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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2017-153370(P2017-153370A)
(43)【公開日】2017年9月7日
(54)【発明の名称】シイタケの品種識別法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20060101AFI20170810BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20170810BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 AZNA
C12N15/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】28
(21)【出願番号】特願2016-36584(P2016-36584)
(22)【出願日】2016年2月29日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２７年８月３０日発行の平成２７年日本きのこ学会第１９回大会講演要旨集，第８３頁（日本きのこ学会第１９回大会実行委員会）にて発表 〔刊行物等〕 平成２７年９月４日に日本きのこ学会第１９回大会（つくば国際会議場）にて展示
(71)【出願人】
【識別番号】504203572
【氏名又は名称】国立大学法人茨城大学
(71)【出願人】
【識別番号】390039963
【氏名又は名称】森産業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100069903
【弁理士】
【氏名又は名称】幸田 全弘
(74)【代理人】
【識別番号】100101166
【弁理士】
【氏名又は名称】斎藤 理絵
(74)【代理人】
【識別番号】100157509
【弁理士】
【氏名又は名称】小塩 恒
(72)【発明者】
【氏名】井上 栄一
(72)【発明者】
【氏名】田中 徳夫
【テーマコード（参考）】
4B024
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B024AA05
4B024AA07
4B024AA11
4B024BA80
4B024CA01
4B024CA11
4B024GA30
4B024HA14
4B024HA20
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ07
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR40
4B063QR62
4B063QR76
4B063QS25
4B063QS34
(57)【要約】
【課題】 シイタケの品種識別を、迅速かつ高精度に行うことができる品種識別法を提供する。【解決手段】 このシイタケの品種識別法は、シイタケの遺伝子のＳＳＲ領域を指標としてシイタケの品種を識別するもので、特に、シイタケのオルガネラを含む全ゲノム上に存在する、２塩基ないし５塩基の反復配列が連続した、ＳＳＲ領域の任意の塩基配列を用いて作成したプライマーからなるプライマーセットを使用して、識別対象のシイタケの品種毎に、そのオルガネラを含む全ゲノムに対してＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することで品種の識別を行うものである。
このような構成によって、シイタケの品種を迅速かつ高精度に識別することができる。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シイタケの遺伝子のＳＳＲ領域を指標として、シイタケの品種を識別すること
を特徴とするシイタケの品種識別法。
を特徴とするシイタケの品種識別法。
【請求項2】
シイタケのオルガネラを含む全ゲノム上に存在する、２塩基ないし５塩基の反復配列が連続したＳＳＲ領域の任意の塩基配列を用いて作成した、オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを使用して、識別対象のシイタケの品種毎にそのオルガネラを含む全ゲノムに対してＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することで品種の識別を行うこと
を特徴とする請求項１に記載のシイタケの品種識別法。
を特徴とする請求項１に記載のシイタケの品種識別法。
【請求項3】
前記ＳＳＲ領域は、
配列番号１〜１２に記載の反復配列若しくはその一部からなる反復配列からなる群より選ばれる１以上の領域であること
を特徴とする請求項１又は２に記載のシイタケの品種識別法。
配列番号１〜１２に記載の反復配列若しくはその一部からなる反復配列からなる群より選ばれる１以上の領域であること
を特徴とする請求項１又は２に記載のシイタケの品種識別法。
【請求項4】
前記プライマーセットは、
ＭＬＥＸ００１（配列番号１３，１４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００２（配列番号１５，１６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００３（配列番号１７，１８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００４（配列番号１９，２０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００５（配列番号２１，２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００６（配列番号２３，２４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００７（配列番号２５，２６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００８（配列番号２７，２８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００９（配列番号２９，３０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１０（配列番号３１，３２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１１（配列番号３３，３４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
及び
ＭＬＥＸ０１２（配列番号３５，３６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
からなる群より選ばれたものであること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のシイタケの品種識別法。
ＭＬＥＸ００１（配列番号１３，１４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００２（配列番号１５，１６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００３（配列番号１７，１８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００４（配列番号１９，２０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００５（配列番号２１，２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００６（配列番号２３，２４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００７（配列番号２５，２６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００８（配列番号２７，２８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００９（配列番号２９，３０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１０（配列番号３１，３２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１１（配列番号３３，３４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
及び
ＭＬＥＸ０１２（配列番号３５，３６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
からなる群より選ばれたものであること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のシイタケの品種識別法。
【請求項5】
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、２塩基ないし５塩基反復配列のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、２塩基ないし５塩基反復配列のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
【請求項6】
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、２塩基反復配列が（ＧＴ）６ または（ＣＡ）５ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、２塩基反復配列が（ＧＴ）６ または（ＣＡ）５ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
【請求項7】
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、３塩基反復配列が、
（ＣＴＴ）５ ＣＴＣＣＡＴ（ＣＣＴ）３ 、
（ＧＧＣ）４ 、
（ＣＧＡ）４ 、
（ＧＣＣ）４ 、
（ＧＧＣ）２ ＧＧＴ（ＧＧＣ）４ 、
（ＧＧＣ）２（ＧＧＡ）２、（ＧＧＣ）４ 、
（ＣＣＧ）２ＴＧＣＴ（ＣＧＣ）２
のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、３塩基反復配列が、
（ＣＴＴ）５ ＣＴＣＣＡＴ（ＣＣＴ）３ 、
（ＧＧＣ）４ 、
（ＣＧＡ）４ 、
（ＧＣＣ）４ 、
（ＧＧＣ）２ ＧＧＴ（ＧＧＣ）４ 、
（ＧＧＣ）２（ＧＧＡ）２、（ＧＧＣ）４ 、
（ＣＣＧ）２ＴＧＣＴ（ＣＧＣ）２
のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
【請求項8】
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、３塩基ないし４塩基反復配列が（ＧＧＡＡ）２ ＧＧ（ＧＧＡ）３ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、３塩基ないし４塩基反復配列が（ＧＧＡＡ）２ ＧＧ（ＧＧＡ）３ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
【請求項9】
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、５塩基反復配列が（ＣＣＡＣＡ）５ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、５塩基反復配列が（ＣＣＡＣＡ）５ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とする請求項２に記載のシイタケの品種識別法。
【請求項10】
シイタケのオルガネラを含む全ゲノム上に存在する、２塩基ないし５塩基の反復配列が連続したＳＳＲ領域の任意の塩基配列を用いて作成したプライマーからなること
を特徴とするプライマーセット。
を特徴とするプライマーセット。
【請求項11】
ＭＬＥＸ００１（配列番号１３，１４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００２（配列番号１５，１６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００３（配列番号１７，１８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００４（配列番号１９，２０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００５（配列番号２１，２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００６（配列番号２３，２４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００７（配列番号２５，２６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００８（配列番号２７，２８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００９（配列番号２９，３０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１０（配列番号３１，３２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１１（配列番号３３，３４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
及び
ＭＬＥＸ０１２（配列番号３５，３６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
からなる群より選ばれたものであること
を特徴とする請求項１０に記載のプライマーセット。
ＭＬＥＸ００２（配列番号１５，１６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００３（配列番号１７，１８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００４（配列番号１９，２０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００５（配列番号２１，２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００６（配列番号２３，２４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００７（配列番号２５，２６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００８（配列番号２７，２８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００９（配列番号２９，３０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１０（配列番号３１，３２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１１（配列番号３３，３４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
及び
ＭＬＥＸ０１２（配列番号３５，３６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
からなる群より選ばれたものであること
を特徴とする請求項１０に記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この発明は、シイタケの品種識別法に関するものである。より詳しくは、シイタケの品種識別を、迅速かつ高精度に行うことができる品種識別法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
菌類、特にキノコ類の品種の識別は、一般的に形態的、生理的特徴に基づいて行われている。しかしながら、形態的、生理的特徴に基づく品種の識別法では、類似した形態的、生理的特徴を有する品種を精度よく識別するのは困難である。
かつ、前記の方法は、熟練を要し、時に再現性、迅速性に乏しいという解決すべき課題を有していた。
【0003】
前記形態的、生理的特徴に基づく品種の識別法の特徴は、遺伝子（ＤＮＡ）の表現形質であって、遺伝子そのものを解することにより菌株（品種）を決定することは、客観性、再現性、簡便性など従来の方法と比べて多くの利点を有すると考えられる。そこで、このような遺伝子情報（ゲノム配列）を利用した品種識別法が提案されている。
【0004】
例えば、タンパク質生合成の場であるリボソームを構成するｒＲＮＡの塩基配列は、種を越えてよく保存されていることから、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の両側に位置するＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）塩基配列を比較する方法や、ｒＲＮＡ遺伝子の５Ｓ遺伝子の両側に位置するＩＧＳ（ＩＧＳ１，ＩＧＳ２：ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒｓ）塩基配列を、比較する方法が提案されている。
【0005】
さらに、集団の中で１％以上の頻度で多型が存在する遺伝子座位は、多型性部位と呼ばれ、この多型性部位を、多型性ＤＮＡマーカーとして利用して同一種内の個体間の識別を行う方法が知られている。
【0006】
例えば、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法は、制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片のサイズが、同一種内の個体間で異なる（多型を示す）ことを利用するものである。
【0007】
一方、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）法は、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ランダムプライマーの存在下でＰＣＲによって増幅した際、ゲノムＤＮＡの塩基配列に差異があると、プライマーの結合に差異が生じ、ランダムプライマーでＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片のサイズや、数が異なることを利用するもので、その差異を、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で検出するものである。
【0008】
他方、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法は、１〜２種類の制限酵素で処理した制限酵素断片に、塩基配列が既知のアダプターを連結し、このアダプター配列に１〜３塩基を付加したプライマーを用いてＰＣＲで増幅して、増幅断片長の多型を解析する手法である。
【0009】
さらにまた、遺伝的多型性を利用して菌類の個体（品種）を識別する方法の一例が、特許文献１及び２に開示されている。
【0010】
例えば、特開２０００−３２５０８４号公報（特許文献１）においては、菌類の個体（品種）を簡便かつ精度よく識別できる方法が提案されている。
【0011】
この品種識別法は、菌類、特にキノコ類のｒＲＮＡ遺伝子の転写単位間に存在する高頻度重複領域を指標として、菌類の品種を識別することを特徴とするものである。
【0012】
さらに、特開２０１３−２５５４６６号公報（特許文献２）においては、ブナシメジの品種ごとにおいて、ＳＳＲマーカーの増幅断片長の多型との関連づけを行うことで、多数のブナシメジ品種の品種識別を、網羅的かつ容易にすることができる方法が提案されている。
【0013】
この品種識別方法は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上に、コードされた４塩基ないし６塩基の反復配列の両端からそれぞれ外側へ、５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列であって、その反復配列の前及び後から各１配列ずつを選択して、設計されたプライマーセットを使用して、識別対象のブナシメジの全ゲノム上からＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うものである。【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】特開２０００−３２５０８４号公報（特許請求の範囲）
【特許文献2】特開２０１３−２５５４６６号公報（特許請求の範囲）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
前記ＩＴＳ塩基配列やＩＧＳ塩基配列を比較する方法では、比較対象の塩基配列を解読しなければならないので、品種を識別するまで時間を要するという問題があった。
【0016】
前記ＲＦＬＰ法は、制限酵素断片長多型を検出する操作が煩雑で、時間が掛かり、検出に多量のＤＮＡを要し、微量のサンプルからの検出には、使用できないという問題があった。
【0017】
前記ＲＡＰＤ法は、鋳型ＤＮＡとプライマーとの量比やアニーリング温度、ＰＣＲ装置などの僅かなＰＣＲ条件によって、増幅結果が異なることがあるという問題や、増幅バンドが多いことから、識別判定に誤りを生じる可能性があるという問題があった。
【0018】
前記ＡＦＬＰ法は、一回の反応で、多数のゲノムＤＮＡ領域の多型を分析できる利点があるが、やや再現性に劣るという問題があった。
【0019】
前記特許文献１に記載されている品種識別法は、菌類、特にシイタケの品種識別を簡便かつ精度よく行うことができるが、シイタケの品種識別を、より一層迅速かつ高精度に行うことができる方法の開発が求められている。
【0020】
前記特許文献２に記載されている品種識別法は、ブナシメジのためのもので、シイタケの品種識別を、迅速かつ高精度に行うことができる方法の開発が求められている。
【0021】
かかる現状に鑑み、発明者らは、シイタケの品種識別を、迅速かつ高精度に行うことができる品種識別法を提供することを目的として検討を行なった。
【0022】
発明者らは、シイタケにも存在するマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）である単純反復配列（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ； ＳＳＲ）に着目し、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、２塩基ないし５塩基反復配列のＳＳＲ領域は、各品種（個体ないし菌株）間で反復配列とその数が相違しており、当該ＳＳＲ領域を、特異的に増幅することが可能なプライマーセットを作成した。さらに、当該プライマーセットを用いて、シイタケ遺伝子を鋳型としたＰＣＲを行い、得られた増幅産物を解析することによって、シイタケの品種を、迅速かつ高精度に識別することができることを見出して、この発明を完成させたものである。
【課題を解決するための手段】
【0023】
すなわち、この発明の請求項１に記載の発明は、シイタケの遺伝子のＳＳＲ領域を指標として、シイタケの品種を識別すること
を特徴とするシイタケの品種識別法である。
【0024】
この発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のシイタケの品種識別法において、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノム上に存在する、２塩基ないし５塩基の反復配列が連続したＳＳＲ領域の任意の塩基配列を用いて作成した、オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを使用して、識別対象のシイタケの品種毎に、そのオルガネラを含む全ゲノムに対してＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することで品種の識別を行うこと
を特徴とするシイタケの品種識別法である。
【0025】
この発明の請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載のシイタケの品種識別法において、
前記ＳＳＲ領域は、
配列番号１〜１２に記載の反復配列若しくはその一部からなる反復配列からなる群より選ばれる１以上の領域であること
を特徴とするものである。
【0026】
この発明の請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載のシイタケの品種識別法において、
前記プライマーセットは、
ＭＬＥＸ００１（配列番号１３，１４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００２（配列番号１５，１６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００３（配列番号１７，１８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００４（配列番号１９，２０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００５（配列番号２１，２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００６（配列番号２３，２４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００７（配列番号２５，２６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００８（配列番号２７，２８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００９（配列番号２９，３０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１０（配列番号３１，３２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１１（配列番号３３，３４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
及び
ＭＬＥＸ０１２（配列番号３５，３６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
からなる群より選ばれたものであること
を特徴とするものである。
【0027】
この発明の請求項５に記載の発明は、請求項２に記載のシイタケの品種識別法において、
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、２塩基ないし５塩基反復配列のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とするものである。
【0028】
この発明の請求項６記載の発明は、請求項２に記載のシイタケの品種識別法において、
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、２塩基反復配列が（ＧＴ）６ または（ＣＡ）５ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とするものである。
【0029】
この発明の請求項７に記載の発明は、請求項２に記載のシイタケの品種識別法において、
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、３塩基反復配列が、
（ＣＴＴ）５ ＣＴＣＣＡＴ（ＣＣＴ）３ 、
（ＧＧＣ）４ 、
（ＣＧＡ）４ 、
（ＧＣＣ）４ 、
（ＧＧＣ）２ ＧＧＴ（ＧＧＣ）４ 、
（ＧＧＣ）２（ＧＧＡ）２ 、（ＧＧＣ）４ 、
（ＣＣＧ）２ＴＧＣＴ（ＣＧＣ）２
のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とするものである。
【0030】
この発明の請求項８に記載の発明は、請求項２に記載のシイタケの品種識別法において、
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、３塩基ないし４塩基反復配列が（ＧＧＡＡ）２ ＧＧ（ＧＧＡ）３ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とするものである。
【0031】
この発明の請求項９に記載の発明は、請求項２に記載のシイタケの品種識別法において、
前記プライマーセットは、
シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、５塩基反復配列が（ＣＣＡＣＡ）５ のＳＳＲ領域を増幅すること
を特徴とするものである。
【0032】
この発明の請求項１０に記載の発明は、シイタケのオルガネラを含む全ゲノム上に存在する、２塩基ないし５塩基の反復配列が連続したＳＳＲ領域の任意の塩基配列を用いて作成したプライマーからなること
を特徴とするプライマーセットである。
【0033】
この発明の請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載のプライマーセットは、
ＭＬＥＸ００１（配列番号１３，１４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００２（配列番号１５，１６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００３（配列番号１７，１８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００４（配列番号１９，２０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００５（配列番号２１，２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００６（配列番号２３，２４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００７（配列番号２５，２６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００８（配列番号２７，２８に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ００９（配列番号２９，３０に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１０（配列番号３１，３２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）、
ＭＬＥＸ０１１（配列番号３３，３４に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
及び
ＭＬＥＸ０１２（配列番号３５，３６に記載の塩基配列からなるプライマーセット）
からなる群より選ばれたものであること
を特徴とするものである。
【発明の効果】
【0034】
この発明のシイタケの品種識別法は、シイタケの遺伝子のＳＳＲ領域を指標としてシイタケの品種を識別するものである。特に、シイタケのオルガネラを含む全ゲノム上に存在する、２塩基ないし５塩基の反復配列が連続したＳＳＲ領域の任意の塩基配列を用いて作成した、プライマーからなるプライマーセットを使用して、識別対象のシイタケの品種ごとに、そのオルガネラを含む全ゲノムに対してＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することで品種の識別を行うものである。
このような構成によって、シイタケの品種を迅速かつ高精度に識別することができる。
【0035】
さらに、この発明のプライマーセット（プライマー対）は、シイタケの全ゲノムからＳＳＲ領域（ＳＳＲマーカー）を増幅することを可能とするものである。したがって、このプライマーセットを用いてシイタケ遺伝子のＳＳＲ領域を増幅させて生成した反復を比較する、より具体的には、シイタケの各品種（個体ないし菌株）について、ＰＣＲによるＳＳＲ領域の増幅によって生成した、ＤＮＡ断片長の多型の比較・関連付けを行うことで、シイタケの品種を迅速かつ高精度に識別することが可能となる。
【0036】
さらにまた、この発明は、シイタケの品種保護、海外から流入するコピー品種の水際での阻止や適正かつ公平な製品・商品の流れを担保する手段となるものである。【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００１の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図2】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００２の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図3】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００３の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図4】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００４の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図5】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００５の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図6】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００６の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図7】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００７の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図8】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００８の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図9】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ００９の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図10】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ０１０の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図11】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ０１１の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図12】ＳＳＲマーカーＭＬＥＸ０１２の周辺領域の塩基配列を示すものである。 なお、下線は、プライマー設計のための塩基配列を示す。
【図13】濃縮ゲノムライブラリーから得られたクローンに含まれていたＳＳＲ配列の種類と構成比を示す図である。
【図14】ＳＳＲマーカー遺伝子座におけるアリル共有率に基づいてＵＰＧＭＡ法によって描画した樹形図である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下、この発明にかかるシイタケの品種識別法の実施の形態について、具体的に説明する。なお、この発明について、好ましい代表的な例を中心に説明するが、この発明はこのような代表例に限定されるものではない。
【0039】
この発明のシイタケの品種識別法は、シイタケの遺伝子の、マイクロサテライトであるＳＳＲ領域を指標として、シイタケの品種（ないし個体、菌株）を識別するものである。このような構成によって、シイタケの品種を迅速かつ高精度に識別することができる。
【0040】
この発明において、識別対象としては、シイタケが選択される。なお、この発明は、シイタケ以外の担子菌類などを含む真核生物の、品種の識別への適用が期待できるものである。
ここで、シイタケなどの菌類の品種は、完全なクローンであるので、菌類の個体は菌類の品種をも意味する。
したがって、この発明において、「個体」とは、それが「菌類の個体」を意味する場合には「菌類の品種」をも意味する。
【0041】
前記シイタケの種類は、特に限定されない。例えば、森１２１号や森ＸＲ１号（農林水産省 品種登録番号：第１７０３９号）などの国内外で流通している品種が挙げられる。
この発明において、特に、識別可能なシイタケ品種は、２９０、１２１、ゆう次郎、春光、こう太郎、だい次郎、４Ｍ−１０、７Ｌ−５、ＸＲ１、ＸＲ１８、ＸＲ４５、ＸＴ４４、ＫＶ−９２、５Ｋ−１６、９Ｋ−４、３Ｖ−５８、Ｙ６０２、Ｙ７６３、与一丸、夏実、優実、４６５、４３６、清実、４Ｍ４６、早夏、成実、秋実、２０４、富富、ｄｓ１６及び丸丸の３２品種である。
【0042】
この発明において、前記シイタケを試料として用いるに際しては、シイタケのどの組織でも使用可能である。したがって、菌糸体や、子実体を試料とすることができる。
【0043】
前記シイタケからＤＮＡを抽出する方法としては、ＣＴＡＢ法や市販のＤＮＡ抽出キットによる方法など、公知のＤＮＡ抽出方法を採用することができる。
【0044】
前記シイタケから抽出したＤＮＡについては、これを鋳型とし、特定のプライマーセットを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）によって、ＤＮＡを増幅する。なお、この発明において、プライマーセット（プライマー対）とは、ＰＣＲ法において使用される、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを指す。
【0045】
この発明において使用されるプライマーの設計に際しては、任意の塩基配列を選択するに当たり、Ｔｍ値（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が６２〜６６程度、又は最適アニーリング温度が、温度５８〜６２℃程度になるようにすることが好ましいが、これに制限されるものではない。前記プライマーの設計は、商業的に入手可能なまたは公に利用可能なプログラムを用いて行うことができ、例えば、プライマー設計ソフトウエア「Ｐｒｉｍｅｒ３」をデフォルトにて使用することによって行うことができる。
【0046】
この発明において、前記プライマーセットとしては、シイタケ３２品種間におけるＰＣＲ増幅の可否や、多型の有無などを考慮して、特に、以下の１２組のプライマーセットを選択することができる。これらのプライマーは、シイタケのオルガネラを含む全ゲノムのうち、２塩基ないし５塩基反復配列のＳＳＲ領域を増幅することが可能である。
特に、２塩基反復配列が、（ＧＴ）６ 又は（ＣＡ）５ のＳＳＲ領域や、
３塩基反復配列が（ＣＴＴ）５ ＣＴＣＣＡＴ（ＣＣＴ）３、（ＧＧＣ）４ 、（ＣＧＡ）４ 、（ＧＣＣ）４ 、（ＧＧＣ）２ ＧＧＴ（ＧＧＣ）４ 、（ＧＧＣ）２（ＧＧＡ）２ 、（ＧＧＣ）４ 、（ＣＣＧ）２ ＴＧＣＴ（ＣＧＣ）２ のＳＳＲ領域、
３塩基ないし４塩基反復配列が、（ＧＧＡＡ）２ ＧＧ（ＧＧＡ）３ のＳＳＲ領域、
５塩基反復配列が、（ＣＣＡＣＡ）５ のＳＳＲ領域
を増幅することが可能である。
【0047】
１）ＭＬＥＸ００１ＭＬＥＸ００１は、配列表の配列番号１３に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１４に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0048】
２）ＭＬＥＸ００２ＭＬＥＸ００２は、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0049】
３）ＭＬＥＸ００３ＭＬＥＸ００３は、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0050】
４）ＭＬＥＸ００４ＭＬＥＸ００４は、配列表の配列番号１９に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0051】
５）ＭＬＥＸ００５ＭＬＥＸ００５は、配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0052】
６）ＭＬＥＸ００６ＭＬＥＸ００６は、配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２４に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0053】
７）ＭＬＥＸ００７ＭＬＥＸ００７は、配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２６に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0054】
８）ＭＬＥＸ００８ＭＬＥＸ００８は、配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２８に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0055】
９）ＭＬＥＸ００９ＭＬＥＸ００９は、配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３０に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0056】
１０）ＭＬＥＸ０１０ＭＬＥＸ０１０は、配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３２に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0057】
１１）ＭＬＥＸ０１１ＭＬＥＸ０１１は、配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３４に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0058】
１２）ＭＬＥＸ０１２ＭＬＥＸ０１２は、配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３６に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
【0059】
前記設計したプライマーの合成については、特に制限はなく、例えば、その塩基配列情報に従って公知の方法によって化学的に合成することができる。このような方法として、任意の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する方法が公知である。
このオリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ合成装置（ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）によって合成することができる。
【0060】
前記ＰＣＲ法については、例えば、前記１２組のプライマーセットの中から選ばれたいずれか１組を用いて、前記シイタケから抽出したＤＮＡを鋳型として、常法に従って行うことができる。例えば、シイタケ菌糸体から抽出したＤＮＡに、前記１２組のプライマーセットのうちの１組、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応用緩衝液及びｄＮＴＰｓを加えた状態で、常法に従い、温度９０〜１００℃程度での変性、温度３０〜７５℃程度、好ましくは温度５０〜７０℃程度、より好ましくは温度５５〜６５℃程度でのアニーリング、及び温度７０〜７５℃程度での伸長、の３過程を１サイクルとする反応を３０〜４０サイクル行い、その後の温度７０〜７５℃程度での最終伸長を行ってＤＮＡを増幅することができる。
【0061】
この発明においては、前記ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の長さ（ＤＮＡ断片長）を解析することにより、品種間の多型を検出することができる。前記ＰＣＲによって、前記プライマーセットのフォワードプライマーとリバースプライマーとに挟まれたＳＳＲ領域のＤＮＡ断片が大量に増幅される。
特に、前記１２組のプライマーセットは、品種間で反復回数の差が出るＳＳＲ領域を挟むように設計されているので、場合によっては品種ごとに断片長（分子量）の異なる増幅ＤＮＡが得られる。
したがって、この発明においては、前記得られた増幅ＤＮＡの長さを決定することにより、品種間の多型（ＳＳＲ領域における反復回数の差）を検出することが可能となる。
【0062】
前記増幅ＤＮＡの長さの解析は、例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどのゲルを用いたゲル電気泳動や、キャピラリー電気泳動などにより行うことができる。ＰＣＲ後の反応液を電気泳動すると、分子量の小さい（断片長の短い）増幅ＤＮＡほど速く陽極に移動するので、増幅ＤＮＡのバンドの移動距離から該増幅ＤＮＡの断片長を決定することができる。
なお、各品種（個体）に由来する電気泳動パターンの差は、サザンプロット法を用いることによって精度よく検出することができる。
【0063】
したがって、この発明においては、識別対象のシイタケの品種ごとに抽出したＤＮＡ（オルガネラを含む全ゲノム）について、前記複数のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することにより、シイタケの品種を迅速かつ高精度に識別することができる。
【0064】
この発明においては、さらに、前記プライマーセット、特に前記１２組の品種識別用のプライマーセットから選ばれた、少なくとも１組のプライマーセットを含むシイタケの品種識別用キットを提供することができる。前記品種識別用キットの提供に際しては、前記品種識別用のプライマーセットの他に、ＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲ用試薬や、使用のための説明書なども含んでいてよい。
【実施例】
【0065】
以下に、実施例を挙げて、この発明のシイタケの品種識別法を詳細に説明するが、この発明は、これら実施例により制限されることはない。
【0066】
＜実施例１＞（シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｐｅｇｌｅｒ）のＤＮＡの抽出及びそのＳＳＲ領域の調製）
（１）シイタケＤＮＡの抽出
森１２１号および森ＸＲ１号（農林水産省 品種登録番号：第１７０３９号）の各々のシイタケ培養菌糸から、改変ＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出した。
【0067】
（２）ＳＳＲ濃縮ゲノムライブラリーの作製得られたＤＮＡをもとに、セレクティブハイブリダイゼーション法によって、ＳＳＲ濃縮ゲノムライブラリーを作製した。
ここで、前記セレクティブハイブリダイゼーション法とは、目的とするＳＳＲ配列をアンカーとしたフィルターハイブリダイゼーションにより、ＳＳＲ濃縮ゲノムライブラリーを作製する方法である。
【0068】
（３）塩基配列の決定得られたライブラリーから、アダプター配列とＳＳＲ配列を、プライマーに用いるコロニーＰＣＲ法により、ＳＳＲ配列を含むポジティブコロニーを７２個選抜し、塩基配列を決定したところ、ＳＳＲ領域を含む３１配列が得られた。
その結果を、表１及び図１３に示す。
【0069】
【表1】
【0070】
図１３から、得られた３１配列（クローン）のうち、２塩基リピートでは、ＣＡ／ＧＴが最も多く全体の３２％を占め、次いで、３塩基のＣＧＧ／ＧＣＣが多く確認された。
【0071】
＜実施例２＞（プライマーの設計及び作成）
（１）プライマーの設計
ＳＳＲ配列を含む配列について、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウエアを用いて、ＰＣＲプライマーを設計した。
その際、プライマー対のうちいずれか一方の５’端には、６−ＦＡＭ （６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）または６−ＨＥＸ （６−ｃａｒｂｏｘｙ−２’，４’，４’，５’，７，７’− ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）による蛍光標識を行った。
【0072】
（２）ＰＣＲ産物の解析ＳＳＲ−ＰＣＲ産物の電気泳動は、ＡＢＩ３１３０ｘｌジェネティックアナライザーで行い、ジーンマッパーソフトウエアで断片長を決定した。
その結果を、図１〜１２に示す。
【0073】
図１〜１２に示すように、ＳＳＲ領域を含む配列のうち、１３クローンでプライマーの作製に成功した。その結果、２クローンが２塩基リピート、９クローンが３塩基リピート、１クローンは５塩基リピート、１クローンが３塩基および４塩基の複合配列であった。
【0074】
＜実施例３＞（シイタケの品種識別）
（１）シイタケのＤＮＡの抽出
シイタケ菌糸体からＤＮＡを抽出した。
なお、シイタケとして、下記表２に示す３２品種のものを使用した。
【0075】
【表2】
【0076】
（２）ＰＣＲによる増幅得られたＤＮＡについて、下記表３に示す１２組のプライマーセットを用いて、下記方法に従い、ＰＣＲ法による増幅をした。
その際、試薬としては、既製のＰＣＲ関連試薬を使用した。
また、１２組のプライマーセットについては、カスタムプラーマー合成サービスに依頼して合成し、１０μＭに調整したフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むＳＳＲプライマー溶液として調製したものを用いた。
【0077】
【表3】
【0078】
３２品種のシイタケから抽出したＤＮＡ溶液を、それぞれ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．０５μＬ、１０ｘＰＣＲ緩衝液１．２５μＬ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．３７５μＬ、１００ｍＭ ｄＮＴＰ混合液１μＬ、ＤＮＡ溶液１μＬ、ＳＳＲプライマー溶液を各０．２５μＬ、滅菌超純水８．５７５μＬで混合した。その後、得られた溶液について、サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社：Ｔｈｅ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００）
を用いて温度９０℃で３分間ＤＮＡを変性させた後、温度９４℃で３０秒ＤＮＡを変性させ、その後、連続して温度５８〜６２℃で４５秒プライマーをアニーリングさせ、さらに連続して温度７２℃で６０秒の伸長反応させるサイクルを３５回繰り返した。
さらに、その後、温度７５℃で１０分間最終伸長反応させて、ＰＣＲ増幅産物を得た。
【0079】
（３）ＰＣＲ産物の解析得られたＳＳＲ−ＰＣＲ産物について、電気泳動を行った。
電気泳動については、ＡＢＩ３１３０ｘｌジェネティックアナライザーを用いて、３６ｃｍのキャピラリーとポリマーＰＯＰ７を使用して、フラグメント解析を行った。
表２に示すシイタケ３２品種について、使用した１２組のプライマー対による対立遺伝子型の結果を、表４に示す。
【0080】
【表4】
【0081】
表４から、表２に示す３２品種のシイタケの対立遺伝子型について、１０座（プライマー）が多型を示した。さらに、ＳＳＲマーカーごとに品種固有の多型を確認し、１２種類のＳＳＲマーカーの組み合わせによる多型を品種ごとに比較すると、品種間でＳＳＲマーカーが一致するものはなかった。
さらにまた、図１４に示すように、これらの３２品種のアリル共有率に基づきＵＰＧＭＡ法（平均距離法：Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｐａｉｒ Ｇｒｏｕｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ Ａｖｅｒａｇｅ）により樹形図を描画したところ、全品種の識別に成功した。
【産業上の利用可能性】
【0082】
この発明は、シイタケの品種識別法に関するもので、シイタケの品種識別を迅速かつ高精度に行うことを可能にするものである。したがって、シイタケを製造ないし取扱う業界において、利用される可能性の高いものである。
（配列表）
【表5】