特開 2017-169547 新規タンパク質及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-169547(P2017-169547A)

(43)【公開日】2017年9月28日

(54)【発明の名称】新規タンパク質及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170901BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170901BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170901BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170901BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170901BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20170901BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20170901BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N9/88

   C12N1/20 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2016-62651(P2016-62651)

(22)【出願日】2016年3月25日

(71)【出願人】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100169764

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 雄一郎

(72)【発明者】

【氏名】小林 達彦

(72)【発明者】

【氏名】熊野 匠人

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050CC07

4B050DD02

4B050FF12E

4B050FF13E

4B050FF17E

4B050LL02

4B065AA01Y

4B065AB01

4B065BA01

4B065BA22

4B065CA27

4B065CA41

(57)【要約】      （修正有）

【課題】セサミンを代謝する新たな酵素及びその遺伝子を提供する。
【解決手段】以下のいずれかに記載の核酸：（ａ）特定の配列を有する核酸、（ｂ）特定の配列と同一性が８０％以上でありセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換するタンパク質をコードする核酸、（ｃ）特定の配列と相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換するタンパク質をコードする核酸、（ｄ）特定の配列のタンパク質をコードする核酸、（ｅ）特定の配列と同一性が８０％以上であり且つセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換するタンパク質をコードする核酸、（ｆ）特定の配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され且つセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換するタンパク質をコードする核酸。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸

【請求項2】

請求項１に記載の核酸を含有する組換えベクター。

【請求項3】

請求項２に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。

【請求項4】

以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質

【請求項5】

請求項４に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを含む、セサミン又はその誘導体のカテコール体への変換用組成物。

【請求項6】

セサミン又はセサミン誘導体と請求項４に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる工程を備える、セサミン又はその誘導体のカテコール体の製造方法。

【請求項7】

セサミン又はセサミン誘導体と請求項４に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる前記工程が、セサミン又はセサミン誘導体と請求項３に記載の形質転換体とを接触させる工程である、請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

セサミン又はセサミン誘導体と請求項４に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる前記工程が、セサミン又はセサミン誘導体とシノモナス属細菌とを接触させる工程である、請求項６に記載の製造方法。

【請求項9】

受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２２３０であるシノモナス属細菌Ｎｏ．２２株（Ｓｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｎｏ．２２）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規タンパク質及びその使用に関する。より具体的には、核酸、組換えベクター、形質転換体、セサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質、セサミン又はその誘導体のカテコール体への変換用組成物、セサミン又はその誘導体のカテコール体の製造方法及びシノモナス属細菌株に関する。

【背景技術】

【0002】

セサミンはゴマリグナンの一種であり、ゴマ種子に含まれている脂溶性化合物である。セサミンはサプリメントとして利用されており、ヒトを含む動物の体内で、抗酸化活性、アルコールの代謝促進、脂肪酸の代謝の調節等の作用を示すとされている。下記式（１）にセサミンの化学式を示す。

【0003】

【化1】

【0004】

しかしながら、試験管内の反応では、セサミンそのものには抗酸化活性はほとんど認められないことが知られている。そして、セサミンは肝臓でセサミンモノカテコール、セサミンジカテコール等のカテコール体に代謝され、これらのカテコール体がラジカル消去活性や過酸化脂質生成抑制活性等の抗酸化活性を示すことが明らかにされている。

【0005】

マウスやヒトにおけるセサミンの代謝についてはいくつかの報告がなされている。例えば、非特許文献１には、ヒト肝臓のシトクロムＰ４５０がセサミンを代謝することが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Yasuda K., et al., Metabolism of sesamin by cytochrome P450 in human liver microsomes., Drug Metab. Dispos. 38 (12), 2117-2123, 2010.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、セサミンを代謝することができる微生物由来の酵素が同定された例はない。そこで、本発明は、セサミンを代謝することができる微生物を自然界よりスクリーニングし、セサミンを代謝する新たな酵素及びその遺伝子を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は以下の態様を含む。
［１］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
［２］［１］に記載の核酸を含有する組換えベクター。
［３］［２］に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
［４］以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質
［５］［４］に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを含む、セサミン又はその誘導体のカテコール体への変換用組成物。
［６］セサミン又はセサミン誘導体と［４］に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる工程を備える、セサミン又はその誘導体のカテコール体の製造方法。
［７］セサミン又はセサミン誘導体と［４］に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる前記工程が、セサミン又はセサミン誘導体と［３］に記載の形質転換体とを接触させる工程である、［６］に記載の製造方法。
［８］セサミン又はセサミン誘導体と［４］に記載のタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる前記工程が、セサミン又はセサミン誘導体とシノモナス属細菌とを接触させる工程である、［６］に記載の製造方法。
［９］受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２２３０であるシノモナス属細菌Ｎｏ．２２株（Ｓｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｎｏ．２２）。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、セサミンを代謝する新たな酵素及びその遺伝子を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】（ａ）は、シノモナス属細菌Ｎｏ．２２株のＬＢ寒天培地上でのコロニーの形状を示す写真である。（ｂ）は、Ｎｏ．２２株のグラム染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。

【図2】実験例３のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。

【図3】実験例４の各精製段階におけるタンパク質試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した結果を示す写真である。

【図4】（ａ）は実験例８において、酵素の温度依存性を検討した結果を示すグラフである。（ｂ）は実験例８において、酵素の温度安定性を検討した結果を示すグラフである。（ｃ）は実験例８において、酵素のｐＨ依存性を検討した結果を示すグラフである。（ｄ）は実験例８において、酵素のｐＨ安定性を検討した結果を示すグラフである。

【図5】実験例８において、基質濃度と酵素の反応速度をプロットしたグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［核酸］
１実施形態において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の核酸を提供する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸

【0012】

実施例において後述するように、発明者らは、テトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有する新規タンパク質（以下、「ＳｅｓＡ」という場合がある。）を同定した。配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸は、発明者らが同定したＳｅｓＡ遺伝子であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、発明者らが同定したＳｅｓＡタンパク質である。

【0013】

本明細書において、核酸はＤＮＡであってもよくＲＮＡであってもよい。配列番号１にはＤＮＡの塩基配列を記載しているため、対象の核酸がＲＮＡである場合には、配列番号１の塩基配列を対応するＲＮＡの塩基配列に読み替えればよい。より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列におけるチミン残基をウラシル残基に読み替えればよい。

【0014】

本実施形態の核酸は、テトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードしている限り、配列番号１の塩基配列に対して変異を有していてもよい。より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であればよい。

【0015】

ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（ａ）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００ （ａ）

【0016】

あるいは、本実施形態の核酸は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。

【0017】

ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム，０．３Ｍクエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１質量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２質量％のＳＤＳ、２質量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液が挙げられる。

【0018】

本実施形態の核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。

【0019】

また、本実施形態の核酸は、テトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードしている限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであってもよい。

【0020】

ここで、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（ｂ）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００ （ｂ）

【0021】

あるいは、本実施形態の核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。

【0022】

ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜１００個であってもよく、１〜５０個であってもよく、１〜３０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよい。

【0023】

本明細書において、セサミン誘導体としては、メチレンジオキシフェニル基を有する化合物が挙げられ、より具体的には、例えば、下記式（２）で表されるセサミノール、下記式（３）で表される（＋）−セサモリン、下記式（４）で表される（−）−アサリニン、下記式（５）で表される（＋）−エピセサミン、下記式（６）で表されるピぺリン等が挙げられる。

【0024】

実施例において後述するように、発明者らは、ＳｅｓＡタンパク質が、これらのセサミン誘導体をカテコール体に変換することを明らかにした。

【0025】

【化2】

【0026】

【化3】

【0027】

【化4】

【0028】

【化5】

【0029】

【化6】

【0030】

本明細書において、セサミン又はその誘導体のカテコール体とは、セサミン又はその誘導体のメチレンジオキシフェニル基の少なくとも１つがカテコール基に変換された化合物を意味する。

【0031】

例えば、セサミンのカテコール体としては、メチレンジオキシフェニル基の一方がカテコール基に変換されたセサミンモノカテコール、メチレンジオキシフェニル基が２つともカテコール基に変換されたセサミンジカテコールが挙げられる。下記式（７）にセサミンモノカテコールの化学式を示し、下記式（８）にセサミンジカテコールの化学式を示す。

【0032】

【化7】

【0033】

【化8】

【0034】

セサミンのカテコール体と同様に、セサミン誘導体のカテコール体とは、そのメチレンジオキシフェニル基の少なくとも１つがカテコール基に変換された化合物を意味する。

【0035】

［ベクター］
１実施形態において、本発明は、上述した核酸を含有する組換えベクターを提供する。本実施形態の組換えベクターは、発現ベクターであってもよい。本実施形態の組換えベクターを宿主中で発現させることにより、テトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質を製造することができる。

【0036】

本実施形態の組換えベクターにおいて、上述した核酸の５’末端又は３’末端に、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ配列をコードするＤＮＡが付加されていてもよい。上記の発現ベクターとしては、宿主細胞にＳｅｓＡタンパク質を発現させる細胞系ベクターと、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系においてＳｅｓＡタンパク質を発現させる無細胞系ベクターが挙げられる。

【0037】

細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。

【0038】

無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。

【0039】

無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、ＳｅｓＡ遺伝子を転写して、ｍＲＮＡを合成する。転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ等が挙げられる。

【0040】

続いて、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系としては、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。

【0041】

細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質からＳｅｓＡタンパク質を精製して用いることができる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて精製することにより、ＳｅｓＡタンパク質の純度を高めることができる。

【0042】

［形質転換体］
１実施形態において、本発明は、上述した組換えベクターを含有する形質転換体を提供する。本実施形態の形質転換体又はその培地等より、ＳｅｓＡタンパク質を製造することができる。

【0043】

本実施形態の形質転換体は、上述した組換えベクターを宿主に導入することにより得ることができる。形質転換体としては、例えば、上述した組換えベクターが導入された、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の培養細胞；上述したベクターが導入された、カイコ等の昆虫生体；上述したベクターが導入された、タバコ等の植物体等が挙げられる。

【0044】

組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にも、ファージベクター、ウイルスベクター等を宿主に感染させて形質転換する方法を利用してもよい。

【0045】

［タンパク質］
１実施形態において、本発明は、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載のタンパク質を提供する。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質

【0046】

実施例において後述するように、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、発明者らが新規に同定した、テトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するＳｅｓＡタンパク質である。実施例において後述するように、ＳｅｓＡタンパク質のｋ_ｃａｔは、セサミンをカテコール体に代謝する酵素として知られているヒトシトクロムＰ４５０のｋ_ｃａｔと比較して２２０倍高いことが明らかとなった。

【0047】

本実施形態のタンパク質は、テトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有する限り、配列番号２のアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。配列同一性については、上述したものと同様である。

【0048】

あるいは、本実施形態のタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質であってもよい。

【0049】

ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜１００個であってもよく、１〜５０個であってもよく、１〜３０個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよい。

【0050】

本実施形態のタンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグを有していてもよい。タグは、タンパク質の精製や検出を容易にするために利用することができる。タグは、ＳｅｓＡタンパク質の活性には影響しない。このため、本実施形態のタンパク質がタグを有している場合、当該タグ配列は上記の配列同一性又は付加されたアミノ酸の計算から除外してもよい。

【0051】

なお、本明細書においては、上記（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質だけでなく、上記（ｈ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質、及び上記（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つテトラヒドロ葉酸の存在下でセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する活性を有するタンパク質をＳｅｓＡタンパク質という場合がある。

【0052】

［組成物］
１実施形態において、本発明は、上述したＳｅｓＡタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを含む、セサミン又はその誘導体のカテコール体への変換用組成物を提供する。

【0053】

実施例において後述するように、発明者らは、ＳｅｓＡタンパク質によるセサミン又はその誘導体のカテコール体への変換に、補酵素としてテトラヒドロ葉酸が必要であることを明らかにした。

【0054】

したがって、ＳｅｓＡタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを含む組成物は、セサミン又はその誘導体のカテコール体への変換用であるということができる。

【0055】

実施例において後述するように、ＳｅｓＡタンパク質の酵素活性にはテトラヒドロ葉酸の存在が必要であり、テトラヒドロ葉酸の代わりに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、補酵素Ａ（ＣｏＡ）、ビタミンＢ６、チアミン−ＨＣｌ、イノシトール、Ｄ−パントテン酸カルシウム、ＭｇＣｌ_２、Ｆｅ_２（ＳＯ_４）_３、ＦｅＳＯ_４又はＦｅＣｌ_２を添加しても、酵素活性は認められなかった。

【0056】

１実施形態において、本発明は、セサミン又はセサミン誘導体と上述したＳｅｓＡタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる工程を備える、セサミン又はその誘導体のカテコール体の製造方法を提供する。

【0057】

実施例において後述するように、セサミン又はセサミン誘導体と上述したＳｅｓＡタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させることにより、セサミン又はその誘導体のカテコール体を製造することができる。

【0058】

実施例において後述するように、ＳｅｓＡタンパク質のｋ_ｃａｔは、セサミンをカテコール体に代謝する酵素として知られているヒトシトクロムＰ４５０のｋ_ｃａｔと比較して２２０倍高いことが明らかとなった。したがって、本実施形態の方法により、セサミン又はその誘導体のカテコール体を効率よく製造することができる。

【0059】

本実施形態の製造方法において、セサミン又はセサミン誘導体とＳｅｓＡタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる工程は、セサミン又はセサミン誘導体と上述した形質転換体とを接触させる工程であってもよい。

【0060】

あるいは、セサミン又はセサミン誘導体とＳｅｓＡタンパク質とテトラヒドロ葉酸とを接触させる上記工程は、セサミン又はセサミン誘導体とシノモナス属細菌とを接触させる工程であってもよい。

【0061】

実施例において後述するように、ＳｅｓＡタンパク質はシノモナス属細菌から見出されたものであるため、シノモナス属細菌はセサミン又はその誘導体をカテコール体に変換する酵素を有している蓋然性が高いということができる。

【0062】

上記のシノモナス属細菌は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２２３０であるシノモナス属細菌Ｎｏ．２２株（Ｓｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｎｏ．２２）であることが好ましい。

【実施例】

【0063】

以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

【0064】

［実験例１］
（微生物のスクリーニング）
土壌サンプルからセサミンを資化する微生物をスクリーニングした。微生物の集積培養を行った後、微生物を単離し、それぞれの微生物の細胞抽出液・無細胞抽出液を調製した。セサミンを基質として反応させ、活性測定を行うことでセサミンを代謝できる微生物を選択した。

【0065】

《集積培養》
１０ｍＬセサミン単一炭素源液体培地にゴマ畑より採取した土壌をスパーテル１杯分添加し、２８℃又は３７℃で３日間振とう培養を行った。続いて、新しい液体培地に２％植菌し、同条件で培養した。植継ぎは３回行った。続いて、培養液を１０^−４に希釈し、１００μＬをセサミン単一炭素源プレート培地に広げ、２８℃又は３７℃で１０日間平板培養した。生育したコロニーを新しい寒天培地に植継ぎ、同条件で培養し菌を単離した。

【0066】

集積培養の結果、４０株の菌を単離した。得られたすべての菌株について細胞抽出液・無細胞抽出液を調製し、セサミンと反応させた。その結果、４０株のうち７株でセサミンの減少及び代謝産物と思われる物質の生成が確認された。

【0067】

《細胞抽出液の調製》
細胞抽出液の調製は次のようにして行った。菌株をセサミン単一炭素源液体培地１０ｍＬで培養した後、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。沈殿に、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）を適量入れ、菌体を洗浄し、再び４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。沈殿を１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５００μＬに懸濁し反応チューブに移した。超音波破砕機（型式「Ｍｉｃｒｏｓｏｎ ＸＬ２０００」、Ｍｉｓｏｎｉｘ社）を用いて１秒間×３０回超音波処理し、菌体を破砕し、細胞抽出液を得た。

【0068】

《無細胞抽出液の調製》
無細胞抽出液の調製は次のようにして行った。菌株をセサミン単一炭素源液体培地１０ｍＬで培養した後、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。沈殿に、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）を適量入れ、菌体を洗浄し、再び４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。沈殿を菌体重量の２倍容量の１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に懸濁して反応チューブに移した。続いて、超音波破砕機（型式「Ｍｉｃｒｏｓｏｎ ＸＬ２０００」、Ｍｉｓｏｎｉｘ社）を用いて１秒間×３０回超音波処理し、菌体を破砕した。続いて、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を無細胞抽出液として回収した。

【0069】

《セサミンとの反応》
セサミンをＤＭＳＯに溶解し１０ｍＭに調製した。細胞破砕液又は無細胞抽出液１００μＬ、１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）９０μＬ及び１０ｍＭセサミン１０μＬを混合し、反応液２００μＬを調製した。続いて、反応液を２８℃で１、３、６、２４時間反応させた。対照として、細胞破砕液又は無細胞抽出液の代わりに１０ｍＭ ＫＰＢを混合した反応液を調製し、同様にインキュベートした。反応後、反応液に０．５倍容量のアセトニトリルを添加して反応を停止した。

【0070】

《活性測定》
細胞抽出液反応又は無細胞抽出液反応後、反応を停止した溶液を４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、基質であるセサミンの減少量を測定した。

【0071】

その結果、代謝産物と思われる２つのピークが見られた。セサミンのピークは保持時間１４．２分で見られ、代謝産物と思われるピークの保持時間は１１．３分及び８．４分であった。

【0072】

《微生物の同定》
セサミンの代謝活性を示した７つの菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて遺伝子データベースの相同性検索を行った。その結果、１６Ｓ ｒＲＮＡの類似度から、得られた菌株は表１に示す種の菌であると考えられた。

【0073】

【表1】

【0074】

［実験例２］
（菌株の解析）
菌株番号Ｎｏ．２２株について、更に詳細な解析を行った。図１（ａ）は、Ｎｏ．２２株のＬＢ寒天培地上でのコロニーの形状を示す写真である。コロニーの直径は１〜２ｍｍであった。図１（ｂ）は、Ｎｏ．２２株のグラム染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。

【0075】

表２〜６に、Ｎｏ．２２株の形態観察及び生理・生化学的性状試験の結果を示す。その結果、Ｎｏ．２２株はシノモナス属細菌であることが明らかとなった。シノモナス属細菌Ｎｏ．２２株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（受領日：平成２８年３月２５日、受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０２２３０、微生物名「Ｓｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｎｏ．２２」）。

【0076】

【表2】

【0077】

【表3】

【0078】

【表4】

【0079】

【表5】

【0080】

【表6】

【0081】

［実験例３］
（Ｎｏ．２２株によるセサミン代謝産物の同定）
Ｎｏ．２２株から調製した無細胞抽出液とセサミンを上述したものと同様にして反応させ、ＨＰＬＣで分析した。図２は、ＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。図２中、矢印Ａ及びＢで示すピークがセサミン代謝産物のピークである。核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）で構造解析を行った結果、矢印Ａで示すピークが下記式（７）で表わされるセサミンモノカテコールであり、矢印Ｂで示すピークが下記式（８）で表わされるセサミンジカテコールであることが明らかとなった。

【0082】

【化9】

【0083】

【化10】

【0084】

［実験例４］
（酵素の精製）
Ｎｏ．２２株の無細胞抽出液からセサミン代謝酵素の精製を行った。様々な条件検討を行った結果、硫酸アンモニウム沈殿、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社）による精製、及びＭｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ １ Ａ６ＸＬカラム（プロメティックバイオサイエンシス社）による精製により、セサミン代謝酵素を単一バンドになるまで精製することができた。以下、このセサミン代謝酵素を「ＳｅｓＡ」という場合がある。

【0085】

また、精製の初期段階でＳｅｓＡタンパク質の活性がなくなる現象が見られた。さらに検討を行った結果、ＳｅｓＡタンパク質の酵素活性には、補酵素としてテトラヒドロ葉酸が必要であることが明らかになった。詳細については後述する。

【0086】

《活性測定時の反応液組成の検討》
ＳｅｓＡタンパク質の活性を測定するにあたり、基質であるセサミンは反応液中に完全に溶解している必要がある。しかしながら、セサミンは脂溶性であることから水系バッファーには溶解しない。そこで、表７に示す組成の反応液を調製し、界面活性剤及びシクロデキストリンの検討を行った。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＳＤＳを検討した。シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンを検討した。界面活性剤は反応液中に終濃度２％となるように添加した。シクロデキストリンは終濃度１ｍＭとなるように添加した。セサミンが溶解しているか否かは、目視又はＨＰＬＣを用いて確認した。

【0087】

【表7】

【0088】

目視でセサミンの溶解を確認した結果、Ｔｗｅｅｎ８０以外の界面活性剤又はシクロデキストリンを添加した全ての反応液に濁りが確認された。そこで、Ｔｗｅｅｎ８０を添加した反応液をＨＰＬＣに供し、どの程度の濃度のセサミンが反応液中に溶解しているのか確認した。その結果、反応液中には０．５ｍＭのセサミンを添加しているが、ＨＰＬＣにより検出されたセサミンは０．３８ｍＭであった。この結果から、後述する、Ｋ_ｍ、ｋ_ｃａｔの測定を行う際には、セサミン濃度０．３ｍＭを基質濃度最大値として設定した。

【0089】

《酵素の活性測定》
精製の各過程の酵素液を用い、表８に示す組成で活性測定を行った。反応停止は反応液の０．５倍容量のアセトニトリルを添加することにより行った。ＳｅｓＡタンパク質の活性１単位を、１分間に１μｍｏｌの代謝産物を増加させる酵素量と定義した。セサミンの代謝産物の増加量はＨＰＬＣで測定した。表９に、精製の各段階での酵素活性を示す。

【0090】

【表8】

【0091】

【表9】

【0092】

図３は、各精製段階におけるタンパク質試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果を示す写真である。図３中、「Ｍ」は分子量マーカーを示し、「ＣＦＥ」は無細胞抽出液を示し、「ＡＳ」は硫酸アンモニウム沈殿分画を示し、「ＢＴ」はＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社）により精製した試料を示し、「ＯＲ」はＭｉｍｅｔｉｃ Ｏｒａｎｇｅ １ Ａ６ＸＬカラム（プロメティックバイオサイエンシス社）により精製した試料を示す。

【0093】

［実験例５］
（ＳｅｓＡ遺伝子の塩基配列の決定）
Ｎｏ．２２株の染色体ＤＮＡを抽出し、ゲノムの塩基配列を決定した。また、ＳｅｓＡタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、ＳｅｓＡタンパク質のバンドを切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。その結果、ＳｅｓＡタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は「ＴＡＥＱＡＩＮ」（配列番号３）であることが明らかとなった。

【0094】

決定されたＳｅｓＡタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を基に、Ｎｏ．２２株のゲノムの塩基配列を検索した結果、ＳｅｓＡタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができた。配列番号１にＳｅｓＡ遺伝子の塩基配列を示し、配列番号２にＳｅｓＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。

【0095】

［実験例６］
（ＳｅｓＡタンパク質の分子量測定）
ゲル濾過カラムを用いて、実験例４で精製したＳｅｓＡの分子量を測定した。その結果、ＳｅｓＡタンパク質の分子量は１４７８３５．７９５と計算された。ＳｅｓＡタンパク質モノマーの分子量は５０３８５．５１であることから、ＳｅｓＡタンパク質は３量体を形成していると考えられた。

【0096】

［実験例７］
（ＳｅｓＡ遺伝子のクローニング及び組換えタンパク質の精製）
Ｎｏ．２２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４に示すＳｅｓＡ−Ｆｗプライマー及び配列番号５に示すＳｅｓＡ−Ｒｖプライマーを用いてＳｅｓＡ遺伝子を増幅し、増幅断片を精製した。続いて、発現ベクターであるｐＥＴ２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に、増幅したＳｅｓＡ遺伝子断片をクローニングし、ＳｅｓＡタンパク質の発現プラスミドを得た。

【0097】

続いて、ＳｅｓＡタンパク質の発現プラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ社）を形質転換した。続いて、形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）株を大量培養し、硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィーにより精製し、ＳｅｓＡタンパク質を単一バンドになるまで精製した。

【0098】

表１０に、精製の各段階での酵素活性を示す。その結果、Ｎｏ．２２株から精製したＳｅｓＡタンパク質と、ＢＬ２１（ＤＥ３）株から精製したＳｅｓＡタンパク質の比活性はほぼ同一であることが確認された。

【0099】

【表10】

【0100】

また、精製したＳｅｓＡタンパク質との反応により、セサミンからセサミンモノカテコール及びセサミンジカテコールの２つの代謝産物が生成された。この結果から、ＳｅｓＡタンパク質は下記反応スキーム１に示す２段階の反応を触媒する酵素であることが明らかとなった。

【0101】

【化11】

【0102】

［実験例８］
（酵素の特性解析）
実験例７で精製したＳｅｓＡタンパク質を用いて、酵素の諸性質の解析を行った。
《温度依存性の検討》
表１１に示す組成で反応液を調製した。続いて、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃及び７０℃で１０分間反応させた。ＳｅｓＡタンパク質の添加により反応を開始し、反応直前にテトラヒドロ葉酸を添加した。また、反応液の０．５倍容量のアセトニトリルを添加することにより反応を停止した。セサミンの代謝産物の増加量はＨＰＬＣで測定した。

【0103】

【表11】

【0104】

図４（ａ）は温度依存性を検討した結果を示すグラフである。その結果、ＳｅｓＡタンパク質は４０℃で最も高い活性を示し、６０℃以上で失活することが明らかとなった。

【0105】

《温度安定性の検討》
まず、ＳｅｓＡタンパク質を１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃及び７０℃で１５分間インキュベートした。続いて、温度依存性の検討におけるのと同様にしてＳｅｓＡタンパク質の活性を測定した。

【0106】

図４（ｂ）は温度安定性を検討した結果を示すグラフである。その結果、ＳｅｓＡタンパク質は３０℃まで活性を保持し、５０℃以上で完全に失活することが明らかとなった。

【0107】

《ｐＨ依存性の検討》
表１２に示す組成で反応液を調製した。ｐＨは、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファーを用いて、ｐＨ２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２に調整した。反応は２８℃で１０分間行った。ＳｅｓＡタンパク質の添加により反応を開始し、反応直前にテトラヒドロ葉酸を添加した。また、反応液の０．５倍容量のアセトニトリルを添加することにより反応を停止した。セサミンの代謝産物の増加量はＨＰＬＣで測定した。

【0108】

【表12】

【0109】

図４（ｃ）はｐＨ依存性を検討した結果を示すグラフである。その結果、ＳｅｓＡタンパク質はｐＨ４．５〜１０で活性を示し、ｐＨ７．５〜８．５で最も高い活性を示すことが明らかとなった。

【0110】

《ｐＨ安定性の検討》
まず、ＳｅｓＡタンパク質（０．７３ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２の０．２Ｍ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファーで１０倍希釈し、氷上で１５分間インキュベートした。続いて、温度依存性の検討におけるのと同様の組成の反応液でＳｅｓＡタンパク質の活性を測定した。反応は２８℃で１０分間行った。

【0111】

図４（ｄ）はｐＨ安定性を検討した結果を示すグラフである。その結果、ＳｅｓＡタンパク質はｐＨ５．５〜１０．５において安定であり、高い活性を保持することが明らかとなった。

【0112】

《Ｋ_ｍ、ｋ_ｃａｔの測定》
セサミン濃度を０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０１ｍＭとした反応液を調製し、Ｋ_ｍ及びｋ_ｃａｔの測定を行った。また、各セサミン濃度の反応液について、２８℃で、１、３、５、７、１０分間反応を行った。反応はＳｅｓＡタンパク質の添加で開始し、反応液の０．５倍容量のアセトニトリルの添加で停止した。各セサミン濃度、各反応時間ごとに２連でサンプルを作製し、セサミンの代謝産物の増加量をＨＰＬＣで測定した。

【0113】

活性測定の結果に基づいて、各基質濃度［Ｓ］におけるセサミンモノカテコールの生成量から傾きＶを算出した。表１３に、各基質濃度［Ｓ］における傾きＶを示す。

【0114】

【表13】

【0115】

また、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式を用いてＫ_ｍを算出するため、各基質濃度［Ｓ］におけるＶ_ｍａｘ（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）を求めた。まず、反応液中に７．３１×１０^−５ｍｇのＳｅｓＡタンパク質が含まれていたことから、Ｖを７．３１×１０^−５で割った。計算された値を表１４に示す。

【0116】

【表14】

【0117】

図５は、表１４に基づいて作成したグラフである。表１４の値に基づいて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式を用いて直接非線形最小二乗法でパラメータを求めた。その結果、Ｋ_ｍ＝０．０３２ｍＭ、Ｖ_ｍａｘ＝９．３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであることが明らかとなった。続いて、ｋ_ｃａｔを計算した。ｋ_ｃａｔは酵素１分子が１秒間に触媒する基質の個数である。その結果、ＳｅｓＡタンパク質１ｍｇが１９．８ｎｍｏｌであることから、９．３２（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）×１０００／１９．８＝４７０．７１／ｍｉｎ＝７．８５／ｓｅｃと計算された。このｋ_ｃａｔの値は、非特許文献１に記載されたヒトシトクロムＰ４５０のｋ_ｃａｔと比較して約２２０倍高かった。表１５にＳｅｓＡタンパク質の反応速度論的パラメータをまとめた。

【0118】

【表15】

【0119】

［実験例９］
（補酵素の検討）
ＳｅｓＡタンパク質の補酵素であるテトラヒドロ葉酸の代わりに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、補酵素Ａ（ＣｏＡ）、ビタミンＢ６、チアミン−ＨＣｌ、イノシトール、Ｄ−パントテン酸カルシウム、ＭｇＣｌ_２、Ｆｅ_２（ＳＯ_４）_３、ＦｅＳＯ_４又はＦｅＣｌ_２を添加してＳｅｓＡタンパク質とセサミンとを反応させた。続いて、セサミンの代謝産物の増加量をＨＰＬＣで測定した。

【0120】

その結果、いずれの補酵素又は金属を添加した試料においてもＳｅｓＡタンパク質の活性は観察されなかった。この結果は、ＳｅｓＡタンパク質の酵素活性にはテトラヒドロ葉酸が必要であることを示す。

【0121】

［実験例１０］
（基質特異性の検討）
セサミンの立体異性体や類似体を基質とし、ＳｅｓＡタンパク質がそれらの基質に対して活性を有するか否かについて検討した。各基質の溶媒にはＤＭＳＯを利用し、表１６に示す組成で反応液を調製した。ＳｅｓＡタンパク質の添加により反応を開始し、反応直前にテトラヒドロ葉酸を添加した。また、反応液の０．５倍容量のアセトニトリルを添加することにより反応を停止した。酵素活性はＨＰＬＣで測定した。

【0122】

【表16】

【0123】

その結果、ＳｅｓＡタンパク質は、上記式（２）で表されるセサミノール、上記式（３）で表される（＋）−セサモリン、上記式（４）で表される（−）−アサリニン、上記式（５）で表される（＋）−エピセサミン、上記式（６）で表されるピぺリンに対する活性を有することが確認された。

【0124】

表１７に、セサミンを基質とした場合のＳｅｓＡタンパク質の酵素活性を１００％とした場合の各基質に対する酵素活性を示す。

【0125】

【表17】

【産業上の利用可能性】

【0126】

本発明によれば、セサミンを代謝する新たな酵素及びその遺伝子を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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