特開 2017-155057 パルボウイルスおよびＢｃｌ−２阻害剤を含有する医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-155057(P2017-155057A)

(43)【公開日】2017年9月7日

(54)【発明の名称】パルボウイルスおよびＢｃｌ−２阻害剤を含有する医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/768 20150101AFI20170810BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170810BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170810BHJP

   A61K 31/495 20060101ALI20170810BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20170810BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170810BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/768

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61K31/495

   A61K31/496

   A61P43/00 121

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2017-116440(P2017-116440)

(22)【出願日】2017年6月14日

(62)【分割の表示】特願2016-528375(P2016-528375)の分割

【原出願日】2014年7月22日

(31)【優先権主張番号】13003664.3

(32)【優先日】2013年7月22日

(33)【優先権主張国】EP

(71)【出願人】

【識別番号】512151403

【氏名又は名称】ドイッチェス・クレープスフォルシュングスツェントルム

【氏名又は名称原語表記】ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＫＲＥＢＳＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ

(71)【出願人】

【識別番号】509161141

【氏名又は名称】ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルク

【氏名又は名称原語表記】Ｒｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】マルキーニ，アントーニオ

(72)【発明者】

【氏名】リ，ジュンウェイ

(72)【発明者】

【氏名】シュレーダー，レア

(72)【発明者】

【氏名】ロンメレーレ，ジャン

(72)【発明者】

【氏名】ゲレットネキー，カルステン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC50

4C086CB05

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA02

4C087NA05

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

【課題】正常組織に対する望ましくない副作用を増加させることなく、相互に補完してそれらの個々の治療作用を強化する、Ｈ−１ＰＶおよび他の抗癌剤を含む併用療法の合理的設計に対するニーズがある。
【解決手段】 （ａ）パルボウイルス、および（ｂ）Ｂｃｌ−２阻害剤を含む医薬組成物、ならびに癌、例えば充実性腫瘍を治療するための前記組成物の使用について記載する。好ましい阻害剤は、ＢＨ３ミメティックであるＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−１９９である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）Ｂｃｌ−２阻害剤を含有する医薬組成物であって、前記パルボウイルスは、Ｈ−１（Ｈ−１ＰＶ）、または、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）およびラットウイルス（ＲＶ）から選択される関連齧歯類パルボウイルスである医薬組成物。

【請求項2】

（ａ）前記パルボウイルスおよび（ｂ）前記Ｂｃｌ−２阻害剤を別個の実体として含有する請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記Ｂｃｌ−２阻害剤は、ＡＢＴ−７３７またはＡＢＴ−１９９である請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

腫瘍を治療する方法において使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記パルボウイルスおよび前記Ｂｃｌ−２阻害剤が連続的に投与されることを特徴とする、請求項４に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

充実性腫瘍および／または癌始原幹細胞を治療するためであることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

パルボウイルス細胞毒性に対して抵抗性である腫瘍を治療するためであることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記腫瘍は、脳腫瘍、膵臓癌、子宮頸癌、肺癌、頭頸部癌、乳癌または大腸癌である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

神経膠腫または再発性多形性膠芽細胞腫を治療するためであることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記パルボウイルスおよび／またはＢｃｌ−２阻害剤が腫瘍内投与されることを特徴とする、請求項４〜９のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）Ｂｃｌ−２阻害剤を含む医薬組成物、ならびに、癌、例えば充実性腫瘍を治療するための上記組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は、世界中において二番目に多い死亡原因である。男性の半数および女性の三分の一は彼らの寿命中に何らかの形態の癌と診断されると推定されている。さらに、癌は主として老化を原因とする疾患であり、世界中の癌死亡数は、高齢者の比率が増大するために２００７年から２０３０年までに約４５％（死亡数が７９０万人から１１５０万人へ）増加すると予測されている（ＷＨＯの推定値、２００８年）。癌は、最も費用を要する疾患でもある。米国立癌研究所からの最新の推定値は、２００７年において米国内の癌に要した総経済費用が２，２６８億ドルであったことを示しており、より成功が得られる予防的介入が講じられず、早期発見がなされず、より効率的な治療法が開発されなければ、既に莫大なこの経済的負担は今後二十年間の間にさらに増大すると予測されている。過去三十年間にわたる米国および欧州における癌五年後生存率の増加によって証明されている多数の形態の癌の予防、発見、診断および治療における大きな進歩にもかかわらず、例えば膵臓、肝臓、肺、脳などの一部の腫瘍タイプは依然として効果的治療法が得られておらず、新規の治療選択肢の開発が求められている。正常細胞には影響を及ぼすことなく癌細胞を殺滅する癌特異的脆弱性を利用する腫瘍細胞崩壊性ウイルスは、癌と闘うための前途有望なツールとして急速に浮上しつつある（非特許文献１（Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ他、２０１１）、非特許文献２（Ｒｕｓｓｅｌｌ他、２０１２））。現在は十二種類もの腫瘍細胞崩壊性ウイルスが、単独で、または他の抗癌剤と併用されて様々な悪性腫瘍に対する第Ｉ〜ＩＩＩ相臨床試験中である（非特許文献２（Ｒｕｓｓｅｌｌ他、２０１２））。中でも特に、腫瘍細胞崩壊性ラットパルボウイルスＨ−１ＰＶは、再発性多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）を有する患者における第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験において安全性および有効性の初発症候に関して評価されている（非特許文献３（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ他、２０１２））。

【0003】

Ｈ−１ＰＶは、５．１ｋｂの長い一本鎖ＤＮＡを含有する小さな（直径が約２５ｎｍの）非エンベロープ二十面体粒子である（非特許文献４（Ｃｏｔｍｏｒｅ及びＴａｔｔｅｒｓａｌｌ、２００７））。Ｈ−１ＰＶのゲノム機構は、二つのプロモーターであるＰ４早期プロモーターおよびＰ３８後期プロモーターの制御下にある二つの転写単位からなる。Ｐ４は、非構造的（ＮＳ）タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードする遺伝子の発現を調節し、Ｐ３８はカプシド（ＶＰ）タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）をコードする遺伝子の発現を調節する（非特許文献４（Ｃｏｔｍｏｒｅ及びＴａｔｔｅｒｓａｌｌ、２００７））。このウイルスは、高速分割する癌細胞内で優先的に増殖する。この腫瘍選択性は、癌性細胞によるウイルスのより良好な取り込みに基づくのではなく、むしろ癌細胞がウイルスＤＮＡ複製のために必要とされる例えばサイクリンＡ、Ｅ２ＦもしくはＣＲＥＢ／ＡＴＦなどの因子を過剰発現するという事実に起因する。さらに、癌細胞はウイルス増殖に好都合である効率的抗ウイルス免疫応答を起こす能力に欠陥があることが多い（非特許文献５（Ｎｕｅｓｃｈ他、２０１２））。このウイルスは、多数の細胞死経路を活性化することが公知である。細胞タイプおよび増殖条件に依存して、Ｈ−１ＰＶは、アポトーシス（非特許文献６（Ｈｒｉｓｔｏｖ他、２０１０）、非特許文献７（Ｏｈｓｈｉｍａ他、１９９８）、非特許文献８（Ｒａｙｅｔ他、１９９８）、非特許文献９（Ｕｅｎｏ他、２００１））、ネクローシス（非特許文献１０（Ｒａｎ他、１９９９））またはカテプシンＢ依存性細胞死（非特許文献１１（非特許文献１１（ｄｉ Ｐｉａｚｚａ他、２００７））を誘導する場合がある。このウイルスはＴＲＡＩＬ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）に抵抗性である癌細胞、シスプラチンおよびＢｃｌ−２が過剰発現している場合でさえ（非特許文献１１（Ｄｉ Ｐｉａｚｚａ他、２００７））腫瘍崩壊を誘導することができた。後者の結果は、Ｂｃｌ−２がパルボウイルス細胞毒性のネガティブモジュレーターではないことを示唆している。近年、パルボウイルスおよびそれと化学療法もしくはＨＤＡＣ阻害剤との併用を使用する癌療法が報告されている（特許文献１（国際公開第２００９／０８３２３２（Ａ１）号パンフレット）、特許文献２（国際公開第２０１１／１１３６００（Ａ１）号パンフレット））。

【0004】

主要非構造的タンパク質ＮＳ１は、ウイルスＤＮＡ複製、ウイルス遺伝子発現および細胞毒性の主要調節因子である。ＮＳ１の単独発現は、全ウイルスと同様に、反応性酸素種の蓄積およびＤＮＡ損傷による細胞周期停止、アポトーシスおよび細胞溶解を誘導するために十分である（非特許文献６（Ｈｒｉｓｔｏｖ他、２０１０））。その腫瘍細胞崩壊活性の結果として、このウイルスは、ＧＢＭに対する臨床試験を開始するための基礎となる、多数の動物モデルにおいて立証された腫瘍抑制性を有することが証明されている（非特許文献３（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ他、２０１２））。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２００９／０８３２３２（Ａ１）号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２０１１／１１３６００（Ａ１）号パンフレット

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Breitbach CJ, Burke J, Jonker D, Stephenson J, Haas AR, Chow LQ, Nieva J, Hwang TH, Moon A, Patt R et al (2011) Intravenous delivery of a multi- mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans. Nature 477: 99- 102

【非特許文献2】Russell SJ, Peng KW, Bell JC (2012) Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol30: 658-670

【非特許文献3】Geletneky K, Huesing J, RommelaereJ, Schlehofer JR, Leuchs B, Dahm M, Krebs O, von KnebelDoeberitz M, Huber B, HajdaJ (2012) Phase I/IIa study of intratumoral/intracerebral or intravenous/intracerebral administration of Parvovirus H-l (ParvOryx) in patients with progressive primary or recurrent glioblastoma multiforme: ParvOryxOlprotocol. BMC cancer 12: 99

【非特許文献4】Cotmore SF, Tattersall P (2007) Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv Virus Res 70: 183-232

【非特許文献5】Nuesch JP, Lacroix J, Marchini A, Rommelaere J (2012) Molecular pathways: rodent parvoviruses--mechanisms of oncolysis and prospects for clinical cancer treatment. Clin Cancer Res 18: 3516-3523

【非特許文献6】Hristov G, Kramer M, Li J, El-Andaloussi N, Mora R, Daeffler L, Zentgraf H, Rommelaere J, Marchini A (2010) Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-l Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J Virol 84: 5909-5922

【非特許文献7】Ohshima T, IwamaM, Ueno Y, Sugiyama F, Nakajima T, Fukamizu A, Yagami K (1998) Induction of apoptosis in vitro and in vivo by H-l parvovirus infection. The Journal of general virology 79 ( Pt 12) : 3067-3071

【非特許文献8】Rayet B, Lopez-Guerrero JA, Rommelaere J, Dinsart C (1998) Induction of programmed cell death by parvovirus H-1 in U937 cells: connection with the tumor necrosis factor alpha signalling pathway. J Virol 72: 8893-8903

【非特許文献9】Ueno Y, Harada T, Iseki H, Ohshima T, Sugiyama F, Yagami K (2001) Propagation of rat parvovirus in thymic lymphoma cell line C58(NT)d and subsequent appearance of a resistant cell clone after lytic infection. J Virol 75: 3965-3970

【非特許文献10】Ran Z, RayetB, Rommelaere J, Faisst S (1999) Parvovirus H-l-induced cell death: influence of intracellular NAD consumption on the regulation of necrosis and apoptosis. Virus Res 65: 161-174

【非特許文献11】Di Piazza M, MaderC, Geletneky K, Herrero y CalleM, Weber E, Schlehofer J, DeleuL, Rommelaere J (2007) Cytosolic Activation of Cathepsins Mediates Parvovirus H-l-Induced Killing of Cisplatin and TRAIL-Resistant Glioma Cells. Journal of Virology 81: 4186-4198

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかし、他の抗癌剤を用いた場合にも観察されるような癌療法の枠組みにおいては、一部の癌細胞が腫瘍再発をもたらすＨ−１ＰＶ細胞毒性に対して抵抗性である、または抵抗性を獲得する可能性があるというリスクがある。このため、正常組織に対する望ましくない副作用を増加させることなく、相互に補完してそれらの個々の治療作用を強化する、Ｈ−１ＰＶおよび他の抗癌剤を含む併用療法の合理的設計に対するニーズがある。

【0008】

このため、本発明の目的は、改良されたパルボウイルスに基づく療法のための手段を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明によると、本発明の目的は、特許請求の範囲に規定した主題により達成される。

【0010】

結果として本発明を生じさせた試験では、Ｂｃｌ−２阻害剤であるＡＢＴ−７３７もしくはＡＢＴ−１９９が癌細胞を殺滅する際にＨ−１ＰＶとの相乗作用を示すかどうかが問われた。ＡＢＴ−７３７（およびＡＢＴ−１９９）の亜致死量は、広範囲の充実性腫瘍、例えば神経膠腫（ｎ＝１１）、膵臓癌（ｎ＝３）、子宮頸癌（ｎ＝３）、肺癌（ｎ＝３）、頭頸部癌（ｎ＝３）、乳癌（ｎ＝１）および結腸癌（ｎ＝１）に由来する２５種のヒト細胞系において、正常非形質転換初代細胞に対するウイルスの安全性プロファイルを維持しながらＨ−１ＰＶの腫瘍細胞崩壊活性を相乗的方法で増強することが証明された。驚くべきことに、強力な相乗作用は、パルボウイルス細胞毒性に抵抗性であることが有名な癌細胞系においても観察された。注目すべきことに、Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置は、脳腫瘍および子宮頸癌に由来する腫瘍始原幹細胞（ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ）培養に対しても有効であった（ｎ＝５）。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置された神経膠腫由来細胞系では、ミトコンドリア膜透過化（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＭＭＰ））ならびにカスパーゼ−３および７の活性化を特徴とするアポトーシスの誘導の増加もまた証明することができた。

【0011】

アポトーシスシグナルへの変化した応答は、癌の顕著な特徴である（Ｈａｎａｈａｎ ＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０１１）。アポトーシスは、二つの異なる、それでもクロストークする経路：プロアポトーシスリガンド、例えば細胞表面死受容体を活性化するＡｐｏ２／ＴＲＡＩＬによって開始される外因性経路および細胞内ストレスシグナルによって誘発されてミトコンドリア外膜透過化（ＭＭＰ）、その後にミトコンドリアから細胞質ゾルへのシトクロムＣの遊離および最後にカスパーゼ類の活性化を生じさせる内因性経路の活性化を通して発生する。Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ−２）ファミリーメンバーは、ミトコンドリア外膜の完全性を制御するアポトーシスの調節において中心的役割を果たす（Ｙｏｕｌｅ ＆ Ｓｔｒａｓｓｅｒ，２００８）。これまでにＢｃｌ−２タンパク質フェミリーの二十五のメンバーが同定されている。それらはアポトーシス経路に及ぼす作用およびＢｃｌ−２ホモロジードメインの数に依存して、抗アポトーシスタンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１）、プロアポトーシスＢＨ３ ｏｎｌｙ タンパク質（Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋなど）およびＢａｘ様プロアポトーシスタンパク質（Ｂａｘ、ＢａｋおよびＢｏｋ）に細分される（Ｂａｊｗａ他、２０１２）。プロアポトーシスタンパク質と抗アポトーシスタンパク質との平衡が細胞の運命を決定する。プロアポトーシスタンパク質の数を抗アポトーシスタンパク質によって相殺できない場合、ＢａｋおよびＢａｘはオリゴマー化してミトコンドリア膜内に大きなコンダクタンス孔を形成して、結果としてアポトーシスの誘導を生じさせる。抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質は、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、脳腫瘍および乳癌を含む様々なタイプの癌において過剰発現することが多く（Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、２００５）、ならびに腫瘍開始（ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）、進行および従来型化学療法薬への抵抗性に関連することが多い（Ｂａｊｗａ他、２０１２）。このため、これらの抗アポトーシスタンパク質の活性に対する拮抗を試みることに多くの努力が向けられてきた。これらの戦略の一つは、例えばＢＨ３ミメティックであるＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−１９９などの選択的低分子の使用である。

【0012】

ＢＨ３ｏｎｌｙタンパク質と同様に、ＢＨ３ミメティックは、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーをそれらの疎水性溝に結合することにより阻害する（Ｃｒａｇｇ他、２００９）。活性化ＢＨ３ｏｎｌｙタンパク質の遊離は、ＢａｘおよびＢａｋの活性化を誘導してアポトーシスを誘発する。ＢＨ３ミメティックであるＡＢＴ−７３７は、Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆおよび同僚らにより発見された。これは高親和性（Ｋｉ≦１ｎＭ）でＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ_ＬおよびＢｃｌ−ｗに結合し（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ他、２００５）、Ｂｃｌ−２由来のＢＩＭのようなＢＨ３ｏｎｌｙタンパク質と置換する（Ｄｅｌ Ｇａｉｚｏ Ｍｏｏｒｅ他、２００７）。インビトロでは、白血病およびリンパ腫細胞中、多発性骨髄腫および小細胞性肺癌由来細胞系では単独物質としてアポトーシスを誘導することが証明された（Ｖｏｇｌｅｒ他、２００９）。ＡＢＴ−７３７処置は、異種移植片マウスモデルにおいて小細胞性肺癌の完全退行をもたらした（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ他、２００５）。さらにＡＢＴ−７３７は、非小細胞性肺癌における抗癌薬パクリタキセル（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ他、２００５）ならびに神経膠芽細胞腫細胞におけるビンクリスチンおよびエトポシド（Ｔａｇｓｃｈｅｒｅｒ他、２００８）の細胞毒性を相乗作用的に増強することが証明された。非悪性の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、半有効濃度（ＥＣ５０）が１，０００ｎＭより高いと決定されたのでＡＢＴ−７３７に対して感受性ではない（Ｄｅｌ Ｇａｉｚｏ Ｍｏｏｒｅ他、２００７）。現在、ＡＢＴ−７３７の経口利用可能な誘導体であるＡＢＴ−２６３は、リンパ性悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫および末梢Ｔ細胞リンパ腫に対する第ＩＩ相臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）において試験されている。しかし、血小板減少症に関する懸念は、それらの強力な抗癌活性にもかかわらず急性白血病の臨床試験へのＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−２６３の導入を制限している。これは、血小板のＢＣＬ−Ｘ_Ｌへの依存性の結果として、予想通りの毒性に起因する可能性が最も高い（Ｄａｖｉｄｓ ＆ Ｌｅｔａｉ、２０１２）。近年、Ｓｏｕｅｒｓおよび同僚らは、ＡＢＴ−７３７の密接に関連する経口利用可能なアナログであるＡＢＴ−２６３を修飾することによって高選択性Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ−１９９を生成した。ＡＢＴ−１９９は、高親和性でＢｃｌ−２に選択的に結合するが（Ｋ_ｉ≦０．０１ｎＭ）、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ（Ｋ_ｉ＝４８ｎＭ）およびＢｃｌ−ｗ（Ｋ_ｉ＝２４５ｎＭ）には結合しない（Ｓｏｕｅｒｓ他、２０１３）。インビトロでは、数種のヒト血液学的腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を阻害することが証明されたが、ＡＢＴ−７３７とは対照的に、少ない副作用でヒト血小板を減少させない（Ｓｏｕｅｒｓ他、２０１３）。近年、Ｂｃｌ−２阻害剤処置は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）由来細胞系を水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）腫瘍崩壊に感作させること、およびアポトーシス抵抗性は克服され得ることが報告されている（Ｓａｍｕｅｌ他、２０１０；Ｓａｍｕｅｌ他、２０１３）。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1a】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1b】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1c】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1d】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1e】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1f】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1g】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1h】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1i】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1j】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図1k】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でヒト神経膠腫細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を１１種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｋ）において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（プラーク形成単位／細胞数））および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2a】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2b】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2c】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2d】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2e】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2f】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2g】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2h】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2i】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2j】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2k】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2l】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2m】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図2n】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で様々な腫瘍実体由来のヒト細胞系に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の細胞毒性を三例の膵管腺癌（ａ〜ｃ）、三例の子宮頸癌（ｄ〜ｆ）、三例の肺癌（ｇ〜ｉ）、三例の頭頸部扁平上皮癌（ｊ〜l）、一例の結腸直腸癌（ｍ）および一例の乳癌（ｎ）細胞系において評価した（細胞系の名称はグラフの最上部に明示した）。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図3a】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で癌幹細胞（ＣＳＣ）に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置を多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）腫瘍（ａ〜ｃ）ならびにＧＢＭ（Ｕ８７、ｄ）および子宮頸癌（ＨｅＬａ、ｅ）を有する患者に由来する癌細胞系から単離したＣＳＣに対して試験した。１０，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図3b】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で癌幹細胞（ＣＳＣ）に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置を多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）腫瘍（ａ〜ｃ）ならびにＧＢＭ（Ｕ８７、ｄ）および子宮頸癌（ＨｅＬａ、ｅ）を有する患者に由来する癌細胞系から単離したＣＳＣに対して試験した。１０，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図3c】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で癌幹細胞（ＣＳＣ）に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置を多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）腫瘍（ａ〜ｃ）ならびにＧＢＭ（Ｕ８７、ｄ）および子宮頸癌（ＨｅＬａ、ｅ）を有する患者に由来する癌細胞系から単離したＣＳＣに対して試験した。１０，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図3d】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で癌幹細胞（ＣＳＣ）に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置を多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）腫瘍（ａ〜ｃ）ならびにＧＢＭ（Ｕ８７、ｄ）および子宮頸癌（ＨｅＬａ、ｅ）を有する患者に由来する癌細胞系から単離したＣＳＣに対して試験した。１０，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図3e】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法で癌幹細胞（ＣＳＣ）に対するＨ−１ＰＶ誘導性細胞毒性を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置を多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）腫瘍（ａ〜ｃ）ならびにＧＢＭ（Ｕ８７、ｄ）および子宮頸癌（ＨｅＬａ、ｅ）を有する患者に由来する癌細胞系から単離したＣＳＣに対して試験した。１０，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図4a】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶは本発明の処置条件下で正常初代細胞に対して有害ではない Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の安全性プロファイルをヒトアストロサイト（ａ）、初代口腔線維芽細胞（ＰＯＦ、ｂ）、メラノサイト（ｃ）およびヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ、ｄ）において評価した。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／または４０μΜのＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染九十六時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図4b】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶは本発明の処置条件下で正常初代細胞に対して有害ではない Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の安全性プロファイルをヒトアストロサイト（ａ）、初代口腔線維芽細胞（ＰＯＦ、ｂ）、メラノサイト（ｃ）およびヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ、ｄ）において評価した。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／または４０μΜのＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染九十六時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図4c】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶは本発明の処置条件下で正常初代細胞に対して有害ではない Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の安全性プロファイルをヒトアストロサイト（ａ）、初代口腔線維芽細胞（ＰＯＦ、ｂ）、メラノサイト（ｃ）およびヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ、ｄ）において評価した。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／または４０μΜのＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染九十六時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図4d】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶは本発明の処置条件下で正常初代細胞に対して有害ではない Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の安全性プロファイルをヒトアストロサイト（ａ）、初代口腔線維芽細胞（ＰＯＦ、ｂ）、メラノサイト（ｃ）およびヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ、ｄ）において評価した。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶ（ＭＯＩ：ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）および／または４０μΜのＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染九十六時間後に、細胞溶解物を材料および方法の項目に記載したようにＬＤＨアッセイによって分析した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図5a】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図5b】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図5c】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図5d】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図5e】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図5f】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図5g】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図5h】ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性アポトーシスを増強する 処置に応答したＤＮＡ断片化（サブ−Ｇ１細胞集団）の発生を八種のヒト神経膠腫細胞系（ａ〜ｈ）においてヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７（ＡＢＴ）を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後に、細胞を材料および方法の項目に記載したように染色および分析した。上方パネルには代表的なヒストグラムプロットを示した。下方パネルのグラフは、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている（下方パネル）。

【図6a】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）を誘導する Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置がＭＭＰ（アポトーシスの顕著な特徴）に及ぼす作用を四種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｄ）においてＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後、細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色し、収集し、フローサイトメトリーによって分析した。ＭＭＰを備える細胞のパーセンテージは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて決定した。上方パネルには、各条件についての代表的ヒストグラムプロットを示した。下方パネルには、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図6b】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）を誘導する Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置がＭＭＰ（アポトーシスの顕著な特徴）に及ぼす作用を四種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｄ）においてＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後、細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色し、収集し、フローサイトメトリーによって分析した。ＭＭＰを備える細胞のパーセンテージは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて決定した。上方パネルには、各条件についての代表的ヒストグラムプロットを示した。下方パネルには、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図6c】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）を誘導する Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置がＭＭＰ（アポトーシスの顕著な特徴）に及ぼす作用を四種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｄ）においてＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後、細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色し、収集し、フローサイトメトリーによって分析した。ＭＭＰを備える細胞のパーセンテージは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて決定した。上方パネルには、各条件についての代表的ヒストグラムプロットを示した。下方パネルには、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図6d】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）を誘導する Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置がＭＭＰ（アポトーシスの顕著な特徴）に及ぼす作用を四種の神経膠腫細胞系（ａ〜ｄ）においてＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ染色およびフローサイトメトリーによって評価した。２．５×１０^５細胞／ウエル（またはＮＣＨ１２５については６．２５×１０^４細胞／ウエル）を６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八〜九十六時間後、細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色し、収集し、フローサイトメトリーによって分析した。ＭＭＰを備える細胞のパーセンテージは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて決定した。上方パネルには、各条件についての代表的ヒストグラムプロットを示した。下方パネルには、三回ずつ実施した典型的な実験の結果を示した。棒は、平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図7a】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図7b】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図7c】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図7d】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図7e】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図7f】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図7g】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図7h】ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶはカスパーゼ−３／７によるアポトーシスを誘導する アポトーシスの誘導をＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を使用して八種のヒト神経膠腫細胞系中の活性カスパーゼ−３および７（切断型）を分析することによって評価した（ａ〜ｈ）。４，０００細胞／ウエルを１０ウエル顕微鏡スライド上に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を用いて、または用いずに処置した。感染四十八時間後、細胞をカスパーゼ−３／７緑色検出試薬で染色し、固定した。核はＤＡＰＩ染色によって視認した。蛍光シグナルは、二十倍の倍率で青色および緑色チャネルを用いて顕微鏡により検出した。代表的画像を示した。

【図8】ＡＢＴ−１９９はＨ−１ＰＶ誘導性腫瘍崩壊を増強する ＬＤＨアッセイ。Ｈ−１ＰＶと併用したＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−１９９の効果を神経膠芽細胞腫細胞系Ｕ１３８において比較した。４，０００細胞／ウエルを９６ウエルプレート内に播種し、二十四時間後に指示した濃度のＨ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７および／またはＡＢＴ−１９９を用いて、または用いずに処置した。感染七十二時間後、溶解を受けている（ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ）細胞のパーセンテージはＬＤＨアッセイによって測定した。棒は、三例の複製物からの平均値を表し、相対標準偏差バーを伴っている。

【図9】Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置はＡｓＰＣ−１異種移植片の完全退行を生じさせる ５×１０^６個のＡｓＰＣ−１細胞を五週齢の雌性ヌードラットの右側腹部に皮下注射した。一週間後に（腫瘍が２００〜４００ｍｍ^３の容積に達した時点）、担癌動物を四群（ｎ＝８）に無作為割り付けした。これらの群をＰＢＳ（コントロール）、ＡＢＴ−７３７（５０ｍｇ／ｋｇ、最初の十四日間にわたり二日目毎に投与）、Ｈ−１ＰＶ（２．５×１０^８ｐｆｕ／動物の総用量、四回の腫瘍内投与に分割）のいずれか、または両方の物質の併用を用いて処置した。腫瘍容積は、指示した日にデジタル式カリパスを用いて測定し、式：容積（ｃｍ^３）＝幅^２×長さ／２にしたがって計算した。ラットは、動物福祉規則を順守しながら、腫瘤が４，０００ｍｍ^３に達した時点に犠死させた。図示したデータは、標準偏差バーを伴う平均値を示している。

【図10】ＡＢＴ−７３７の構造

【図11】ＡＢＴ−１９９の構造

【発明を実施するための最良の形態】

【0014】

本発明は、（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）Ｂｃｌ−２阻害剤を含有する医薬組成物を提供する。

【0015】

好ましくは、上記医薬組成物中では、パルボウイルスおよびＢｃｌ−２阻害剤は、有効量で医薬上許容される担体と結合されて存在する。「医薬上許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない、およびそれが投与される患者にとって非毒性である任意の担体を含むことを意味する。適切な医薬担体の例は当分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、従来型方法によって調製することができ、有効量で被験者に投与することができる。

【0016】

本明細書で使用する用語「パルボウイルス」には、野生型もしくはその改良された複製可能な誘導体ならびに関連ウイルスもしくはそのようなウイルスもしくは誘導体に基づくベクターが含まれる。適切なパルボウイルス、誘導体などならびに上記パルボウイルスを活発に産生するために使用できる、および療法のために有用である細胞は、過度の経験による努力を伴わずに、本明細書の開示に基づけば当分野の技術の範囲内で容易に決定できる。

【0017】

「有効量」は、疾患の経過および重症度に影響を及ぼすのに十分であり、そのような病状の減少および寛解をもたらす有効成分の量を意味する。これらの疾患もしくは障害を治療および／または予防するために有用である「有効量」は、当業者は公知の方法を使用して決定してよい。

【0018】

更なる医薬上適合する担体は、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、治療薬を含有する移植用エレメント、または任意の他の適切なビヒクル、送達用もしくは投薬用手段もしくは材料を含むことができる。

【0019】

化合物の投与は、様々な方法によって、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、腫瘍内もしくは皮内投与によって実施されてよい。投与経路は、当然ながら、治療の種類および医薬組成物中に含有される化合物の種類に左右される。パルボウイルスおよびＢｃｌ−２阻害剤の用法・用量は当分野の技術の範囲内で、患者データ、観察所見および例えば患者の体格、体表面積、年齢、性別を含む他の臨床因子、投与すべき特定パルボウイルス、特定阻害剤など、投与の時間および経路、腫瘍のタイプおよび特徴、患者の総体的な健康、および患者が受けている他の薬物療法に基づいて主治医であれば容易に決定できる。

【0020】

本発明によるＢｃｌ−２阻害剤と併用したパルボウイルスが血液脳関門を貫通する能力を備える感染性ウイルス粒子を含む場合、ウイルスの静脈内注射によって治療を実施できる、または少なくとも開始できる。しかし、好ましい投与経路は腫瘍内投与である。

【0021】

長期静脈内治療はウイルスに対する中和抗体の形成の結果として非効率になりやすいので、初期レジメン静脈内ウイルス投与後に様々な投与方法を採用することができる、またはパルボウイルス治療の全経過を通して代替的にそのような様々な投与技術、例えば頭蓋内もしくは腫瘍内ウイルス投与を使用することができる。

【0022】

また別の特定の投与技術として、パルボウイルス（ウイルス、ベクターおよび／または細胞薬）は、患者に植え込まれた起源から患者に投与することができる。例えば、更なる外科的介入を実施せずに様々な回数でパルボウイルス組成物を局所注入することを許容するために、シリコンもしくは他の生体適合性材料でできたカテーテルを腫瘍除去中または別個の手技によって患者の体内に据え付けられた小型の皮下リザーバー（Ｒｉｃｋｈａｍリザーバー）に接続することができる。パルボウイルスもしくはパルボウイルス由来ベクターは、定位外科技術によって、または神経ナビゲーションターゲティング技術によって腫瘍内に注入することもできる。

【0023】

パルボウイルスの投与はさらに、適切なポンプシステム、例えば蠕動注入ポンプまたは対流強化送達（ＣＥＤ）ポンプを使用した低流量での埋め込み型カテーテルを介したウイルス粒子もしくはウイルス粒子を含有する流体の持続注入によって実施することもできる。

【0024】

パルボウイルス組成物のさらに別の投与方法は、所望の癌組織へパルボウイルスを分注するために構築および配置された埋め込み型製品からである。例えば、パルボウイルス、例えばパルボウイルスＨ−１が含浸させられているウエハーを使用できるが、このときウエハーは外科的腫瘍除去の終了時に切除腔の辺縁に取り付けられる。そのような治療介入においては、複数のウエハーを使用できる。活発にパルボウイルス、例えばパルボウイルスＨ−１、もしくはＨ−１に基づくベクターを産生する細胞を腫瘍内または腫瘍除去後の腫瘍腔内に注入することができる。

【0025】

本発明による併用療法は、癌、特に（しかし排他的ではなく）脳腫瘍、膵臓癌、子宮頸癌、肺癌、頭頸部癌、乳癌もしくは大腸癌の治療的処置のために有用であり、上記疾患の予後を有意に改善することができる。本発明による併用療法は、さらに安全性を高めて副作用を減少および／または回避しながら、抗癌有効性を維持する、または強化さえする低治療用量でウイルスおよび／またはｂｃｌ−２阻害剤の臨床使用を可能にできる。パルボウイルスおよびＢｃｌ−２阻害剤との強力な相乗作用を考えると、治療用量の減量を予見することができ、例えばこれまで使用された単一成分用量の半分もしくは三分の一で所望の治療効果を維持する。減少した用量を考えると、（重篤な）副作用は減少させられる、または回避さえされる可能性がある。

【0026】

パルボウイルス感染は腫瘍細胞の殺滅をもたらすが正常細胞を傷つけることはなく、そのような感染は、有害な神経学的もしくはその他の副作用を伴わずに腫瘍特異的療法を達成するために、例えば、適切なパルボウイルス、例えばパルボウイルスＨ−１または関連するウイルスまたはそのようなウイルスに基づくベクターの脳内使用によって実施できる。

【0027】

本発明はさらに、癌を治療するための（ａ）医薬組成物を調製するための（ａ）パルボウイルスおよび（ｂ）Ｂｃｌ−２阻害剤の使用に関する。

【0028】

（ａ）および（ｂ）の投与方法は、同時であっても連続的であってもよいが、好ましくは、（ａ）および（ｂ）は連続的（もしくは別個に）投与される。これは、（ａ）および（ｂ）が一緒に摂取するために単一単位剤形で、または同時もしくは所定の時間差をあけて投与される別個の実体（例えば別個の容器内で）として提供されてよいことを意味する。この時間差は、一時間〜一週間、好ましくは十二時間〜三日間であってよい。さらに、パルボウイルスをＢｃｌ−２阻害剤とは別の投与方法で投与することも可能である。これに関連して、パルボウイルスまたはＢｃｌ−２阻害剤のどちらかを腫瘍内へ、および他方を全身性もしくは経口のいずれかで投与するのが有益な場合がある。特に好ましい実施形態では、パルボウイルスは腫瘍内投与され、Ｂｃｌ−２阻害剤は静脈内もしくは経口投与される。

【0029】

本発明の一つの好ましい実施形態では、作用物質の併用が充実性腫瘍の治療において利用される。例は、脳腫瘍、膵臓癌、子宮頸癌、肺癌、頭頸部癌、乳癌または大腸癌である。好ましい実施形態では、これらの腫瘍はパルボウイルス毒性に抵抗性である。本発明の医薬組成物の特別の利点は、癌を発症させる幹細胞さえ首尾よく治療できることである。

【0030】

本発明の一つの実施形態では、本組成物のパルボウイルスには、パルボウイルスＨ−１（Ｈ−１ＰＶ）もしくは関連パルボウイルス、例えばＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）またはラットウイルス（ＲＶ）である。

【0031】

本発明による作用物質の併用によって治療可能な患者には、ヒトならびに非ヒト動物が含まれる。後者の例には、非限定的に、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコの動物が含まれる。

【0032】

本発明の目的のために有用なＢｃｌ−２阻害剤には、（ａ）好ましくは正常細胞に対する副作用を伴わずにパルボウイルスの抗癌効力を増加させる、および（ｂ）Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１ ｐＢｃｌ−２のような抗アポトーシスタンパク質を阻害する、および／またはプロアポトーシス性ＢＨ３ ｏｎｌｙ タンパク質（ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋなど）もしくはＢａｘ様プロアポトーシスタンパク質（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ）の模倣化合物（ｍｉｍｅｔｉｃ）である全ての化合物が含まれる。Ｂｃｌ−２阻害剤の投与は、非経口および経腸経路による全身性を含む様々な方法（上記参照）で実施できる。好ましくは、パルボウイルスおよびＢｃｌ−２阻害剤は、別個の化合物として投与される。２種の薬剤を用いた併用治療もまた可能である。

【0033】

併用療法のために適切なＢｃｌ−２阻害剤の例には、ＡＢＴ−２６３、メシル酸オバトクラックス（ＧＸ１５０７０）、ＴＷ−３７、ＨＡ１４−１、アポゴシポロン（Ａｐｏｇｏｓｓｙｐｏｌｏｎｅ）（ＡｐｏＧ２）、ＢＡＭ７、サブトクラックス（Ｓａｂｕｔｏｃｌａｘ）、ＡＴ１０１およびＢＭ−１０７４が含まれる。特に好ましいのは、ＢＨ３模倣化合物である低分子阻害剤、好ましくはＡＢＴ−７３７（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＬＬＣ社、テキサス州ヒューストンから入手可能、図１０）およびＡＢＴ−１９９（Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ニュージャージー州メイプルウッドから入手可能、図１１）の使用である。下記の実施例では、本発明をより詳細に説明する。

【実施例】

【0034】

（実施例１）
材料および方法
（Ａ）細胞系および培養
ヒト神経膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）由来細胞系Ｕ３７３、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、Ａ１７２およびＵ８７は、Ｄｒ．Ｉｒｉｓ Ａｕｇｕｓｔｉｎ（ＤＫＦＺ、独国ハイデルベルク）のご厚意により贈呈された。Ｕ１３８およびＵ３４３は、腫瘍バンク（ＤＫＦＺ、独国ハイデルベルク）によって提供された。神経膠芽細胞腫由来細胞系であるＮＣＨ８９、ＮＣＨ８２、ＮＣＨ１２５および膠肉腫（ｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）由来細胞系ＮＣＨ３７は、神経外科学科（独国ハイデルベルク）で調製され、特性解析された。ＨｅＬａおよびＳｉＨａ子宮頸癌（ＣＣ）細胞系は、Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ａｎｇｅｌ Ａｌｏｎｓｏ（ＤＫＦＺ、独国ハイデルベルク）のご厚意で提供された。ＣＣ由来細胞系ＣａＳｋｉおよび膵管腺癌（ＰＤＡＣ）由来細胞系ＭＩＡ ＰａＣａ−２、Ｔ３Ｍ−４およびＡｓＰＣ−１は、ＡＴＣＣ（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍＢＨ社、独国ヴェーゼル）から購入した。頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）細胞系ＨＮＣ９７、Ｃａｌ２７、２１１ＭＣおよびヒト初代口腔線維芽細胞（ＰＯＦ）およびヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）は、Ｄｒ．Ｍａｓｓｉｍｏ Ｔｏｍｍａｓｉｎｏ（ＩＡＲＣ、仏国リオン）のご厚意で贈呈された。肺癌（ＬＣ）細胞系ＥＫＶＸ、Ｈｏｐ９２、Ｈ３２２Ｍ、結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ−１１６および乳癌細胞系Ｈｓ５７８Ｔは、国立癌研究所（ＮＣＩ）（メリーランド州ベテスダ）から購入した。神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）由来細胞系ＬＮ２２９、ＬＮ３０８および神経膠腫始原細胞（ＧＩＣ）系Ｔ２６９、Ｓ２４およびＴ３２５は、Ｐｒｏｆ．Ｗ．Ｗｉｃｋ（ハイデルベルク大学神経腫瘍学科、独国）のご厚意により提供された。

【0035】

幹細胞様Ｕ８７細胞は、Ｙｕおよび同僚ら（Ｙｕ他、２００８）により記載されたようにＵ８７細胞系から単離した。スフェロイドは、Ｃｈｅｎおよび同僚ら（Ｃｈｅｎ他、２０１１）によって記載された方法にしたがってＨｅＬａ細胞系から産生した。ヒトメラノサイトは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールスバッド）から、そしてアストロサイトはＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。

【0036】

神経膠腫由来細胞系は、高濃度グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、独国ダルムシュタット）を備えるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＨｅＬａ、ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ、ＡｓＰＣ−１、ＨＮＣ−９７、２１１ＭＣ、Ｃａｌ２７およびＨＦＦ細胞系は、ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、独国ミュンヘン）中で増殖させた。Ｔ３Ｍ−４、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、Ｈ３２２Ｍ、ＨＯＰ−９２、ＥＫＶＸ、ＨＣＴ−１１６およびＨｓ５７８Ｔは、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地１６４０（ＲＰＭＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国カールスルーエ）中で培養した。全培地には、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ社、独国コルベ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）を補給した。神経膠腫細胞を除いて、培地はさらに１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ社）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を含有した。神経膠腫由来癌幹細胞（ＣＳＣ）培養Ｔ２６９、Ｓ２４、Ｔ３２５およびＵ８７は、２０％のＢＩＴ−１００（Ｐｒｏｖｉｔｒｏ社、独国ベルリン）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）ならびに２０ｎｇ／ｍＬのヒト線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）および２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ社、独国ベルリン）が補給されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。スフェロイドＨｅＬａ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２および１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを補給した無血清Ｑｕａｎｔｕｍ ２６３培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中で培養した。メラノサイトは、ヒトメラノサイト成長補給剤（Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＭＧＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国ダルムシュタット）を備える培地２５４中で培養した。アストロサイトは、アストロサイト用培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で培養した。ＰＯＦは、Ｌ−グルタミンおよびフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中で培養した。全細胞は、３７℃、５％のＣＯ_２、湿度９５％で増殖させ、マイコプラズマ汚染について定期的にチェックした。

【0037】

（Ｂ）ウイルスの産生
野生型Ｈ−１ＰＶはＮＢ３２４Ｋ細胞中でＢａｒｂａｒａ Ｌｅｕｃｈｓによって産生され、以前に記載されたようにイオジキサノール勾配において精製した（Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ他、２００３）。ウイルス力価は、プラークアッセイによって決定した（Ｄａｅｆｆｌｅｒ他、２００３）。Ｈ−１ＰＶは、Ｍｏｒｉｔａおよび同僚ら（Ｍｏｒｉｔａ他、２００３）によって記載されたように総線量５０ｍＬ／ｃｍ^２を用いてＵＶ処置した。

【0038】

（Ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイ
Ｈ−１ＰＶ細胞毒性は、膜完全性の消失（溶解）に起因して細胞から遊離される酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の定量によって評価した。本アッセイは、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキットを製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ社、独国ハイデルベルク）の取扱説明書にしたがって使用して実施した。

【0039】

細胞は、通常は１０％のＦＢＳを補給した各培養培地５０μＬ中に４，０００細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレート中に播種した。一部の細胞系の異なる増殖率を考慮に入れて、Ｔ３Ｍ−４およびＨｅＬａ細胞に対しては２，０００細胞、癌幹細胞培養に対しては１０，０００細胞を播種した。二十四時間後、Ｈ−１ＰＶおよび／またはＡＢＴ−７３７を含む、または含まない５０μＬのＦＢＳフリー培地（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＬＬＣ社、テキサス州ヒューストン）を表１に指示した濃度で細胞に加えた。

【0040】

【表1-1】

【表1-2】

【0041】

メラノサイト、アストロサイト、ＨＦＦおよびＰＯＦを４０μΜのＡＢＴ−７３７の存在下または非存在下において、５０および１００ｐｆｕ／ｃｅｌｌの高感染多重度（ＭＯＩ、細胞１個当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｃｅｌｌ））でＨ−１ＰＶで感染させた。ＬＤＨアッセイは、感染後に七十二時間の代わりに長い九十六時間のインキュベーション時間行ったことを除いて上述したように実施した。

【0042】

ＡＢＴ−７３７およびＡＢＴ−１９９の効果を直接的に比較するために、神経膠芽細胞腫細胞系Ｕ１３８はＨ−１ＰＶにより５および１０ｐｆｕ／ｃｅｌｌのＭＯＩで感染させ、０．５μΜのＡＢＴ−７３７またはＡＢＴ−１９９（Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ニュージャージー州メイプルウッド）を用いて、または用いずに処置した。

【0043】

試験した各状態に対して、七例の複製物（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）を調製し、その内三例は界面活性剤の存在下での全細胞溶解を計算するために使用した。プレートの一列は、バックグラウンドを計算するために細胞を含めずに放置した。３７℃で七十二時間後、細胞は、以前に記載されたようにＬＤＨアッセイのために処置した（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ他、２０１２）。

【0044】

手短には、プレートの三列において１ウエル当たり１０μＬの１０×溶解バッファー［リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中の９％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社、独国ダルムシュタット）］を加え、これらを１００％細胞溶解コントロールとして機能させた。他の列には１０μＬのＰＢＳを加えた。細胞溶解が完了した時点に、各ウエルの３０μＬの上清を新たな９６ウエルプレートに移した。キットによって提供された３０μＬの基質ミックスを各ウエルに加えた。プレートは光線から保護し、室温で三十分間インキュベートし、その後にキットによって提供された３０μＬの停止液を加えることによって反応を停止させた。吸光度は、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４９２ｎｍの波長で測定した。テトラゾリウム塩からレッドホルマザン生成物への転換によって形成される色の量は、溶解細胞の数に比例している。各条件に対して、本発明者らは溶解バッファーを含めて（Ａ）または含めずに（Ｂ）インキュベートした三つのウエルの平均値を計算した。細胞を含まないウエル内で測定した平均値（バックグラウンド）を、細胞を含むウエル内で得られた数値から減じた。全溶解のパーセンテージは、下記の式を使用して計算した。
細胞溶解率［％］＝（Ａ−バックグラウンド）／（Ｂ−バックグラウンド）×１００

【0045】

（Ｄ）フローサイトメトリーによるサブ−Ｇ１アポトーシス集団の決定
処置後のアポトーシス細胞を検出するためにヨウ化プロピジウム染色を実施した。この色素はＤＮＡ中にインターカレートされるので、ＤＮＡ中でフローサイトメトリーによって測定できる。蛍光発光は、細胞中のＤＮＡ含量に比例する。アポトーシス細胞は、核ＤＮＡ断片化を特徴とし、低蛍光発光（サブ−Ｇ１アポトーシス細胞集団）によって同定できる（Ｒｉｃｃａｒｄｉ ＆ Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ、２００６）。

【0046】

神経膠腫細胞（Ｕ３７３、Ｕ２５１、Ｕ１３８、Ｕ３４３、Ａ１７２、ＮＣＨ３７、Ｕ８７、ＮＣＨ１２５）は、６．２５×１０^４細胞／ウエルの密度で播種されたＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５細胞を除いて３ｍＬの培養培地中の２．５×１０^５細胞／ウエルの密度で６ウエルプレート内に播種した。播種二十四時間後、細胞は、０．５〜７．５ｐｆｕ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨ−１ＰＶを用いて、または用いずに感染させた、および／または０．２５〜５μΜのＡＢＴ−７３７を用いて処置した。Ｈ−１ＰＶおよびＡＢＴ−７３７は１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に希釈し、２００μＬの最終量をウエルに加えた。全条件を三回ずつ試験した。

【0047】

感染の四十八時間後（Ｕ２５１、Ｕ１３８、Ａ１７２、Ｕ８７、ＮＣＨ１２５）、七十二時間後（Ｕ３７３）または九十六時間後（Ｕ３４３、ＮＣＨ３７）、上清および細胞（トリプシン処理により収集した）を集め、ＰＢＳで洗浄した。遠心分離後、細胞ペレットを５００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、細胞は４．５ｍＬの氷冷７０％エタノールを滴下して固定した。細胞はその後、二十四時間まで−２０℃で保管した。染色する工程の前に、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで一回洗浄した。細胞は次に２０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および２００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含有する１ｍＬのＤＮＡ染色溶液中に再懸濁させ、室温の暗所で三十分間インキュベートした。細胞懸濁液はナイロンネットでろ過し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）上で測定した。少なくとも二万例の事象を獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて分析した。ヨウ化プロピジウムは、ＦＬ−２チャネル内で検出された。アポトーシス細胞断片に対するゲートを設定するためには未処置細胞使用したが、これは未処置細胞が生存性非アポトーシス細胞の蛍光発光を示すからであった。サブ−Ｇ１集団のパーセンテージを各サンプル中で決定し、平均値は三回の測定から計算した。

【0048】

（Ｅ）ミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）の評価
生細胞中のミトコンドリアを染色する蛍光色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国ダルムシュタット）を使用してＭＭＰの変化を測定した。ミトコンドリア膜内の細孔形成に起因して、アポトーシス細胞は色素を保持することができず、フローサイトメトリー分析において低い蛍光シグナルを示す。

【0049】

神経膠腫細胞は、６．２５×１０^４細胞／ウエルの密度で播種されたＮＣＨ１２５細胞を除いて３ｍＬの培養培地中の２．５×１０^５細胞／ウエルの密度で６ウエルプレート内に播種した。二十四時間後、細胞は２．５ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（Ｕ３４３およびＮＣＨ１２５）または５ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（Ｕ３７３）または７．５ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（Ｕ１３８）のＭＯＩでＨ−１ＰＶを用いて、もしくは用いずに感染させ、０．５μΜ（Ｕ３７３、Ｕ１３８、Ｕ３４３）もしくは１μΜ（ＮＣＨ１２５）の濃度でＡＢＴ−７３７を用いて、もしくは用いずに処置した、または両方の作用物質を用いて共処置した。インキュベーションの四十八時間後（Ｕ１３８、ＮＣＨ１２５）または七十二時間後（Ｕ３７３）または九十六時間後（Ｕ３４３）、培地は、補給剤を含まないＤＭＥＭ中に色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（２００ｎＭ）を含有する１ｍＬのミトコンドリア染色溶液と取り替えた。３７℃での一時間の染色後、細胞はトリプシン処理により収集し、ＰＢＳで一回洗浄し、最終的にＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。少なくとも一万例の事象を獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて分析した。ＭＭＰを経験した細胞の平均値は三例の複製物から計算した。

【0050】

（Ｆ）活性切断カスパーゼ−３／７形態の検出
Ｈ−１ＰＶおよびＡＢＴ−７３７を用いた処置後のカスパーゼ−３／７の切断（アポトーシスの顕著な特徴）は、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国ダルムシュタット）を使用して分析した。アポトーシス細胞中でのカスパーゼ−３もしくは７の活性化は、試薬からのペプチド配列の切断を生じさせ、これは核酸結合色素を遊離させる。色素がＤＮＡに結合すると、蛍光顕微鏡によって検出できる緑色蛍光シグナルが生成される。

【0051】

細胞は、１０ウエル顕微鏡スライド上に４，０００細胞／ウエルの密度で播種した。二十四時間後、細胞は、０．２５μΜのＡＢＴ−７３７（Ｕ３７３）または１μΜ（ＮＣＨ３７、ＮＣＨ１２５）または１．２５μΜ（Ａ１７２）または２．５μＭ（Ｕ２５１、Ｕ１３８、Ｕ３４３、Ｕ８７）の存在下または非存在下において、１ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（ＮＣＨ３７およびＮＣＨ１２５）または５ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（Ｕ３７３、Ｕ２５１、Ｕ１３８、Ａ１７２、Ｕ８７）または１０ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（Ｕ３４３）のＭＯＩでＨ−１ＰＶで感染させた。未処置細胞をコントロールとして使用した。二十四時間後、細胞は１０μΜのＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ−３／７緑色検出試薬を用いて三十分間染色した。細胞は次にＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定した。核染色のためには、市販のＤＡＰＩ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、独国レラッハ）を細胞に加えた。ＰＢＳを用いた染色後、細胞をカバースリップに載荷し、倍率二十倍で青色および緑色チャネルを使用して蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社、独国ノイ・イーゼンブルク）により分析した。

【0052】

（実施例２）
ＡＢＴ−７３７は相乗的方法でＨ−１ＰＶの腫瘍細胞崩壊活性を増強する
Ｈ−１ＰＶが様々な組織由来のヒト癌細胞系に感染することができ、細胞毒性活性を発揮することは公知である。しかし、全細胞系がウイルス細胞毒性に同一レベルで応答するわけではなく、一部の細胞系はウイルスに対して極めて感受性であるが、他の細胞系はほぼ抵抗性である（Ｅ１−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ他、２０１２）。このため、ウイルスの極めて優れた安全性プロファイルを保持しながら癌細胞を殺滅することにおいてＨ−１ＰＶと協働できるであろう他の抗癌剤を見いだすことは極めて重要であろう。癌細胞は細胞死経路における欠陥、例えば抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー、例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ、Ｂｃｌ−ｗおよびＭｃｌ−１などの過剰発現を特徴とすることが多いので、本発明者らは、これらの欠陥がＨ−１ＰＶ細胞毒性に対して寄与する可能性があると仮説を立て、Ｈ−１ＰＶと併用においてＢｃｌ−２阻害剤であるＡＢＴ−７３７の使用が癌細胞内のアポトーシス細胞死を回復させ、強化された処置効果を生じさせられるかどうかを探索した。

【0053】

最初に、ヒト神経膠腫に対するＨ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置を評価した。このために、１１種のヒト細胞系のパネル、即ち、ＧＢＭを患う患者から単離された１０種（Ｕ３７３、ＬＮ３０８、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ１３８、Ｕ３４３、Ａ１７２、ＬＮ２２９、Ｕ８７、ＮＣＨ１２５）神経膠肉腫を患う患者から単離された１種（ＮＣＨ３７）、を使用した。細胞を９６ウェルプレート内で増殖させ、ＡＢＴ−７３７の存在下または非存在下におけるＨ−１ＰＶ誘導性細胞溶解をＬＤＨアッセイによって分析した（実験条件については表１および実施例１を参照されたい）。ウイルス用量依存性細胞殺滅が試験した全細胞系において観察された。しかし細胞系はウイルス感染に対する感受性について異なり、Ｕ３７３、ＬＮ３０８、Ｕ２５１、Ｔ９８ＧおよびＵ１３８のような一部の細胞系はウイルス細胞毒性に対して高度に抵抗性で高いウイルス感染多重度（ＭＯＩ、ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）で感染させた場合でさえ極めて小さな細胞毒性作用しか提示しなかった（ＭＯＩ＝１０にあるＨ−１ＰＶにより感染させた場合は、細胞殺滅≦２５％）が（図１ａ〜ｅ）、Ｕ３４３、Ａ１７２およびＬＮ２２９などの他の細胞系は中間表現型（２５〜５０％の細胞殺滅）を示し（図１ｆ〜ｈ）、例えばＮＣＨ３７、Ｕ８７およびＮＣＨ１２５などの他の細胞系はウイルス細胞毒性に感受性であることが見いだされた（５０％を超える細胞殺滅）（図１ｉ〜ｋ）。使用した用量でのＡＢＴ−７３７単独では、控えめな細胞毒性作用が観察された神経膠腫Ｕ８７の唯一の例外を除き、細胞についての明白な細胞毒性を有していなかった（図１ａ〜ｋ）。注目すべきことに、これらの量のＡＢＴ−７３７は、極めて多数の症例において１００〜２００％超までウイルス細胞毒性を増加させ、統計的有意な相乗的方法でＨ−１ＰＶ腫瘍細胞崩壊を強化するために十分であった。重要なことに、例えばＵ３４３（細胞をＡＢＴ−７３７の存在下でＭＯＩ＝１０でＨ−１ＰＶに感染させた場合にＨ−１ＰＶ誘導性細胞殺滅を４．７倍に増加させた）、Ｕ１３８（３．５倍の増加）およびＬＮ３０８（３．２倍の増加）などの低感受性細胞系さえ、ウイルス細胞毒性作用に感受性になり、ＡＢＴ−７３７の存在下で効率的に殺滅された（図１ａ〜ｋ）。

【0054】

第二に、Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置が他の腫瘍実体由来の癌細胞を殺滅することにも有効であるかどうかを調査した。ＬＤＨアッセイのために下記の１４種のヒト癌細胞系、すなわち、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、Ｔ３Ｍ−４およびＡｓＰＣ−１、子宮頸癌（ＣＣ）ＨｅＬａ、ＣａＳｋｉおよびＳｉＨａ、肺癌（ＬＣ）Ｈ３２２Ｍ、ＨＯＰ９２およびＥＫＶＸ、頭頸部皮膚扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、ＨＮＣ９７、２１１ＭＣおよびＣａｌ２７、結腸大腸癌ＨＣＴ−１１６および乳癌Ｈｓ５７８Ｔ細胞系を選択した。神経膠腫細胞系を用いて得られた結果に一致して、ＡＢＴ−７３７は、それらの起源とは無関係に試験した全癌細胞系において相乗的方法でＨ−１ＰＶ誘導性腫瘍細胞崩壊を誘導した（図２ａ〜ｎ）。

【0055】

癌幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍の維持、攻撃性および再発に対して責任を負う可能性が最も高い。このため、第３工程では、新鮮腫瘍（ＧＢＭ Ｔ２６９、Ｓ２４およびＴ３２５）ならびにＧＢＭ（Ｕ８７）おびＣＣ（ＨｅＬａ）を患う患者に由来する癌細胞系から単離したＣＳＣを溶解させることにおけるＨ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置の能力を評価した。ＣＳＣは、ＡＢＴ−７３７と併用して、または併用せずにＨ−１ＰＶで感染させられる前に腫瘍球体（ｓｐｈｅｒｅ）として増殖させられた。Ｈ−１ＰＶは、様々なＣＳＣ培養物を効率的に感染させることができた（データは示していない）。さらにこの場合でも、ＡＢＴ−７３７はＨ−１ＰＶ細胞毒性を増加させた（図３ａ〜ｅ）。

【0056】

最後に、Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置が正常ヒト初代細胞にとって安全であるかどうかがチェックされた。正常初代線維芽細胞（口腔および包皮）、メラノサイトおよびアストロサイトは、ＡＢＴ−７３７と併用して、または併用せずに、Ｈ−１ＰＶにより感染させ、次にＭＴＴ（細胞生存性）アッセイ（データは示していない）およびＬＤＨ（細胞溶解）アッセイに供した。ウイルスおよびＡＢＴ−７３７を高濃度（ＭＯＩ、各々１００および４０μΜ）および長時間（七十二時間の代わりに九十六時間）使用した場合でさえ、癌細胞に対して観察された重度の細胞毒性は観察されなかった。これらの結果は、組み合わされた二種の作用物質が正常初代細胞にとって有害ではないという重要な証拠を提供している（図４）。

【0057】

結論として、これらの結果は初めて、Ｈ−１ＰＶおよびＢｃｌ−２阻害剤であるＡＢＴ−７３７の併用が癌に対する妥当なアプローチである可能性があることを証明している。

【0058】

（実施例３）
Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置はミトコンドリア膜透過化およびカスパーゼ類の活性化によりアポトーシスを誘導する
ＡＢＴ−７３７は、癌細胞においてアポトーシスを回復している抗アポトーシスＢｃｌ−２分子の活性を遮断する（Ｃｒａｇｇ他、２００９）。しかし、細胞変性作用を発揮するためには、薬物は初期実験において使用される濃度より高い濃度で使用されなければならない（Ｔａｇｓｃｈｅｒｅｒ他、２００８）。他方、Ｈ−１ＰＶはアポトーシスからネクローシス、カテプシン媒介性細胞死への範囲に渡る多数の細胞死プログラムを誘導する可能性があることは公知である（Ｎｕｅｓｃｈ他、２０１２）。Ｈ−１ＰＶがＡＢＴ−７３７の存在下または非存在下においてアポトーシスを誘導する能力を八種の神経膠腫細胞系（Ｕ３７３、Ｕ２５１、Ｕ１３８、Ｕ３４３、Ａ１７２、ＮＣＨ３７、Ｕ８７、ＮＣＨ１２５）の選択において、ＤＮＡ断片化の発生をフローサイトメトリー分析によって評価することによってチェックした（サブ−Ｇ１細胞集団の検出）。Ｈ−１ＰＶを用いて、または用いずに感染させた未処置もしくはＡＢＴ−７３７処置細胞を集菌し、ヨウ化プロピジウムを用いて染色した。実験で使用した濃度で、ＡＢＴ−７３７およびＨ−１ＰＶ単独処置は、アポトーシスを効率的に誘導することができなかった。これとは反対に、併用で使用した場合に２種の作用物質は、分析した全細胞系において観察されたサブ−Ｇ１集団の強度の増加によって推定されるようにアポトーシスを誘発することに極めて有効であった（Ｈ−１ＰＶ単独処置をＨ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７併用と比較した場合に、Ｕ２５１における４．７倍の増加、Ｕ３４３における３．８倍の増加、Ｕ３７３およびＮＣＨ１２５における３．４倍の増加、Ｕ８７における２．８倍の増加、Ｕ１３８における２．１倍の増加、Ａ１７２における１．９倍の増加、ＮＣＨ３７における１．８倍の増加）（図５ａ〜ｈ）。

【0059】

ミトコンドリアは、内因性アポトーシス経路において中心的役割を果たし、ミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）はアポトーシスの顕著な特徴である。ＭＭＰは、主としてＢｃｌ−２ファミリーメンバーによって制御される。Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７誘導性アポトーシスがミトコンドリアアポトーシス経路の活性化を含むかどうかという問題を取り扱った。Ｕ３７３、Ｕ１３８、Ｕ３４３およびＮＣＨ１２５神経膠腫細胞系は、ＡＢＴ−７３７の存在下または非存在下において、Ｈ−１ＰＶを用いて、または用いずに感染させた。四十八〜九十六時間後、細胞はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを用いて染色し、ＭＭＰについてフローサイトメトリーによって分析した（図６ａ〜ｄ）。ＡＢＴ−７３７単独処置はＭＭＰにほとんど影響を及ぼさず、Ｈ−１ＰＶ単独による感染はわずかなＭＭＰとしか関連していなかったが、Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置は劇的にＭＭＰを増加させ（Ｈ−１ＰＶ単独処置をＨ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７併用と比較した場合に、Ｕ３７３における二倍、Ｕ１３８における２．１倍、Ｕ３４３における３．６倍およびＮＣＨ１２５における３．４倍）、これは共処置誘導性アポトーシスにおけるミトコンドリアの関与を示唆した。

【0060】

次に、Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７誘導性アポトーシスにおけるカスパーゼ−３および７が果たす役割を調査した。以前にアポトーシス性サブ−Ｇ１細胞集団の存在についてＦＡＣＳ分析によって分析された神経膠腫細胞は、エフェクターカスパーゼ−３および７の活性形を検出するＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬を用いて染色した。以前の結果と一致して、全８種のＨ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置神経膠腫細胞系においてアポトーシスの強度の増加が観察された（図７ａ〜ｈ）。

【0061】

（実施例４）
ＡＢＴ−１９９はＡＢＴ−７３７程効果的ではないがＨ−１ＰＶの腫瘍細胞崩壊活性を強化する
ＡＢＴ−１９９は、Ｂｃｌ−２に対してＡＢＴ−７３７より特異的で強力な阻害剤であるが、ＡＢＴ−７３７とは対照的にＢｃｌ−Ｘ_ＬおよびＢｃｌ−ｗを標的とすることができない（Ｓｏｕｅｒｓ他、２０１３）。この実験では、ＡＢＴ−１９９もまたＨ−１ＰＶの腫瘍細胞崩壊活性を強化できるかどうかを調査した。ＬＤＨ実験は、ヒト膠芽細胞腫細胞系であるＵ１３８を使用して実施した。細胞はＨ−１ＰＶを用いて、または用いずに感染させ、ＡＢＴ−７３７もしくはＡＢＴ−１９９の存在下または非存在下において増殖させた。以前に見いだされたように、ＡＢＴ−７３７は、ウイルス単独（ＭＯＩ ５で）処置に比較して強化して相乗的方法でＨ−１ＰＶ細胞毒性を３．８倍増加させた。ＡＢＴ−１９９はさらに、ＡＢＴ−７３７より少ない程度ではあるがウイルスの細胞毒性活性を増加する（１．７倍の増加）こともできた（図８）。Ｈ−１ＰＶ細胞毒性を促進することにおけるこの差は、Ｕ１３８細胞がＢｃｌ−２に加えて、同様にＡＢＴ−７３７の標的ではあるがＡＢＴ−１９９の標的ではない高レベルの抗アポトーシス性Ｂｃｌ−Ｘ_ＬおよびＢｃｌ−ｗも発現するという事実に起因する可能性がある。にもかかわらず、ウイルスと併用したＡＢＴ−１９９の使用は、特に低レベルのＢｃｌ−Ｘ_ＬおよびＢｃｌ−ｗを発現する癌においては、優れた安全性プロファイルを考えると価値があると見なすことができる。

【0062】

（実施例５）
Ｈ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７共処置は定着腫瘍を撲滅する
インビボでのＨ−１ＰＶ／ＡＢＴ−７３７相乗作用の妥当性を確認するために、本発明者らは、ヒト膵臓癌のＡｓＰＣ−１異種移植片ヌードラットモデルを使用した（Ｌｉ他、２０１３）。Ｈ−１ＰＶおよびＡＢＴ−７３７単独は、使用した用量では有意な治療効果を得ることに失敗した（ラットは、腫瘍が４，０００ｍｍ^３の最大許容サイズに達した時点に犠死させた）。対照的に、併用治療は強力な相乗効果を生じさせ、全部の共治療動物において完全で永続性の腫瘍寛解をもたらした（図９）。治療群動物のいずれにおいても体重減少または他の有害な副作用は証明されなかった。

【0063】

結論として、上記の実施例の結果は、パルボウイルス（例えば、Ｈ−１ＰＶ）およびＢｃｌ−２阻害剤（例えば、ＡＢＴ−７３７）の併用が、癌、特に神経膠腫および膵臓癌に対する妥当なアプローチである可能性があることを初めて証明したものである。

【0064】

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【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図1g】

【図1h】

【図1i】

【図1j】

【図1k】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図2i】

【図2j】

【図2k】

【図2l】

【図2m】

【図2n】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図5f】

【図5g】

【図5h】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図7e】

【図7f】

【図7g】

【図7h】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】