特開 2017-193713 メロシアニン系化合物、これを含む生体分子標識用染料、キット及び造影剤組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-193713(P2017-193713A)

(43)【公開日】2017年10月26日

(54)【発明の名称】メロシアニン系化合物、これを含む生体分子標識用染料、キット及び造影剤組成物

(51)【国際特許分類】

   C09B 23/00 20060101AFI20170929BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20170929BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20170929BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20170929BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20170929BHJP

   A61K 49/10 20060101ALI20170929BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170929BHJP

【ＦＩ】

   C09B23/00 LCSP

   C09B23/00 M

   C12Q1/68 A

   G01N21/78 C

   G01N33/48 P

   G01N33/50 P

   A61K49/10

   C12N15/00 A

【審査請求】有

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】71

(21)【出願番号】特願2017-83726(P2017-83726)

(22)【出願日】2017年4月20日

(31)【優先権主張番号】10-2016-0048233

(32)【優先日】2016年4月20日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2016-0181338

(32)【優先日】2016年12月28日

(33)【優先権主張国】KR

(71)【出願人】

【識別番号】507074834

【氏名又は名称】エスエフシー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002321

【氏名又は名称】特許業務法人永井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム，スジン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ドミン

(72)【発明者】

【氏名】ジェ，ジョンテ

【テーマコード（参考）】

2G045

2G054

4B063

4C085

【Ｆターム（参考）】

2G045AA24

2G045BB20

2G045BB25

2G045CB01

2G045DA13

2G045FB12

2G054AA02

2G054AB01

2G054AB10

2G054BA02

2G054BB08

2G054BB13

2G054CA22

2G054CE02

2G054CE08

2G054EA03

2G054EB01

2G054GA03

2G054GB01

2G054GB02

2G054GB04

2G054GE05

4B063QA01

4B063QQ01

4B063QQ20

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR66

4B063QR71

4B063QS24

4B063QS32

4B063QS36

4B063QX02

4C085HH01

4C085HH11

4C085JJ01

4C085KA27

4C085KB56

4C085LL18

(57)【要約】      （修正有）

【課題】生体分子にインターカレーティングされることで生体分子を標識でき、遺伝毒性のない新規なメロシアニン系化合物、これを含む生体分子標識用染料、キット及び造影剤組成物の提供。
【解決手段】下式で示されるメロシアニン系化合物。

［Ａｒは芳香族環；Ｙ₁及びＹ₂は夫々独立にＯ、Ｓ等；Ｒ₁〜Ｒ₇はＨ、−Ｌ−Ｚ基等；Ｌはリンカー；Ｚは蛍光団又は上式の構造］
【選択図】図１２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の化学式１で表わされる構造を有するメロシアニン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）系化合物：
［化学式１］

ここで、
Ａｒは置換または非置換された芳香族環であり、
Ｙ₁及びＹ₂はそれぞれ独立に、硫黄、酸素、セレニウム、ＮＲ₈及び−ＣＲ₈=ＣＲ₉−から選択され、
Ｒ₁ないしＲ₉はそれぞれ独立に、水素、重水素、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルケニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルキニル、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カルバミン酸塩、スルフィドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ホスホン酸エステル、ケトン（−ＣＯＲ₁₀）、アルデヒド、エステル（−ＣＯＯＲ₁₀）、塩化アシル、スルホン酸、スルホン酸塩、ポリアルキレンオキシド、及び−Ｌ−Ｚ作用基から選択され、
Ｒ_a（ここで、ａは１ないし９から選択される整数）がケトン基（−ＣＯＲ₁₀）またはエステル基（−ＣＯＯＲ₁₀）であるとき、Ｒ₁₀は置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルケニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルキニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルコキシ、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀ハロアルキル及び置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アミノアルキルから選択され、
Ｒ_b（ここで、ｂは１ないし１０から選択される整数）が置換された場合、上記作用基内の任意の炭素または末端炭素は、スルホン酸、スルホン酸塩、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸塩、リン酸、リン酸塩、塩化アシル、ポリアルキレンオキシド、４次アンモニウム塩、エステル、及びアミドから選択される少なくとも一つに置換されてもよく、
ｍは１ないし３の整数であり、
Ｌは３ないし１５０個の非水素原子を含むリンカーであり、
Ｚは蛍光信号を発生させることができる蛍光団であるか、又は化学式１で表わされる構造を有し、
化学式１で表わされる構造は、一つまたは二つの−Ｌ−Ｚ作用基を有する。

【請求項2】

Ｚは、フェナントリジウム（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｕｍ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎｓ）、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ）、ピレン（ｐｙｒｅｎｅｓ）、カルボピロニン（ｃａｒｂｏｐｙｒｏｎｉｎ）、オキサジン（ｏｘａｚｉｎｅ）、キサンテン（ｘａｎｔｈｅｎｅｓ）、チオキサンテン（ｔｈｉｏｘａｎｔｈｅｎｅ）、及びアクリジン（ａｃｒｉｄｉｎｅ）から選択される、請求項１に記載のメロシアニン系化合物。

【請求項3】

−Ｌ−Ｚ作用基は、下記の化学式２で表わされる請求項１に記載のメロシアニン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）系化合物：
［化学式２］
-L₁-[A¹-(CH₂)_x1-]_y1[A²-(CH₂)_x2-]_y2[A³-(CH₂)_x3-]_y3[A⁴-(CH₂)_x4-]_y4[A⁵-(CH₂)_x5-]_y5[A⁶-(CH₂)_x6-]_y6[A⁷-(CH₂)_x7-]_y7[A⁸-(CH₂)_x8-]_y8[A⁹-(CH₂)_x9-]_y9-A¹⁰-L₂-Z
ここで、
Ｌ₁及びＬ₂はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むＣ₁−Ｃ₁₂ポリメチレン単位であるか、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールであり、
Ａ¹ないしＡ¹⁰はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む鎖型アルキルまたは分岐型アルキルであるか、又は窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む５原子環または６原子環であり、
x１ないしx９はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数であり、
ｙ１ないしｙ９はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数であり、
Ｚは、フェナントリジウム（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｕｍ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎｓ）、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ）、ピレン（ｐｙｒｅｎｅｓ）、カルボピロニン（ｃａｒｂｏｐｙｒｏｎｉｎ）、オキサジン（ｏｘａｚｉｎｅ）、キサンテン（ｘａｎｔｈｅｎｅｓ）、チオキサンテン（ｔｈｉｏｘａｎｔｈｅｎｅ）、及びアクリジン（ａｃｒｉｄｉｎｅ）から選択される。

【請求項4】

Ａ¹ないしＡ¹⁰のいずれか一つは、下記の化学式３で表わされる請求項３に記載のメロシアニン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）系化合物：
［化学式３］

ここで、
Ｒ₁₁は炭素、窒素、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールであり、
Ｒ₁₂は下記の化学式４で表され、
［化学式４］
-[A¹¹-(CH₂)_x11-]_y11[A¹²-(CH₂)_x12-]_y12[A¹³-(CH₂)_x13-]_y13-A¹⁴-L₃-Z
ここで、
Ｌ₃は窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むＣ₁−Ｃ₁₂ポリメチレン単位であるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールであり、
Ａ¹¹ないしＡ¹⁴はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む鎖型アルキルまたは分岐型アルキルであるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む５原子環または６原子環であり、
x１１ないしx１３はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数であり、
ｙ１１ないしｙ１３はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数である。

【請求項5】

請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物を含む生体分子標識用染料。

【請求項6】

上記メロシアニン系化合物は、生体分子である核酸内でインターカレーションされる、請求項５に記載の生体分子標識用染料。

【請求項7】

上記生体分子は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡから選択される少なくとも一つの核酸である、請求項６に記載の生体分子標識用染料。

【請求項8】

請求項５による生体分子標識用染料；または請求項５による生体分子標識用染料及び緩衝液を含む生体分子標識用キット。

【請求項9】

請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物；
緩衝液、ゲルマトリックス、ゲルマトリックスを形成するための少なくても一つの物質、表面、または表面を形成するための少なくても一つの物質；及び
使用説明書；を含み、
核酸がサンプル内に存在する場合、上記マトリックスまたは上記表面に固定されるサンプル内の核酸の存在または不在を決定するための電気泳動キット。

【請求項10】

核酸がサンプル内に存在する場合、
請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物に核酸を露出させ、上記メロシアニン系化合物が核酸内でインターカレーションされて複合体を形成する段階；及び
上記メロシアニン系化合物の蛍光、またはその不在を決定する段階；を含む、サンプル内の核酸の存在または不在を決定する方法。

【請求項11】

核酸増幅反応を行う方法であって、
標的核酸、上記標的核酸を増幅させるために必要な試薬、及び請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物を含む反応混合物を提供する段階；
上記反応混合物を増幅された標的核酸の形成に好適な条件下で重合反応させる段階；
上記反応混合物を光で照明する段階；及び
上記反応混合物から蛍光放出を検出する段階；を含む、増幅された標的核酸の存在または不在を決定する方法。

【請求項12】

請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物を含む混合物と核酸を含むサンプルを混合する段階；
上記メロシアニン系化合物が上記サンプル内の核酸とインターカレーションされて複合体を形成し、蛍光信号を発生させるように上記サンプルと上記混合物を十分な時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）する段階；及び
感知される蛍光信号と決められた核酸量の蛍光標準特性を比べてサンプル内の核酸を定量する段階；を含む、サンプル内の核酸を定量する方法。

【請求項13】

請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物を含む混合物と、死滅細胞を含むサンプルを混合する段階；
上記メロシアニン系化合物が上記サンプル内の死滅細胞とインターカレーションされて複合体を形成し、蛍光信号を発生させるように上記サンプルと上記混合物を十分な時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）する段階；及び
感知される蛍光信号と決められた死滅細胞量の蛍光標準特性を比べてサンプル内の死滅細胞を定量する段階；を含む、サンプル内の細胞の生存度を定量する方法。

【請求項14】

死滅細胞にインターカレーションする請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物、及び細胞にインターカレーションすることができる上記メロシアニン系化合物以外の化合物を含む水溶液と細胞を含むサンプルを混合する段階；
上記メロシアニン系化合物、及びそれ以外の上記化合物がインターカレーションされた細胞を含むサンプルを光で照明する段階；及び
上記サンプルから蛍光放出を検出する段階；を含み、
上記サンプルから放出された上記蛍光は、上記メロシアニン系化合物及びそれ以外の上記化合物がともにサンプル内の細胞にインターカレーションされて細胞間に蛍光反応で発生し、
放出された上記蛍光は上記メロシアニン系化合物だけの蛍光反応で発生した蛍光とは違う、サンプル内の細胞の生存度を分析する方法。

【請求項15】

請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物；及び
使用説明書を含み、
死滅細胞がサンプル内に存在する場合、上記メロシアニン系化合物がインターカレーションされて蛍光が検出される、サンプル内の細胞生存度を分析するキット。

【請求項16】

請求項１ないし４のいずれか一項によるメロシアニン系化合物を含む造影剤組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体分子にインターカレーティングされることにより、生体分子を標識することができる、新規なメロシアニン系化合物、これを含む生体分子標識用染料、キット及び造影剤組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

蛍光性染料は、ＤＮＡ及びＲＮＡを始め、核酸及び核酸を伴う多様な生物学的サンプルの検出に使用されてきた。これによって、核酸に特異的に結合またはインターカレーションされ、優れた蛍光性を表す複合体を形成する蛍光性核酸染料に対する研究が活発に行われてきた。

【0003】

核酸に特異的に結合またはインターカレーションされる染料は、純水溶液、細胞抽出物、電気泳動ゲル、マイクロアレイチップ、生細胞または固定細胞、死滅細胞及び環境サンプルなどに使われることができ、各種サンプル内のＤＮＡ及びＲＮＡの存在及び量を検出するために使われてもよい。特に、このような蛍光染料は、ゲノム研究及び医療診断に使われる代表的な方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じる核酸の検出に使われてもよい。

【0004】

このとき、一般的なｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ＰＣＲの場合、サンプル核酸の量に比例した定量的ＰＣＲが不可能であるため、増幅サイクルごとにリアルタイムで変化する蛍光値を測定し、核酸の量に対する定量的分析が可能なリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲまたはｑＰＣＲ）が主に使われている。

【0005】

このようなｑＰＣＲはＰＣＲの結果物から蛍光信号を測定して定量的分析をすることになるが、蛍光信号を測定するための方式としては、蛍光プローブ（ｐｒｏｂｅ）を利用した検出法と、インターカレーティング蛍光染料を利用した検出法などが主に知られている。

【0006】

蛍光プローブを利用した検出法は、蛍光性染料とクェンチャー染料の複合体で標識化されたプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）を使う。蛍光性染料とクェンチャー染料の複合体で標識化されたオリゴヌクレオチドが標的配列と混成化される場合、蛍光染料が複合体から切断して分離されることにより、蛍光信号を発生させる。

【0007】

上述した蛍光プローブを利用した検出法は、標的配列に対する選択性と特異性が高いという利点があるが、設計が複雑で、多量に使うには高価という短所がある。

【0008】

インターカレーティング蛍光染料を利用した検出法は、蛍光性核酸染料（ｄｙｅ）または着色剤（ｓｔａｉｎ）と称されるＤＮＡ結合蛍光性染料に基づく。蛍光性核酸染料は、割と簡単な分子で構成されるので、設計及び製造が容易であり、相対的に安いという利点がある。

【0009】

しかし、qＰＣＲに使われるためには、幾つかの基準を満たさなければならないので、一般的に知られている蛍光性核酸染料の全てがｑＰＣＲに使われることはない。

【0010】

例えば、qＰＣＲに使われる蛍光性核酸染料は、貯蔵及びＰＣＲの中で十分な安定性を持たなければならないし、ＰＣＲに使われる緩衝液のｐＨ範囲に対する耐性を持たなければならない。

【0011】

また、蛍光性核酸染料は、核酸が存在しない場合、蛍光信号を発生させなかったり、とても微弱な蛍光信号のみを発生しなければならないので、核酸が存在する場合、相対的に強い蛍光信号を発生させなければならない。

【0012】

従来核酸の標識に最も多く使われる染料としては、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）がある。
[エチジウムブロマイド]

【0013】

エチジウムブロマイドは、例えば、電気泳動が完了したゲルを染色するために使用（事後染色）されるし、電気泳動前のゲルの製造時に予め添加して電気泳動とともに染色されるように使用（事前染色）される。また、エチジウムブロマイドは４００nm以下のＵＶ光を発生させ、ＤＮＡと結合するとき、約６２０nmの発光スペクトルを有するので、ＤＮＡの存在及び位置を視覚的に容易に確認できるという利点がある。

【0014】

上述したエチジウムブロマイドの利点にもかかわらず、エチジウムブロマイドは突然変異誘発物質（ｍｕｔａｇｅｎ）及び発がん物質（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ）に該当するので、使用する際に相当注意を要するという短所がある。特に、エチジウムブロマイドはＤＮＡとＲＮＡの合成を妨害し、ＤＮＡ複製を阻害することによって突然変異を誘発することがあるという研究結果も報告された事がある。

【0015】

これにより、非遺伝毒性を示す代替蛍光染料としてＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ Ｉが主に使われた。ただし、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩはＰＣＲ工程を抑制するので、単にＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉの濃度を増加させても、より高い最大蛍光信号を得られないという限界がある。

【0016】

すなわち、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉの濃度がＰＣＲ工程を有意的に抑制し始める基準濃度に逹するまでは、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉの濃度に比例して蛍光信号の強度が増加するが、以後はＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉの濃度の追加的増加によってＤＮＡの増幅が減少する。これによって、観察される蛍光信号の強度が減少したり、所定の強度以上の蛍光信号を観察するための閾値サイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）が増加するようになる。

【0017】

また、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉは、特定の化学的環境下で不安定であるため、緩衝液内で数日内に相当な量が分解することが知られている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

上述した技術的背景下で、本発明はインターカレーティング蛍光染料を利用したｑＰＣＲに使うことに好適なインターカレーティング蛍光染料としてメロシアニン系化合物を提供することを目的とする。

【0019】

また、本発明はエチジウムブロマイドと違い、非遺伝毒性のメロシアニン系化合物を提供することを目的とする。

【0020】

また、本発明は閾値サイクル数を増加せずに、核酸濃度に比例して蛍光信号の強度を増加させることができるメロシアニン系化合物を提供することを目的とする。

【0021】

また、本発明は上述したメロシアニン系化合物を含む染料、キット及び造影剤組成物を提供することを目的とする。

【0022】

同時に、本発明は上述したメロシアニン系化合物を利用した核酸の存否、または細胞生存度の決定及び定量方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0023】

上述した技術的課題を解決するための本発明の一側面によれば、下記の化学式１で表わされる構造を有するメロシアニン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）系化合物が提供されてもよい。
［化学式１］

【0024】

ここで、
Ａｒは置換または非置換された芳香族環であり、
Ｙ₁及びＹ₂はそれぞれ独立に、硫黄、酸素、セレニウム、ＮＲ₈及び−ＣＲ₈=ＣＲ₉−から選択され、
Ｒ₁ないしＲ₉はそれぞれ独立に、水素、重水素、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルケニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルキニル、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カルバミン酸塩、スルフィドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ホスホン酸エステル、ケトン（−ＣＯＲ₁₀）、アルデヒド、エステル（−ＣＯＯＲ₁₀）、塩化アシル、スルホン酸、スルホン酸塩、ポリアルキレンオキシド及び−Ｌ−Ｚ作用基から選択され、

【0025】

Ｒ_a（ここで、ａは１ないし９から選択される整数）がケトン基（−ＣＯＲ₁₀）またはエステル基（−ＣＯＯＲ₁₀）であるとき、Ｒ₁₀は置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルケニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルキニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルコキシ、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀ハロアルキル、及び置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アミノアルキルから選択され、

【0026】

Ｒ_b（ここで、ｂは１ないし１０から選択される整数）が置換された場合、上記作用基内の任意の炭素または末端炭素は、スルホン酸、スルホン酸塩、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸塩、リン酸、リン酸塩、塩化アシル、ポリアルキレンオキシド、４次アンモニウム塩、エステル、及びアミドから選択される少なくとも一つに置換されてもよく、
ｍは１ないし３の整数であり、
Ｌは３ないし１５０個の非水素原子を含むリンカーであり、
Ｚは蛍光信号を発生させることができる蛍光団、または化学式１で表わされる構造を有し、
化学式１で表わされる構造は、一つまたは二つの−Ｌ−Ｚ作用基を有する。

【0027】

ここで、蛍光信号を発生させることができる蛍光団として、Ｚは、フェナントリジウム（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｕｍ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎｓ）、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ）、ピレン（ｐｙｒｅｎｅｓ）、カルボピロニン（ｃａｒｂｏｐｙｒｏｎｉｎ）、オキサジン（ｏｘａｚｉｎｅ）、キサンテン（ｘａｎｔｈｅｎｅｓ）、チオキサンテン（ｔｈｉｏｘａｎｔｈｅｎｅ）及びアクリジン（ａｃｒｉｄｉｎｅ）から選択されてもよい。

【0028】

本発明の一実施形態によれば、−Ｌ−Ｚ作用基は、下記の化学式２で表わされてもよい。
［化学式２］
-L₁-[A¹-(CH₂)_x1-]_y1[A²-(CH₂)_x2-]_y2[A³-(CH₂)_x3-]_y3[A⁴-(CH₂)_x4-]_y4[A⁵-(CH₂)_x5-]_y5[A⁶-(CH₂)_x6-]_y6[A⁷-(CH₂)_x7-]_y7[A⁸-(CH₂)_x8-]_y8[A⁹-(CH₂)_x9-]_y9-A¹⁰-L₂-Z

【0029】

ここで、Ｌ₁及びＬ₂はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むＣ₁−Ｃ₁₂ポリメチレン単位であるか、又は窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールであり、Ａ¹ないしＡ¹⁰はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む鎖型アルキルまたは分岐型アルキルであるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む５原子環または６原子環であり、x１ないしx９はそれぞれ独立に、 ０または１ないし２０の整数であり、ｙ１ないしｙ９はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数である。

【0030】

また、Ｚはフェナントリジウム、クマリン、シアニン、ボディピー、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、キサンテン、チオキサンテン及びアクリジンから選択されたり、それ以外の蛍光団構造を有してもよい。

【0031】

他の変形例によれば、Ａ¹ないしＡ¹⁰のいずれか一つは下記の化学式３で表わされてもよい。
［化学式３］

【0032】

ここで、Ｒ₁₁は炭素、窒素、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールであり、Ｒ₁₂は下記の化学式４で表わされる。
［化学式４］
-[A¹¹-(CH₂)_x11-]_y11[A¹²-(CH₂)_x12-]_y12[A¹³-(CH₂)_x13-]_y13-A¹⁴-L₃-Z

【0033】

ここで、Ｌ₃は窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むＣ₁−Ｃ₁₂ポリメチレン単位であるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールであり、Ａ¹¹ないしＡ¹⁴はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む鎖型アルキルまたは分岐型アルキルであるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む５原子環または６原子環であり、x１１ないしx１３はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数であり、ｙ１１ないしｙ１３はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数である。

【0034】

また、本発明の他の側面によれば、メロシアニン系化合物を含む生体分子標識用染料が提供されてもよい。

【0035】

また、本発明の他の側面によれば、メロシアニン系化合物を含む生体分子標識用キットが提供されてもよい。

【0036】

また、本発明の他の側面によれば、メロシアニン系化合物を含む造影剤組成物が提供されてもよい。

【0037】

また、本発明の他の側面によれば、サンプル内の核酸の存在または不在を決定するための電気泳動キットが提供されてもよい。

【0038】

また、本発明の他の側面によれば、サンプル内の核酸の存否を決定する方法または定量する方法が提供されてもよい。

【0039】

また、本発明の他の側面によれば、サンプル内の細胞生存度を分析または定量する方法が提供されてもよい。

【発明の効果】

【0040】

本発明による新規なメロシアニン系化合物は、生体分子にインターカレーティングされることで可視光線領域で蛍光信号を表すことができ、非遺伝毒性を示すので、これに基づいて本発明によるメロシアニン系化合物は、生体分子標識用染料、生体分子標識用キット及び造影剤組成物などで有用に使われてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】商用化された染料ＳＹＢＲ（登録商標）ｓａｆｅの電気泳動結果を示したもの。

【図2】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図3】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図4】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図5】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図6】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図7】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図8】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図9】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図10】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の電気泳動結果を示したもの。

【図11】商用化された染料であるＳＹＢＲ ｓａｆｅの吸収及び放出スペクトルの結果を示したもの。

【図12】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の吸収及び放出スペクトルの結果を示したもの。

【図13】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の吸収及び放出スペクトルの結果を示したもの。

【図14】商用化された染料であるＳＹＢＲ ｓａｆｅの細胞透過性実験結果を示した写真。

【図15】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の細胞透過性実験結果を示した写真。

【図16】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の細胞透過性実験結果を示した写真。

【図17】本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物の細胞透過性実験結果を示した写真。

【図18】商用化された細胞サイクル分析染料であるヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を利用した細胞サイクル分析結果を示したグラフ。

【図19】化合物６を利用した細胞サイクル分析結果を示したグラフ。

【図20】蛍光染料として化合物３８を使用したｑＰＣＲの溶融曲線（ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅ）を示したグラフ。

【図21】蛍光染料としてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを使用したｑＰＣＲの溶融曲線を示したグラフ。

【図22】蛍光染料としてＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）を使用したｑＰＣＲの溶融曲線を示したグラフ。

【図23】化合物３８の光退色実験結果を示したグラフ。

【図24】化合物３８の光退色実験結果を示したグラフ。

【図25】化合物３８の光退色実験結果を示したグラフ。

【図26】ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）の光退色実験結果を示したグラフ。

【図27】ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）の光退色実験結果を示したグラフ。

【図28】ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）の光退色実験結果を示したグラフ。

【図29】ＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品）の光退色実験結果を示したグラフ。

【図30】ＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品）の光退色実験結果を示したグラフ。

【図31】ＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品）の光退色実験結果を示したグラフ。

【図32】蛍光染料としてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ及び化合物３８を使用したｑＰＣＲの増幅曲線及びｑＰＣＲの溶融曲線を示したグラフ。

【図33】蛍光染料としてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ及び化合物３８を使用したｑＰＣＲの増幅曲線及びｑＰＣＲの溶融曲線を示したグラフ。

【図34】蛍光染料として化合物３８を使用した蛍光染料濃度によるｑＰＣＲの増幅曲線を示したグラフ。

【図35】蛍光染料としてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを使用した蛍光染料濃度によるｑＰＣＲの増幅曲線を示したグラフ。

【図36】蛍光染料としてＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用した蛍光染料濃度によるｑＰＣＲの増幅曲線を示したグラフ。

【図37】蛍光染料として化合物３６、化合物３８、化合物３９及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの増幅曲線及び溶融曲線を示したグラフ。

【図38】蛍光染料として化合物３６、化合物３８、化合物３９及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの増幅曲線及び溶融曲線を示したグラフ。

【図39】蛍光染料として化合物３６、化合物３８、化合物３９及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの増幅曲線及び溶融曲線を示したグラフ。

【図40】蛍光染料として化合物３６、化合物３８、化合物３９及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの増幅曲線及び溶融曲線を示したグラフ。

【図41】蛍光染料として化合物３６、化合物３８、化合物３９及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの増幅曲線及び溶融曲線を示したグラフ。

【図42】蛍光染料として化合物３６、化合物３８、化合物３９及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの増幅曲線及び溶融曲線を示したグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本発明をより容易に理解するために、便宜上、特定用語を本願で定義する。本願で別に定義しない限り、本発明に使われる科学用語及び技術用語は、当該技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を持つ。

【0043】

また、文脈上特に指定しない限り、単数形用語はその複数形も含むものであり、複数形用語はその単数形も含んでもよい。

【0044】

＜新規なメロシアニン系化合物＞
本発明の一側面によれば、下記の化学式１で表わされる構造を有するメロシアニン系化合物が提供されてもよい。
［化学式１］

【0045】

ここで、Ａｒは置換または非置換された芳香族環で、例えば、ベンゾ（ｂｅｎｚｏ）またはナフト（ｎａｐｈｔｏ）基であり、Ｙ₁及びＹ₂はそれぞれ独立に、硫黄、酸素、セレニウム、ＮＲ₈及び−ＣＲ₈=ＣＲ₉−から選択されることができ、ｍは１ないし３の整数である。

【0046】

Ｒ₁ないしＲ₉はそれぞれ独立に、水素、重水素、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルケニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルキニル、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カルバミン酸塩、スルフィドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、４次アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ホスホン酸エステル、ケトン（−ＣＯＲ₁₀）、アルデヒド、エステル（−ＣＯＯＲ₁₀）、塩化アシル、スルホン酸、スルホン酸塩、ポリアルキレンオキシド及び−Ｌ−Ｚ作用基から選択されてもよい。

【0047】

Ｒ_a（ここで、ａは１ないし９から選択される整数）がアルケニルまたはアルキニルであるとき、アルケニルのｓｐ²−混成炭素またはアルキニルのｓｐ−混成炭素が直接的に結合されたり、アルケニルのｓｐ²−混成炭素またはアルキニルのｓｐ−混成炭素に結合されたアルキルのｓｐ³−混成炭素によって間接的に結合された形態であってもよい。

【0048】

本願でＣ_a−Ｃ_b作用基は、ａないしｂ個の炭素原子を持つ作用基を意味する。例えば、Ｃ_a−Ｃ_bアルキルは、ａないしｂ個の炭素原子を有する、直鎖アルキル及び分枝鎖アルキルなどを含む飽和脂肪族基を意味する。直鎖または分枝鎖アルキルは、これの主鎖に１０個以下（例えば、Ｃ₁−Ｃ₁₀の直鎖、Ｃ₃−Ｃ₁₀の分枝鎖）、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下の炭素原子を有する。

【0049】

具体的に、アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、i−プロピル、ｎ−ブチル、s−ブチル、i−ブチル、t−ブチル、ペント−１−イル、ペント−２−イル、ペント−３−イル、３−メチルブト−１−イル、３−メチルブト−２−イル、２−メチルブト−２−イル、２,２,２−トリメチルエト−１−イル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル及びｎ−オクチルであってもよい。

【0050】

また、本願でアルコキシは、−Ｏ−（アルキル）基と−Ｏ−（非置換されたシクロアルキル）基の両方を意味するもので、一つ以上のエーテル基、及び１ないし１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素である。

【0051】

具体的に、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１,２−ジメチルブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなどを含むが、これに限定されない。

【0052】

また、本願でハロゲンは、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）またはヨード（−Ｉ）を意味し、ハロアルキルは上述したハロゲンに置換されたアルキルを意味する。例えば、ハロメチルはメチルの水素のうち、少なくとも一つがハロゲンに取り替えられたメチル（−ＣＨ₂Ｘ、−ＣＨＸ₂または−ＣＸ₃）を意味する。

【0053】

本願でアラルキルは、アリールがアルキルの炭素に置換された形態の作用基として、−（ＣＨ₂）_nＡｒの総称である。アラルキルの例として、ベンジル（−ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）またはフェネチル（−ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅）などがある。

【0054】

本願において、アリールが別に定義されない限り、単一環、または互いに接合、または共有結合で連結された多重環（好ましくは、１ないし４個の環）を含む不飽和芳香族性環を意味する。アリールの非制限的な例としては、フェニル、ビフェニル、o− ターフェニル（ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）、ｍ−ターフェニル、p−ターフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル（ａｎｔｈｒｙｌ）、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントレニル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｙｌ）、２−フェナントレニル、３−フェナントレニル、４−フェナントレニル、９−フェナントレニル、１−ピレニル、２−ピレニル、及び４−ピレニルなどがある。

【0055】

本願でヘテロアリールは、上記で定義されたアリール内の一つ以上の炭素原子が窒素、酸素または硫黄のような非炭素原子に置換された作用基を意味する。ヘテロアリールの非制限的な例としては、フリル（ｆｕｒｙｌ）、テトラヒドロフリル、ピロリル（ｐｈｒｒｏｌｙｌ）、ピロリジニル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）、チエニル（ｔｈｉｅｎｙｌ）、テトラヒドロチエニル、オキサゾリル（ｏｘａｚｏｌｙｌ）、イソオキサゾリル（ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ）、トリアゾリル（ｔｒｉａｚｏｌｙｌ）、チアゾリル（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、イソチアゾリル（ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリル（ｐｙｒａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリジニル（ｐｙｒａｚｏｌｉｄｉｎｙｌ）、オキサジアゾリル（ｏｘａｄｉａｚｏｌｙｌ）、チアジアゾリル（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリル（ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリニル（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｙｌ）、ピリジル（ｐｙｒｉｄｙｌ）、ピリダジイル（ｐｙｒｉｄａｚｉｙｌ）、トリアジニル（ｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、ピラジニル（ｐｙｒａｚｉｎｙｌ）、ピペライニル（ｐｉｐｅｒａｉｎｙｌ）、ピリミジニル（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル（ｉｎｄｏｌｙｌ）、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、キヌクリジニル（ｑｕｉｎｕｃｌｉｄｉｎｙｌ）、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチジニル（ｐｈｅｎｏｔｈｉｚｉｎｙｌ）、フェノキサジニル、プリニル、ベンズイミダゾリル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）及びベンゾチアゾリルなどと、これらが接合された類似体がある。

【0056】

本願において、炭化水素環（ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）またはヘテロ原子を含む炭化水素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）は別途定義されない限り、それぞれアルキルまたはヘテロアルキルの環型構造として理解される。

【0057】

炭化水素環の非制限的な例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル及びシクロヘプチルなどがある。ヘテロ原子を含む炭化水素環の非制限的な例としては、１−（１,２,５,６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどがある。

【0058】

また、炭化水素環またはヘテロ原子を含む炭化水素環は、これに炭化水素環、ヘテロ原子を含む炭化水素環、アリールまたはヘテロアリールが接合されたり共有結合で連結された形態を有することができる。

【0059】

Ｒ_a（ここで、ａは１ないし９から選択される整数）がケトン基（−ＣＯＲ₁₀）またはエステル基（−ＣＯＯＲ₁₀）であるとき、Ｒ₁₀は置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルケニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルキニル、置換または非置換されたＣ₂−Ｃ₁₀アルコキシ、置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀ハロアルキル、及び置換または非置換されたＣ₁−Ｃ₁₀アミノアルキルから選択されてもよい。

【0060】

Ｒ_b（ここで、ｂは１ないし１０から選択される整数）が置換された場合、上記作用基内の任意の炭素または末端炭素は、スルホン酸、スルホン酸塩、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸塩、リン酸、リン酸塩、塩化アシル、ポリアルキレンオキシド、４次アンモニウム塩、エステル及びアミドから選択される少なくとも一つに置換されてもよい。

【0061】

ここで、ポリアルキレンオキシドは、ポリマーの特性が維持される限度内で必要に応じて追加的に置換されてもよい。例えば、上記置換は、ポリマーの化学的または生物学的安定性を増加または減少させるための化学的結合であってもよい。具体例として、ポリアルキレンオキシド内の任意の炭素または末端炭素はヒドロキシ、アルキルエーテル（メチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエーテルなど）、カルボキシルメチルエーテル、カルボキシルエチルエーテル、ベンジルエーテル、ジベンジルメチレンエーテル、またはジメチルアミンに置換されてもよい。一実施形態において、ポリアルキレンオキシドは、メチルエーテルに終決されるポリアルキレンオキシド（ｍＰＥＧ）であってもよく、ここでｍＰＥＧは−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＣＨ₃の化学式で表わされ、エチレングリコール反復単位の数に該当するnの大きさによってｍＰＥＧの大きさが変わることがある。

【0062】

本発明の多様な変形例によれば、Ｒ_a（ここで、ａは１ないし９から選択される整数）は少なくとも一つの−Ｌ−Ｚ作用基を有してもよい。

【0063】

ここで、Ｌは化学式１で表わされる構造と、蛍光信号を発生させることができる蛍光団であるＺを連結するＬが３ないし１５０個の非水素原子を含むリンカーで、具体的に、８ないし１５０個の非水素原子を含むリンカーである。

【0064】

また、Ｚは、フェナントリジウム、クマリン、シアニン、ボディピー、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、キサンテン、チオキサンテン及びアクリジンから選択される蛍光団であったり、化学式１で表わされる構造を有することができる。

【0065】

本発明の一実施形態によれば、−Ｌ−Ｚ作用基は下記の化学式２で表わされてもよい。
［化学式２］
-L₁-[A¹-(CH₂)_x1-]_y1[A²-(CH₂)_x2-]_y2[A³-(CH₂)_x3-]_y3[A⁴-(CH₂)_x4-]_y4[A⁵-(CH₂)_x5-]_y5[A⁶-(CH₂)_x6-]_y6[A⁷-(CH₂)_x7-]_y7[A⁸-(CH₂)_x8-]_y8[A⁹-(CH₂)_x9-]_y9-A¹⁰-L₂-Z

【0066】

ここで、Ｌ₁及びＬ₂はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むＣ₁−Ｃ₁₂ポリメチレン単位であるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールであり、Ａ¹ないしＡ¹⁰はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む鎖型アルキルまたは分岐型アルキルであるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む５原子環または６原子環であり、x１ないしx９はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数であり、ｙ１ないしｙ９はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数である。

【0067】

また、Ｚはフェナントリジウム、クマリン、シアニン、ボディピー、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、キサンテン、チオキサンテン及びアクリジンから選択されたり、これ以外の蛍光団構造を有してもよい。

【0068】

他の変形例によれば、Ａ¹ないしＡ¹⁰のいずれか一つは下記の化学式３で表わされることができる。
［化学式３］

【0069】

ここで、Ｒ₁₁は炭素、窒素、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールで、Ｒ₁₂は下記の化学式４で表わされる。
［化学式４］
-[A¹¹-(CH₂)_x11-]_y11[A¹²-(CH₂)_x12-]_y12[A¹³-(CH₂)_x13-]_y13-A¹⁴-L₃-Z

【0070】

ここで、Ｌ₃は窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むＣ₁−Ｃ₁₂ポリメチレン単位であるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含むアリールで、Ａ¹¹ないしＡ¹⁴はそれぞれ独立に、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む鎖型アルキルまたは分岐型アルキルであるか、または窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を選択的に含む５原子環または６原子環で、x１１ないしx１３はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数で、ｙ１１ないしｙ１３はそれぞれ独立に、０または１ないし２０の整数である。

【0071】

また、本発明の一実施形態によるメロシアニン系化合物は、カウンターイオンをさらに含む構造を有してもよい。カウンターイオンは有機または無機アニオンであって、メロシアニン系化合物の溶解度及び安定性などを考慮して適宜選択されてもよい。

【0072】

本発明の一実施形態によるメロシアニン系化合物のカウンターイオンの例として、リン酸６フッ化物イオン、ハロゲンイオン、６フッ化物イオン、過塩素酸イオン、過ヨウ素酸イオン、アンチモン６フッ化物イオン、酒石酸６フッ化物イオン、フルオロホウ酸イオン及び４フルオロイオンなどのような無機酸アニオンと、チオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、p−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、３ハロアルキルカルボン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、トリハロアルキルスルホン酸イオン、及びニコチン酸イオンなどのような有機酸イオンがある。また、ビスペニルジトール、チオビスフェノールキレート及びビスジオル−α−ジケントンなどのような金属化合物イオン、ソジウム及びポタジウムなどのような金属イオンと、４次アンモニウム塩もカウンターイオンとして選択されてもよい。

【0073】

本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物は次のとおりである。
[化合物１]

【0074】

[化合物２]

【0075】

[化合物３]

【0076】

[化合物４]

【0077】

[化合物５]

【0078】

[化合物６]

【0079】

[化合物７]

【0080】

[化合物８]

【0081】

[化合物９]

【0082】

[化合物１０]

【0083】

[化合物１１]

【0084】

[化合物１２]

【0085】

[化合物１３]

【0086】

[化合物１４]

【0087】

[化合物１５]

【0088】

[化合物１６]

【0089】

[化合物１７]

【0090】

[化合物１８]

【0091】

[化合物１９]

【0092】

[化合物２０]

【0093】

[化合物２１]

【0094】

[化合物２２]

【0095】

[化合物２３]

【0096】

[化合物２４]

【0097】

[化合物２５]

【0098】

[化合物２６]

【0099】

[化合物２７]

【0100】

[化合物２８]

【0101】

[化合物２９]

【0102】

[化合物３０]

【0103】

[化合物３１]

【0104】

[化合物３２]

【0105】

[化合物３３]

【0106】

[化合物３４]

【0107】

[化合物３５]

【0108】

[化合物３６]

【0109】

[化合物３７]

【0110】

[化合物３８]

【0111】

[化合物３９]

【0112】

本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物のターゲットとなる生体分子は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡから選択される少なくとも一つであってもよく、メロシアニン系化合物は核酸内でインターカレーション（挿入又は結合）されてもよい。

【0113】

＜生体分子標識用染料、キット及び造影剤組成物＞
本発明の他の側面によれば、本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物から選択される少なくとも一つを含む生体分子標識用染料、キット及び造影剤組成物が提供されてもよい。

【0114】

また、必要に応じて、生体分子標識用キットは、ターゲット生体分子である核酸内にインターカレーションするための酵素、溶媒（緩衝液など）、及びその他の試薬などをさらに含んでもよい。

【0115】

ここで、溶媒としては、リン酸塩緩衝液、カーボネート緩衝液、及びトリス緩衝液から構成された群から選択される緩衝液、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、メタノール、エタノール及びアセトニトリルから選択される有機溶媒または水などが使われてもよく、溶媒の種類によってシアニン系化合物に多様な作用基を取り入れることで溶解度を調節することができる。

【0116】

本発明の一実施形態による生体分子標識用染料内で二量体及び／または三量体形態のメロシアニン系化合物は、分子間相互作用によって互いに凝集された状態で存在することができる。

【0117】

このとき、二量体及び／または三量体形態のメロシアニン系化合物は、凝集された状態では蛍光信号を発生しない。一方、生体分子（例えば、核酸）が存在する場合、凝集された状態で存在する二量体及び／または三量体形態のメロシアニン系化合物は、互いに分離されて核酸内でインターカレーションされることで蛍光信号を発生することができる。

【0118】

すなわち、インターカレーションできる生体分子の存在可否が本発明の一実施形態による生体分子標識用染料の消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）としての役割をすることになる。

【0119】

例えば、本発明の一実施形態による生体分子標識用キットは、生体分子である核酸を大きさ別に分離した後、生体分子標識用染料内のメロシアニン系化合物が核酸内でインターカレーションされることによって核酸を標識するように構成された電気泳動キットに提供されてもよい。

【0120】

具体的に、上記電気泳動キットは、本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物から選択される少なくとも一つの化合物；緩衝液、ゲルマトリックス、ゲルマトリックスを形成するための少なくとも一つの物質、表面、または表面を形成するための少なくても一つの物質；及び使用説明書；を含み、核酸がサンプル内に存在する場合、上記マトリックスまたは上記表面に固定されるサンプル内の核酸の存在または不在を決定するための電気泳動キットであってもよい。

【0121】

上記表面は、固体表面、膜表面、ガラス表面、プラスチック表面、またはポリシリコーン表面であってもよい。上記マトリックスはアルジネート、コラーゲン、ペプチド、フィブリン、ヒアルロン酸、アガロース、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチルレングリコールジアクリレート、ゼラチン、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ポリ乳酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、キトサン、ラテックス及びセファローズから選択される少なくとも一つに製造されてもよく、ビーズまたはメンブレンの形態であってもよい。

【0122】

また、上記実施形態による造影剤組成物は、経口または非経口方式で投与されるため、本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物以外に薬学的に許容する担体をさらに含んでもよい。

【0123】

薬学的に許容される担体の具体例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルビドロキシ安息香酸塩、プロピルビドロキシ安息香酸塩、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどがある。

【0124】

以下では、上述した生体分子標識用染料または生体分子標識用キットを利用した生体分子の標識方法について説明する。

【0125】

＜生体分子標識用染料を用いた生体分子の標識方法＞
本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物で生体分子を標識する方法としては、標識された固体または半固体状態の生体分子の蛍光を測定する標識方法ができる全ての生体分子の標識に適用されてもよい。

【0126】

従来の蛍光染料の代わりにメロシアニン系化合物を使うことにより、高感度で、化学的に安定的であり、造作性（操作性）に優れた標識方法を提供することができる。

【0127】

本発明の多様な実施形態によれば、ターゲット生体分子にメロシアニン系化合物をインターカレーションして生体分子を標識する方法などが実現されてもよい。また、これを利用して液またはゲル内の生体分子の定量化、生細胞または死滅細胞内の生体分子の染色、及びマイクロアレイでの生体分子検出及び定量化ができる。

【0128】

具体的に、本発明の多様な実施形態によれば、上記メロシアニン系化合物を利用してサンプル内の核酸の存在または不在を決定することができる。より具体的に、核酸がサンプル内に存在する場合、本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物に核酸を露出させ、上記メロシアニン系化合物が核酸内にインターカレーションされて複合体を形成する段階；及び上記メロシアニン系化合物の蛍光またはそれの不在を決定する段階；を含む、サンプル内の核酸の存在または不在を決定する方法がある。

【0129】

上記メロシアニン系化合物は、高感度で、化学的に安定して、サンプル内に存在する核酸に容易にインターカレーションされて複合体を形成する。そして、上記形成された複合体に十分な波長の光を照射して、放出された蛍光信号によりサンプル内の核酸の存否を容易に決定することができる。

【0130】

上記蛍光信号は、例えば、プレートリーダー、顕微鏡、蛍光光度計、量子カウンター及び流細胞分析器のような各種機器または肉眼を通じて検出される。

【0131】

また、上記メロシアニン系化合物を利用して増幅された標的核酸の存在または不在を決定することができる。

【0132】

具体的に、核酸増幅反応を行う方法として、標的核酸、上記標的核酸を増幅させるために必要な試薬、及び本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物を含む反応混合物を提供する段階；上記反応混合物を増幅された標的核酸の形成に好適な条件下で重合反応させる段階；上記反応混合物を光で照明する段階；及び上記反応混合物から蛍光放出を検出する段階；を含む、増幅された標的核酸の存在または不在を決定する方法であってもよい。

【0133】

上記反応混合物は、標的核酸の他に増幅酵素、標的核酸配列の増幅に十分なプライマー及びデオキシヌクレオシド三リン酸塩のような試薬などを含んでもよい。

【0134】

上記メロシアニン系化合物はＰＣＲ反応を抑制しなくても使用できるので、増幅された標的核酸の存否を決定するために有用に使うことができる。

【0135】

また、上記メロシアニン系化合物を利用してサンプル内の核酸を定量することができる。具体的に、本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物を含む混合物と、核酸を含むサンプルを混合する段階；上記メロシアニン系化合物が上記サンプル内の核酸にインターカレーションされて複合体を形成し、蛍光信号を発生させるように上記サンプルと上記混合物を十分な時間をもって培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）する段階；及び感知される蛍光信号と決められた核酸量の蛍光標準特性を比べてサンプル内の核酸を定量する段階；を含む、サンプル内の核酸を定量する方法であってもよい。

【0136】

上記サンプル内の核酸量は特定核酸量の蛍光標準特性に基づいて感知される蛍光信号と比べて定量化することができる。

【0137】

核酸の量と蛍光強度の間の実質的な一次的関係が核酸の定量化のために使われてもよく、細胞抽出物が使われる場合には、細胞数評価のために使われてもよい。一例として、核酸はブロット（ｂｌｏｔ）またはゲルのような不活性マトリックスに含浸されたり、マイクロアレイチップまたは任意の他の固体表面のような固体表面に付着されてもよい。このとき、上記メロシアニン系化合物を含む溶液を核酸含有マトリックスの表面、またはマイクロアレイチップの表面または他の固体表面に塗布し、染料−核酸複合体が形成されるように十分な時間の間、インキュベーションすることで行われる。

【0138】

また、本発明の多様な実施形態によれば、ターゲット細胞内に含まれた生体分子にメロシアニン系化合物をインターカレーションさせて、ターゲット細胞の生存度及びターゲット細胞を定量する方法などが実現されることができる。

【0139】

具体的に、本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物を含む混合物と、死滅細胞を含むサンプルを混合する段階；上記メロシアニン系化合物が上記サンプル内の死滅細胞にインターカレーションして複合体を形成し、蛍光信号を発生させるように上記サンプルと上記混合物を十分な時間培養する段階；及び感知される蛍光信号と決められた死滅細胞量の蛍光標準特性を比べてサンプル内の死滅細胞を定量する段階；を含む、サンプル内の細胞の生存度を定量する方法であってもよい。

【0140】

本発明の一実施形態によれば、上記メロシアニン系化合物は、細胞、つまり生細胞は透過しないが、死滅細胞は透過することができる。このような特性を利用して、上記メロシアニン系化合物が死滅細胞の膜を通過して、膜内の核酸と複合体を形成するように十分な時間インキュベーションして行われる。

【0141】

他の具体例として、死滅細胞にインターカレーションする本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物、及び細胞にインターカレーションすることができる上記メロシアニン系化合物以外の化合物を含む水溶液と細胞を含むサンプルを混合する段階；上記メロシアニン系化合物、及びそれ以外の上記化合物をインターカレーションした細胞を含むサンプルを光で照明する段階；及び上記サンプルから蛍光放出を検出する段階；を含み、上記サンプルから放出された上記蛍光は上記メロシアニン系化合物及びそれ以外の上記化合物が共にサンプル内の細胞にインターカレーションして細胞間に蛍光反応で発生し、放出された上記蛍光は上記メロシアニン系化合物だけの蛍光反応で発生した蛍光とは別のものとして、サンプル内の細胞の生存度を分析する方法であってもよい。

【0142】

本発明の一実施形態によれば、上記メロシアニン系化合物は、死滅細胞にインターカレーションすることができる。具体的に、上記メロシアニン系化合物は、死滅細胞を透過して死滅細胞内の核酸にインターカレーションすることができる。

【0143】

一方、上記メロシアニン系化合物以外の化合物、例えば、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ、ＡＯ）は、細胞、つまり死滅細胞だけでなく生細胞にもインターカレーションできる。すなわち、アクリジンオレンジ（ＡＯ）は死滅細胞だけでなく生細胞の膜を透過して細胞内の核酸にインターカレーションすることができる。

【0144】

上記メロシアニン系化合物、及びメロシアニン系化合物以外の化合物を核酸にインターカレーションして形成された複合体から発生した蛍光信号を測定し、サンプル内の細胞の生存度を分析することができる。具体的に、上記メロシアニン系化合物と核酸の複合体が発生させる蛍光信号の波長と、それ以外の化合物と核酸の複合体が発生させる蛍光信号の波長を測定及び区分して細胞の生存度を分析することができる。

【0145】

また、本発明は上記のような特徴を利用したサンプル内の細胞生存度を分析するキットであってもよい。

【0146】

具体的に、本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物；及び使用説明書を含み、死滅細胞がサンプル内に存在する場合、上記メロシアニン系化合物をインターカレーションして蛍光が検出されるサンプル内の細胞の生存度を分析するキットであってもよい。

【0147】

同時に、メロシアニン系化合物で標識した生体分子を電気泳動を通じて同定する方法が実現されてもよい。

【0148】

＜ＤＮＡマイクロアレイ法＞
ＤＮＡマイクロアレイ法は、標識すべき標的核酸に染料を反応（すなわち、メロシアニン系化合物を標的核酸内にインターカレーション）させて標識するが、このとき、標的核酸に対して相補的な塩基配列を持つ一本鎖のプローブ核酸を用意し、一本鎖に変性させた標的核酸とプローブ核酸を基板上で混成化した後、蛍光染料を標的核酸内にインターカレーションするようにすることで蛍光信号を発生させることができる。

【0149】

本標識方法で基板に固定するプローブ核酸としては、遺伝子の発現を調査する場合、ｃＤＮＡなどのｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、または全てのゲノムを鋳型にし、ＰＣＲ法で増幅して調剤したものを使うことができる。

【0150】

また、遺伝子変異などを調べる場合、標準となる既知の配列に基づいて、変異などに対応する様々なオリゴヌクレオチドを合成したものを使うことができる。

【0151】

プローブ核酸を基板上に固定することは、核酸の種類や基板の種類によって適当な方法を選択することができる。例えば、ＤＮＡの電荷を利用して、ポリリシンなどのカチオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を利用することもできる。

【0152】

＜ＰＣＲ法＞
ＰＣＲ法は、標識しなければならない標的核酸の塩基配列に相補的なプローブを染料で標識し、標的核酸の増幅前に、あるいは増幅した後で標的核酸とプローブを反応させ、標的核酸の蛍光を測定する。

【0153】

具体的には、標的核酸の伸長反応は、酵素（ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素）によって行われるし、このとき、標的核酸とオリゴヌクレオチドからなるプライマーが形成した二本鎖核酸配列を酵素が認識し、この認識した位置から伸長反応が行われ、目的とする遺伝子領域のみを増幅させる。

【0154】

酵素を合成する際に、ヌクレオシド（ｄＮＴＰ、ＮＴＰ）を原料として合成反応が行われる。

【0155】

このとき、通常のヌクレオシド（ｄＮＴＰ、ＮＴＰ）に染料を有するヌクレオシドを任意の割合で混合すれば、その割合の染料が取り入れられた核酸を合成することができる。

【0156】

また、ＰＣＲによって任意の割合でアミノ基を有するヌクレオシドを取り入れた後で標識用染料を結合し、標識用染料が取り入れられた核酸を合成することもできる。

【0157】

酵素を合成するとき、ヌクレオシドを原料として合成反応が行われるが、このときのヌクレオシドの３'のＯＨをＨに変えたものを使用した場合、それ以上核酸の伸長反応が行われずに、その時点で反応が終了する。

【0158】

このヌクレオシド、ｄｄＮＴＰ（ｄｉｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐａｅ）はターミネーターと言われる。

【0159】

通常のヌクレオシドにターミネーターを混ぜて核酸を合成すれば、一定の確率でターミネーターが取り入れられて反応が終了するので、様々な長さの核酸が合成される。

【0160】

これをゲル電気泳動によって大きく分離すれば、長さの順にＤＮＡが並ぶようになる。ここで、ターミネーターの各塩基の種類ごとに他の標識用染料で標識しておけば、合成反応の終点（３'末端）には各塩基に依存する傾向が観察され、ターミネーターに標識した標識用染料を基点にして蛍光情報を読み取ることにより、その標的核酸の塩基配列の情報を得ることができる。

【0161】

また、ターミネーターの代りに予め標識用染料で標識したプライマーを使用して標的核酸と混成化することもできる。

【0162】

また、プローブとしてＰＮＡ（ペプチド核酸）を使用してもよい。ＰＮＡは核酸の基本骨格構造である五炭糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸とかなり似た３次元構造を有し、相補的な塩基配列を有する核酸に対して非常に特異的に強力に結合する。これを通じて、ＩＳＨ（iｎ−ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法などの既存のＤＮＡ解釈方法だけでなく、テロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ、末端小粒）ＰＮＡプローブに応用することで、テロメア研究の試薬として使うこともできる。

【0163】

標識は、例えば、二本鎖ＤＮＡをＤＮＡの塩基配列の全部または一部に相補的な塩基配列を有し、標識用染料で標識されたＰＮＡと接触させて混成し、その混合物を加熱して一本鎖ＤＮＡを生成し、混合物をゆっくり室温まで冷却してＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を調剤し、その蛍光を測定することで進めることができる。

【0164】

上記の例では、標的核酸をＰＣＲ法によって増幅させることにより生成物の蛍光を測定する方法について説明したが、この方法では電気泳動で生成物の大きさを確認し、その後蛍光強度を測定することで増幅生成物の量を調べる必要がある。

【0165】

そのために、蛍光染料のエネルギートランスファーを利用し、ＰＣＲ法の生成物に混成させることで蛍光を発するように考案されたプローブを使用し、リアルタイムで生成物の量を測定することもできる。

【0166】

例えば、ドナーとアクセプターを標識したＤＮＡを使用してもよい。具体的な標識方法としては、特定配列の核酸の存在を確認する分子標識法やＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、またはサイクリングプローブ（ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）法などを挙げられる。

【0167】

＜その他の標識方法＞
また、本発明の標識用染料を利用して、細胞内の信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）現象を観察してもよい。内部信号伝達又はこれによる細胞の反応には多様な酵素などが関与している。代表的な信号伝達現象では、特殊なタンパク質リン酸化酵素（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）が活性化され、これによってタンパク質のリン酸化が誘導され、信号伝達が開始されることが知られている。

【0168】

ヌクレオシド（例えば、ＡＴＰまたはＡＤＰ）の結合と加水分解は、これらの活性に重大な役割をしていて、ヌクレオシド誘導体に標識用染料を取り入れることで、細胞内の信号伝達現象を高感度で観察することができる。

【0169】

また、本発明の標識用染料をＲＮＡ干渉作用（ＲＮＡi）を利用した遺伝子発現現象の観察に利用してもよい。

【0170】

ＲＮＡiは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に取り入れることで、標的遺伝子のｍＲＮＡを分解して発現を抑制するものであって、設計されたｄｓＲＮＡを標識用染料で標識することでＲＮＡi現象を観察することが可能である。

【0171】

以下では、本発明の具体的な実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明を具体的に例示したり説明するためのものに過ぎず、これによって本発明が制限されてはならない。

【0172】

＜製造例＞
＜製造例１．化合物１の合成＞
（１）中間体１及び中間体２の合成

【0173】

２５０ｍＬの１口反応器に２−メチルチオベンゾチアゾル（２−（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）（１１．１１５g、０．０６１４ｍｏｌ）とアセトニトリル（１１０ｍＬ）を入れて常温で５分間撹拌した。次いで、反応器にＯｘｏｌａｎｅ、すなわち２−ヨードエチル−１，３−ジオキソラン（２１g、０．０９２１ｍｏｌ）を入れて、還流下で４０時間撹拌した後冷却し、濃縮及びコラム精製して中間体１（１４g、０．０５２３ｍｏｌ、８５％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.45-7.48 (m, 1H), 7.38-7.43 (m, 1H), 7.26-7.32 (m, 2H), 5.00 (t, J=4.0 Hz, 1H), 4.54-4.58 (m, 2H), 3.89-4.02 (m, 4H), 2.18-2.23 (m, 2H)

【0174】

次いで、１００ｍＬの１口反応器に中間体１（２．３７g、０．０１ｍｏｌ）とアセトニトリル（３０ｍＬ）を入れて常温で５分間撹拌した。反応器にヨードメタン（ｍｅｔｈｙｌ ｉｏｄｉｄｅ、ＭｅＩ）（１．２６g、０．０３ｍｏｌ）を入れて還流下で１２時間撹拌した後冷却し、濃縮してエチルアセテート（５０ｍＬ）を入れて固体を析出させた。析出された固体をろ過及び真空乾燥して中間体２（３g、０．００７３３ｍｏｌ、７３％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.51 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.92 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.76 (t, J=8.4Hz, 1H), 7.64 (t, J=8.0H, 1H), 5.03 (t, J=3.6Hz, 1H), 4.78 (t, J=7.2Hz, 2H), 3.84-4.00 (m, 2H), 3.21 (s, 3H), 2.38-2.42 (m, 2H)

【0175】

（２）中間体３の合成

【0176】

５０ｍＬの１口反応器に４−メチル−５−キノリノール（２g、０．０１２５ｍol）、エチル６−ヨードヘキサノエート（１０g、０．０３７５ｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）を入れて１２０℃で１２時間撹拌した後冷却し、濃縮及びコラム精製して中間体３（３．５g、０．００８２８ｍｏｌ、６７％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.19 (d, J=6.4Hz, 1H), 7.952 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.73-7.77 (m, 2H), 7.22 (d, J=7.6Hz, 1H), 4.85 (t, J=6.8Hz, 2H), 4.01 (q, J=7.6Hz, 2H), 3.09 (s, 3H), 2.35 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.89-1.93 (m, 2H), 1.55-1.61 (m, 4H), 1.12 (t, J=6.8Hz, 3H)

【0177】

（３）中間体４の合成

【0178】

１００ｍＬの１口反応器に中間体２（１．５５g、３．８１４ｍｍｏｌ）、中間体３（１．６４g、３．８１４ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（３０ｍＬ）を入れて常温で５分間撹拌した。次いで、反応器にトリエチルアミン（１．１５g、１１．４４２ｍｍol）を入れて常温で１２時間撹拌した後、濃縮及びコラム精製して中間体４（１．５g、２．２６３ｍｍｏｌ、５９％）を得た。

【0179】

（４）中間体５の合成

【0180】

２５０ｍＬの１口反応器に中間体４（１．５g、２．２６３ｍｍｏｌ）、クロロホルム（４５ｍＬ）を入れて常温で５分間撹拌した後、反応器に５０％硫酸水溶液（９ｍＬ）を入れて１２時間撹拌した。次いで、反応器に水（１０ｍＬ）を入れてジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を濃縮及びコラム精製して中間体５（０．４g、０．６６６ｍｍｏｌ、２９％）を合成した。¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.35 (d, J=7.2Hz, 1H), 7.91 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.82 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.62-7.65 (m, 2H), 7.54 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.42-7.44 (m, 1H), 7.36 (d, J=7.2Hz, 1H), 7.11 (d, J=8.0Hz, 1H), 5.21-5.25 (m, 1H), 4.70-4.75 (m, 1H), 4.45-4.60 (m, 2H), 4.13-4.20 (m, 1H), 2.87-2.92 (m, 1H), 2.52-2.56 (m, 1H), 2.33 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.94-2.02 (m, 2H), 1.66-1.73 (m, 2H), 1.46-1.52 (m, 2H)

【0181】

（５）化合物１の合成

【0182】

２５０ｍＬの１口反応器に中間体５（２００ｍg、０．３５ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）を入れて常温で５分間撹拌した後、反応器にＴＳＴＵ（１０６ｍg、０．３５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５０μl、０．３５ｍｍｏｌ）を入れて常温で１５分間撹拌した。次いで、トリエチルアミン（５０μl、０．３５ｍｍｏｌ）、２,２'−オキシビスエチルアミン（１３μl、０．１１９ｍｍｏｌ）を入れて常温で３日間撹拌した後、エチルアセテート（４０ｍＬ）に反応液を注いで固体を析出させた。析出された固体は、ろ過及びコラム精製して化合物１（１１０ｍg、０．０９０６ｍｍｏｌ、２６％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.25 (d, J=6.8Hz, 2H), 7.77-7.80 (m, 2H), 7.68-7.73 (m, 2H), 7.51-7.54 (m, 4H), 7.41 (t, 2H, J=8.8Hz, 2H), 7.29-7.35 (m, 2H), 7.16-7.20 (m, 2H), 7.01 (d, J=7.6Hz, 2H), 5.04-5.11 (m, 2H), 4.60-4.63 (m, 2H), 4.32-4.43 (m, 4H), 4.00-4.09 (m, 2H), 3.44-3.47 (m, 4H), 3.30-3.32 (m, 4H), 2.79-2.82 (m, 2H), 2.35-2.45 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.85-1.92 (m, 4H), 1.61-1.69 (m, 4H), 1.39-1.45 (m, 4H)

【0183】

＜製造例２．化合物２ないし化合物４の合成＞
製造例１の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりにそれぞれ４,７,１０−トリオキサ−１,１３−トリデカンジアミン、１,２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、１,１１−ジアミノ−３,６,９−トリオキサウンデカンを使用して化合物２、化合物３及び化合物４を合成した。

【0184】

化合物２−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.25 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77 (t, J=8.0Hz, 2H), 7.69-7.73 (m, 2H), 7.50-7.55 (m, 4H), 7.41 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.30-7.32 (m, 2H), 7.17-7.20 (m, 2H), 7.01 (d, J=8.0Hz, 2H), 5.05-5.10 (m, 2H), 4.60-4.63 (m, 2H), 4.34-4.45 (m, 4H), 4.04-4.10 (m, 2H), 3.54-3.56 (m, 4H), 3.48-3.50 (m, 4H), 3.42 (t, J=6.0Hz, 4H), 3.18 (t, J=6.8Hz, 4H), 2.79-2.83 (m, 2H), 2.37-2.44 (m, 2H), 2.16 (t, J=6.8Hz, 4H), 1.85-1.92 (m, 4H), 1.60-1.70 (m, 8H), 1.37-1.42 (m, 4H)

【0185】

化合物３−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.26 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.77-7.79 (m, 2H), 7.69-7.72 (m, 2H), 7.52-7.54 (m, 4H), 7.42 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.31-7.33 (m, 2H), 7.17-7.20 (m, 2H), 7.02 (d, J=7.6Hz, 2H), 5.05-5.12 (m, 2H), 4.60-4.64 (m, 2H), 4.33-4.43 (m, 4H), 4.01-4.10 (m, 2H), 3.54-3.57 (m, 4H), 3.50 (t, J=6.4Hz, 4H), 3.32 (t, J=6.4Hz, 4H), 2.80-2.83 (m, 2H), 2.40-2.43 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.86-1.92 (m, 4H), 1.63-1.68 (m, 4H), 1.42-1.46 (m, 4H)

【0186】

化合物４−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.27 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77-7.80 (m, 2H), 7.69-7.73 (m, 2H), 7.52-7.54 (m, 4H), 7.42 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.31-7.33 (m, 2H), 7.18-7.20 (m, 2H), 7.02 (m, J=7.6Hz, 2H), 5.06-5.11 (m, 2H), 4.60-4.64 (m, 2H), 4.35-4.44 (m, 4H), 4.05-4.08 (m, 2H), 3.54-3.58 (m, 8H), 3.48 (t, J=6.0Hz, 4H), 3.32 (t, J=4.8Hz, 4H), 2.80-2.84 (m, 2H), 2.39-2.43 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.87-1.94 (m, 4H), 1.63-1.40 (m, 4H), 1.40-1.46 (m, 4H)

【0187】

＜製造例３．化合物５の合成＞
製造例３は、製造例１における中間体１の生成時に２−メチルチオベンゾチアゾルの代わりに５−クロロ−２−メチルチオベンゾチアゾルを使用したことを除いて、製造例１と同じ方法によって化合物５を合成した。¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.34 (d, J=6.4Hz, 2H), 7.71-7.77 (m, 4H), 7.58 (m, 2H) 7.46 (t, J=8.4Hz, 2H), 7.27 (t, J=7.2Hz, 2H), 7.20 (t, J=6.8Hz, 2H), 7.05 (d, J=7.6Hz, 2H), 5.07 (m, 2H), 4.55-4.58 (m, 2H), 4.41 (m, 4H), 400-4.03 (m, 2H), 3.46 (m, 4H), 3.29 (m, 4H), 2.82 (m, 2H), 2.40-2.42 (m, 2H), 2.21 (m, 4H), 1.90 (m, 4H), 1.65 (m, 4H), 1.41 (m, 4H)

【0188】

＜製造例４．化合物６ないし化合物８の合成＞
製造例３の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりにそれぞれ１,２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、１,１１−ジアミノ−３,６,９−トリオキサウンデカン、４,７,１０−トリオキサ−１,１３−トリデカンジアミンを使用して化合物６、化合物７及び化合物８を合成した。

【0189】

化合物６−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.33-8.36 (m, 2H), 7.74-7.78 (m, 4H), 7.62-7.64 (m, 2H), 7.46-7.51 (m, 2H), 7.30-7.34 (m, 2H), 7.25 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.05-7.07 (m, 2H), 5.09-5.12 (m, 2H), 4.50-4.61 (m, 2H), 4.42-4.47 (m, 4H), 4.01-4.05 (m, 2H), 3.54 (m, 4H), 3.46-3.48 (m, 4H), 3.29 (m, 4H), 2.80-2.82 (m, 2H), 2.41-2.45 (m, 2H), 2.17-2.20 (m, 4H), 1.89-1.92 (m, 4H), 1.62-1.66 (m, 4H), 1.40-1.42 (m, 4H)

【0190】

化合物８−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.36-8.38 (m, 2H), 7.75-7.82 (m, 4H), 7.62-7.65 (m, 2H), 7.49-7.54 (m, 2H), 7.30-7.34 (m, 2H), 7.27 (t, J=7.2Hz, 2H), 7.08-7.10 (m, 2H), 5.11-5.17 (m, 2H), 4.60-4.63 (m, 2H), 4.44-4.53 (m, 4H), 4.05-4.08 (m, 2H`), 3.56-3.59 (m, 4H), 3.50-3.53 (m, 4H), 3.45 (t, J=6.0Hz, 4H), 3.20 (t, J=6.8Hz, 4H), 2.82-2.84 (m, 2H), 2.44-2.49 (m, 2H), 2.19 (t, J=6.4Hz, 4H), 1.90-1.97 (m, 4H), 1.63-1.72 (m, 8H), 1.40-1.65 (m, 4H)

【0191】

上記製造例１ないし４で得られた化合物１ないし化合物８と、市販されるＳＹＢＲ ｓａｆｅの吸収スペクトル（λ_abs）、発光スペクトル（λ_em）、モル吸光係数（ε）及び量子効率を測定して下記表１に示した。

【0192】

【表1】

【0193】

上記製造例１ないし４で得られた化合物１ないし化合物８は、ＳＹＢＲ ｓａｆｅと類似であるか、又は優れたモル吸光係数を示し、特に量子効率の側面においても相当優秀であることを確認できる。

【0194】

＜製造例５．化合物９ないし化合物２０の合成＞
製造例１の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりに、それぞれ１,６−ジアミノヘプタン、１,８−ジアミノオクタン、１,１０−ジアミノデカン、１,１２−ジアミノドデカン、３,３−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンを使用して化合物９ないし化合物１３を合成した。

【0195】

製造例１の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりに、下記化学式で表わされるアミンブリッジを使用して化合物１４を合成した。

【0196】

【0197】

製造例１の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりにピペラジン、２,６−ジアミノピリジン、p−ペニルジアミン、１,４−ジアミノナフタレンを使用して化合物１５ないし化合物１８を合成した。

【0198】

製造例１の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりに下記の化学式で表わされるアミンブリッジを使用して化合物１９を合成した。

【0199】

【0200】

製造例１の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりに下記の化学式で表わされるアミンブリッジを使用して化合物２０を合成した。

【0201】

【0202】

＜製造例６．化合物３６の合成＞
（１） 中間体１及び中間体２の合成

【0203】

１Ｌの１口反応器にＯｘｏｌａｎｅ、すなわち、２−ブロモエチル−１，３−ジオキソラン（５２．６g、０．２９０ｍol）、ヨウ化カリウム（６４．３g、０．３８７ｍｏｌ）、アセトニトリル（３２０ｍＬ）を入れて、５０℃で１時間撹拌した。次いで、反応器に２−メチルチオベンゾオキサゾール（２−（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｏxａｚｏｌｅ）（３２．０g、０．１９３ｍｏｌ）を入れて還流下で２０時間撹拌して冷却した後、濃縮及びコラム精製して中間体１（３０．２g、０．１２０ｍol、６２％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.40-7.28 (m, 4H), 4.93 (t, J=4.4Hz, 1H), 4.33 (t, J=6.8Hz, 2H), 4.10-3.90 (m, 2H), 3.84-3.78 (m, 2H), 2.22-2.00 (m, 2H)

【0204】

次いで、５０ｍＬの１口反応器に中間体１（１．０g、３．９７９ｍｍｏｌ）、メチルトシラート（ｍｅｔｈｙｌ ｔｏｓｙｌａｔｅ、ＭｅＯＴｓ）（０．９ｍＬ、５．９６８ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を１２０℃で１時間撹拌して冷却した後、反応器にエチルアセテートを入れて常温で撹拌した。それから、上層液を捨てて真空乾燥させ、中間体２（０．９g、２．０５７ｍｍｏｌ、５２％）を得た。¹H-NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.95-7.89 (m, 2H), 7.73-7.66 (m, 4H), 7.22 (d, J=7.8Hz, 2H), 4.96 (t, J=3.6Hz, 1H), 4.54 (t, J=6.6Hz, 2H), 3.93-3.77 (m, 4H), 3.19 (s, 3H), 2.44-2.35 (m, 5H)

【0205】

（２） 中間体３の合成

【0206】

５０ｍＬの１口反応器に４−メチル−５−キノリノール（２g、０．０１２５ｍol）、エチル６−ヨードヘキサノエート（１０g、０．０３７５ｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）を入れて１２０℃で１２時間撹拌して冷却した後、濃縮及びコラム精製して中間体３（３．６g、０．００８２８ｍｏｌ、６７％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.19 (d, J=6.4Hz, 1H), 7.952 (t, J=8.0Hz, 1H), 7.73-7.77 (m, 2H), 7.22 (d, J=7.6Hz, 1H), 4.85 (t, J=6.8Hz, 2H), 4.01 (q, J=7.6Hz, 2H), 3.09 (s, 3H), 2.35 (t, J=7.6Hz, 2H), 1.89-1.93 (m, 2H), 1.55-1.61 (m, 4H), 1.12 (t, J=6.8Hz, 3H)

【0207】

（３） 中間体４の合成

【0208】

１００ｍＬの１口反応器に中間体２（１．８７g、４．２９２ｍｍｏｌ）、中間体３（１．４５g、４．２９２ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（２０ｍＬ）を入れて常温で５分間撹拌した。次いで、反応器にトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＴＥＡ）（０．８６８g、８．５８４ｍｍｏｌ）を入れて常温で１２時間撹拌した後、濃縮及びコラム精製して中間体４を得た。

【0209】

（４） 中間体５の合成

【0210】

５００ｍＬの１口反応器に中間体４（８．６g、０．０１３３ｍｍｏｌ）、５０％硫酸水溶液（５０ｍＬ）、クロロホルム（２５０ｍＬ）を入れて常温で撹拌した。次いで、反応器に水（１０ｍＬ）を入れてジクロロメタン（２ x ５０ｍＬ）で抽出し、有機層を濃縮及びコラム精製して中間体５（０．３７g、０．６６５ｍｍｏｌ、５％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.25 (d, J=6.8Hz, 1H), 7.80 (t, J=8.4Hz, 1H), 7.69 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.53-7.47 (m, 3H), 7.44-7.40 (m 1H), 7.08 (d, J=8.0Hz, 1H), 5.31-5.27 (m, 1H), 4.57-4.50 (m, 2H), 4.47-4.40 (m, 1H0, 4.18-4.10 (m, 1H), 2.87-2.83 (m, 1H), 2.57-2.47 (m, 1H)m 2.31 (s, J=7.2Hz, 2H), 1.99-1.92 (m, 2H), 1.71-1.64 (m, 2H), 1.51-1.43 (m, 2H)

【0211】

（５） 化合物３６の合成

【0212】

２５０ｍＬの１口反応器に中間体５（１２３ｍg、０．２２０ｍｍol）、ＴＢＴＵ（１０６ｍg、０．３３０ｍｍol）、ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を入れて常温で５分間撹拌した後、反応器にトリエチルアミン（９２μl、０．６６０ｍｍol）、２,２'−オキシビスエチルアミン（２３μl、０．２２０ｍｍol）を入れて常温で１２時間撹拌した。次いで、エチルアセテート（４０ｍＬ）に反応液を注いで固体を析出させた。析出された固体をろ過及びコラム精製して化合物３６（３０ｍg、０．０９０６ｍｍｏｌ、１１％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.21 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77-7.72 (m, 2H), 7.66 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.60 (t, J=6.8Hz, 2H), 7.49-7.44 (m, 6H), 7.41-7.37 (m, 2H), 7.06-7.03 (m, 2H), 5.24-2.18 (m, 2H), 4.54-4.49 (m, 2H), 4.44-4.37 (m, 4H), 4.14-4.07 (m, 2H), 3.49-3.47 (m, 4H), 3.32 (m, 4H), 2.84-2.81 (m, 2H), 2.52-2.39 (m, 2H), 2.23 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.94-1.91 (m, 4H), 1.70-1.65 (m, 4H), 1.49-1.40 (m, 4H)

【0213】

＜製造例７．化合物３７ないし化合物３９の合成＞
製造例６の中間体５から化合物１を合成する例で、２,２'−オキシビスエチルアミンの代わりに、それぞれ１,２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、１,１１−ジアミノ−３,６,９−トリオキサウンデカン、４,７,１０−トリオキサ−１,１３−トリデカンジアミンを使用して化合物３７、化合物３８及び化合物３９を合成した。

【0214】

化合物３７−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.20 (d, J=7.2, 2H), 7.76-7.70 (m, 2H), 7.65 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.48-7.42 (m, 6H), 7.39-7.35 (m, 2H), 7.04-7.01 (m, 2H), 5.23-5.17 (m, 2H), 4.52-4.47 (m, 2H), 4.44-4.34 (m, 4H), 4.12-4.06 (m, 2H), 3.57 (s, 4H), 3.51-3.48 (m, 4H), 3.36-3.30 (m, 4H), 2.83-2.80 (m, 2H), 2.48-2.40 (m, 2H), 2.25-2.21 (m, 4H), 1.93-1.89 (m, 4H), 1.68-1.64 (m, 4H), 1.46-1.39 (m, 4H)

【0215】

化合物３８−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.20 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.77-7.72 (m, 2H), 7.66 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.62-7.59 (m, 2H), 7.47-7.44 (m, 6H), 7.41-7.36 (m, 2H), 7.03 (d, J=8.0Hz, 2H), 5.25-5.19 (m, 2H), 4.52-4.48 (m, 2H), 4.44-4.39 (m, 4H), 4.13-4.07 (m, 2H), 3.59-3.58 (m, 8H), 3.50-3.48 (m, 4H), 3.33-3.30 (m, 4H), 2.84-2.81 (m, 2H), 2.49-2.40 (m, 2H), 2.21 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.94-1.89 (m, 4H), 1.69-1.65 (m, 4H), 1.44-1.43 (m, 4H)

【0216】

化合物３９−¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.22-8.21 (m, 2H), 7.78-7.72 (m, 2H), 7.67 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.63-7.60 (m, 2H), 7.51-7.44 (m, 6H), 7.41-7.37 (m, 2H), 7.05-7.03 (m, 2H), 5.26-4.20 (m, 2H), 4.53-4.49 (m, 2H), 4.47-4.37 (m, 4H), 4.15-4.07 (m, 2H), 3.60-3.58 (m, 4H), 3.54-3.53 (m, 4H), 3.48-3.45 (m, 4H), 3.23-3.20 (m, 4H), 2.85-2.82 (m, 2H), 2.50-2.42 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2Hz, 4H), 1.97-1.89 (m, 4H), 1.73-1.68 (m, 8H), 1.46-1.40 (m, 4H)

【0217】

上記製造例６及び７で得られた化合物３６ないし化合物３９と、市販されるＳＹＢＲ ｓａｆｅの吸収スペクトル（λ_abs）、発光スペクトル（λ_em）、モル吸光係数（ε）及び量子効率を測定して下記表２に示した。

【0218】

【表2】

【0219】

上記製造例６及び７で得られた化合物３６ないし化合物３９は、ＳＹＢＲ ｓａｆｅと類似であるか、又は優れたモル吸光係数を表し、特に量子効率の側面においても相当優秀であることを確認できる。

【0220】

＜実験例＞
＜実験例１．核酸標識実験＞
製造例に従って製造された化合物１ないし化合物８、化合物３８と、市販中の染料であるＳＹＢＲ ｓａｆｅの核酸標識特性を比べるために、１％アガロースゲル（４０ｍl １Ｘ ＴＡＥ バッファー + ０．４gアガロース）に、それぞれ４μlずつ混合して９個のアガロースゲルを用意した。

【0221】

[ＳＹＢＲ ｓａｆｅ]

【0222】

用意された９個のアガロースゲルを１Ｘ ＴＡＥ バッファーに完全に浸すように入れた後、５個のウェルに１０μl、５μl、２．５μl、１μl、０．５μlのＤＮＡサンプルをそれぞれローディングした。電気泳動は１００Ｖの電源で３０分間行った。上記電気泳動結果は、図１及び図２ないし図１０に示した。

【0223】

図２ないし図１０は、それぞれ化合物１ないし化合物８、化合物３８の電気泳動結果を示したものである。

【0224】

図１ないし図１０を参照すれば、ＳＹＢＲ ｓａｆｅに比べて本発明の多様な実施形態によるメロシアニン系化合物を染料として使う場合、ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌが均一であることを確認することができ、全般的なバンドの明るさがＳＹＢＲ ｓａｆｅより明るくて、標識結果の判読性を向上させたことを確認することができる。

【0225】

また、ＳＹＢＲ ｓａｆｅの場合、ＵＶを０．５秒間照射したにもかかわらず、全般的なバンドの明るさが暗い一方、図６ないし図１０を参照すれば、ＳＹＢＲ ｓａｆｅより短い時間の間ＵＶを照射したにもかかわらず、もっと明るいバンドが観察されたことを確認することができる。

【0226】

図１１は商用化された染料であるＳＹＢＲ ｓａｆｅの吸収及び放出スペクトルの結果を示したものであり、図１２及び図１３はそれぞれ化合物３及び化合物６の吸収及び放出スペクトルの結果を示したものである。

【0227】

ＳＹＢＲ ｓａｆｅ、化合物３及び化合物６のいずれもＤＮＡにインターカレーションしつつ、吸収波長が長波長へと移動（ｒｅｄ ｓｈｉｆｔ）し、蛍光強度が増加することを確認することができるが、ｒｅｄ ｓｈｉｆｔされた化合物３及び化合物６による蛍光強度は、ＳＹＢＲ ｓａｆｅの蛍光強度よりかなり向上したことを確認することができる。

【0228】

化合物１ないし化合物８、化合物３６ないし化合物３９と、市販されるＳＹＢＲ ｓａｆｅのＤＮＡ存在下で測定された吸収スペクトル（λ_abs）、発光スペクトル（λ_em）及び量子効率を測定して下記表３に示した。

【0229】

【表3】

【0230】

化合物１ないし化合物８、化合物３６ないし化合物３９は、ＤＮＡの存在下で市販されるＳＹＢＲ ｓａｆｅと類似する波長領域で蛍光信号を表す一方、ＳＹＢＲ ｓａｆｅに比べて相当優秀な量子効率を示すことを確認することができる。

【0231】

＜実験例２．細胞透過性実験＞
ＳＹＢＲ ｓａｆｅと本発明の一実施例による化合物１、化合物４及び化合物６の細胞透過性を確認するために、ヒーラ細胞測定を利用した。

【0232】

ヒーラ細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０,０００ｕｎｉｔｓ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０,０００μg／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＭ培地に、ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気下、３７℃で培養した。ヒーラ細胞を３回メディアで洗浄した後、１μＭ濃度のＳＹＢＲ ｓａｆｅと化合物６をそれぞれヒーラ細胞（Ｈｅｌａ Ｃｅｌｌ）に処理し、３７℃で３０分間培養した。上記と同様に３回メディアで洗浄した後、顕微鏡でイメージを観察し、その結果を図１４ないし図１７に示した。

【0233】

図１４は商用化された染料であるＳＹＢＲ ｓａｆｅの細胞透過性実験結果を示したイメージで、図１５は化合物１、図１６は化合物４、及び図１７は化合物６の細胞透過性実験結果を示したイメージである。

【0234】

図１４を参照すれば、ＳＹＢＲ ｓａｆｅは細胞透過性を示す一方、図１５ないし図１７を参照すれば、本発明の多様な実施形態による化合物は細胞を透過しないことを確認することができる。

【0235】

＜実験例３．細胞サイクル（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）分析実験＞
６−ウェルプレートの各ウェルに５×１０⁵〜１×１０⁶で株分けした細胞をｖｅｈｉｃｌｅ及びＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）で処理した後、ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで回収した後、ＦＡＣＳチューブに移してＰＢＳ（４℃）１ｍlで洗浄した。次いで、３００μlのＰＢＳ（４℃）をチューブに入れた後、細胞を浮遊させた。

【0236】

浮遊した細胞が載せられたチューブをｖｏｒｔｅｘしながら１００％Ｅｔ−ＯＨ ７００μlを一滴ずつ落とした後、４℃で１時間以上反応させ、細胞固定（ｃｅｌｌ ｆｉｘａｔｉｏｎ）させてＥｔ−ＯＨをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、１ｍlのＰＢＳに懸濁した細胞をそれぞれ化合物６（２μＭ）またはＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（５０ｍg／ｍl）１０μlと１ｍg／ｍl濃度のＲＮａｓｅ １μlを添加して３０分間暗室で反応させ、流細胞分析機を利用して分析した。

【0237】

すなわち、ＦＳＣ−Ａ、ＳＳＣ−Ａを利用して核を区画（ｇａｔｉｎｇ）し、ＦＩＴＣ−Ａ、ＦＩＴＣ−Ｗ ｐｌｏｔを電圧で調節してｓｉｎｇｌｅｔを分ける。ｓｉｎｇｌｅｔに分けられたものは、再度ＦＩＴＣ−Ａ ｈｉｓｔｏｇｒａｍを見ながら電圧を調節してＤＮＡ ２Ｎ、４Ｎになるピークを指定し、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、そしてＧ２／Ｍ期を区分し、その結果を図５ａ及び図５ｂに示した。

【0238】

図１８は商用化された細胞サイクル分析染料であるヨウ化プロピジウムを利用した細胞サイクル分析結果を示したグラフで、図１９は化合物６を利用した細胞サイクル分析結果を示したグラフである。

【0239】

図１８と図１９を比べると、図１９の細胞サイクル分析結果が図１８に比べて各段階の間の区分が明確で、信号の可視性も向上されたことを確認することができる。

【0240】

＜実験例４．エイムス試験（Ａｍｅｓ ｔｅｓｔ）＞
本発明の一実施例による化合物６の遺伝毒性を評価する目的として、バクテリア菌株を用いたエイムス試験を行った。

【0241】

試験菌株として凍結保存されたＨｉｓｔｉｄｉｎｅ要求性変異株であるネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＴＡ９８株）に代謝活性酵素であるＳ９混合物を処理した試験系にて、化合物６、ＥｔＢｒ及びＳＹＢＲ ｓａｆｅ処理による試験菌株の生育度合を観察した。

【0242】

冷凍冷蔵庫で保管中の試験菌株を取って、滅菌された液体培地（２．５％のＯｘｏｉｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ Ｎｏ．２）に接種し、シェイキングインキュベーター（３７℃、２００rpｍ）で１０時間培養した。最小培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ａｇａｒｐｌａｔｅ）は、１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）とＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ及び２％グルコースを含んだものをペトリ皿（９０×１５ｍｍ）に２０ｍlずつ株分けして使用した。トップアガーは０．６％ａgａrと０．５％ＮａＣｌで調剤し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株用トップアガーは０．０５ｍＭの濃度になるようにヒスチジン−ビオチンを添加した。

【0243】

高圧滅菌したトップアガーを４５℃に予熱した加熱ブロックに刺した滅菌チューブ（１２×７５ｍｍ）に２ｍlずつ株分けした後、それぞれ化合物６、ＥｔＢｒ及びＳＹＢＲ ｓａｆｅ ０．１ｍlとＳ９混合物と、試験菌株培養液０．１ｍlを入れて、すぐボルテックスミキサーで２〜３秒間振盪してｍｉｎｉｍａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｇａｒ ｐｌａｔｅに注ぎ、幾つかの方向に傾けた後で固める。トップアガーが固まると、プレートをひっくり返して３７℃で４８時間培養した後、集落数を計数した。

【0244】

化合物６、ＥｔＢｒ及びＳＹＢＲ ｓａｆｅの処理濃度（μg／plａte）とプレート当たり計数された集落数は次のとおりである。

【0245】

【表4】

【0246】

上記表４の結果を察してみると、既存遺伝毒性を示すものと知られていたＥｔＢｒの集落数と比べるとき、化合物６はＳ９代謝活性ＴＡ９８株で集落数が有意的に増加しなかったことを確認することができる。すなわち、化合物６は非遺伝毒性染料としてＥｔＢｒと充分に取り替えることができる。

【0247】

【表5】

【0248】

上記表５の結果を察してみると、現在市販されているＳＹＢＲ ｓａｆｅ染料は、化合物６の処理濃度（８μg／plａte）よりさらに低い濃度（１．６μg／plａte）でも化合物６よりさらに多い集落数が計数された。

【0249】

一般に、電気泳動時のゲルの染色濃度が１ないし３μg／ｍl（３ないし８μg／plａte）である点を考慮すれば、上記濃度範囲内で化合物６はＳＹＢＲ ｓａｆｅより低い遺伝毒性を表す。

【0250】

＜実験例５．qＰＣＲ実験＞
（１）ｑＰＣＲは２Ｘ Ｒeａl−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃellｓａｆｅ）１０μl、各種濃度のＨｅｌａ ｃＤＮＡ、１０pｍol 正方向プライマー１μl、１０pｍol 逆方向プライマー１μl、及び１μlの化合物３８を含む２０μlの反応溶液で行った。ｃＤＮＡ内の断片をプライマー（ＧＡＰＤＨ）を利用して増幅させた。９５℃で５分、９５℃で１０秒、６０℃で２０秒、及び７２℃で１５秒で行われるサイクルを４０回繰り返し、７２℃段階で蛍光を測定した。qＰＣＲ結果は下記表６のとおりである。

【0251】

【表6】

【0252】

ここで、閾値サイクル数（Ｃt）は、一般的に蛍光信号が任意の閾値に達するサイクルの数を意味し、例えば、qＰＣＲ増幅グラフでは、蛍光信号が基準線を越え始める地点でのサイクル数を意味する。

【0253】

蛍光染料として化合物３８を用いてｑＰＣＲを行った場合、増幅効率は９７．４４％で、反応溶液中に化合物３８が含まれているとしてもｑＰＣＲの増幅効率が低下しないことを確認することができる。

【0254】

また、表６を参照すれば、１ｐｇのように、かなり低い濃度のｃＤＮＡサンプルを使用してもＰＣＲの産物が生成される点に照らし、qＰＣＲ反応に対する化合物３８の敏感度が高いことを確認することができる。

【0255】

（２）ｑＰＣＲはＴＯＰｒｅａｌ^TM ｑＰＣＲ ２Ｘ ＰｒｅＭＩＸ（ＴａｇＭａｎ Ｐｒｏｂｅ、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製品）１０μl、各種濃度のＨｅｌａ ｃＤＮＡ、０．５μＭ正方向プライマー１μl、０．５μＭ逆方向プライマー１μl、及びＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（０．４５Ｘ）、または化合物３８（１Ｘ）を含む２０μl反応溶液でＣＦＸ９６を使用して行った。Ｈｅｌａ ｃＤＮＡ内の断片を０．５μＭ正方向プライマー5'-GTATGACAACAGCCTCAAGAT-3'、０．５μＭ逆方向プライマー5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'を利用して増幅させた。９５℃で１０分、９５℃で１０秒、６０℃で１５秒、及び７２℃で１５秒に行われるサイクルを４０回繰り返し、７２℃段階で蛍光を測定した。qＰＣＲは計３回繰り返され、qＰＣＲ結果は図３２、３３及び下記の表７のとおりである。

【0256】

【表7】

【0257】

蛍光染料として化合物３８を使用してｑＰＣＲを行った場合、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉに比べてＣt値が最大０．５程小さいことを確認することができ、ＲＦＵ値は約５倍以上を示すことを確認することができる。

【0258】

（３）ｑＰＣＲは２Ｘ Ｒeａl−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＤＱ３７２、バイオファクト社製品）１０μl、２μlのＨｇＤＮＡ（２５ｎｇ／μl）、プライマー（ＨＳＰ９８）１μl、及び各種濃度（希釈倍数）の蛍光染料（化合物３８、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）、またはＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品））を含む２０μlの反応溶液でＡＢＩ ７５００ ＦＡＳＴを使用して行った。９５℃で１５分、９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、及び７２℃で３０秒に行われるサイクルを４０回繰り返し、７２℃段階で蛍光を測定した。qＰＣＲは計３回繰り返され、qＰＣＲ結果は図３４ないし図３６及び下記表８のとおりである。

【0259】

【表8】

【0260】

蛍光染料として化合物３８を使用してｑＰＣＲを行った場合、同一の希釈倍数のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩまたはＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用した場合に比べてＣt 値が低いことを確認することができる。また、蛍光強度も同一の希釈倍数のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩまたはＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用した場合に比べて約２倍以上高いことを確認することができる。

【0261】

また、表８の結果を通じて、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉの濃度に対して高い濃度の化合物３８をｑＰＣＲ反応の抑制なしに使用できたことを確認することができる。

【0262】

図２０は蛍光染料として化合物３８を使用したｑＰＣＲの溶融曲線を示したグラフで、図２１は蛍光染料としてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを使用したｑＰＣＲの溶融曲線を示したグラフで、図２２は蛍光染料としてＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの溶融曲線を示したグラフである。

【0263】

図２０ないし図２２を参照すれば、化合物３８及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用したｑＰＣＲの場合、単一の特異的ピークを表すが、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを使用したｑＰＣＲの場合、ｅｘｔｒａプライマー−二量体ピークを表すことを確認することができる。

【0264】

（４）ｑＰＣＲは２Ｘ Ｒeａl−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃellｓａｆｅ）１０μl、各種濃度（希釈倍数）の蛍光染料（化合物３６、化合物３８、化合物３９、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）またはＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品））、Ｈｅｌａ ｃＤＮＡ（０．５ｎｇ／μl）４μl及び１μlのプライマー（ＧＡＰＤＨ）セットを含む２０μlの反応溶液でＣＦＸ９６を使用して行った。９５℃で１０分、９５℃で１０秒、及び６０℃で１分で行われるサイクルを４６回繰り返し、６０℃の段階で蛍光測定した。qＰＣＲ結果は図３７ないし図４２及び下記表９のとおりである。

【0265】

【表9】

【0266】

相対的に高濃度（２Ｘ、１Ｘ）の蛍光染料濃度で化合物３８及び化合物３９を使用した場合、同一の希釈倍数のＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用した場合に比べてＣt値が小さいと同時に、蛍光強度も高いことを確認することができる。相対的に低濃度（０．５Ｘ）の蛍光染料濃度では、化合物３６を使用した場合も同一の希釈倍数のＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩまたはＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用した場合に比べてＣt 値が小さいと同時に、蛍光強度も高いことを確認することができる。

【0267】

＜実験例６．熱的安定性実験＞
ＰＣＲ反応時の蛍光染料の安定性を確認するために、１μlの化合物３８と１μlのＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品）をそれぞれ含む２０μlのＰＣＲ反応緩衝液を用意した。それぞれのＰＣＲ反応緩衝液は９５℃に加熱され、９５℃での放置時間につれ変化する吸光度を測定した。

【0268】

下記表１０に記載された吸光度測定結果を察してみると、９５℃での放置時間に沿う吸光度偏差は、化合物３８がＥｖａＧｒｅｅｎ^TMより小さいことを確認することができる。すなわち、化合物３８の高温安定性はＥｖａＧｒｅｅｎ^TMより高い。

【0269】

【表10】

【0270】

＜実験例７．光退色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）実験＞
各種濃度（希釈倍数）の蛍光染料（化合物３８、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）またはＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品））５μlだけを含む２０μlの反応溶液でＲeａl−Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。２５℃で３０秒及び２５℃で３０秒に行われるサイクルを６０回繰り返し、各サイクル（１分）ごとに蛍光強度を測定し、各種濃度（希釈倍数）の蛍光染料に対する光退色を観察した。

【0271】

上述した方法に従って測定した化合物３８の光退色実験結果は図２３ないし図２５、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）の光退色実験結果は図２６ないし図２８、及びＥｖａＧｒｅｅｎ^TM（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製品）の光退色実験結果は図２９ないし図３１に示した。

【0272】

図２６は０．５Ｘ、図２７は０．２５Ｘ、図２８は０．１２５Ｘの希薄倍率でＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉを使用した場合に測定された蛍光強度の変化を示したものであって、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉの場合に低濃度での半減期が５．５時間に過ぎないことを確認することができる。

【0273】

図２３と図２９は１Ｘ、図２４と図３０は０．５Ｘ、図２５と図３１は０．２５Ｘの希薄倍率で化合物３８またはＥｖａＧｒｅｅｎ^TMを使用した場合に測定された蛍光強度の変化を示したものであって、化合物３８を使用した場合、同一濃度のＥｖａＧｒｅｅｎ^TMと類似であるか、又は高い水準の半減期を示すことを確認することができる。

【0274】

以上、本発明の一実施形態について説明したが、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求範囲に記載した本発明の思想から脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除または追加などによって本発明を多様に修正及び変更することができ、これもまた本発明の権利範囲内に含まれると言える。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【手続補正書】

【提出日】2017年8月18日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0001】

本発明は、生体分子にインターカレーティングされることにより、生体分子を標識することができる、新規なメロシアニン系化合物、これを含む生体分子標識用染料、キット及び造影剤組成物に関する。
本研究は、大韓民国通商産業資源部による「高度技術センター（ＡＴＣ）プログラム（１００７６９８８、分子診断のための蛍光体とその応用技術の開発）」からの助成金の支援を受けたものである。