよび／またはリパーゼをコードする外因性または過剰発現さ
れる遺伝子を含まない場合もある。例えば、本明細書において提供されるような組換え微
生物は、アシル−ＣｏＡ基質を利用することなく、または生成することなく１種または複
数の脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケンまたはワックスエステルを製
造し得る。例えば、非アシル−ＣｏＡ基質を使用して脂肪アルコールおよびワックスエス
テルを製造する方法は、２０１２年９月２７日に出願され、参照によりその全文が本明細
書に組み込まれる、「Production and Secretion of Fatty Acids and Fattty Acid Deri
vatives」と題された同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／
８６０，４１７号に、また２０１２年３月６日に出願され、同様に参照によりその全文が
本明細書に組み込まれる、「Acyl-ACP Wax Ester Synthases」と題された、同時係属中の
、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／４１３，４２６号に提供されている
。
【0115】
アルデヒド生成性レダクターゼ所望により、脂肪アルコール、ワックスエステルまたはアルカンなどの生成物にさらに
変換され得る脂肪アルデヒドの製造のために、本明細書において提供されるようなトラン
スジェニック微生物は、例えば、アルデヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アルデ
ヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼまたはカルボン酸レダクターゼなどのアルデヒド
形成性レダクターゼをコードする外因性遺伝子を含み得る。脂肪アルデヒドを生成する既
知アシル−ＣｏＡレダクターゼと相同であるタンパク質をコードすると予測されるＧｅｎ
Ｂａｎｋおよびその他の遺伝子データベースに列挙される遺伝子または遺伝子の一部は、
本明細書において「アルデヒド生成性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ」と呼ばれ、そ
れから製造される特定の脂肪アルデヒドまたは脂肪アルコールの製造について調べるため
に種々の微生物中に導入され得る。脂肪アルデヒド生成性アシル−ＣｏＡレダクターゼの
限定されない例として、アシネトバクター・ベイリー（Acinetobacter baylyi）（ＡＡＣ
４５２１７．１）のＡｃｒ１遺伝子、アシネトバクター属（Acinetobacter）種Ｍ−１の
ＡｃｒＭ−１遺伝子（ＹＰ００１０８６２１７）ならびに種々のフォトルミネッセンス細
菌、例えば、アルテルモナス属（Altermonas）、フォトバクテリウム属（Photobacterium
）、シュワネラ属（Shewanella）、ビブリオ属（Vibrio）またはゼノラブダス属（Xenorh
abdus）の種のｌｕｘＣおよびｌｕｘＥ遺伝子が挙げられる。例えば、配列相同性または
タンパク質ドメインによって同定されるこれらのおよびその他の遺伝子によってコードさ
れる酵素は、当技術分野で公知のアッセイを使用してその基質および生成物を調べるため
に試験され得る。
【0116】
いくつかの例では、宿主細胞は、それだけには限らないが、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０２２１７９８（ＷＯ２００９／１４０６９６）に開
示されるもののいずれかなどのアルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼをコードす
る非天然遺伝子を含み得る。例えば、組換え宿主細胞は、例えば、ＷＯ２００９／１４０
６９６またはＷＯ２０１１／０６６１３７に開示されるようなアルデヒド形成性レダクタ
ーゼ、例えば、受託番号ＡＡＭ８２６４７；ＡＡＭ８２６４７；ＢＡＤ７８２４１；ＡＢ
Ａ２２１４９；ＢＡＢ７６９８３；ＺＰ＿０３７６３６７４；ＡＣＬ４２７９１；ＺＰ＿
０１６２８０９５；ＺＰ＿０１６１９５７４；ＹＰ＿００１８６５３２４；ＹＰ＿７２１
９７８；ＮＰ＿６８２１０２；ＹＰ＿００１５１８３４１；ＹＰ＿００２３７１１０６；
ＺＰ＿０５０２７１３６；ＺＰ＿０３２７３５５４；ＮＰ＿４４２１４６；ＺＰ＿０１７
２８６２０；ＺＰ＿０５０３９１３５；ＹＰ＿００１８０２８４６；ＮＰ＿９２６０９１
；ＹＰ＿００１６６０３２２；ＺＰ＿００５１６９２０；ＣＡＯ９０７８１；ＺＰ＿０１
０８５３３７；ＹＰ＿００１２２７８４１；ＡＢＤ９６３２７；ＮＰ＿８９７８２８；Ｙ
Ｐ＿００１２２４３７８；ＡＢＤ９６４８０；ＺＰ＿０１１２３２１５；ＡＢＢ９２２４
９；ＺＰ＿０１０７９７７３；ＹＰ＿３７７６３６；ＮＰ＿８７４９２６；ＮＰ＿８９５
０５８；ＡＢＤ９６２７４；ＡＢＤ９６４４２；ＺＰ＿０１４６９４６９；ＺＰ＿０５０
４５０５２；ＹＰ＿００１０１４４１６；ＹＰ＿００１０１０９１３；ＹＰ＿３８１０５
６；ＹＰ＿００１５５０４２１；ＮＰ＿８９２６５１；ＹＰ＿００１０９０７８３；ＺＰ
＿０１４７２５９５；ＹＰ＿２９３０５５；ＺＰ＿０５１３８２４３；ＹＰ＿７３１１９
２；ＹＰ＿００１４８３８１５；ＹＰ＿００１００８９８２；ＹＰ＿４７３８９６；ＹＰ
＿４７８６３８；またはＹＰ＿３９７０３０を有するレダクターゼのいずれかなどに対し
て、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するアル
デヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼを含み得る。いくつかの例では、組換え宿主細
胞は、アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼをコードする外因性遺伝子を含み、
ここで、アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼは、ラン藻の種に由来するもので
あり得、宿主微生物と同一種に由来しても、異なる種に由来してもよい。あるいは、ラン
藻宿主は、内因性アシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子を過剰発現するように操作され得る
。
【0117】
本発明において使用され得るカルボン酸レダクターゼをコードする遺伝子の限定されない例として、ノカルジア（Nocardia）属ＣＡＲ遺伝子（ＡＹ４９５６９７）およびその相
同体が挙げられ、その一部は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１
０／０１０５９６３に開示されている。
【0118】
アルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼ脂肪アルコール（所望により、ワックスエステルシンターゼによって基質として使用さ
れ得る）の製造のために、本明細書において提供されるような核酸分子は、脂肪アルコー
ル形成性アシルレダクターゼまたはアシル−ＣｏＡを脂肪アルコールに還元し得る「ＦＡ
Ｒ」をコードする配列をさらに有し得る（can further）。ＦＡＲは、例えば、ユーグレ
ナ属（Euglena）（例えば、Teerawanichpanら、Lipids 45:263〜273頁(2010年)を参照の
こと）、アラビドプシス属（Arabidopsis）（例えば、Rowlandら、Plant Physiol. 142:8
66〜877頁(2006年)、Doanら、J. Plant Physiol. 166:787〜796頁(2009年)およびDomergu
eら、Plant Physiol. 153:1539〜1554頁(2010年)を参照のこと）、ヨモギ属（Artemisia
）（例えば、Maesら、New Phytol. 189:176〜189頁(2011年)を参照のこと）、ホホバ（例
えば、Metzら、Plant Physiol. 122:635〜644頁(2000年)を参照のこと）、ガ（例えば、L
ienardら、Proc. Natl. Acad. Sci. 107:10955〜10960頁(2010年)を参照のこと）、ミツ
バチ（例えば、Teerawanichpanら、Insect Biochemistry and Molecular Biology 40:641
〜649頁(2010年)を参照のこと）および哺乳動物（例えば、Honshoら、J. Biol. Chem. 28
5:8537〜8542頁(2010年)を参照のこと）において同定されている。本発明の微生物および
方法において有用なアルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼは、宿主微生物において
活性を有する任意のアルコール形成性レダクターゼであり得る。
【0119】
使用され得るその他のアルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼの限定されない例として、それだけには限らないが、カイコ（Bombyx mori）由来のｂｆａｒ（ＢＡＣ７９４
２６）、ホホバ（Simmondsia chinensis）由来のｊｊｆａｒ（ＡＡＤ３８０３９）、コム
ギ（Triticum aestivum）由来のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＡＤ３０６９４または
ＣＡＤ３０６９２）、ハツカネズミ（Mus musculus）由来のｍｆａｒｌ（ＮＰ＿０８１６
５５）、ハツカネズミ（Mus musculus）由来のｍｆａｒ２（ＮＰ＿８４８９１２）、ヒト
（H. sapiens）由来のｈｆａｒ（ＮＰ＿１１５６０４）、アズキノメイガ（Ostrinia sca
pulalis）由来のＦＡＲＸＩＩＩ（ＡＣＪ０６５２０）、トウモロコシ（Z. mays）由来の
ＭＳ２（ＮＰ＿００１１５１３８８またはＥＵ９７０８６５）またはシロイヌナズナ（Ar
abidopsis thaliana）由来のＭＳ２（ＮＰ＿１８７８０５）、ＦＡＲ４（ＮＰ＿００１０
３０８０９またはＮＰ＿１９００４０）、ＦＡＲ６（６７６３３７０３）、ＣＥＲ４（Ｎ
Ｐ＿５６７９３６）またはＡｔｈ（ＮＰ５６７９３６）、サクラスガ（Yponomeuta evony
mellus）由来のＹｅｖ−ｐｇＦＡＲ（ＧＱ９０７２３１−ＧＱ９０７２３３）、イポノメ
ウタ・ロレルス（Yponomeuta rorellus）由来のＹｒｏ−ｐｇＦＡＲ（ＧＱ９０７２３４
）、イポノメウタ・パデルス（Yponomeuta padellus）由来のＹｐａ−ｐｇＦＡＲ（ＧＱ
９０７２３５）、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）由来のＯｎｕＥ（ＦＪ８０７７３
５）、ヒト（Homo sapiens）由来のＨａｓ（ＡＡＴ４２１２９）などが挙げられる。
【0120】
本発明の微生物および方法において有用なアルコール形成性脂肪酸アシルレダクターゼはまた、またはあるいは、マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）
ＶＴ８ Ｍａｑｕ＿２２２０（ＹＰ＿９５９４８６）、マリノバクター・アルジコラ（Ma
rinobacter algicola）ＤＧ８９３（ΖΡ＿０１８９２４５７）；ハヘラ・ケジュエンシ
ス（Hahella chejuensis）ＫＣＴＣ ２３９６ ＨＣＨ＿０５０７５（ＹＰ＿４３６１８
３）；オセアノバクター属（Oceanobacter）種ＲＥＤ６５（ＺＰ＿０１３０５６２９）ま
たはマリノバクター・アクアエオリ（Marinobacter aquaeoli）ＶＴ８ ２２２０ Ｍａ
ｑｕ＿２５０７遺伝子（ＡＢＭ１９５８２）などの原核生物アルコール形成性アシル−Ｃ
ｏＡレダクターゼであり得る。
【0121】
基質としてアシル−ＡＣＰを使用できるアルコール形成性レダクターゼ（外因性および／または内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子を欠く組換え微生物における脂肪アル
コールおよびワックスエステルの製造のために使用され得る）は、２０１２年９月２７日
に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Production and Secreti
on of Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives」と題された、本発明の譲受人に譲渡さ
れた同時係属中の米国特許出願第１３／８６０，４１７号に、また２０１２年３月６日に
出願され、同様に参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、「Acyl-ACP Wax Ester
Synthases」と題された、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１
３／４１３，４２６号に開示される。
【0122】
ワックスエステルシンターゼワックスエステルは、ワックスエステルシンターゼによって触媒される、脂肪酸アシル
−チオエステル基質および脂肪アルコール間の縮合反応の生成物である。ワックスエステ
ルシンターゼ活性を有するポリペプチドは、ワックスシンターゼ、膜結合Ｏ−アシルトラ
ンスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）、ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（
例えば、ＥＣ２．３．１．２０）、アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ、ＥＣ
２．３．１．８４）、長鎖アルコールＯ−脂肪アシルトランスフェラーゼ（例えば、２
．３．１．７５）またはアルコールシンターゼ／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロール
アシルトランスフェラーゼを含めたＯ−アシルトランスフェラーゼとして同定されるポリ
ペプチドであり得る。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）とし
て同定されるいくつかのポリペプチドは、ワックスエステルシンターゼ活性を有するとわ
かり得る。ワックスエステルシンターゼは、例えば、アシネトバクター属（Acinetobacte
r）（Ishigeら、Appl. Environ. Microbiol. 68:1192〜1195頁(2002年)；Kalscheuerおよ
びSteinbuchel、J. Biol. Chem. 278:8075〜8082頁(2003年)；Kalscheuerら、Appl. Envi
ron. Microbiol. 72:1373〜1379頁(2006年)）、マリノバクター属（Marinobacter）（Hol
tzappleおよびSchmidt-Dannert、J. Bacteriol. 189:3804〜3812頁(2007年)）、アラビド
プシス属（Arabidopsis）（Liら、Plant Physiol. 148:97-107(2008年)）、ペチュニア（
Kingら、Planta 226:381〜394頁(2007年)）、ホホバ（Lardizabalら、Plant Physiol.122
:645〜655頁(2000年)）および哺乳動物種（ChengおよびRussell、J. Biol. Chem. 279:37
798〜37807頁(2004年)；Yenら、J. Lipid Res. 46:2388〜2397頁(2005年)）において同定
されている。
【0123】
ワックスエステルシンターゼは、構造ドメインまたは既知ワックスエステルシンターゼ／ＤＧＡＴ配列に対する配列類似性に基づいて、当技術分野で公知の方法を使用して同定
され得る。限定されない例として、２０．６のギャザリングカットオフよりも高いビット
スコアおよび０．０１以下のＥ値を有するＰｆａｍ ＰＦ０３００７（ワックスエステル
シンターゼ様アシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼドメイン）に入る、または２５．
０のギャザリングカットオフより高いビットスコアおよび０．０１以下のＥ値を有するＰ
ｆａｍ ＰＦ１３８１３（「ＭＢＯＡＴ＿２」）に入るポリペプチドをコードする遺伝子
が、本明細書において提供される核酸分子および微生物において使用するために選択され
得る。
【0124】
本明細書において提供される核酸分子によってコードされるワックスエステル合成タンパク質として、それだけには限らないが、ホホバ（Simmondsia chinensis）、アシネトバ
クター属（Acinetobacter）種の株ＡＤＰ１（以前は、アシネトバクター・カルコアセチ
クス（Acinetobacter calcoaceticus）ＡＤＰ１）、シュードモナス・エルギノーサ（Pse
udomonas aeruginosa）、ファンジバクター（アルカニボラックス）・ジャデンシス（Fun
dibacter （Alcanivorax） jadensis）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）また
はアルカリゲネス・ユートロフス（Alkaligenes eutrophus）由来の多酵素複合体から選
択されるアシルトランスフェラーゼまたはワックスシンターゼ、脂肪酸アシルトランスフ
ェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ｃｏＡワックスア
ルコールアシルトランスフェラーゼおよび二機能性ワックスエステルシンターゼ／アシル
１−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを挙げることができる。ワ
ックスシンターゼはまた、アルカリゲネス・ユートロフス（Alkaligenes eutrophus）な
らびにワックスおよび脂肪酸エステルを製造すると文献においてわかっているその他の生
物に由来する多酵素複合体に由来し得る。
【0125】
本明細書において提供される核酸分子およびトランスジェニック微生物において使用するために考慮されるワックスエステルシンターゼ活性を有するとわかっているか、有する
と疑われるタンパク質として、それだけには限らないが、マリノバクター・ヒドロカルボ
ノクラスチクス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）ＷＳ １（ＡＢＯ２１０２０）
、マリノバクター・ヒドロカルボノクラスチクス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus
）ＤＳＭ ８７９８ ＷＳ２（ＡＢＯ２１０２１）、Ｍ．種ＥＬＢ １７（ＧｅｎＢａｎ
ｋ受託ＥＢＡ００３８８）、Ｍ．アクアエオレイ（aquaeolei）Ｍａｑｕ＿０１６８ Ｗ
Ｓ（ＹＰ＿９５７４６２）、Ｍ．アドヘレンス（adhaerens）ＨＰ１５ ＷＳ（ＡＤＰ９
９６３９）、ハヘラ・ケジュエンシス（Hahella chejuensis）ＫＣＴＣ ２３９６（ＹＰ
＿４３２５１２）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）ワック
スエステルシンターゼ（ＥＧＪ６３４０８）、Ａ．カルコアセチクス（calcoaceticus）
ＷＳ／ＤＧＡＴ（ＺＰ＿０６０５８９８５）アシネトバクター・ベイリー（Acinetobacte
r baylyi）ＡＤＰ１ワックスエステルシンターゼ（ＡＡＯ１７３９１またはＱ８ＧＧＧ１
）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０（
ＮＰ＿７６９５２０）、エリスロバクター・リトラリス（Erythrobacter litoralis）Ｈ
ＴＣＣ ２５９４（ＹＰ＿４５７３８９）、ロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opac
us）ワックスエステルシンターゼ（ＢＡＨ５３７０２）、結核菌（Mycobacterium tuberc
ulosis）ワックスエステルシンターゼ（ＮＰ＿３３４６３８）、スメグマ菌（M. smegmat
is）ワックスエステルシンターゼ（ＡＢＫ７４２７３）、アルカニボラックス属（Alcani
vorax）の種の「ＷＳ／ＤＧＡＴ／ＭＧＡＴ」サブファミリータンパク質（ＣＡＬ１７２
５２、ＥＤＸ９０９６０、ＥＤＸ８９０５２、ＺＰ＿０５０４３５３９、ＺＰ＿０５０４
１６３１）、ノカルジア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ １０１５２由来
のｗｓａｄｐｌ（ＹＰ＿１１７３７５）、フォトバクテリウム・プロフンダム（Photobac
terium profundum）ＳＳ９（ＹＰ＿１３０４１３）、ロドフェラックス・フェリレデュセ
ンス（Rhodoferax ferrireducens）ＤＳＭ１５２３６（ＺＰ＿００６９１７０４）および
サリニバクター・ルバー（Salinibacter ruber）ＤＳＭ１３８５５（ＹＰ＿４４６６０３
）などの原核生物種に由来するワックスシンターゼが挙げられる。
【0126】
ワックスシンターゼとして有用であり得る真核生物ポリペプチドの例として、制限するものではないが、ホホバワックスエステルシンターゼＪｊＷＳ（ＡＦ１４９９１９）、ユ
ーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）ワックスエステルシンターゼ（ＡＤＩ６００
５８）、シロイヌナズナ（Arabidiopsis thaliana）ＷＳＤ１ Ｏ−アシルトランスフェ
ラーゼ（ＮＰ＿５６８５４７）、シロイヌナズナ（Arabidiopsis thaliana）ＧＰＡＴア
シルトランスフェラーゼ（ＮＰ＿１７４４９９）、シロイヌナズナ（Arabidiopsis thali
ana）の推定長鎖アルコールＯ−脂肪アシルトランスフェラーゼ４（ＮＰ＿２００３４６
）ナンヨウザンショウ（Murraya koenigii）ワックスエステルシンターゼ、ヒト（H. sap
iens）由来のアシル−ＣｏＡワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ２（ＮＰ＿０
０１００２２５４）、ハツカネズミ（Mus musculus）由来のｍＷＳ（Ｑ６Ｅ１Ｍ８）、フ
ラガリア・キサナナス（Fragaria xananas）由来のＳＡＡＴ（ＡＡＧ１３１３０）、トウ
モロコシ（Zea mays）の膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）（ＮＰ＿０
０１１３１１７９）、リンゴ（Malus x domestica）由来のｍｄＡＡＴ２（ＡＡＳ７９７
９７）ならびに昆虫ワックスエステルシンターゼなどが挙げられる。
【0127】
基質としてアシル−ＡＣＰを使用でき、例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼまたはチオエステラーゼをコードする外因性または内因性遺伝子のいずれかまたは両方を欠く組換
え微生物におけるワックスエステルの製造のために使用され得るワックスエステルシンタ
ーゼとして、２０１２年３月６日に出願され、同様に参照によりその全文が本明細書に組
み込まれる、「Acyl-ACP Wax Ester Synthases」と題された、本発明の譲受人に譲渡され
た、同時係属中の米国特許第１３／４１３，４２６号に開示されるものが挙げられる。基
質としてアシル−ＡＣＰを使用できるワックスエステルシンターゼはまた、ＤＧＡＴ活性
を有し得、それだけには限らないが、アシル−ＣｏＡを欠くラン藻類および／またはアシ
ル−ＣｏＡシンセターゼもしくはチオエステラーゼをコードする外因性もしくは内因性遺
伝子のいずれかもしくは両方を欠く微生物などの組換え微生物におけるトリグリセリドの
製造において有用であり得る。
【0128】
あるいは、または上記の非天然遺伝子のいずれかに加えて、本発明の組換え微生物は、外因性脂肪酸デカルボキシラーゼまたは外因性脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコード
する少なくとも１種の核酸分子、さらに、所望により、外因性アシル−ＣｏＡレダクター
ゼ、カルボン酸レダクターゼまたはアシル−ＡＣＰレダクターゼをコードする少なくとも
１種の外因性核酸分子を含み得、アルカンおよび／またはアルケンを製造し得る。例えば
、本明細書において提供されるような組換え微生物は、例えば、シロイヌナズナ（Arabid
opsis thaliana）のＣＥＲ１（ＮＰ＿１７１７２３）もしくは別の種のオーソログもしく
はその誘導体などのデカルボニラーゼまたは全文が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１
０１２４０７１（ＷＯ２０１１／０６２９８７）に開示されるデカルボニラーゼのいずれ
かをコードする外因性核酸分子を含み得、これは、本明細書において上記に開示されるい
ずれかなどのアルデヒド形成性アシルレダクターゼをコードする非天然遺伝子とともに発
現され得る。あるいは、本明細書において提供されるような組換え微生物は、それだけに
は限らないが、両方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１００
２３５９３４またはＵＳ８，１１０，０９３に開示されるいずれかなどのオレフィン（ア
ルケン）の製造のための遺伝子をコードする非天然遺伝子を含み得る。本発明の組換え微
生物または宿主細胞によって製造されるアルカンおよびアルケンは、例えば、例えば、７
、９、１１、１３、１５および／または１７個の炭素の鎖長または７、９、１１、１３お
よび／または１５個の炭素の鎖長または１１、１３および／または１５個の炭素の鎖長を
含めた７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３個の炭素の鎖長
を有し得る。
【0129】
トリグリセリド（ＴＡＧ）の製造のために微生物を操作するために、１種または複数のグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（本明細書において以下、「ＧＰＡ
Ｔ」とも呼ばれる；ＥＣ ２．３．１．１５）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフ
ェラーゼまたは「ＬＰＡＡＴ」、ＥＣ ２．３．１．５１、ホスファチジン酸ホスファタ
ーゼ（ＰＡＰ、３−ｓｎ−ホスファチジン酸ホスホ加水分解酵素）またはジアシルグリセ
ロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ、Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０）をコードする
非天然遺伝子を、微生物中に導入してもよい。遺伝子は、原核生物または真核生物の任意
供給源に由来し得る。これらのクラスの酵素のすべてに属する遺伝子は、当技術分野で公
知であり、これらの活性を有する遺伝子への言及は、例えば、米国特許出願公開２００７
／０１８４５３８、ＵＳ２０１０／０１５９１１０および２０１００２５５５５１に、ま
た、２０１２年２月２４日に出願され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、
「Enhanced Production of Fatty Acids and Fatty Acid Derivatives by Recombinant M
icroorganism」と題された、本発明の譲受人に譲渡された、同時係属中の米国特許出願第
１３／４０４，７１７１号に見出すことができる。
【0130】
あるいは、または上記の修飾のいずれかに加えて、本発明の組換え微生物は、所望により、脂肪酸製造に影響を及ぼす酵素をコードする外因性または組換え核酸分子を含み得る
。例えば、本明細書において提供されるような組換え微生物は、それだけには限らないが
、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼまた
はβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを含めた脂肪酸の合成に関与しているポリペプチド
をコードする１種または複数の外因性核酸分子を含み得るか、または脂肪酸または脂質製
造のためのポリペプチドをコードする内因性遺伝子を過剰発現するように操作され得る。
【0131】
なおさらに、組換え宿主細胞は、所望により、１種または複数の脂肪酸生成物の分泌を促進するために、外因性膜貫通輸送体を発現するように操作され得る。例えば、組換え宿
主細胞は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体またはＲＮＤポンプをコードする非天然
遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、輸送体は、アラビドプシス（Arabidopsis
）遺伝子ＣＥＲ５、ＷＢＣ１１、ＡｔＭＲＰＳ、ＡｍｉＳ２およびＡｔＰＧＰ１またはサ
ッカロミセス属（Saccharomyces）、ドロソフィラ属（Drosophila）、マイコバクテリア
の種もしくは哺乳動物の種に由来する脂肪酸輸送体（ＦＡＴＰ）遺伝子によってコードさ
れる輸送体タンパク質と、配列で、少なくとも８０％同一である。
【0132】
上記の組換え宿主細胞は、本明細書において記載されるような脂肪酸生成物を製造する方法のいずれかにおいて使用され得る。
【0133】
ＦＦＡ製造のためのさらなる修飾組換え微生物は、例えば、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＡＣＰシンセターゼ
、アシルＣｏＡ脱水素酵素、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、アセトアルデヒドＣ
ｏＡ脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、酢酸キナーゼなど、およびその組合せをコード
する内因性核酸分子の修飾をさらに含み得る。特定の実施形態では、修飾は、内因性核酸
を下方調節し、核酸もしくはその調節エレメントの部分的な、実質的なまたは完全な欠失
、サイレンシングまたは不活化を含む。
【0134】
いくつかの例では、例えば、ラン藻であり得る宿主微生物は、脂肪酸の脂質への再利用に関与しているアシル−ＡＣＰシンセターゼをコードする内因性遺伝子の弱毒化された発
現を有し得る。内因性アシル−ＡＣＰシンセターゼ遺伝子は、例えば、プロモーターの欠
失もしくは突然変異によって下方調節され得るか、または遺伝子のタンパク質コーディン
グは、例えば、挿入突然変異誘発によって内部が欠失されるか、もしくは破壊され得る。
あるいは、全アシル−ＡＣＰシンセターゼ遺伝子は、例えば、相同組換えまたはその他の
ゲノム修飾技術によって欠失され得る。なおさらなる代替法では、それだけには限らない
が、リボザイム、アンチセンスまたはＲＮＡｉ構築物などの遺伝子ノックダウン構築物が
宿主細胞中に導入されて、内因性アシル−ＡＣＰシンセターゼ遺伝子の発現が弱毒化され
得る。
【0135】
あるいは、またはさらに、本発明の組換え微生物（例えば、組換えラン藻（cuanobacterium））は、貯蔵炭水化物および／またはポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生合
成経路酵素をコードする１種または複数の遺伝子が不活化または下方調節されるよう、お
よび／またはこのような経路で作動する酵素自体が阻害されるよう修飾され得る。例とし
て、それだけには限らないが、グルカンシンターゼおよび／または分岐酵素を含めた、グ
リコーゲン、デンプンまたはクリソラミナリン合成に関与している酵素が挙げられる。そ
の他の例として、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼおよびＰＨＡシンターゼなどのＰＨ
Ａ生合成に関与している酵素が挙げられる。
【0136】
遺伝子は、破壊、欠失、アンチセンス配列の作製、リボザイムの作製、ＲＮＡｉ、メガヌクレアーゼゲノム修飾および／またはその他の組換えアプローチによって特異的に標的
化され得る。遺伝子の不活化は、ＵＶおよび／または化学変異誘発物質に対する曝露など
のランダム突然変異技術によって、さらに、またはあるいは達成され得、得られた遺伝子
および／または酵素は、所望の活性を有する突然変異体についてスクリーニングされ得る
。タンパク質自体が適当な抗体の細胞内生成、ペプチド阻害物質の細胞内生成など、また
はそのいくつかの組合せによって阻害され得る。
【0137】
核酸分子本明細書に記載される核酸分子およびコードされるポリペプチドは、本発明の方法のい
ずれかにおいて使用され得、本発明の構築物、ベクターまたは組換え微生物のいずれかに
含まれ得る。脱水素酵素をコードする配列を含む核酸分子は、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒ
ド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカン、アルケンおよび／
またはトリグリセリドなどのグリセロ脂質を含めた脂肪酸生成物を製造するための宿主微
生物および方法において使用するために提供される。本明細書において開示されるような
核酸分子は、単離および／または精製され得る。
【0138】
本発明は、脱水素酵素をコードする核酸配列、例えば、本明細書に開示される任意のものまたはその任意の活性断片を含む単離核酸分子を提供する。例えば、本明細書において
提供されるような核酸分子は、アルデヒド脱水素酵素、２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、Ｄ
−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グリセリド−３−リン酸脱水素酵素（非リン酸化）、リ
ンゴ酸酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、グ
ルタミン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはソルビトール脱水素酵素をコード
する核酸配列を含み得る。
【0139】
本明細書に記載されるような脱水素酵素をコードする組換え核酸分子の配列の宿主微生物（脂質の合成に関与しているポリペプチドをコードする非天然遺伝子を発現する組換え
微生物など）における発現は、宿主微生物の培養物によって製造される脂肪酸生成物の、
対照微生物の培養物の製造レベルよりも高い製造レベルをもたらし得、対照微生物は、同
一条件下で培養され、対照微生物が、脱水素酵素をコードする非天然核酸配列を発現しな
い点を除いて、脱水素酵素をコードする核酸配列を発現する微生物とすべての点で実質的
に同一である。さらに、脱水素酵素をコードする、本明細書において提供されるような組
換え核酸分子または配列を含む組換え宿主微生物は、対照微生物が、脱水素酵素をコード
する非天然核酸分子または配列を含まないという点を除いて、すべての点において脱水素
酵素をコードする非天然核酸分子を含む宿主微生物と同一である対照微生物よりも、高い
繁殖および／または増殖速度を有し得る。脱水素酵素をコードする配列を含む、本明細書
において提供される組換え核酸分子を含む組換え宿主微生物は、組換え微生物が脂質を製
造している培養期間の間に、脱水素酵素をコードする非天然核酸分子を欠く対照微生物よ
りも、高い繁殖および／または増殖速度を有し得る。組換え微生物は、例えば、光合成微
生物であり得る。
【0140】
特定の例では、本明細書において提供されるような組換え核酸分子は、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のアミノ
酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも
６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくと
も９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有す
るアミノ酸配列を含む脱水素酵素をコードし得る。
【0141】
例えば、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列またはその一部に対して、例えば、配列番号２９のポリペプチドの機能的断片に対して、少なくとも少なくとも５０％、少なく
とも５５％、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８
７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列を含む単離核酸分子または組換え核酸分子を提供する。例えば、本明細
書において提供されるような核酸分子は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくと
も８５％の配列同一性を有する、または配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも
９０％の配列同一性を有する、または、例えば、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少
なくとも９５％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし得、
配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得
る。
【0142】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に対して、またはその一部に対して、例えば、ポリペプチドの機能的断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なく
とも６０％、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８
８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む脱水素酵素活性を有するポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含み得る、脱水素酵素をコードする単離核酸分子または
組換え核酸分子を提供する。例えば、脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする
核酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片に対して少なくとも８５％
の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか、または配列番号２のアミノ酸配列また
はその機能的断片に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み
得るか、または、例えば、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片に対して少な
くとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、また、配列番号２のアミノ酸
配列のすべてもしくは活性断片に対して同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含み得る。
【0143】
本発明は、本明細書に記載されるようなポリペプチドの機能的断片または変異体をコードするものなどの本発明のヌクレオチド配列の変動を包含する。種々の変異誘発物質およ
び変異誘発プロセスによって誘導されるものなどのこのような変異体は、天然に存在する
場合も、天然に存在しない場合もある。変動は、それだけには限らないが、保存的または
非保存的アミノ酸変更またはアミノ酸付加および欠失をもたらし得る、１つまたは複数の
ヌクレオチドの付加、欠失および置換を含む。所与の核酸配列は、例えば、核酸分子もし
くはその一部の化学合成、ランダムもしくは定方向突然変異を導入するＤＮＡ増幅方法、
標準化学的もしくは照射突然変異誘発および／または人工進化（選択）またはドメインス
ワッピング方法によって修飾され、修飾された配列を生成し得る。さらに、脱水素酵素Ｏ
ＲＦは、ｃＤＮＡライブラリーなどの転写物の収集物から誘導することができ、転写物の
配列は未知であり得る。加速された進化方法は、例えば、Stemmer(1994年) Nature 370、
389〜391頁およびStemmer(1994年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91、10747〜10751頁に
記載されている。突然変異は、それだけには限らないが、藻類またはラン藻類などのトラ
ンスジェニック種における野生型配列の発現を増強するためのコドン最適化（例えば、Bu
rgess-Brown(2008年)Protein Expr. Purif. 59、94〜102頁）および本発明の脱水素酵素
のアミノ酸配列を変更する部位指定突然変異誘発に起因する突然変異を含む。アミノ酸配
列におけるこのような変更は、本発明の脱水素酵素の生物活性を高め得る。例えば、本発
明の脱水素酵素タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、その生物活性を高
めて、脂肪酸、脂肪酸誘導体または脂質製造を高めるよう突然変異誘発され得る。
【0144】
例えば、本発明は、参照ポリペプチドと比較して増大した活性を有する脱水素酵素の断片および変異体を提供し、特定の実施形態では、脱水素酵素断片または変異体は、変異体
が誘導される脱水素酵素の活性と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４
００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％増大され
る活性を有し得る。特定の実施形態では、断片または変異体を発現する宿主細胞の培養物
によって製造される脂肪酸生成物の量は、断片または変異体が由来する脱水素酵素を発現
する宿主細胞の培養物によって製造される脂肪酸生成物の少なくとも５％、１０％、２０
％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、
３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１００
０％の量である。
【0145】
さらに、またはあるいは、本発明は、天然に存在する脱水素酵素アミノ酸配列の変異体、例えば、それだけには限らないが、参照配列のＮおよび／またはＣ末端で、および／ま
たは参照配列内で少なくとも１つのアミノ酸残基が付加または欠失されている、配列番号
４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２、配列番号２９
、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３または
その断片の脱水素酵素配列の変異体をコードする核酸分子を提供する。例えば、タンパク
質を葉緑体などの位置に向かわせるために、細胞標的化シグナルがタンパク質に付加され
得る。
【0146】
本発明はまた、１個または複数のアミノ酸がタンパク質から欠失している脱水素酵素の欠失突然変異体をコードする核酸分子も包含する。例えば、コードされるポリペプチドは
、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０個のアミノ酸を欠くことがあり、配列番
号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番
号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３
の対応するアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるア
ミノ酸配列を有し得る。いくつかの例では、欠失された配列は、標的化配列、例えば、葉
緑体輸送ペプチドの少なくとも一部、ミトコンドリア標的化配列の少なくとも一部、小胞
体標的化配列の少なくとも一部などを含み得る。
【0147】
置換、挿入または欠失は、変更された配列が、タンパク質と関連している生物学的機能を実質的に阻害する場合に、タンパク質に悪影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、脱
水素酵素の変異体は、変異体が誘導される脱水素酵素（例えば、配列番号４、配列番号６
、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号
１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のいずれかまたは
その他の脱水素酵素）の活性と比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、
８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％または５０％以下だけ低減された
活性を有し得る。いくつかの実施形態では、脱水素酵素変異体を発現する宿主細胞の培養
物によって製造される脂肪酸生成物の量は、変異体が誘導される脱水素酵素（例えば、例
えば、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番
号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号１１または
配列番号１３のいずれかまたはその他の脱水素酵素）を発現する宿主細胞の培養物によっ
て製造された脂肪酸生成物の量の約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、
９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％または７５％以上である。
【0148】
したがって、本発明はまた、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１
０、配列番号１１または配列番号１３のペプチド配列と少なくとも５０％、少なくとも５
５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％または８５％、例
えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少
なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも
９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、
少なくとも９９％または約１００％の配列同一性のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子；全タンパク質の少なくとも
５０個、例えば、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なく
とも１５０個またはそれ以上のアミノ酸残基の連続配列を含むその断片；このような配列
のアミノ酸配列変異体を含み、ここでは、挿入および置換を含有する開示された配列（複
数可）、開示された配列のアミノ酸配列変異体ならびに／または上記で定義されるその断
片のＮおよび／もしくはＣ末端に、および／もしくはその内部に少なくとも１個のアミノ
酸残基が挿入されている。考慮される変異体は、さらに、またはあるいは、例えば、相同
組換えまたは部位指定もしくはＰＣＲ突然変異誘発によって所定の突然変異を含有するも
のならびにそれだけには限らないが、本明細書において記載されるものを含めたその他の
種の対応するタンパク質、挿入および置換を含有するタンパク質のファミリーの対立遺伝
子もしくはその他の天然に存在する変異体ならびに／またはタンパク質が、挿入および置
換を含有する天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）
を用いて、置換、化学的、酵素的もしくはその他の適当な手段によって共有結合によって
修飾されている誘導体を含み得る。
【0149】
本発明の「核酸」または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであり得る。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、コー
ディングまたはセンス鎖であっても、非コーディングまたはアンチセンス鎖であってもよ
い。さらに、発現される核酸およびポリペプチドの化学的または酵素的変化は、標準的な
方法によって実施され得る。例えば、配列は、リン酸基、メチル基、脂質、糖、ペプチド
、有機もしくは無機化合物の付加によって、修飾されたヌクレオチドもしくはアミノ酸を
含むことなどによって修飾され得る。
【0150】
さらに、核酸は、本明細書において開示される任意の脱水素酵素またはその活性断片を、本明細書において開示されるようなポリペプチドまたはその活性断片を含む融合タンパ
ク質としてコードし得る。例えば、本発明の核酸は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）、ポリＨＮ、ポリリシン、血球凝
集素、ＨＳＶタグまたはＨＩＶ−Ｔａｔの少なくとも一部と融合している、本発明の脱水
素酵素またはその活性断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【0151】
本明細書において記載される本発明はまた、少なくとも２０の連続するヌクレオチドから少なくとも５０の連続するヌクレオチドまたはより長い長さのものである本明細書にお
いて記載されるヌクレオチド配列の一部を包含する本明細書において記載される単離核酸
分子の断片に関する。このような断片は、プローブおよびプライマーとして有用であり得
る。特に、プライマーおよびプローブは、本明細書において記載されるポリペプチドをコ
ードする核酸分子と選択的にハイブリダイズし得る。例えば、以下に記載されるように、
活性を保持するポリペプチドをコードする断片は、特に有用である。
【0152】
本発明はまた、選択的ハイブリダイゼーションなどのために、本明細書において記載されるヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載されるポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし、脱水素酵素をコードする核酸分子）と高
ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子も提供
する。ハイブリダイゼーションプローブは、塩基特異的方法で核酸の相補鎖と結合する合
成オリゴヌクレオチドを含む。適したプローブは、Nielsen(1991年)Science、254、1497
〜1500頁に記載されるようなポリペプチド核酸を含む。
【0153】
このような核酸分子は、例えば、高ストリンジェンシー条件下での特異的ハイブリダイゼーションによって検出および／または単離され得る。ハイブリダイゼーションのための
「ストリンジェンシー条件」は、インキュベーションおよび洗浄条件、例えば、特定の核
酸の第２の核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする温度およびバッファー濃度の条
件を指す技術分野の用語であり、第１の核酸は、第２に対して完全に相補的、すなわち、
１００％であり得るか、または第１および第２は、完全未満、例えば、６０％、７５％、
８５％、９５％またはそれ以上である、ある程度の相補性を共有し得る。例えば、完全に
相補的な核酸を、少ない相補性のものと区別する、特定の高ストリンジェンシー条件が使
用され得る。
【0154】
核酸ハイブリダイゼーションのための「高ストリンジェンシー条件」、「中ストリンジェンシー条件」および「低ストリンジェンシー条件」は、Current Protocols in Molecul
ar Biology(2011年) John Wiley & Sons）において説明されている。ハイブリダイゼーシ
ョンのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、洗浄バッファーのイオン強度、例え
ば、０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、温度、例えば、２３℃、４２℃、６８℃などおよ
びホルムアミドなどの不安定化剤またはＳＤＳなどの変性剤の濃度だけでなく、核酸配列
の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチパーセントおよびその他の同
一ではない配列内のその配列のサブセットの出現の頻度などの因子によっても変わる。し
たがって、高、中または低ストリンジェンシー条件は、経験的に決定され得る。
【0155】
ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーのレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルへハイブリダイゼーション条件を変更することによっ
て、所与の配列が、サンプル中の最も類似の配列とハイブリダイズすることを可能にする
条件が決定され得る。
【0156】
例示的条件は、Krause(1991年) Methods in Enzymology、200、546〜556頁に記載されている。洗浄は、条件が普通、ハイブリッドの最少レベルの相補性を決定するよう設定さ
れるステップである。一般的に、相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度から
出発して、ＳＳＣ濃度を一定に保ちながらの最終洗浄温度が低下される１℃が、ハイブリ
ダイズする配列間のミスマッチの最大程度の１％の増大を可能にする。一般的に、ＳＳＣ
の濃度を２倍にすることは、Ｔｍの増大をもたらす。これらの指針を使用して、洗浄温度
を、考えられるミスマッチのレベルに応じて、高、中または低ストリンジェンシーについ
て経験的に決定できる。例示的な高ストリンジェンシー条件として、それだけには限らな
いが、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、３７℃で１％ ＳＤＳでのハイブリダイゼ
ーションおよび６０℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。進行性に、より高ストリ
ンジェンシーの条件の例として、ハイブリダイゼーション後の、およそ室温での０．２×
ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを用いる洗浄（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃で
の０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを用いる洗浄（中ストリンジェンシー条件；お
よび約６８℃での０．１×ＳＳＣを用いる洗浄（高ストリンジェンシー条件）が挙げられ
る。洗浄は、これらの条件のうち１つのみ、例えば、高ストリンジェンシー条件を使用し
て実施され得るが、洗浄が増大するストリンジェンシーの順で２以上のストリンジェンシ
ー条件を包含してもよい。最適条件は、関与する個々のハイブリダイゼーション反応に応
じて変わり、経験的に決定され得る。
【0157】
標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブ間の同様の程度の同一性または類似性を維持しながら、当技術分野で公知であるように、例として与えられたパラメータの
うち１以上を変更することによって、同等条件が決定され得る。ハイブリダイズ可能なヌ
クレオチド配列は、例えば、本発明の核酸を含む生物を同定するための、および／または
本発明の核酸を単離するためのプローブおよびプライマーとして有用である。
【0158】
本発明の核酸分子は、所望により、脱水素酵素遺伝子に対して同種であっても、異種であってもよい、非コーディング３’および５’配列などのさらなる非コード配列（例えば
、調節配列を含む）を含み得る。あるいは、またはさらに、提供される核酸分子のいずれ
も、所望により、光合成生物に由来する少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１０
０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６０
０、７００、８００、９００、１０００または１５００ヌクレオチドのさらなる核酸配列
をさらに含み得る。本明細書において記載される核酸分子およびポリペプチドは、本発明
の方法のいずれにおいても使用され得、本発明のベクターまたは組換え微生物のいずれに
も含まれ得る。脱水素酵素をコードする配列を含む核酸分子は、遊離脂肪酸、脂肪アルデ
ヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカン、アルケン、モノ
グリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドを含めた脂肪酸生成物を製造するための
宿主微生物および方法において使用するために提供される。
【0159】
核酸構築物本発明はまた、ヌクレオチド配列の転写、翻訳または宿主ゲノムへの組込みを調節また
は媒介する１種または複数の配列をさらに含み得る脂質の製造に関与している脱水素酵素
またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む構築物を提供する。例えば、本発明は、
１種または複数の「発現制御エレメント」または作動可能に連結している遺伝子の発現転
写または転写されたＲＮＡの翻訳を調節する配列を含む発現構築物を提供する。例えば、
発現制御エレメントは、発現構築物または「発現カセット」中で対象の遺伝子（例えば、
脱水素酵素遺伝子）に作動可能に連結され得るプロモーターであり得る。プロモーターは
、調節可能、例えば、誘導可能であり得る。
【0160】
核酸構築物が、対象の遺伝子（例えば、脱水素酵素遺伝子）をコードする核酸配列との作動可能な連結でプロモーターを含有しない態様では、核酸配列は、例えば、相同組換え
、部位指定組込みおよび／またはベクター組込みによって内因性プロモーターと作動可能
に連結されるようになるように細胞に形質転換され得る。いくつかの例では、相同組換え
を宿主ゲノム中に媒介するために核酸構築物中に含まれるゲノム宿主配列は、遺伝子調節
配列、例えば、核酸構築物の脱水素酵素遺伝子の発現を調節し得るプロモーター配列を含
み得る。このような例では、構築物の導入遺伝子（複数可）は、宿主微生物に対して内因
性であるプロモーターと作動可能に連結されるようになり得る。内因性プロモーター（複
数可）は、調節可能、例えば、誘導可能であり得る。
【0161】
脱水素酵素をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターは、脱水素酵素遺伝子に対して異種であるプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモー
ターは、誘導プロモーター、すなわち、特定の刺激に応じて作動可能に連結された遺伝子
の転写を媒介するプロモーターであり得る。このようなプロモーターは、例えば、宿主細
胞の成長に対する任意の有害な効果を最小化するのに、および／または脂肪酸生成物の製
造を最大化するのに有利であり得る。誘導プロモーターは、例えば、明暗または高温もし
くは低温に対して反応性であり得る、および／または特定の化合物に対して反応性であり
得る。誘導プロモーターは、ａｒａプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモー
ター、ｔｅｔプロモーター（例えば、米国特許第５，８５１，７９６号）、ｔｒｐ、ｌａ
ｃまたはｔｅｔプロモーターの一部を含むハイブリッドプロモーター、ホルモン反応性プ
ロモーター（例えば、米国特許第６，３７９，９４５号に記載されるものなどのエクジソ
ン反応性プロモーター）、メタロチオニエンプロモーター（例えば、米国特許第６，４１
０，８２８号）、例えば、サリチル酸、エチレン、チアミン、および／またはＢＴＨ（米
国特許第５，６８９，０４４）などといった化学物質に対して反応性であり得る病因関連
（ＰＲ）プロモーターまたはそのいくつかの組合せであり得る。誘導プロモーターは、明
暗（米国特許第５，７５０，３８５号、同５，６３９，９５２号）、金属（Eukaryotic C
ell 2:995〜1002頁(2003年)）または温度（米国特許第５，４４７，８５８号；AbeらPlan
t Cell Physiol. 49: 625〜632頁(2008年)；ShrodaらPlant J. 21:121〜131頁(2000年)）
に対して反応性であり得る。前記のリストは、例示的なものであって、制限ではない。プ
ロモーター配列は、宿主生物において機能性である限り、任意の生物に由来し得る。特定
の実施形態では、誘導プロモーターは、例えば、宿主種において作動するプロモーターに
誘導性を付与するために、既知誘導プロモーターに由来する１種または複数の部分または
ドメインを、宿主細胞において作動し得る異なるプロモーターの少なくとも一部と融合す
ることによって形成される。
【0162】
ラン藻類の形質転換には、それだけには限らないが、ａｒａ、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃプロモーターならびにｔｒｃＹまたはｔｒｃＥプロモーターなどのイソプロピルβ−
Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の付加によって誘導性である誘導体を含め
た、ラン藻類において機能する種々のプロモーターが利用され得る。本発明において使用
され得るその他のプロモーターとして、トランスポゾンによる、または細菌染色体による
抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ、スペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼな
ど、またはそれらの組合せ）と天然に関連しているプロモーター、種々の異種細菌および
天然ラン藻遺伝子と関連しているプロモーター、ウイルスおよびファージ由来のプロモー
ター、合成プロモーターなど、またはそれらの組合せが挙げられる。例えば、プロモータ
ー（複数可）は、真正細菌およびラン藻の種を含めたさまざまな種に由来する原核生物の
プロモーター、例えば、ａｒａＣまたはｐＢＡＤプロモーター、ｒｈａプロモーター、Ｐ
ｍプロモーター、ｘｙｌＳプロモーター、ｎｉｒプロモーター、ｎａｒプロモーターｐｈ
ｏプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｃｙｓプロモーター、メタロチオニエンプロモー
ター、ｆｔｆプロモーター、ｇｌｎプロモーター、熱ショックプロモーター、低温誘導プ
ロモーターまたはウイルス性プロモーターなどから選択され得る。前記のプロモーターは
、例示的なものであって、制限ではない。使用され得るラン藻類から単離されるプロモー
ターとして、それだけには限らないが、以下：ｎｒｓ（ニッケル誘導性）、ｓｅｃＡ（分
泌；細胞の酸化還元状態によって制御される）、ｒｂｃ（Ｒｕｂｉｓｃｏオペロン）、ｐ
ｓａＡＢ（ＰＳ Ｉ反応中心タンパク質；光調節される）、ｐｓｂＡ（ＰＳＩＩのＤｌタ
ンパク質；光誘導性）など、およびそれらの組合せを挙げることができる。いくつかの実
施形態では、プロモーターは、窒素化合物によって調節される、例えば、ｎａｒ、ｎｔｃ
、ｎｉｒまたはｎｒｔプロモーターなど。いくつかの実施形態では、プロモーターは、リ
ン酸（例えば、ｐｈｏまたはｐｓｔプロモーター）または金属、例えば、ｎｒｓプロモー
ター（LiuおよびCurtis(2009年) Proc Natl Acad Sciences USA 106: 21550〜21554頁）
またはｐｅｔＥプロモーター（BuikemaおよびHaselkorn(2001年) Proc Natl Acad Scienc
es USA 98:2729〜2734頁)）によって調節される。本発明の構築物において使用されるよ
うな誘導プロモーターは、上記のプロモーターおよび／または例えば、宿主種において作
動するプロモーターに誘導性を付与するために、宿主生物において作動し得る異なるプロ
モーターの少なくとも一部に融合されたその他の誘導プロモーターの１つまたは複数の部
分またはドメインを使用し得る。
【0163】
同様に、発現ベクター構築のためにさまざまな転写ターミネーターが使用され得る。可能性があるターミネーターの例として、それだけには限らないが、ｐｓｂＡ、ｐｓａＡＢ
、ｒｂｃ、ｓｅｃＡ、Ｔ７コートタンパク質などおよびそれらの組合せを挙げることがで
きる。
【0164】
いくつかの実施形態では、本発明の単離核酸分子または組換え核酸分子は、脱水素酵素をコードする核酸配列および脂質の合成に関与しているポリペプチド、例えば、チオエス
テラーゼまたはその他の脂質製造ポリペプチドをコードする核酸配列の両方を含み得る。
脱水素酵素および脂質製造ポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、本明細書に記
載される核酸配列のいずれかであり得る。特定の実施形態では、脱水素酵素をコードする
核酸配列および脂質の製造に関与している脂質ポリペプチドをコードする核酸配列は、同
一プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結され得る。例えば、特定の
実施形態では、２種の遺伝子（脱水素酵素および、例えば、チオエステラーゼをコードす
る）は、オペロンとして組織されてもよく、例えば、プロモーター配列に、５’から３’
方向に、チオエステラーゼをコードする配列（またはその他のポリペプチドをコードする
配列）、次いで、脱水素酵素をコードする配列が続く、逆もまた同様。脱水素酵素遺伝子
および脂質合成のためのポリペプチドをコードする遺伝子を含むオペロンの上記の実施形
態のいずれにおいても、１種または複数のさらなる調節配列が単離核酸分子中に含まれ得
、例えば、翻訳を増強するための配列が、遺伝子をコードする配列のいずれかの上流に含
まれ得、および／または転写ターミネーターが、所望により、合成オペロンの３’末端に
またはその付近に含まれ得る。
【0165】
脱水素酵素遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする遺伝子に加えて、１種または複数のさらなる遺伝子が、本明細書において提供されるような合成オ
ペロン中に所望により含まれ得、１種または複数のさらなる遺伝子は、例えば、脂肪酸合
成または脂肪酸合成もしくは脂質合成経路の酵素またはタンパク質をコードする１種もし
くは複数のさらなる遺伝子および／または脂肪酸生成物合成を増強し得る酵素もしくはタ
ンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子、光合成または炭素固定を増強し得る１
種もしくは複数の遺伝子および／または１種もしくは複数のリポーター遺伝子もしくは選
択マーカーを含み得る。
【0166】
いくつかの実施形態では、脱水素酵素をコードする核酸配列および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする核酸配列が、同一核酸構築物で提供され得、それらは異
なるプロモーターおよび／または転写エンハンサーと作動可能に連結される。プロモータ
ーおよびエンハンサーは、例えば、本明細書に記載されるプロモーターおよび転写エンハ
ンサーのいずれかであり得る。
【0167】
特定の実施形態では、脱水素酵素をコードする核酸配列を含むベクターは、ラン藻類への形質転換のために設計される。特定の実施形態では、ベクターは、脱水素酵素をコード
する配列の、ラン藻ゲノムとの相同組換えを可能にする。
【0168】
本発明の単離核酸分子は、脱水素酵素またはその他のポリペプチドをコードする本明細書において開示される配列を、それだけには限らないが、発現ベクターなどのベクター中
に含み得る。ベクターは、組換え手段および／または直接化学合成を含めたヒトの介入に
よって作製された核酸であり得、例えば、１種または複数の１）１種または複数の宿主に
おける核酸配列の繁殖のための複製起点（製造宿主を含む場合も含まない場合もある）；
２）１種または複数の選択マーカー；３）１種または複数のリポーター遺伝子；４）それ
だけには限らないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、翻訳
を増強する配列などといった１種または複数の発現制御配列；および／または５）核酸配
列の宿主ゲノムへの組込みを促進する１種または複数の配列、例えば、宿主微生物の１種
または複数のヌクレオチド配列と相同性を有する１種または複数の配列を含み得る。ベク
ターは、宿主細胞における特定の核酸の転写および／または翻訳を可能にする１種または
複数の指定の核酸「発現制御エレメント」を含む発現ベクターであり得る。ベクターは、
プラスミド、プラスミドの一部、ウイルス構築物、核酸断片などまたはそれらの組合せで
あり得る。
【0169】
ベクターは、高コピー数ベクター、２種以上の細胞において複製し得るシャトルベクター、発現ベクター、組込みベクターまたはそれらの組合せであり得る。通常、発現ベクタ
ーは、「発現カセット」において、プロモーターと作動可能に連結された対象の遺伝子を
含む核酸を含み得、これは、それだけには限らないが、転写ターミネーター、リボソーム
結合部位、スプライシング部位またはスプライシング認識配列、イントロン、エンハンサ
ー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位および同様のエレメントも含み得
る。いくつかの実施形態によれば、本発明は、異種プロモーターの制御下に対象の遺伝子
を含む単離核酸で形質転換された組換え微生物を含み得る。あるいは、ベクターが、対象
の遺伝子を含む単離核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有しない場合には、単
離核酸は、相同組換え、部位指定組込みおよび／またはベクター組込みによって、内因性
プロモーターと作動可能に連結されるようになるように、微生物または宿主細胞に形質転
換され得る。
【0170】
いくつかの実施形態では、本発明は、１種または複数の発現制御エレメントと作動可能に連結している対象の遺伝子を含む単離核酸で形質転換された組換え微生物または宿主細
胞をさらに提供する。いくつかの例では、組換え微生物の繁殖の間の特定の時点でタンパ
ク質を発現すること、例えば、組換え微生物の成長または増殖に対する任意の有害な効果
を最小にすることおよび／またはトリグリセリドまたは対象の脂肪酸生成物の製造を最大
にすることが有利であり得る。このような例では、組換え微生物または宿主細胞中に導入
された１種または複数の外因性遺伝子は、特定の刺激に応じて作動可能に連結された遺伝
子の転写を媒介する誘導プロモーターと作動可能に連結され得る。
【0171】
形質転換ベクターは、さらに、またはあるいは、それだけには限らないが、薬物耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、代謝酵素および／または宿主の生存にとって必要な因子（例え
ば、栄養要求性マーカー）などまたはそれらの組合せなどの選択マーカーを含み得る。形
質転換された細胞は、耐性カセットまたは栄養要求性マーカーを欠く細胞が成長できない
条件下で抗生物質および／またはその他の選択マーカーの存在下で成長する能力に基づい
て選択され得る。さらに、非選択マーカーが、蛍光タンパク質または検出可能な反応生成
物を生成する酵素をコードする遺伝子などのベクター上に存在し得る。
【0172】
微生物および宿主細胞の形質転換対象の遺伝子を含む単離核酸を含むベクターは、従来の形質転換および／またはトラン
スフェクション技術によってラン藻類中に導入され得る。本関連において使用されるよう
な、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「コンジュゲーション」および「形
質導入」は、リン酸カルシウムおよび／または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、ナチュラルコンピテンス、化学的
に媒介される転移、エレクトロポレーション、微粒子銃など、またはそれらの組合せを含
めた、外来核酸（例えば、外因性ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当業者に公知の
多様な方法を含むものとする。宿主細胞の形質転換および／またはトランスフェクション
のための適した方法の例は、例えば、Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2010)、C
old Spring Harbor Laboratory Pressに見出すことができる。
【0173】
本発明において使用するための植物などの宿主細胞は、制限するものではないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の使用、パーティクルガン媒介性形質転換、レーザー
媒介性形質転換またはエレクトロポレーションを含めた任意の実現可能な手段によって形
質転換され得る。藻類および光合成細菌は、限定されない例として、ナチュラルＤＮＡ取
り込み（Chungら(1998年) FEMS Microbiot Lett. 164:353〜361頁；Frigaardら(2004年)
Methods Mol. Biol. 274: 325〜40頁；Zangら(2007年) J. Microbiol. 45:241〜245頁)、
コンジュゲーション(Wolkら(1984年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81、1561〜1565頁)、
形質導入、ガラスビーズ形質転換(Kindleら(1989年) J. Cell Biol. 109:2589〜601頁；F
engら(2009年) Mol. Biol. Rep. 36:1433〜9頁；米国特許第５，６６１，０１７号）、シ
リコンカーバイドウィスカー形質転換（Dunahayら(1997年) Methods Mol. Biol.(1997年)
62: 503〜9頁）、遺伝子銃（Dawsonら(1997年) Curr. Microbiol. 35: 356〜62頁；Hall
mannら(1997年) Proc. Natl. Acad. USA 94:7469〜7474頁；Jakobiakら(2004年) Protist
155:381〜93頁；Tanら(2005年) J. Microbiol. 43: 361〜365頁；Steinbrennerら(2006
年) Appl Environ. Microbiol. 72:7477〜7484頁；Kroth(2007年) Methods Mol. Biol. 3
90:257〜267頁；米国特許第５，６６１，０１７号）エレクトロポレーション（Kjaerulff
ら(1994年) Photosynth. Res. 41:277〜283頁；Iwaiら(2004年) Plant Cell Physiol. 45
:171〜5頁；Ravindranら(2006年) J. Microbiol. Methods 66:174〜6頁；Sunら(2006年)
Gene 377:140〜149頁；Wangら(2007年) Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:651〜657頁；
Chaurasiaら(2008年) J. Microbiol. Methods 73:133〜141頁；Ludwigら(2008年) Appl.
Microbiol. Biotechnol. 78:729〜35頁）、レーザー媒介性形質転換または任意のポリ（
アミドアミン）デンドリマーの存在下、またはそれで前処理した後のＤＮＡととものイン
キュベーション（Pasupathyら(2008年) Biotechnol. J. 3: 1078〜82頁）、ポリエチレン
グリコール（Ohnumaら(2008年) Plant Cell Physiol. 49:117〜120頁）、陽イオン性脂質
（Muradawaら(2008年) J. Biosci. Bioeng. 105:77〜80頁）、デキストラン、リン酸カル
シウムまたは塩化カルシウム（Mendez-Alvarezら(1994年) J. Bacteriol. 176:7395〜739
7頁）、所望により、細胞壁分解酵素で細胞を処理した後（Perrone ら(1998年) Mol. Bio
l. Cell 9: 3351〜3365頁）を含めた、任意の適した方法によって形質転換され得る。ア
グロバクテリウム媒介性形質転換はまた、例えば、藻類細胞壁を除去または傷づけた後に
、藻類細胞で実施され得る（例えば、ＷＯ２０００／６２６０１；Kumarら(2004年) Plan
t Sci. 166: 731〜738頁）。遺伝子銃法は、植物および真核生物の藻類種の葉緑体の形質
転換にとって特に上首尾である（例えば、Rameshら(2004年) Methods Mol. Biol. 274: 3
55〜307頁；Doestchら(2001年) Curr. Genet. 39:49〜60頁；米国特許第７，２９４，５
０６号；ＷＯ２００３／０９１４１３；ＷＯ２００５／００５６４３；およびＷＯ２００
７／１３３５５８を参照のこと、すべて参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）
。
【0174】
脂肪酸生成物を製造する方法本発明は、脱水素酵素が発現され、少なくとも１種の脂肪酸生成物が製造される条件下
で脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む本明細書において記載されるような組換え
微生物を培養することによって脂肪酸生成物を製造する方法を包含する。方法は、少なく
とも１種の脂肪酸生成物を単離することをさらに含み得る。脱水素酵素をコードする非天
然遺伝子の発現は、培養期間の間、所望により、誘導され得る。所望により、組換え微生
物によって製造される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の少なくとも一部は、微生物に
よって成長培地中に放出または分泌され得る。
【0175】
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む組換え微生物を、脱水素酵素をコードす
る非天然遺伝子および脂質の製造のためのポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺
伝子が発現される条件下で培養して脂質を製造することを含む、脂質を製造する方法も、
本明細書において提供される。方法は、少なくとも１種の脂質を単離することをさらに含
み得る。脂質は、例えば、脂肪酸生成物であり得る。
【0176】
本明細書において提供される方法のいずれにおいても、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物の培養物は、対照微生物が、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まな
い点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物の培養物とすべての点におい
て同一である対照微生物の対照培養物によって製造されるものよりも多くの脂質（例えば
、脂肪酸生成物）を製造し得る。本明細書において提供される方法のいずれにおいても、
非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物は、対照微生物が、脱水素酵素をコードする
非天然遺伝子を含まない点を除いて、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物に対し
てすべての点で同一である対照微生物よりも高い繁殖および／または増殖速度を有する。
例えば、非天然脱水素酵素遺伝子を含む組換え微生物の培養物は、１、２、３、４、５、
６日または７日以上培養した後に、対照培養物によって達成されるものよりも高い細胞密
度を達し得る。本方法において使用される組換え微生物は、光合成微生物であり得、培養
は、無機炭素が、培養物の増殖および脂質の製造のための炭素の実質的に唯一の供給源で
ある光独立栄養条件下であり得る。
【0177】
いくつかの例では、非天然脱水素酵素遺伝子および少なくとも１種の非天然脂質製造遺伝子を含む組換え微生物によって多量に製造される脂質（例えば、脂肪酸生成物）は、微
生物によって天然には製造されない脂質、例えば、脂肪酸生成物などの脂質の製造に関与
しているポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を欠く同一種の微生物
によって製造されない脂質であり得る。
【0178】
放出および分泌は、本発明の生成物に関連して本明細書において、能動および／または受動輸送機構が、本発明の生成物が細胞膜を越えて細胞の外に出ることを可能にするプロ
セスを指すよう同義的に使用される。このような輸送機構の例として、それだけには限ら
ないが、勾配拡散、促進拡散、能動輸送およびそれらの組合せを挙げることができる。
【0179】
培養は、選択されたおよび／または制御された条件の使用による、１種または複数の細胞の成長（例えば、細胞の大きさ、細胞内容物および／または細胞活性の増大）および／
または繁殖（例えば、有糸分裂による細胞数の増加）の意図的な育成を指す。成長および
繁殖の両方の組合せは、増殖と呼ばれ得る。本明細書において実施例において実証される
ように、脂質製造細胞による脱水素酵素遺伝子の発現は、非天然脱水素酵素遺伝子を含ま
ない脂質製造細胞の培養物に対して、培養物の細胞密度の増大をもたらす。
【0180】
組換え微生物を培養するために使用され得る選択されたおよび／または制御された条件の限定されない例は、定義された培地（ｐＨ、イオン強度および／または炭素供給源など
の既知の特徴を有する）、指定の温度、酸素圧、二酸化炭素レベル、バイオリアクターに
おける成長など、またはそれらの組合せの使用を含む。いくつかの実施形態では、微生物
または宿主細胞は、還元炭素供給源を使用して従属栄養的に、または光および還元炭素供
給源の両方を使用して混合栄養的に成長させられ得る。さらに、またはあるいは、微生物
または宿主細胞は、光栄養的に培養され得る。光栄養的に成長する場合には、微生物は、
エネルギー供給源として光を有利に使用し得る。ＣＯ２または重炭酸などの無機炭素供給
源は、微生物によって生体分子の合成のために使用され得る。「無機炭素」は、本明細書
において、生物によって持続可能なエネルギー供給源として使用され得ない炭素含有化合
物または分子を含む。通常、「無機炭素」は、ＣＯ２（二酸化炭素）、炭酸、重炭酸塩、
炭酸塩、炭酸水素塩など、またはそれらの組合せの形態であり得、これらは、持続可能な
エネルギーのためにさらに酸化され得ず、生物による還元力の供給源として使用され得な
い。光独立栄養的に成長する微生物は、無機炭素が実質的に唯一の炭素の供給源である培
養培地で成長させられ得る。例えば、無機炭素が実質的に唯一の炭素の供給源である培養
物では、培養培地中に提供され得る任意の有機炭素分子または化合物は、細胞によって、
エネルギーのために吸収および／または代謝され得ない、および／または細胞培養物の成
長および増殖のための持続可能なエネルギーを提供するのに十分な量で存在しないのいず
れかである。
【0181】
本発明の方法に従って有用であり得る微生物および宿主細胞は、世界中の種々の場所および環境において見出され得る。最適繁殖ならびに脂質および／またはその他の炭化水素
成分の生成のための特定の成長培地は、変わり得、成長、繁殖または脂質などの生成物の
製造を促進するよう最適化され得る。いくつかの場合には、微生物の特定の株は、微生物
または宿主細胞の特定の株の、いくつかの阻害成分の存在またはいくつかの必須栄養必要
量の不在のために、特定の成長培地では成長できない場合がある。
【0182】
微生物のさまざまな株に適した特定の培地の調製のための使用説明書にあるように、固体および液体成長培地は、一般に、さまざまな供給源から入手可能である。例えば、種々
の新鮮な水および塩水培地として、Barsanti(2005年)Algae:Anatomy、Biochemistry & Bi
otechnology、CRC Press for media and Methods for culturing algaeに記載されるもの
を挙げることができる。藻類培地処方はまた、限定されない例として、ＵＴＥＸ培養物収
集物（ｗｗｗ．ｓｂｓ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｕｔｅｘ／ｍｅｄｉａ．ａｓｐｘ）（２
０１１年９月２０日に訪問した）、藻類および原生動物（Protozoa）の培養物収集物（ｗ
ｗｗ．ｃｃａｐ．ａｃ．ｕｋ）（２０１１年９月２０日に訪問した）；およびカテドラ・
ボタニキー（Katedra Botaniky）（ｂｏｔａｎｙ．ｎａｔｕｒ．ｃｕｎｉ．ｃｚ／ａｌｇ
ｏ／ｃａｕｐ−ｍｅｄｉａ．ｈｔｍｌ）（２０１１年９月２０日に訪問した）を含めた種
々の藻類培養収集物のウェブサイトで見出され得る。
【0183】
いくつかの実施形態では、脂肪酸を製造する生物を培養するために使用される培地は、例えば、標準ＢＧ−１１培地（ＡＴＣＣ培地６１６、表５）、またはＡＴＣＣ培地８５４
（ビタミンＢ１２を含有するよう修飾されたＢＧ−１１）もしくはＡＴＣＣ培地６１７（
さらなるＮａＣｌおよびビタミンＢ１２を含有する、海洋ラン藻類のために修飾されたＢ
Ｇ−１１）などの修飾された培地などの標準培地処方と比較して、例えば、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ベリリウム、鉛、鉄
、ニッケル、コバルト、スズ、クロム、アルミニウム、亜鉛、銅など、またはそれらの組
合せ（マグネシウム、カルシウム、および／または鉄などの特に多価の金属）などの金属
（通常、塩として、および／またはイオン形態で提供される）の濃度の増大を含み得る。
【0184】
例えば、遊離脂肪酸を製造する成長する微生物に使用される培地は、標準培地と比較して、少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少な
くとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、２
倍から１０倍の間および／または１０倍から１００倍の間の量の金属（例えば、カルシウ
ム）を含み得る。遊離脂肪酸を製造し得る成長する微生物に使用される培地は、処方中に
、例えば、少なくとも０．５ｍＭ、約０．５ｍＭから約１ｍＭの間、約１ｍＭから約２ｍ
Ｍの間、約２ｍＭから約５ｍＭの間、約５ｍＭから約１０ｍＭの間、約１０ｍＭから約２
５ｍＭの間および２５ｍＭ超の金属（例えば、カルシウム）を含み得る。例えば、培地中
に過剰量の金属（例えば、カルシウム）を使用することによって、脂肪酸（複数可）の少
なくとも一部が石鹸沈殿物として捕捉され得、これは遊離脂肪酸（複数可）の毒性効果の
低減をもたらし得る。培地中への金属（例えば、カルシウム）の添加は、さらに、または
あるいは、比較的高い濃度の遊離脂肪酸を有する培地中の微生物の耐性を増大し得る。さ
らに、またはあるいは、脂肪酸製造株は有利なことに、過剰の金属（例えば、カルシウム
）含量を用いた場合に、より強固であり得る。過剰の成分は、金属として本発明において
記載されているが、成分は、より一般には、カルボン酸塩対イオン供給源、例えば、石鹸
形成性対イオン供給源、金属イオン供給源（本明細書において「金属」と記載される）、
多価（すなわち、＋２以上の原子価を有する）対イオン供給源、二価対イオン供給源また
はそれらのいくつかの組合せとして記載され得るということは考慮される。この金属／カ
ルボン酸塩対イオン供給源に関するその他の詳細は、２０１１年１２月１３日に出願され
た「Culturing a Microorganism in a Medium with an Elevated Level of a Carbocylat
e Counterion Source」と題された、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特
許出願第１３／３２４，６３６号に記載されている。
【0185】
培養方法は、記載されるような脱水素酵素遺伝子および脂肪酸生成物およびトリグリセリドの製造および／または微生物における代謝経路の調節に関与しているタンパク質をコ
ードする遺伝子の一方または両方の発現を誘導することを含み得る。発現を誘導すること
は、栄養分または化合物を培養物に添加すること、培養培地から１種または複数の成分を
除去すること、光および／または温度を増大または低減することおよび／または対象の遺
伝子の発現を促進するその他の操作を含み得る。このような操作は、対象の遺伝子と作動
可能に連結された（異種）プロモーターの性質に大きく依存し得る。
【0186】
本発明のいくつかの実施形態では、組換え微生物または宿主細胞は、バイオリアクターにおいて培養され得る。「バイオリアクター」とは、所望により、懸濁液中で、懸濁され
る場合には、好ましくは、水性液中で細胞が培養されるエンクロージャまたは部分的エン
クロージャを指す。バイオリアクターは、微細藻類細胞を、その生理学的周期の種々の相
にわたって培養するために使用され得る。バイオリアクターは、従属栄養成長および繁殖
方法において使用するのに多数の利点を提供し得る。食物として使用するためのバイオマ
スを製造するには、微生物または宿主細胞は、好ましくは、例として、懸濁培養物中など
の液体中で多量に発酵される。スチール発酵装置などのバイオリアクターは、極めて多量
の培養容積を収容し得る（４０，０００リットル以上の能力のバイオリアクターが、本発
明の種々の実施形態において使用され得る）。バイオリアクターはまた、通常、温度、ｐ
Ｈ、酸素圧、二酸化炭素レベルなど、ならびにそれらの組合せなどの１種または複数の培
養条件の制御を可能にし得る。バイオリアクターは、通常、例えば、管類と結合している
ポートを使用して設定可能であり、ＣＯ２、ＣＯ２が豊富な空気、酸素および／または窒
素などのガス状成分が、液体培地と接触される（例えば、バブリングされる）のを可能に
し得る。培養培地のｐＨ、微量元素および／または栄養分の同一性および／または濃度、
その他の培地成分の同一性および／または濃度など、またはそれらの組合せなどのその他
の培養パラメータは、通常、バイオリアクターを使用してより容易に操作され得る。
【0187】
微生物および宿主細胞は、さらに、またはあるいは、人工光源を備えたバイオリアクター、「フォトバイオリアクター」中で培養され得、および／または日光を含めた光が、許
容される微生物成長および増殖を可能にする、促進する、および／または維持するのに十
分なほど透明である１種もしくは複数の壁を有し得る。脂肪酸生成物またはトリグリセリ
ドの製造のために、光合成微生物または宿主細胞は、さらに、またはあるいは、振盪フラ
スコ、試験管、バイアル、マイクロタイターディッシュ、ペトリディッシュなど、または
それらの組合せ中で培養され得る。
【0188】
さらに、またはあるいは、組換え光合成微生物または宿主細胞は、池、運河、海上成長容器、溝、水路、流れなど、またはそれらの組合せ中で成長させられ得る。標準バイオリ
アクターと同様、それだけには限らないが、空気、ＣＯ２が豊富な空気、燃焼排ガスなど
、またはそれらの組合せを含めた無機炭素（例えば、それだけには限らないが、ＣＯ２、
重炭酸、炭酸塩など）の供給源が、培養物に供給され得る。ＣＯ２に加えてＣＯを含有し
得る無機の燃焼排ガスおよび／またはその他の供給源を供給する場合には、（フォト）バ
イオリアクター中に導入されるＣＯレベルが、微生物の成長、増殖および／または生存に
対して危険なおよび／または致死的用量を構成しないよう、このような供給源を前処理す
ることが必要であり得る。
【0189】
本方法は、光合成微生物などの組換え微生物、例えば、本明細書において記載されるような脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む微細藻類またはラン藻などを培養して、
少なくとも１種の脂肪酸生成物を製造することを含み、方法は、同一条件下で培養された
、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含まない、そうでなければ同一である微生物の
培養によって製造される脂肪酸生成物の量よりも、少なくともまたは約０．１％、０．５
％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％
、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％
、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％
、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％多い
、培養による製造をもたらす。さらに、またはあるいは、方法は、本明細書において記載
された組換え微生物を培養することによって、１リットルの脂肪酸生成物の培養物あたり
、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも１１０ｍｇ、少なくとも１２０ｍｇ、少なくとも１
３０ｍｇ、少なくとも１４０ｍｇ、少なくとも１５０ｍｇ、少なくとも１６０ｍｇ、少な
くとも１７０ｍｇ、少なくとも１８０ｍｇ、少なくとも１９０ｍｇ、少なくとも２００ｍ
ｇ、少なくとも２１０ｍｇ、少なくとも２２０ｍｇ、少なくとも２３０ｍｇ、少なくとも
２４０ｍｇ、少なくとも２５０ｍｇ、少なくとも２６０ｍｇ、少なくとも２７０ｍｇ、少
なくとも２８０ｍｇ、少なくとも２９０ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも３１０
ｍｇ、少なくとも３２０ｍｇ、少なくとも３３０ｍｇ、少なくとも３４０ｍｇ、少なくと
も３５０ｍｇ、少なくとも３６０ｍｇ、少なくとも３７０ｍｇ、少なくとも３８０ｍｇ、
少なくとも３９０ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、少なくとも４５０ｍｇ、少なくとも５０
０ｍｇ、少なくとも５５０ｍｇ、少なくとも６００ｍｇ、少なくとも６５０ｍｇ、少なく
とも７００ｍｇ、少なくとも７５０ｍｇ、少なくとも８００ｍｇ、少なくとも８５０ｍｇ
、少なくとも９００ｍｇ、少なくとも９５０ｍｇの脂肪酸生成物を製造することを含む。
何度も、目的は、できるだけ多くの脂肪酸生成物を製造および／または回収することであ
り得るが、いくつかの場合には、本明細書において記載される方法によって製造および／
または回収される脂肪酸生成物の量は、１リットルの培養物あたり約２ｇ以下、例えば、
１リットルの培養物あたり１．５ｇ以下、１リットルの培養物あたり１ｇ以下、１リット
ルの培養物あたり８００ｍｇ以下、１リットルの培養物あたり６００ｍｇ以下、例えば、
１リットルの培養物あたり約５５０ｍｇ以下または１リットルの培養物あたり約５００ｍ
ｇ以下に制限され得る。
【0190】
脂肪酸生成物は、当業者に公知の回収手段によって、例えば、有機溶媒を使用する全培養物抽出などによって、培養物から回収され得る。いくつかの場合には、脂肪酸生成物の
回収は、細胞の均質化によって増強され得る。例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体および／ま
たはトリグリセリドなどの脂質は、２０１２年２月２９日に出願され、参照によりその全
文が本明細書に組み込まれる、「Solvent Extraction of Products from Algae」と題さ
れた、同時係属中の、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１３／４０７，８１７
号に記載されるように、高温および／または高圧で溶媒を用いる藻類の抽出によって藻類
から単離され得る。
【0191】
脂肪酸生成物が、微生物から培養培地中に十分に放出または分泌される場合には、放出された脂肪酸生成物のみ、微生物内で製造され、貯蔵された脂肪酸生成物のみ、または製
造され、放出された脂肪酸生成物の両方を効率的に回収するよう、回収方法が適応され得
る。上記の組換え微生物によって培養培地中に分泌／放出された脂肪酸生成物は、種々の
方法で回収され得る。例えば、不混和溶媒を使用する分配による直接的な単離方法が、使
用され得る。さらに、またはあるいは、粒状吸着剤が使用され得る。これらは、回収方法
の設計に応じて親油性粒子および／またはイオン交換樹脂を含み得る。それらは、別個の
培地中を循環し、次いで、収集され得、および／または培地は、これらの粒子を含有する
固定層カラム、例えば、クロマトグラフィーカラム上を通され得る。次いで、脂肪酸生成
物は、例えば、適当な溶媒の使用によって粒状吸着剤から溶出され得る。このような状況
において、１つの単離方法は、溶媒の蒸発を実施することと、続いて、単離された脂肪酸
生成物をさらに処理して、種々の商業的目的のために使用され得る化学物質および／また
は燃料を得ることを含み得る。
【0192】
いくつかの例では、脂肪酸生成物、例えば、Ｃ８−Ｃ２４脂肪酸、Ｃ１０−Ｃ２２脂肪酸またはＣ１２−Ｃ１８脂肪酸、例えば、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６および／またはＣ１８
脂肪酸のうち少なくとも１種などのレベルは、そうでなければ同一であるが、非天然脱水
素酵素遺伝子を欠く微生物または宿主細胞の培養物に対して、培養物中で増大され得る。
本発明は、本発明の方法によって製造される遊離脂肪酸、脂肪酸誘導体またはグリセロ脂
質を含む組成物をさらに含む。
【0193】
さらに、またはあるいは、本発明は、以下の実施形態のうち１つまたは複数を含み得る。
【0194】
実施形態１。組換え微生物の培養物が、対照微生物が脱水素酵素をコードする第１の非天然ヌクレオチド配列を含まない点を除いて、第１および第２の非天然ヌクレオチド配列
を含む組換え微生物に対してすべての点で同一である微生物の対照培養物によって製造さ
れるものよりも、多量の脂質を製造し、組換え微生物が、脂質が製造される条件下で対照
微生物よりも高い繁殖および／または増殖速度を有する、脱水素酵素をコードするヌクレ
オチド配列を含む第１の非天然核酸分子および脂質生合成に関与しているポリペプチドを
コードする配列を含む少なくとも１つの第２の非天然核酸分子を含む組換え微生物。
【0195】
実施形態２。脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、アセトアルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素
酵素、２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ
酸脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、コハク酸塩脱水素酵素、ピル
ビン酸脱水素酵素、αケトグルタル酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、Ｄ
−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、Ｄ−グリセリン酸脱水素
酵素、バンコマイシン耐性タンパク質Ｈ、Ｄ−２−ホスホグリセリン酸脱水素酵素、Ｄ−
乳酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素
およびソルビトール脱水素酵素からなる群から選択され、および／または
脱水素酵素が、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号１８または配列番号１
９、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１０、配列番号
１１または配列番号１３に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
、実施形態１に従う組換え微生物。
【0196】
実施形態３。脂質生合成に関与しているポリペプチドが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、４−ヒドロキシベンゾイル−チオエステラーゼ
、脂質分解活性を有するポリペプチド、アルデヒド形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、
アルデヒド形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、アルコール形
成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アルコール形成性アシル−ＡＣＰレダクターゼ、ワッ
クスシンターゼ、デカルボニラーゼ、デカルボキシラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＰＡ
ＰおよびＤＧＡＴからなる群から選択され、さらに所望により、脂質が、遊離脂肪酸、脂
肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステ
ル、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリドおよびトリアシルグリセリドからなる群
から選択される脂肪酸生成物である、実施形態１または２に従う組換え微生物。
【0197】
実施形態４。第１の非天然核酸分子が、配列番号４、配列番号６または配列番号７に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を有するアミノ酸配列を
含むアルデヒド脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と、
配列番号１８または配列番号１９に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少
なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１０
０％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素
をコードするヌクレオチド配列と、
配列番号２または配列番号２９に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なく
とも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０
％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％
の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする
ヌクレオチド配列と、
配列番号１５または配列番号１６に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少
なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１０
０％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコード
するヌクレオチド配列と、
配列番号１０または配列番号１１に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少
なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１０
０％の間の同一性を有するアミノ酸配列を含むホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする
ヌクレオチド配列と、
配列番号１３に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少
なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％から１００％の間の同一性を
有するアミノ酸配列を含むホスホグルコン酸脱水素酵素をコードするヌクレオチド配列と
を含む、これまでの実施形態のいずれかに従う組換え微生物。
【0198】
実施形態５。脱水素酵素をコードする第１の非天然核酸分子および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする第２の非天然核酸分子を含む組換え微生物の培養物が、
対照微生物が、脱水素酵素をコードする第１の非天然ヌクレオチド配列を含まない点を除
いて、第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチド配列を含む組換え微生
物に対してすべての点で同一である微生物の対照培養物によって製造されるものよりも多
い量の脂質を製造し、脂質が、第２の非天然核酸分子を含まない組換え微生物と同一種ま
たは株の微生物によって製造されない脂肪酸生成物である、これまでの実施形態のいずれ
かに従う組換え微生物。
【0199】
実施形態６。組換え微生物が、光合成微生物である、これまでの実施形態のいずれかに従う組換え微生物。
【0200】
実施形態７。光合成微生物が、所望により、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacysti
s）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アス
テロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）
、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、
クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、ク
リナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム
属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）
、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）
、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococc
opsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フ
レミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitleri
nema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロ
エオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属
（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothr
ix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属
（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、
ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscill
atoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）
、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロ
クロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナ
ベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothri
x）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stani
eria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symplo
ca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サ
ーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、
トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属
（Xenococcus）からなる群から選択されるラン藻であるか、または光合成微生物が、所望
により、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォ
ラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Ast
eromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオ
コッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス
属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、
クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（
Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、
クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、
クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dun
aliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモ
スファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（E
uglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサム
ニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属
（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、
レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィ
ジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（N
annochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロク
ロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzs
chia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイス
ティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova
）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラ
ム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラ
チモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス
属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlore
lla）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）
、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、シゾクラミデラ
属（Schizochlamydella）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra
）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラクロレラ属（Tetrachlorella）、テトラ
セルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viri
diella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類である、こ
れまでの実施形態のいずれかに従う組換え微生物。
【0201】
実施形態８。脱水素酵素をコードする第１の核酸分子の発現が、第１の核酸を欠く、そうでなければ同一である微生物におけるＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比に対して、ＮＡＤＰ
Ｈ対ＮＡＤＰ＋の細胞内比を増大し、例えば、ここで、細胞内ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比
は、第１の核酸を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも約５％高い、約１０％高
い、約２０％高い、約３０％高い、約４０％高い、約６０％高い、約８０％高い、約１０
０％高い、約１５０％高い、約２００％高い、約３００％高い、約５００％高い、約７０
０％高い、約９００％高い、約１０００％高い、または約２０００％高い、実施形態６ま
たは７に従う組換え光合成微生物。
【0202】
実施形態９。組換え微生物の培養物が、前記の第１の核酸を欠く、そうでなければ同一である微生物の培養物と比較して、約１％多い、約５％多い、約１０％多い、約２０％多
い、約３０％多い、約４０％多い、約５０％多い、約６０％多い、約７０％多い、約８０
％多い、約９０％多い、約１００％多い、約２００％多い、約５００％多い、約７００％
多い、約１０００％多い、または約２０００％多い脂肪酸生成物を製造する、実施形態６
〜８のいずれか１つに従う組換え光合成微生物。
【0203】
実施形態１０。組換え光合成微生物が、前記の第１の非天然核酸分子を欠く、そうでなければ同一である光合成微生物よりも約５％高い、約１０％高い、約２０％高い、約３０
％高い、約４０％高い、約６０％高い、約８０％高い、約１００％高い、約１５０％高い
、約２００％高い、４００％高い、約６００％高い、約８００％高い、約１０００％高い
、または少なくとも２０００％高い複製速度を有する、実施形態６〜９のいずれか１つの
組換え光合成微生物。
【0204】
実施形態１１。所望により、脂質が、遊離脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、脂肪酸エステル、ワックスエステル、モノアシルグリセリド、ジア
シルグリセリドおよびトリアシルグリセリドからなる群から選択される脂肪酸生成物であ
る、脂質を製造するのに十分な時間量の間、適した培養培地において、これまでの実施形
態のいずれか１つに従う組換え微生物を培養することを含む、脂質を製造する方法。
【0205】
実施形態１２。組換え微生物が、光合成微生物であり、組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、実施形態１１に従う方法。
【0206】
実施形態１３。脱水素酵素をコードする核酸および脂質の製造に関与しているポリペプチドをコードする核酸配列の一方または両方の発現を誘導することを含む、実施形態１１
または１２に従う方法。
【0207】
実施形態１４。方法が、培養物から脂質を回収することをさらに含む、実施形態１１〜１３のいずれかに従う方法。
【0208】
実施形態１５。脂質を製造する微生物において脱水素酵素をコードする組換え核酸分子を発現させることと、微生物の成長および／または増殖を支援する条件下で微生物を培養
することを含み、微生物の成長および／または増殖速度が、同一条件下で培養され、対照
微生物が脱水素酵素をコードする組換え核酸分子を発現しない点を除いて、組換え微生物
に対してすべての点において同一である対照微生物のものよりも大きい、脂質を製造する
微生物の成長および／または増殖速度を増大する方法。
【0209】
実施形態１６。培養物が、３、４、５または６日の培養後に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く点を除いて、すべての点において同一である微生物の同一培養物によ
って達せられる培養密度よりも高い光学濃度に達する、実施形態１１〜１５のいずれかに
従う方法。
【0210】
実施形態１７。所望により、組換え微生物が、光合成組換え微生物であり、培養物が、実質的な量の還元炭素供給源を含まない、実施形態１〜１０のいずれか１つの組換え微生
物を含む細胞培養物。
【0211】
実施形態１８。配列番号２または配列番号２９に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％
、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同
一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子
。
実施例
【実施例1】
【0212】
微生物による脂肪酸製造を増強できるタンパク質をコードする遺伝子の同定のためにスクリーニングを設計した。ナイルブルースクリーニングは、テキサス州ラグーナマドレ（
Laguna Madre、Texas）において水路から採取した環境サンプルから得られたＤＮＡ断片
を含有するメタゲノムライブラリーの形質転換のためのバックグラウンドとして、クフェ
ア・カルタゲンシス（Cuphea carthagenensis）由来のＣｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰ
チオエステラーゼのＮ末端切断型を保持していた大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０株を使用
した（シネコシスティス属（Synechocystis）のためにコドン最適化されたヌクレオチド
配列、配列番号２０、アミノ酸配列配列番号２１；参照により本明細書に組み込まれるＵ
Ｓ２０１１／００２０８８３を参照のこと）。プレートベースのアッセイを使用して、１
０μｇ／ｍＬのナイルブルーＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ番号
Ａ１７１７４）を含有する固体培地で遊離脂肪酸を製造する組換え大腸菌（E. coli）コ
ロニーを同定した。ナイルブルーは脂肪酸を青色に染める。プレートを標準光ボックス上
に置くことによって、コロニーを目視検査によって染色について調べた。ＣｃｌＦａｔＢ
１チオエステラーゼを発現したが、ライブラリー断片を含まないバックグラウンド対照を
上回る高レベルのナイルブルーＡ染色を示すコロニーを選択し、成長させ、さらにスクリ
ーニングして、遊離脂肪酸検出キット（番号ＳＦＡ−１、Ｚｅｎｂｉｏ、Ｉｎｃ、Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ）を使用して総非エステル化遊離脂肪酸
（ＦＦＡ）の量を決定した。
【0213】
ナイルブループレートアッセイにおいてバックグラウンド対照を上回る上昇した遊離脂肪酸レベルを示す大腸菌（E. coli）クローンの遊離脂肪酸含量を、続いて、遊離脂肪酸
検出キットを用いるアッセイによって、フレームイオン化検出を用いるガスクロマトグラ
フィー（ＧＣ）（ＧＣ−ＦＩＤ）によってさらに解析した。ＧＣ−ＦＩＤ解析においてバ
ックグラウンド対照を上回る上昇した遊離脂肪酸レベルを示す２００種の分離菌を選択し
、クローンのヌクレオチド配列を決定した。これらの分離菌では、クローニングされた断
片は、それらの配列の生物情報学解析に基づいて、各々、１つから少なくとも５つのオー
プンリーディングフレーム（有望な遺伝子）を含有していた。ＤＮＡ塩基配列決定し、重
複性クローンを除去した後、配列を再度解析して、反復するタンパク質ドメインを同定し
た。「ＮＢ」と示されたクローンは、ナイルブルーアッセイから単離された。南カリフォ
ルニアのソルトン湖の北に位置するパシフィックアクアファーム（Pacific Aquafarms）
の池から採取した水サンプルからのＤＮＡの単離から作製されたメタゲノムライブラリー
を使用する、脂肪酸の増強された生合成を検出するための別個の遺伝子アッセイも実施し
、その結果、クローンＢ１０が単離された（表１）。
【0214】
いくつかのクローンを、脱水素酵素ドメインを含有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有すると同定した（表１）。クローンＢ１０およびＮＢ１０
６は、Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素をコードする配列を含むと同定し；
ＮＢ８およびＮＢ１１２は、アルデヒド脱水素酵素をコードすると同定し；ＮＢ１０４は
、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードすると同定した。したがって、機能的スクリ
ーニングにおいて単離された、クローニングされた断片において、３種の別個の種類の脱
水素酵素をコードする遺伝子を同定した。
【0215】
【表1】
【0216】
Ｂ１０挿入部分は、１５９．３のビットスコアおよび４．２ ｅ−４７のｅ値を有する、Ｐｆａｍ ０２８２６（「Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、ＮＡＤ結合
ドメイン」、ギャザリングカットオフ、２５．１）に属すると同定されたポリペプチド（
配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１）を含
んでいた。Ｂ１０ ＯＲＦは、ポリモーフム・ギルバム（Polymorphum gilvum）ＳＬ００
３Ｂ−２６Ａ１のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、ＮＡＤ結合タンパク質
（遺伝子ＩＤ：３２８５４２５９３；受託ＹＰ＿００４３０２７０２）と６４％同一であ
る；ラブレンジア・アレクサンドリー（Labrenzia alexandrii）ＤＦＬ−１１のＤ−異性
体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２５４５０３４３３；受託ＺＰ＿０
５１１５５８４）と５７％同一である；スタッピア・アグレガタ（Stappia aggregata）
ＩＡＭ１２６１１４の２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：１１８４３８９６３；
受託ＺＰ＿０１５４５６６６）と５６％同一である；マリノモナス属（Marinomonas）種
ＭＷＹＬ１のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＮＡＤ結合）（遺伝子ＩＤ
：５３６７８４６；受託ＹＰ＿００１３４２１３３）と５５％同一であるアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードする。Ｂ１０ ＯＲＦの最初の１２個のアミノ酸（配列番号
２）は、ポリモーフム・ギルバム（Polymorphum gilvum）Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキ
シ酸脱水素酵素、ＮＡＤ結合タンパク質の最初のアミノ酸であるメチオニンの上流であり
、したがって、これらのアミノ酸は、Ｂ１０ ＯＲＦによってコードされる天然タンパク
質の一部ではない可能性があり、コードされるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１
３〜３２６を含む可能性が高い。配列番号２９は、配列番号２のアミノ酸１３〜３２６に
相当する。
【0217】
ＮＢ１０６挿入部分は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５５９７４０３；配列番号１６
）のアミノ酸１〜１３７と同一であるポリペプチド（配列番号１５）をコードするオープ
ンリーディングフレーム（配列番号１４）を含んでいた。このポリペプチド配列は、５７
．６のビットスコアおよび７．８ ｅ−１６のｅ値を有する、Ｐｆａｍ ＰＦ００３８９
（「Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、触媒ドメイン」、ギャザリングカッ
トオフ、２４．６）に入った。ＮＢ１０６ ＯＲＦ（配列番号１４）によってコードされ
るポリペプチドに対して相同性を有するさらなるＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水
素酵素として、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２のＤ
−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０５６４８１９９；ＥＥＶ３１５３
２）（７９％の同一性）；エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casselifl
avus）ＡＴＣＣ １２７５５のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０
８１４５０１１；ＥＧＣ６９９１２）（７８％の同一性）；カルノバクテリウム属（Carn
obacterium）種ＡＴ７のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ＿０２１８
５８９３；ＥＤＰ６７３４８）（７２％の同一性）；エンテロコッカス・フェシウム（En
terococcus faecium）Ｅ１６３６のＤ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ
＿０６６９５３４５；ＥＦＦ２３３２１）（７８％の同一性）；ペディオコッカス・アシ
ディラクチシ（Pediococcus acidilactici）７＿４の２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ
＿０６１９６１８１；ＥＦＡ２７３２４）（６３％の同一性）；ラクトバチルス・ブレビ
ス（Lactobacillus brevis）ＡＴＣＣ３６７の２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＹＰ＿７９
４３４３；ＡＢＪ６３３１２）（６３％の同一性）；ラクトバチルス・コレオホミニス（
Lactobacillus coleohominis）１０１−４−ＣＨＮの２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＺＰ
＿０５５５３０１３；ＥＥＵ３０２３３）（６４％の同一性）；およびクロストリジウム
・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ８０５２のＤ−異性体特異的
２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＹＰ＿００１３０９３１６．１ ＧＩ１５００１７０６２
）（７５％の同一性）が挙げられる。
【0218】
ＮＢ８挿入部分は、２８０．５のビットスコアおよび１．４ ｅ−８３のｅ値を有する、Ｐｆａｍ ００１７１（「アルデヒド脱水素酵素」、ギャザリングカットオフ、２３．
０）に属すると同定されたポリペプチド（配列番号４）をコードするＯＲＦ（配列番号３
）を含んでいた。挿入部分の最も５’の末端で始まるＯＲＦは、バチルス・チューリンゲ
ンシス（Bacillus thuringiensis）チューリンゲンシス（thuringiensis）血清型アルデ
ヒドレダクターゼ（遺伝子ＩＤ：１１８４３８９６３；受託ＺＰ＿０１４３２００４；配
列番号７）のアミノ酸９５〜４５５に対して少なくとも９９％の同一性を有する。ＯＲＦ
が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）アルデヒドレダクターゼ
（配列番号７）の最もＮ末端の９０〜１００のアミノ酸に対して相同なアミノ酸を失って
いるので、ＮＢ８は、末端切断型バチルス（Bacillus）アルデヒドレダクターゼをコード
すると思われる。さらに、発現実験が実施された場合に実現されなかったクローニングエ
ラーのために、このＯＲＦの一部のみを、シネコシスティス属（Synechocystis）におけ
る発現のために組込みベクター中にクローニングした。したがって、バチルス（Bacillus
）アルデヒド脱水素酵素のＮ末端の９４個のアミノ酸およびＣ末端の１０８個のアミノ酸
を欠くポリペプチド（配列番号６）をコードするＮＢ８部分ＯＲＦ（配列番号５）の発現
が、増殖および脂肪酸製造性に対して効果を実証したので（実施例２を参照のこと）、配
列番号７（バチルス（Bacillus）アルデヒド脱水素酵素）のアミノ酸Ｎ末端からアミノ酸
９５およびアミノ酸３４７のＣ末端は、活性にとって必要でないと思われる。配列番号４
に対して配列相同性を有するアミノ酸配列を含むその他のバチルス（Bacillus）アルデヒ
ド脱水素酵素として、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ベルリ
ナー（berliner）血清型のｙｗｄＨアルデヒド脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２２８９３８４
９９；受託ＺＰ＿０４１５０１１０８）（９９％の同一性）；バチルス・チューリンゲン
シス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ２００のｙｗｄＨアルデヒド脱水素酵素（遺伝子
ＩＤ：２２８９０７０１３；受託ＺＰ＿０４０７０８７９）（９８％の同一性）；バチル
ス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ＩＢＬ４２２２のアルデヒド脱水素
酵素（ＮＡＤ）ファミリータンパク質（遺伝子ＩＤ：２２８８９９９６２；受託ＺＰ＿０
４０６４２０１）（９８％の同一性）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuri
ngiensis）クルスタキ（kurstaki）血清型のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ
：２２８９５１７６４；ＺＰ＿０４１１３８６３）（９８％の同一性）、バチルス・セレ
ウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０８７６のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子
ＩＤ：２２９１８９４６５；ＺＰ＿０４３１６４８２）（９８％の同一性）、バチルス・
チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ヒュアゾンゲンシス（huazhongensis）
血清型のアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２８９２００９６；ＺＰ＿０４
０８３４４５）（９８％の同一性）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）のアルデ
ヒド脱水素酵素（ＮＡＤ）ファミリータンパク質（遺伝子ＩＤ：２０６９６７８５２；Ｚ
Ｐ＿０３２２８８０８）（９８％の同一性）およびバチルス・セレウス（Bacillus cereu
s）１７２５６０Ｗのアルデヒド脱水素酵素ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２９１７７７９１
；ＺＰ＿０４３０５１６４）（９７％の同一性）が挙げられる。配列番号４に対して少な
くとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルデヒド脱水素酵素として、バチル
ス・サイトトキシカス（Bacillus cytotoxicus）ＮＶＨ３９１−９８のアルデヒド脱水素
酵素（遺伝子ＩＤ：５３４４０５６；ＹＰ＿００１３７４３２７）（８２％の同一性）；
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＷＳＨ−００２のアルデヒド脱水素酵
素（遺伝子ＩＤ：３４５４４４９７３；ｇｂ ＡＥＮ８９９９０）（６２％の同一性）；
バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）Ｒｏｃｋ３−１７のアルデヒド脱水素酵素
ｙｗｄＨ（遺伝子ＩＤ：２２８９９６４８８ ＺＰ＿０４１５６１２７）（８１％の同一
性）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＨ６２１のアルデヒド脱水素酵素ｙｗ
ｄＨ（ｇｉ ２２９１６６２１７； ＺＰ＿０４２９３９７７）（８９％の同一性）およ
びバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）株アル・ハカム（Al Hakam
）のアルデヒド脱水素酵素（ＮＡＤ（Ｐ）＋）（ｇｉ １１８４７６８５８；ＹＰ＿８９
４００９）（９０％の同一性）が挙げられる。
【0219】
ＮＢ１１２挿入部分は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿００１４２３２３８；配列番
号１９）に対して９８％の同一性を有するポリペプチド（配列番号１８）の一部をコード
するオープンリーディングフレーム（配列番号１７）を含んでいた。このポリペプチド配
列は、２０３．７のビットスコアおよび３ ｅ−６０のｅ値を有する、Ｐｆａｍ ＰＦ０
０１７１（「アルデヒド脱水素酵素」、ギャザリングカットオフ、２３．０）に入った。
ＮＢ１１２ ＯＲＦ（配列番号１８）によってコードされるポリペプチドに対して相同性
を有するさらなるメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素として、バチルス・アトロフ
ァエウス（Bacillus atrophaeus）１９４２のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素
（ＹＰ＿００３９７５４２６；ＡＤＰ３４４９５）（９２％の同一性）；バチルス・リケ
ニフォルミス（Bacillus licheniformis）ＡＴＣＣ１４５８０のメチルマロン酸セミアル
デヒド脱水素酵素（ＹＰ＿０８１３２３；ｇｉ ５２０８２５３２）（８９％の同一性）
；パエニバチルス・デンドリティフォルミス（Paenibacillus dendritiformis）Ｃ４５４
のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＺＰ＿０９６７６６３６）（８４％の同一
性）；パエニバチルス・テラエ（Paenibacillus terrae）ＨＰＬ−００３のメチルマロン
酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿００５０７５５４６；ＡＥＴ５９３２３）（８３％
の同一性）；バチルス・クラウシー（bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６のメチルマロン
酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＹＰ＿１７３９２５；ＢＡＤ６２９６４）（８０％の同一
性）；リステリア菌（Listeria monocytogenes）ＦＳＬ Ｆ２−２０８のメチルマロン酸
セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＦＲ８５８２７）（７９％の同一性）；リステリア・マー
シー（Listeria marthii）ＦＳＬ Ｓ４−１２０のメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素
酵素（ＺＰ＿０７８６９６５７；ＥＦＲ８８８４７）（７９％の同一性）；およびアリシ
クロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）ＬＡＡ１のメ
チルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＺＰ ０３４９５１８１；ＥＥＤ０６１２５）
（７０％の同一性）が挙げられる。
【0220】
ＮＢ１０４挿入部分（配列番号８）は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcusfaecalis）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（例えば、ＺＰ＿０５２１２５３；配列
番号１１）の一部として同定されたポリペプチド（配列番号１０）をコードするオープン
リーディングフレーム（配列番号９）を含んでいた。このポリペプチド配列は、５５．４
のビットスコアおよび４．４ ｅ−１５のｅ値を有する、Ｐｆａｍ ００３９３（「ホス
ホグルコン酸脱水素酵素」、ギャザリングカットオフ、２０．４）に入った。ＮＢ１０４
オープンリーディングフレームは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faeca
lis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（配列番号１１）のアミノ酸１３〜３１１に対し
て１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。ＮＢ１０４ ＯＲＦ（配列番号
１０）によってコードされるポリペプチドに対して相同性を有するさらなる６−ホスホグ
ルコン酸脱水素酵素として、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）種ＡＴ７の６−ホ
スホグルコン酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：１６３７９１４８７；ＺＰ＿０２１８５８９４
；５６％の同一性）、アナエロコッカス・バギナリス（Anaerococcus vaginalis）ＡＴＣ
Ｃ５１１７０の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２５６５４６０４４；Ｚ
Ｐ＿０５４７３３９８；５１％の同一性）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Entero
coccus casseliflavus）の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（遺伝子ＩＤ：２５７８６７
２５９；ＺＰ＿０５６４６９１２；５１％の同一性）およびクロストリジウム・ベイジェ
リンキ（Clostridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ ８０５２の６−ホスホグルコン酸脱水
素酵素様タンパク質（遺伝子ＩＤ：１５００１７０６１；ＹＰ＿００１３０９３１５；４
９％の同一性）が挙げられる。
【実施例2】
【0221】
ＮＢ８、ＮＢ１０４およびＢ１０株を含めた、配列決定されたクローンのいくつかのクローニングしたＤＮＡ断片（ＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃＹプロモーター（配列番号２２）の制
御下）を、続いて、異なる遺伝子座に組み込まれたＣｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオ
エステラーゼ遺伝子を含んでいたシネコシスティス属（Synechocystis）ＰＣＣ ６８０
３に形質転換した。
【0222】
Ｎ末端切断型Ｃｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（配列番号２０）を、大腸菌（E. coli）のＰ１５Ａ複製起点、シネコシスティス属（Synechocystis）６
８０３への相同組換えのための「ＲＳ１アップ」（配列番号２４）および「ＲＳ１ダウン
」（配列番号２５）断片、ＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃＥによって駆動されるＣｕｐｈｅａ Ｃ
ｃ１ＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子のｌａｃＩＱレプレッサーおよび選択のためのカ
ナマイシン耐性マーカーを含んでいた、シネコシスティス属（Synechocystis）組込みベ
クターＹＣ２８（配列番号２３）にクローニングした。ベクターのセグメントのＰＣＲ増
幅のためのＤＮＡ供給源材料は、シネコシスティス属（Synechocystis）ゲノムＤＮＡ、
ｐＵＣ−１９ベクター、ｐＡＣＹＣ−１８４ベクターおよび合成されたクフェア属（Cuph
ea）Ｃｃ１ＦａｔＢ１遺伝子（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ）を含有するベクタ
ーに由来する。
【0223】
実施例１に記載された機能的スクリーニングによって、脱水素酵素をコードする配列（またはその一部）を有すると同定された断片を過剰発現するために、発現ベクターも構築
した。Ｂ１０ ＯＲＦ（配列番号１）、ＮＢ１０４コンティグ断片（配列番号８）および
ＮＢ１０４ ＯＲＦ（配列番号９）を、ラン藻組込みベクターｐＳＧＩ−ＹＣ６３（配列
番号２８）と相同な、約１５ｂｐの配列を含有するプライマーを使用するライブラリース
クリーニングにおいて同定された「コンティグ」クローンから独立に増幅した。ＮＢ８部
分ＯＲＦ断片（配列番号５）も、ｐＳＧＩ−ＹＣ６３組込みベクターにクローニングした
。ｐＳＧＩ−ＹＣ６３は、選択のためのスペクチノマイシンマーカー、シネコシスティス
属（Synechocystis）のＲＳ２部位における組込みのための相同な「ＲＳ２アップ」（配
列番号２６）および「ＲＳ２ダウン」（配列番号２７）アーム、ｔｒｃＹプロモーターを
調節するためのｌａｃＩＱレプレッサー（配列番号２２）および大腸菌（E.coli）繁殖の
ためのｐＵＣ複製起点を含有していた。
【0224】
Ｃｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子構築物および脱水素酵素ＯＲＦ構築物を、ラン藻類に導入するために、シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣ
Ｃ６８０３細胞を、実質的な量の還元炭素供給源を含まないＢＧ−１１培地において、約
０．７〜０．９のＯＤ（７３０ｎｍ）に培養した。培養物の約１０ｍＬを、およそ２００
０ｇで１５分間遠沈させ、細胞ペレットを１ｍＬの新鮮ＢＧ−１１培地に再懸濁した。細
胞の３００μｌのアリコートを約１００ｎｇの組込みベクターを用いて形質転換した。細
胞を明所（８０μＥ）で約６時間インキュベートし、次いで、Ｍｉｎｉｐｏｒｅフィルタ
ー上に広げ、抗生物質を含有しないＢＧ−１１寒天プレートの頂部に置いた。プレートを
約８０μΕの光の下、約３０℃で約２４時間インキュベートした。次いで、フィルターを
、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有する新鮮ＢＧ−１１ １．５％寒天プレート上に移
し、７日間培養した。シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３のコロニ
ーを選びとり、新規寒天プレート上にパッチした。シネコシスティス属（Synechocystis
）ゲノムへの組込みのために推定脱水素酵素をコードする構築物を、抗生物質選択が、２
０μｇ／ｍＬのカナマイシンに加えて２０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含んでいた
点を除いて同一の手順を使用してＣｃ１ＦａｔＢ１で形質転換された株に形質転換した。
【0225】
Ｃｃ１ＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子および脱水素酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む培養物を、約６０ｕＥの光を用い、一定に振盪お
よび１％ ＣＯ２を用いて成長させた。誘導時のＯＤは、０．６であった。培養物を１ｍ
Ｍ ＩＰＴＧを用いて誘導した。株を、１．５ｍＬの初期容量を有する４ｍＬのガラスバ
イアル中で成長させた。６日の最後に、バイアル中に約１ｍＬの培養物が残る全バイアル
（蒸発損失のために）をガスクロマトグラフィーに付した。６８０３のＲＳ２部位に組み
込まれたＣｃＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子を有する（ＴｒｃＹプロモーターの制御
下に）が、外因性脱水素酵素遺伝子を保持しない株は、対照として働いた。
【0226】
遊離脂肪酸を、フレームイオン化検出を用いるガスクロマトグラフィー（ＧＣ）（ＧＣ−ＦＩＤ）によって解析した。ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）で内張りされた
キャップ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてキャップされた４ｍＬバ
イアル中の１ｍＬの培養物を、分析のためにＡｎａｌｙｔｉｃａｌに付した。遊離脂肪酸
Ｃ９：０、Ｃ１３：０およびＣ１７：０を各々、ヘキサン中６００μｇ／ｍｌの濃度で含
む８４マイクロリットルの内部標準（Ｉ．Ｓ．）セットを培養サンプルに添加し、続いて
、８３マイクロリットルの５０％ Ｈ２Ｓ０４、１６７マイクロリットルの５Ｍ ＮａＣ
ｌおよび１．４ミリリットルのヘキサンを添加した。各Ｉ．Ｓの最終濃度は、サンプル容
量に対して５０μｇ／ｍｌとした。Ｉ．Ｓ．セットを作製するための脂肪酸は、Ｆｌｕｋ
ａまたはＮｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ、Ｉｎｃから購入した。遊離脂肪酸の変動する反応を
考えて、３種のＩ．Ｓ．を使用した。Ｃ８：０およびＣ１０：０は較正されｗ／Ｃ９：０
Ｉ．Ｓ．；Ｃ１２：０およびＣ１４：０は、Ｃ１３：０ Ｉ．Ｓ．を使用し；残りのＣ
１６：０から１８：２ ｃｉｓ９，１２は、Ｃ１７：０ Ｉ．Ｓ．を使用した。試薬およ
びＩ．Ｓ．添加後に、培養物を、マルチチューブボルテクサーで、２，５００ｒｐｍで３
０分間ボルテックス処理した。バイアルを最終的に、２５００ｒｐｍで３分間遠心分離し
て、有機相および水相間の良好な分離を提供した。ヘキサン層をＧｅｒｓｔｅｌ ＭＰＳ
２Ｌオートサンプラーによってサンプリングした。脂肪酸サンプルを、Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ ＤＢ−ＦＦＡＰキャピラリーカラム（１０ｍの長さ、０．１０ｍｍの内径
、０．１０μｍのフィルム厚）を含むＦＩＤ（フレームイオン化検出器）を備えたＡｇｉ
ｌｅｎｔモデル７８９０Ａガスクロマトグラフで解析した。ＧＣオーブンを、以下の通り
にプログラムした：１２０℃で０．１分、次いで、４０℃／分で２４０℃に加熱した（３
分間維持）。インジェクター温度は、２５０℃で維持し、４０：１スプリット１．０μｌ
インジェクションを使用した。キャリヤーガスとして水素を０．５９９９ｍｌ／分の流速
で使用した。ＦＩＤは３２０Ｃに設定した。分析物は、個々にインジェクトされた標準に
対する保持時間の比較によって同定した。分析物の較正範囲は、Ｃ８：０−Ｃ１６：１脂
肪酸について２．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、Ｃ１８：０−Ｃ１８：２脂肪酸につ
いて０．６２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌとした。各分析物の定量化限界は、Ｃ１８：
０、Ｃ１８：ｌ ｃｉｓ９（１．２５ｕｇ／ｍＬ）およびＣ１８：２ ｃｉｓ９，１２（
２．５μｇ／ｍＬ）を除く、較正範囲に列挙される最低濃度とした。全細胞培養物への添
加および回収実験は、抽出方法によって、Ｃ１６：１ ｃｉｓ９（７４％）、Ｃ１８：１
ｃｉｓ９（６３％）およびＣ１８：２ ｃｉｓ９，１２（６４％）を除いて、このサン
プルバッチ実施中の各分析物について８５％〜１１５％内で一貫して回収されたことを示
した。
【0227】
これらの操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株によって製造された遊離脂肪酸の総量が、図１に提供されている。Ｃｃ１ＦａｔＢ１チオエステラーゼをコードす
る配列（配列番号２０）とともに、Ｂ１０ ＯＲＦ（「ｄｅｈｙｄｒｄ」；配列番号１）
、ＮＢ８部分ＯＲＦ断片（配列番号５）、ＮＢ１０４ ＯＲＦ（「６−Ｐ−ｄｅ」；配列
番号９）およびＮＢ１０４ ＯＲＦ全コンティグ断片（配列番号８）を発現するシネコシ
スティス属（Synechocystis）株は、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼ遺伝子単独を含
有していた対照株と比較して、高レベルの遊離脂肪酸を製造したということがわかる。図
２は、スクリーニングから得られた、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼおよび脱水素酵
素遺伝子を含むこの実験株において、スクリーニングが、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラ
ーゼを発現したが、脱水素酵素遺伝子を欠いた株の細胞密度よりも４〜５倍高い培養物を
達成できたことを実証する。
【実施例3】
【0228】
脂肪酸製造を増強した遺伝子を発現させる効果をさらに調べるために、Ｂ１０（２−ヒドロキシ酸脱水素酵素ＮＡＤ結合ドメインタンパク質）遺伝子およびＮＢ１０４（６−ホ
スホグルコン酸脱水素酵素）遺伝子を、ＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラー
ゼ遺伝子と一緒に発現するよう操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株を、
細胞の酸化還元状態を変更するその能力について評価した。対照として、ＲＳ２部位にＣ
ｃ１ＦａｔＢ１遺伝子が組み込まれた組込みベクターｐＳＧＩ−ＹＣ６３（１Ａ／ＹＣ６
３）を、さらなる脱水素酵素遺伝子を有さない独立したシネコシスティス属（Synechocys
tis）６８０３株において発現させた。導入遺伝子（「６８０３」）を有さないシネコシ
スティス属（Synechocystis）６８０３を、さらなる対照として含めた。細胞を、６０μ
Ｅの一定光条件下で、振盪しながら成長させ、０．５のＯＤ７３０で１ｍＭ ＩＰＴＧを
添加することによって誘導し、チオエステラーゼを、存在する場合には、推定脱水素酵素
を発現させた。サンプルを２４時間毎に３日間収集した。
【0229】
脱水素酵素遺伝子を用いて操作されたシネコシスティス属（Synechocystis）株および対照株の酸化還元状態を決定するために、酵素アッセイを実施して、誘導後１、２および
３日で採取したサンプルでＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を決定した。この目的には、ＮＡＤ
Ｐ／ＮＡＤＰＨ定量化キット（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖ
ｉｅｗ、ＣＡ）を使用した。アッセイキット中の酵素は、酵素サイクリング反応において
ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを特異的に認識する。アッセイのために、各時点について、およ
そ１．５×１０７個の細胞を、アッセイキットとともに提供される１ｍｌのＮＡＤＰＨ抽
出バッファー中に溶解した。細胞を、液体窒素中の２回の凍結／解凍サイクルおよび４ラ
ウンドのビードビーティング（bead beating）に付した。次いで、溶解物を遠心分離し、
上清を１０Ｋカットオフカラムで濾過した。すべての光合成色素およびＮＡＤＰＨを消費
し得る酵素は、フィルター膜上に保持される。濾液は、小さな代謝産物のみからなり、Ｎ
ＡＤＰＨアッセイにおいて使用した。アッセイキットは、総ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰ＋および
ＮＡＤＰＨ）ならびにＮＡＤＰＨの測定を可能にした。ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比は、総
ＮＡＤＰからＮＡＤＰＨの量を差し引いて、ＮＡＤＰ＋の量を提供すること、次いで、Ｎ
ＡＤＰＨの量を、ＮＡＤＰ＋の算出された量によって除することによって決定した。
【0230】
アッセイ結果は、図３に要約されている。図３は、連続する実験日でのＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比を示す。対照株野生型シネコシスティス属（Synechocystis）ＰＣＣ６８０
３では、ＮＡＤＰＨは、培養における各さらなる日数につれて、ＮＡＤＰ＋に対して減少
する。外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃｃ１ＦａｔＢ１を発現する株は、野生
型細胞と比較した場合に、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比の著しい低下を示す。これは、脂
肪酸生合成プロセスが広範な還元力を必要とすると知られているので予測された。しかし
、この実験では、外来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを発現する株への脱水素酵素遺伝
子の付加は、ＮＡＤＰＨ対ＮＡＤＰ＋の比を増大し、ＮＢ１０４（６−ホスホグルコン酸
脱水素酵素）遺伝子は、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比に対して、Ｂ１０（２−ヒドロキシ酸
脱水素酵素ＮＡＤ結合ドメインタンパク質）遺伝子よりも大きな効果を有する。ＮＡＤＰ
Ｈ対ＮＡＤＰ＋の比は、野生型レベルには入らないが、アシルＡＣＰチオエステラーゼ単
独を発現する株よりも少なくとも２倍高い。
【0231】
したがって、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼととものシネコシスティス属（Synechocystis）６８０３におけるＢ１０ ＯＲＦまたはＮＢ１０４ ＯＲＦの発現は、細胞の
ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を高め（図３）、６日での培養密度によって測定されるような
株の高い増殖速度を可能にし（図２）、すべての鎖長の遊離脂肪酸の高い製造にもつなが
った（図１）。ＮＢ１０４ ＯＲＦは、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、ペントースリ
ン酸経路の酵素の一部（図４）をコードする。この経路は、６Ｃ糖からヌクレオチドおよ
び核酸生合成において使用される５Ｃ糖を製造する。ペントースリン酸経路は、脂肪酸生
合成などの細胞内の還元性整合性反応のために使用される、ＮＡＤＰＨの形態の還元性等
価物の生成において役立つ。
【実施例4】
【0232】
メタゲノムライブラリーから得られたＮＢ１０４ ＯＲＦは、エンテロコッカス（Enterococcus）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素の一部をコードしていた。シネコシスティス
属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３から得られた６−ホスホグルコン酸脱水素酵素酵
素遺伝子（配列番号１２）の過剰発現も試験して、エンテロコッカス属（Enterococcus）
由来の６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝子と同一効果を発揮するかどうかを調べた。
したがって、シネコシスティス（Synechocystis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素遺伝
子ｓｌｌ０２３９（受託ＢＡＡ１０１０５；ＧＩ：１００１４７９；配列番号１２）をＹ
Ｃ６３構築物中にクローニングし、これでは、ｔｒｃＹプロモーターの制御下に置かれ、
ｔｒｃＥプロモーター（配列番号３０）によって調節され、ＲＳ１部位で組み込まれてい
るＣｃｌＦａｔＢ１アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を発現するシネコシスティス
属（Synechocystis）株のＲＳ２部位に組み込まれる。得られた株を、ｔｒｃＹプロモー
ターからアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子（ＲＳ２部位で組み込まれた）のみを発
現した対照シネコシスティス属（Synechocystis）種ＰＣＣ６８０３株とともに、脂肪酸
製造について試験した。この実験では、高いレベルの遊離脂肪酸製造を得るよう高い密度
に達した後に株を誘導した。手短には、５．０ ＯＤ等価細胞を遠沈させ、１ｍＭ ＩＰ
ＴＧおよび適当な抗生物質を含有する新鮮なＢＧ１１培地に再懸濁した。最終培養容量は
１．５ｍｌとした。これらの株を、４ｍＬガラスバイアル中で、一定に振盪しながら、６
０ｕＥの光強度および１％ ＣＯ２を用いて成長させた。細胞が比較的高密度で誘導され
、誘導下で６日間培養されるこの実施例では、相同なシネコシスティス（Synechocystis
）脱水素酵素遺伝子の発現はまた、遊離脂肪酸の量を増大した（図５）。サンプルの脂肪
酸解析を、実施例２におけるように実施した。
【0233】
天然シネコシスティス（Synechocystis）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素酵素は、ＣｃｌＦａｔＢ１チオエステラーゼ単独を発現する株と比較して、ＦＦＡを少なくとも２倍
増大した（図５）。模様の入ったバーは、シネコシスティス属（Synechocystis）におい
て、ＣｃｌＦａｔＢ１とともにクローニングされた天然シネコシスティス（Synechocysti
s）６８０３ ６−ホスホグルコン酸脱水素酵素酵素に相当する。したがって、本発明者
らは、光独立栄養的に（培養物の成長または増殖を支援する還元炭素供給源を伴わずに）
培養された光合成微生物を含めた生物における、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素などの
ＮＡＤＰＨ生成性脱水素酵素の過剰発現は、増殖速度を改善し、培養物による遊離脂肪酸
の全体的な収率を増強すると結論付ける。
【0234】
概要および要約の節は、発明者によって考慮される１つまたは複数ではあるが、すべてではない本発明の例示的実施形態を示し得、したがって、決して、本発明および添付の特
許請求の範囲を制限するよう意図するものではない。
【0235】
特定の実施形態の前記の説明は、他者が、当技術分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、こ
のような特定の実施形態を容易に修飾および／または種々の適用のために適応させること
ができる本発明の一般的な性質を示す。したがって、このような適応および修飾は、本明
細書において示された教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味お
よび範囲内にあるものとし、本発明の広がりおよび範囲は、上記の例示的実施形態のいず
れかによって制限されてはならない。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]
【手続補正書】
【提出日】2017年3月9日
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脂質を製造する光合成微生物を培養する方法であって、
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およびチオエステラーゼをコードする非天然遺伝子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およびチオエステラーゼをコードする非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべての点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有する、方法。
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およびチオエステラーゼをコードする非天然遺伝子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子およびチオエステラーゼをコードする非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべての点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有する、方法。
【請求項2】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項11】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
脱水素酵素が、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項14】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、組換え光合成微生物に対して内因性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
組換え光合成微生物が、微細藻類である、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
組換え光合成微生物が、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）またはボルボックス属（Volvox）の種である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
組換え光合成微生物が、ラン藻である、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
組換え光合成微生物が、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）の種である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含む組換え光合成微生物であって、チオエステラーゼをコードする少なくとも第２の非天然遺伝子をさらに含み、
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え光合成微生物。
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え光合成微生物。
【請求項23】
脂質が、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドである、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項24】
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項25】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項２４に記載の組換え光合成微生物。
【請求項26】
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項２５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項27】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の組換え光合成微生物。
【請求項28】
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の組換え光合成微生物。
【請求項29】
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項２５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項30】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の組換え光合成微生物。
【請求項31】
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の組換え光合成微生物。
【請求項32】
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項２５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項33】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項34】
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の組換え光合成微生物。
【請求項35】
組換え光合成微生物が、微細藻類である、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項36】
組換え光合成微生物が、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される属の種である、請求項３５に記載の組換え光合成微生物。
【請求項37】
組換え光合成微生物が、ラン藻である、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【請求項38】
組換え光合成微生物が、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）およびゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択される属の種である、請求項３７に記載の組換え光合成微生物。
【請求項39】
配列番号２９に対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列およびチオエステラーゼをコードする核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む発現カセット。
【請求項40】
核酸配列は、配列番号２９に対して、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３９に記載の発現カセット。
【請求項41】
チオエステラーゼが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項42】
チオエステラーゼが、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項２２に記載の組換え光合成微生物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0008】
非天然遺伝子または組換え核酸分子によってコードされる脱水素酵素は、酸化反応においてＮＡＤＰを使用し得る脱水素酵素であり得る。さらに、またはあるいは、非天然遺伝子は、宿主微生物に対して異種（異なる種から誘導される）または同種（同じ種から誘導される）である脱水素酵素をコードし得、特定の態様では、非天然遺伝子は、宿主微生物における過剰発現のために操作された内因性遺伝子であり得る。種々の例では、脱水素酵素は、アルデヒド脱水素酵素（例えば、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素または非リン酸化型グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．９）を含む）、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素であり得る。例えば、組換え微生物は、いくつかの例では、配列番号４、配列番号４６または配列番号７のアミノ酸配列またはその活性断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得、いくつかの例では、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、脱水素酵素は、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得、いくつかの例では、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素であり得る。あるいは、またはさらに、組換え微生物は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含み得る。６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、いくつかの例では、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列またはその活性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0015】
方法は、培養物から少なくとも１種の脂質を単離することをさらに含み得る。脂質は、細胞、培地または全培養物から単離され得る。また、本明細書において提供される方法または組換え微生物のいずれかによって製造される脂質も本明細書において提供される。脂質は、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ワックスエステル、アルカン、アルケン、リン脂質、ガラクト脂質もしくはトリグリセリドのいずれかまたはいずれかの組合せであり得る。脂質は、１２から２４個の間の炭素原子、例えば、１２から１８個の炭素原子などの８から２４個の炭素原子を含有する少なくとも１種のアシル鎖を含み得る。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0235】
特定の実施形態の前記の説明は、他者が、当技術分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、過度の実験を行うことなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を容易に修飾および／または種々の適用のために適応させることができる本発明の一般的な性質を示す。したがって、このような適応および修飾は、本明細書において示された教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内にあるものとし、本発明の広がりおよび範囲は、上記の例示的実施形態のいずれかによって制限されてはならない。以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
脂質を製造する微生物を培養する方法であって、
脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のための少なくとも１種の遺伝子が発現される条件下、適した培養培地中に、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子および脂質の製造のためのポリペプチドをコードする少なくとも１種の非天然遺伝子を含む組換え微生物の培養物を提供することを含み、
ここで、培養物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を含まない点を除いてすべての点で同一である対照微生物を含む培養物が製造するものよりも、多い量の脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を含む組換え微生物は、非天然脱水素酵素をコードする遺伝子を欠く対照微生物よりも、高い成長および／または増殖速度を有する、方法。
［２］
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１に記載の方法。
［３］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
［４］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［５］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
［６］
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［７］
メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９またはその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
［８］
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［９］
Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
［１０］
脱水素酵素が、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素である、請求項３に記載の方法。
［１１］
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
［１２］
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素が、組換え微生物に対して内因性である、請求項１０に記載の方法。
［１３］
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択されるラン藻の種である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
組換え光合成微生物が、光独立栄養的に培養される、請求項１３または請求項１４のいずれかに記載の方法。
［１６］
脱水素酵素をコードする第１の非天然遺伝子を含む組換え微生物であって、脂質の製造に関与している酵素をコードする少なくとも第２の非天然遺伝子をさらに含み、酵素が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、ヒドロキシベンゾイルチオエステラーゼ、脂質分解活性を有するポリペプチド、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ワックスシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デカルボニラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＰＡＰおよびＤＧＡＴからなる群から選択され、
脂質を製造し、
さらに、脱水素酵素をコードする非天然遺伝子を欠く、そうでなければ同一である微生物よりも高い成長および／または増殖速度を有する、組換え微生物。
［１７］
脂質が、脂肪酸、脂肪酸誘導体またはトリグリセリドである、請求項１６に記載の組換え微生物。
［１８］
脱水素酵素が、ＮＡＤＰ依存性脱水素酵素である、請求項１６または請求項１７のいずれかに記載の組換え微生物。
［１９］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素またはリンゴ酸酵素である、請求項１８に記載の組換え微生物。
［２０］
脱水素酵素が、アルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
［２１］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号４またはその活性断片に対して少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の組換え微生物。
［２２］
脱水素酵素が、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
［２３］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号１８、配列番号１９およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の組換え微生物。
［２４］
脱水素酵素が、Ｄ−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素である、請求項１９に記載の組換え微生物。
［２５］
アルデヒド脱水素酵素が、配列番号２、配列番号２９、配列番号１５、配列番号１６およびその活性断片からなる群に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
［２６］
組換え微生物が、組換え光合成微生物、好ましくは、微細藻類、より好ましくは、アクナンテス属（Achnanthes）、アンフィプローラ属（Amphiprora）、アンフォラ属（Amphora）、アンキストロデスムス属（Ankistrodesmus）、アステロモナス属（Asteromonas）、ボエケロビア属（Boekelovia）、ボロジネラ属（Borodinella）、ボトリオコッカス属（Botryococcus）、ブラクテオコッカス属（Bracteococcus）、カエトセロス属（Chaetoceros）、カルテリア属（Carteria）、クラミドモナス属（Chlamydomonas）、クロロコッカム属（Chlorococcum）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロレラ属（Chlorella）、クロオモナス属（Chroomonas）、クリソスファエラ属（Chrysosphaera）、クリコスファエラ属（Cricosphaera）、クリプテコディニウム属（Crypthecodinium）、クリプトモナス属（Cryptomonas）、シクロテラ属（Cyclotella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、エリプソイドン属（Ellipsoidon）、エミリアニア属（Emiliania）、エレモスファエラ属（Eremosphaera）、エルノデスミウス属（Ernodesmius）、ユーグレナ属（Euglena）、フランセイア属（Franceia）、フラギラリア属（Fragilaria）、グロエオサムニオン属（Gloeothamnion）、ヘマトコッカス属（Haematococcus）、ハロカフェテリア属（Halocafeteria）、ヒメノモナス属（Hymenomonas）、イソクリシス属（Isochrysis）、レポシンクリス属（Lepocinclis）、ミクラクチニウム属（Micractinium）、モノラフィジウム属（Monoraphidium）、ナノクロリス属（Nannochloris）、ナノクロロプシス属（Nannochloropsis）、ナビクラ属（Navicula）、ネオクロリス属（Neochloris）、ネフロクロリス属（Nephrochloris）、ネフロセルミス属（Nephroselmis）、ニツスチア属（Nitzschia）、オクロモナス属（Ochromonas）、オエドゴニウム属（Oedogonium）、オオサイスティス属（Oocystis）、オストレオコッカス属（Ostreococcus）、パブロバ属（Pavlova）、パラクロレラ属（Parachlorella）、パスケリア属（Pascheria）、ファエオダクチラム属（Phaeodactylum）、ファガス属（Phagus）、ピコクロラム属（Picochlorum）、プラチモナス属（Platymonas）、プレウロクリシス属（Pleurochrysis）、プレウロコッカス属（Pleurococcus）、プロトテカ属（Prototheca）、シュードクロレラ属（Pseudochlorella）、シュードネオクロリス属（Pseudoneochloris）、ピラミモナス属（Pyramimonas）、ピロボトリス属（Pyrobotrys）、スセネデスムス属（Scenedesmus）、スケレトネマ属（Skeletonema）、スピロギラ属（Spyrogyra）、スチココッカス属（Stichococcus）、テトラセルミス属（Tetraselmis）、タラシオシーラ属（Thalassiosira）、ビリジエラ属（Viridiella）およびボルボックス属（Volvox）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
［２７］
組換え微生物が、ラン藻、好ましくは、アグメネルム属（Agmenellum）、アナバエナ属（Anabaena）、アナバエノプシス属（Anabaenopsis）、アナシスティス属（Anacystis）、アファニゾメノン属（Aphanizomenon）、アルスロスピラ属（Arthrospira）、アステロカプサ属（Asterocapsa）、ボルジア属（Borzia）、カロトリックス属（Calothrix）、カマエシフォン属（Chamaesiphon）、クロログロエオプシス属（Chlorogloeopsis）、クロコッシディオプシス属（Chroococcidiopsis）、クロコッカス属（Chroococcus）、クリナリウム属（Crinalium）、シアノバクテリウム属（Cyanobacterium）、シアノビウム属（Cyanobium）、シアノシスティス属（Cyanocystis）、シアノスピラ属（Cyanospira）、シアノセイス属（Cyanothece）、シリンドロスペルモプシス属（Cylindrospermopsis）、シリンドロスペルマム属（Cylindrospermum）、ダクチロコッコプシス属（Dactylococcopsis）、デルモカルペラ属（Dermocarpella）、フィッシェレラ属（Fischerella）、フレミエラ属（Fremyella）、ゲイトレリア属（Geitleria）、ゲイトレリネマ属（Geitlerinema）、グロエオバクター属（Gloeobacter）、グロエオカプサ属（Gloeocapsa）、グロエオセイス属（Gloeothece）、ハロスピルリナ属（Halospirulina）、イエンガリエラ属（Iyengariella）、レプトリンビア属（Leptolyngbya）、リムノスリックス属（Limnothrix）、リンビア属（Lyngbya）、ミクロコレウス属（Microcoleus）、ミクロキスティス属（Microcystis）、ミクソサルシナ属（Myxosarcina）、ノデュラリア属（Nodularia）、ノストック属（Nostoc）、ノストコプシス属（Nostochopsis）、オシラトリア属（Oscillatoria）、フォルミジウム属（Phormidium）、プランクトスリックス属（Planktothrix）、プレウロカプサ属（Pleurocapsa）、プロクロロコッカス属（Prochlorococcus）、プロクロロン属（Prochloron）、プロクロロスリックス属（Prochlorothrix）、シュードアナベナ属（Pseudanabaena）、リブラリア属（Rivularia）、シゾスリックス属（Schizothrix）、サイトネマ属（Scytonema）、スピルリナ属（Spirulina）、スタニエリア属（Stanieria）、スタリア属（Starria）、スティゴネマ属（Stigonema）、シンプロカ属（Symploca）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、サーモシネココッカス属（Thermosynechococcus）、トリポスリックス属（Tolypothrix）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、チコネマ属（Tychonema）またはゼノコッカス属（Xenococcus）からなる群から選択される微細藻類の種である、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
［２８］
配列番号２９に対して、少なくとも６５％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【外国語明細書】