特開 2017-19737 小胞体ストレスによる細胞死抑制剤、小胞体ストレス制御剤、および該制御剤を有効成分とする予防・治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-19737(P2017-19737A)

(43)【公開日】2017年1月26日

(54)【発明の名称】小胞体ストレスによる細胞死抑制剤、小胞体ストレス制御剤、および該制御剤を有効成分とする予防・治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/353 20060101AFI20170105BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170105BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170105BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20170105BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/353

   A61P43/00 105

   A61P25/00

   A61P3/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2015-137590(P2015-137590)

(22)【出願日】2015年7月9日

(71)【出願人】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(72)【発明者】

【氏名】小菅 康弘

(72)【発明者】

【氏名】飯島 洋

(72)【発明者】

【氏名】石内 勘一郎

(72)【発明者】

【氏名】北中 進

(72)【発明者】

【氏名】石毛 久美子

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 芳久

(72)【発明者】

【氏名】蒋 文君

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA08

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZB21

4C086ZC35

4C086ZC41

(57)【要約】      （修正有）

【課題】特定の化合物を有効成分とする小胞体ストレスによる細胞死抑制剤、小胞体ストレス制御剤、および該制御剤を有効成分とする予防・治療剤の提供。
【解決手段】一般式［１］で表される化合物を有効成分とする小胞体ストレスによる細胞死抑制剤。

（ＸはＨ、ヒドロキシ基、無置換／置換のＣ１〜６アルキル基、又は無置換／置換のＣ１〜６アルコキシ基；ｍは０〜４の整数；ｍが２以上のとき、Ｘ同士は各々独立である；ＲはＨ若しくはヒドロキシ基）
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式［１］で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる細胞死抑制剤。

【化1】

（一般式［１］中、Ｘは、ヒドロキシ基、無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルキル基、又は無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルコキシ基を表し、ｍは、０〜４のいずれかの整数を表し、ｍが２以上のとき、Ｘ同士は同一でも異なっていてもよい。Ｒは、水素原子若しくはヒドロキシ基を表す。）

【請求項2】

一般式［１］で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス制御剤。

【化2】

（一般式［１］中、Ｘは、ヒドロキシ基、無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルキル基、又は無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルコキシ基を表し、ｍは、０〜４のいずれかの整数を表し、ｍが２以上のとき、Ｘ同士は同一でも異なっていてもよい。Ｒは、水素原子若しくはヒドロキシ基を表す。）

【請求項3】

請求項２に記載の小胞体ストレス制御剤を有効成分とする神経変性疾患予防・治療剤。

【請求項4】

請求項２に記載の小胞体ストレス制御剤を有効成分とする糖尿病予防・治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、小胞体ストレスによる細胞死抑制剤、小胞体ストレス制御剤、および該制御剤を有効成分とする予防・治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、生体内細胞の小胞体にかかるストレス（以下、「小胞体ストレス」という場合がある。）により、変性タンパク質が蓄積され、細胞死（主に、アポトーシス）を誘導することが知られている。近年、この一連の現象が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脳梗塞、ポリグルタミン病などの神経変性疾患、多発性硬化症などの炎症性神経疾患、躁鬱病などの精神疾患、心筋梗塞、動脈硬化などの虚血性心疾患、糖尿病、糸球体腎炎、腎不全などの腎疾患、癌など、様々な疾患の発症および病態進行に密接に関与していることが明らかとなった。これにより小胞体ストレスを制御することはこれらの疾患を予防若しくは治療するために重要である。

【0003】

例えば、特許文献１には、小胞体ストレスを制御する化合物として、特定構造を有するメトキシカルコン、メトキシフラボノイドおよびフラボン系化合物が開示されている。

【0004】

また、特許文献２には、小胞体ストレスを軽減する化合物として、黒米由来の抽出物であるシアニジン及び該抽出物から誘導されたシアニジン配糖体が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００７−３１４４６８号公報

【特許文献2】特開２０１３−１５１４５９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１に記載されている化合物を製造する方法としては、柑橘類の果皮から抽出する方法、若しくは、抽出された化合物の誘導体を用いる方法が開示されているが、医薬品用途で使用する場合には、純度が低く、また収率も悪い。さらに、化学合成による製造方法も可能であるが、合成が困難である。
また、特許文献２に記載されている化合物についても、製造方法として、黒米から抽出する方法、若しくは、抽出された化合物の誘導体を用いる方法が開示されているが、医薬品用途で使用する場合には、純度が低く、また収率も悪い。さらに、化学合成による製造方法も可能であるが、合成が困難である。

【0007】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、特定の化合物を有効成分とする小胞体ストレスによる細胞死抑制剤、小胞体ストレス制御剤、および該制御剤を有効成分とする予防・治療剤を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、以下のとおりである。
（１）本発明の小胞体ストレスによる細胞死抑制剤は、一般式［１］で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

【0009】

【化1】

【0010】

（一般式［１］中、Ｘは、ヒドロキシ基、無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルキル基、又は無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルコキシ基を表し、ｍは、０〜４のいずれかの整数を表し、ｍが２以上のとき、Ｘ同士は同一でも異なっていてもよい。Ｒは、水素原子若しくはヒドロキシ基を表す。）

【0011】

（２）本発明の小胞体ストレス制御剤は、一般式［１］で表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする。

【0012】

【化2】

【0013】

（一般式［１］中、Ｘは、ヒドロキシ基、無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルキル基、又は無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルコキシ基を表し、ｍは、０〜４のいずれかの整数を表し、ｍが２以上のとき、Ｘ同士は同一でも異なっていてもよい。Ｒは、水素原子若しくはヒドロキシ基を表す。）

【0014】

（３）本発明の予防・治療剤は、（２）に記載の小胞体ストレス制御剤を有効成分とする神経変性疾患予防・治療剤である。
（４）本発明の予防・治療剤は、（２）に記載の小胞体ストレス制御剤を有効成分とする糖尿病予防・治療剤である。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、小胞体ストレスによる細胞死を抑制若しくは制御するための化合物を、簡便に合成することができ、高い工業性を達成することができる。また、本発明によれば、簡便に小胞体ストレスによる細胞死を抑制又は制御することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】試験例１においてＭＴＴ法による細胞生存率の評価結果を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。

【0018】

［小胞体ストレスによる細胞死抑制剤］
一実施形態において、本発明は、一般式［１］で表される化合物を有効成分として含有する小胞体ストレスによる細胞死抑制剤を提供する。

【0019】

【化3】

【0020】

一般式［１］中、Ｘは、ヒドロキシ基、無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルキル基、又は無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルコキシ基を表し、ｍは、０〜４のいずれかの整数を表し、ｍが２以上のとき、Ｘ同士は同一でも異なっていてもよい。Ｒは、水素原子若しくはヒドロキシ基を表す。

【0021】

また、本発明者らにより、本実施形態の一般式［１］で表される化合物（（２Ｒ，３Ｒ）体のみ）が、小胞体ストレスにより誘導される細胞死（主に、アポトーシス）に対して、顕著な効果を発揮することが初めて明らかとなった。

【0022】

本明細書において、「小胞体ストレスによる細胞死抑制」とは、小胞体ストレスにより誘導される細胞死を抑制することを意味する。例えば、一般式［１］で表される化合物を、ＨＴ２２（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）細胞等の細胞と、小胞体ストレス誘導物質としてＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ等の化合物を用いたＭＴＴ法（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ Ａｓｓａｙ）で評価した際に、細胞の生存率が好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であることを意味する。

【0023】

また、「無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルキル基」としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。前記Ｃ１〜６アルキル基の置換基としては、特に限定されないが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子などが挙げられる。
また、「無置換若しくは置換基を有するＣ１〜６アルコキシ基」としては、メトキシ基、エトキシ基、プロトキシ基，ブトキシ基，ペントキシ基，ヘキサトキシ基などが挙げられる。前記Ｃ１〜６アルコキシ基の置換基としては、特に限定されないが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子などが挙げられる。

【0024】

小胞体ストレスによる細胞死の抑制効果が高い観点から、一般式［１］中のＸは、ヒドロキシ基であることが好ましい。また、ｍは、２であることが好ましい。Ｒは、ヒドロキシ基であることが好ましい。

【0025】

一般式［１］で表される化合物の具体例としては、式［１−１］又は［１−２］で表される化合物が挙げられる。

【0026】

【化4】

【0027】

式［１−１］および［１−２］中、Ｘおよびｍは、前記と同様の意味を表す。小胞体ストレスによる細胞死の抑制効果が高い観点から、式［１−１］および［１−２］中のＸは、ヒドロキシ基であることが好ましい。また、ｍは、２であることが好ましい。

【0028】

さらに、式［１−１］および［１−２］で表される化合物の具体例としては、式［１−１−１］又は［１−１−２］で表される化合物が挙げられる。

【0029】

【化5】

【0030】

［小胞体ストレスによる細胞死抑制剤の製造方法］
以下に、前記一般式［１］で表される化合物の製造方法について、詳細に説明する。

【0031】

【化6】

【0032】

一般式［２］で表される化合物を大過剰の水素化ナトリムの存在下に大過剰のクロロメチルメチルエーテル(ＭＯＭＣｌ)で水酸基を保護し、一般式［３］で表される化合物を得る。一般式［２］及び一般式［３］中、Ｘ、ｍは、前記と同様の意味を表す。
ベンスアルデヒド誘導体である一般式［４］で表される化合物の水酸基を同様に炭酸カリウムの存在下にＭＯＭＣｌで保護し、一般式［５］で表される化合物を得る。一般式［４］及び一般式［５］中、Ｒは、前記と同様の意味を表し、Ｒ_１は、水素原子若しくは−ＯＭＯＭ基を表す。
一般式［３］で表される化合物と一般式［５］で表される化合物をＫＯＨの存在下にアルドール縮合させ、一般式［６］で表される化合物を得る。さらに、一般式［６］で表される化合物をアルカリ性の水溶液中において過酸化水素水で酸化し、エポキシドである一般式［７］で表される化合物を得る。一般式［７］で表される化合物を塩酸で処理し、ラセミ混合物である一般式［１’］で表される化合物を得る。
本実施形態の製造方法において、上記で述べた溶媒や塩基に限定されるものではなく、反応の目的に合致する限り、一般的な溶媒や塩基は標準的なものを用いることができる。

【0033】

さらに、一般式［１’］で表される化合物から、（２Ｒ，３Ｒ）体である本実施形態の一般式［１］で表される化合物を精製する方法を説明する。
ラセミ混合物である一般式［１’］で表される化合物をメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー装置に装着した光学活性支持体カラムを用いて精製する。エタノール−ヘキサン（好ましくは、３：７の割合）で展開することで、（２Ｒ，３Ｒ）体と（２Ｓ，３Ｓ）体を分離及び分画することができる。
分離したエナンチオマーについては、エタノール中でナトリウムＤ線による旋光度を測定することで確認することができる。

【0034】

［小胞体ストレス制御剤］
一実施形態において、本発明は、一般式［１］で表される化合物を有効成分として含有する小胞体ストレス制御剤を提供する。

【0035】

【化7】

【0036】

一般式［１］中、Ｘ、ｍ、Ｒは、前記と同様の意味を表す。

【0037】

また、本発明者らにより、本実施形態の一般式［１］で表される化合物（（２Ｒ，３Ｒ）体のみ）が、小胞体ストレスを効果的に制御できることが初めて明らかとなった。

【0038】

本明細書において、「小胞体ストレス制御」とは、小胞体への変性タンパク質の蓄積を抑制する、又は、小胞体ストレスにより誘導される細胞死を抑制することを意味する。一般式［１］で表される化合物による小胞体ストレス制御機構について、詳細は明らかになっていないが、小胞体ストレス関連遺伝子又はタンパク質の発現を制御することであると推察される。

【0039】

小胞体ストレスの制御効果が高い観点から、一般式［１］中のＸは、ヒドロキシ基であることが好ましい。また、ｍは、２であることが好ましい。Ｒは、ヒドロキシ基であることが好ましい。

【0040】

一般式［１］で表される化合物の具体例としては、式［１−１］又は［１−２］で表される化合物が挙げられる。

【0041】

【化8】

【0042】

式［１−１］および［１−２］中、Ｘおよびｍは、前記と同様の意味を表す。小胞体ストレスの制御効果が高い観点から、式［１−１］および［１−２］中のＸは、ヒドロキシ基であることが好ましい。また、ｍは、２であることが好ましい。

【0043】

さらに、式［１−１］および［１−２］で表される化合物の具体例としては、式［１−１−１］又は［１−１−２］で表される化合物が挙げられる。

【0044】

【化9】

【0045】

前記一般式［１］で表される化合物の製造方法は、上述のとおりである。

【0046】

本実施形態の小胞体ストレス制御剤は、他の成分として、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液；アジ化ナトリウム、グリセロール等の添加剤を含んでいてもよい。

【0047】

本実施形態においては、小胞体ストレス制御剤を用いて、小胞体ストレスによって生じる、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脳梗塞、ポリグルタミン病などの神経変性疾患、多発性硬化症などの炎症性神経疾患、躁鬱病などの精神疾患、心筋梗塞、動脈硬化などの虚血性心疾患、糖尿病、糸球体腎炎、腎不全などの腎疾患、癌など、様々な疾患の治療に使用することができる。
治療対象としては限定されず、ヒト又は非ヒト動物を含む哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。

【0048】

本実施形態の小胞体ストレス制御剤の投与量は、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節され、例えばヒトの大人では、通常、１日当たり有効成分として０．５〜５０００ｍｇ、子供では通常０．５〜３０００ｍｇ程度投与することができる。
小胞体ストレス軽減剤の配合比は、剤型によって適宜変更することが可能であるが、被検動物（好ましくはヒト）に対し、経口または粘膜吸収により投与される場合は約０．３〜１５．０ｗｔ％、注射剤等非経口投与による場合は、０．０１〜１０ｗｔ％程度にするとよい。なお、投与量は、上述の通り、種々の条件で異なるので、前記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要のある場合もある。
投与回数としては、１日平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。
投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法が挙げられる。
注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。

【0049】

［神経変性疾患予防・治療剤］
一実施形態において、本発明は、上述の小胞体ストレス制御剤を有効成分とする神経変性疾患予防・治療剤を提供する。

【0050】

本実施形態の神経変性疾患予防・治療剤によれば、小胞体ストレスによって生じる、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脳梗塞、ポリグルタミン病などの神経変性疾患を効果的に予防若しくは治療することができる。

【0051】

本実施形態の神経変性疾患予防・治療剤は、治療的に有効量の小胞体ストレス制御剤、及び薬学的に許容され得る担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の神経変性疾患予防・治療剤を調製することができる。
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、小胞体ストレス制御剤の生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、小胞体ストレス制御剤の移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、特定の臓器、組織、又は細胞へ、小胞体ストレス制御剤を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。

【0052】

本実施形態の神経変性疾患予防・治療剤における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。

【0053】

錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

【0054】

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。

【0055】

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

【0056】

［糖尿病予防・治療剤］
一実施形態において、本発明は、上述の小胞体ストレス制御剤を有効成分とする糖尿病予防・治療剤を提供する。

【0057】

本実施形態の糖尿病予防・治療剤によれば、糖尿病を効果的に予防若しくは治療することができる。

【0058】

本実施形態の糖尿病予防・治療剤は、治療的に有効量の小胞体ストレス制御剤、及び薬学的に許容され得る担体又は希釈剤を含む。担体又は希釈剤については、前記と同様の意味を表す。本実施形態の糖尿病予防・治療剤の経口投与若しくは非経口投与時の形態については、上述のとおりである。

【0059】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0060】

［実施例１］式［１−１−１］で表される化合物の合成
（１）ラセミ混合物の合成
下記は、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（式［８］で表される化合物）及び３−ヒドロキシベンズアルデヒド（式［１０］で表される化合物）からラセミ混合物である式［１−１−１’］で表される化合物を合成する工程を示した反応式である。

【0061】

【化10】

【0062】

まず、無水ジメチルホルムアミドに溶解した２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（式［８］で表される化合物）（５ｇ）に、氷冷下において、水素化ナトリウム（６０％流動パラフィン分散，４．８ｇ，４．５当量）を滴下した。反応液の温度が十分に低下した後、継続して氷冷下において、クロロメチルメチルエーテル（９．７ｇ，４．５当量）を、液温が５℃以下を保つように、少量ずつ加えた。その後、反応液を室温で３０分攪拌した。氷冷した精製水を加え反応を停止し、酢酸エチルで生成物を抽出した。酢酸エチル画分を水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ液を減圧下において濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、無色のオイルとして、２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）アセトフェノン（式［９］で表される化合物）を得た（７．２６ｇ，収率９０％）。

【0063】

次に、氷冷下で、３−ヒドロキシベンズアルデヒド（式［１０］で表される化合物）（１．０ｇ）を無水アセトン２０ｍＬに溶かし、ついで炭酸カリウム（１１．３ｇ，１０当量）を加えた。反応液の温度を５℃以下に保ちながら、クロロメチルメチルエーテル（１．０ｇ，１．５当量）を少量ずつ加えた。ついで反応液を室温で３０分攪拌した。氷冷した精製水を加え反応を停止し、酢酸エチルで生成物を抽出した。酢酸エチル画分を水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ液を減圧下において濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、淡黄色のオイルとして、３−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド（式［１１］で表される化合物）を得た（１．２２ｇ，収率９０％）。

【0064】

２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）アセトフェノン（式［９］で表される化合物）（０．５ｇ）のエタノール溶液２０ｍＬに、水酸化カリウム（０．２８ｇ, ３当量）エタノール溶液を加えた。５分攪拌後に、３−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド（式［１１］で表される化合物）（０．２８ｇ，１当量）を加えた（室温）。室温で３時間反応させた後、氷冷した精製水を加え反応を停止し、酢酸エチルで生成物を抽出した。酢酸エチル画分を水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ液を減圧下において濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、淡黄色のオイルとして、カルコン誘導体 ３−（３−（メトキシメトキシ）フェニル）−１−（２，４，６―トリス（メトキシメトキシ）フェニル）プロプ−２−エン−１−オン（式［１２］で表される化合物）を得た（０．５２ｇ，収率７０％）。

【0065】

３−（３−（メトキシメトキシ）フェニル）−１−（２，４，６―トリス（メトキシメトキシ）フェニル）プロプ−２−エン−１−オン（式［１２］で表される化合物）（０．５ｇ）のメタノール溶液１０ｍＬに３０％過酸化水素水２ｍＬと２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍＬを加え、室温で３時間攪拌した。減圧下で、メタノールを留去したのち、精製水を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を、精製水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下において溶媒を除去し、エポキシド体である（３−（３−（メトキシメトキシ）フェニル）オキシラン−２−イル）（２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）フェニル）メタノン（式［１３］で表される化合物）を無色のオイルとして得た（０．４９ｇ，収率９５％）。

【0066】

（３−（３−（メトキシメトキシ）フェニル）オキシラン−２−イル）（２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）フェニル）メタノン（式［１３］で表される化合物）（０．５ｇ）を、１Ｍ塩酸−無水メタノール１０ｍＬ中で、５５℃２５分攪拌し、減圧下においてメタノールを留去した。精製水を加え、酢酸エチルで抽出した。減圧下において溶媒を蒸去して残った赤黄色のオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、フラバノノール誘導体 である３，５，７−トリヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン（式［１−１−１’で表される化合物］）を白色粉末として得た（０．１５ｇ，収率４８％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：４．６３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−３），５．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−２），５．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−６），６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−８），６．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，３．０Ｈｚ，Ｈ−４’），７．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−６’），７．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−２’)，７．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，８．４Ｈｚ，Ｈ−５’）.^１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：７３．３（３−Ｃ），８４．４（２−Ｃ），９６．２（６−Ｃ），９７．３（８−Ｃ），１０１．６（１０−Ｃ），１１５．８（２’−Ｃ），１１６．６（４’−Ｃ），１２０．０（６’−Ｃ），１３０．３（５’−Ｃ），１３９．８（１’−Ｃ），１５８．３（３’−Ｃ），１６４．１（４−Ｃ），１６５．１（９−Ｃ），１６７．９（７−Ｃ），１９８．０（４−Ｃ）．ＨＲ−ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｓ ２８８．０６３２１［Ｍ］^＋（Ｃａｌｃｄ ２８８．０６３３６ ｆｏｒ Ｃ_１５Ｈ_１２Ｏ_６）．

【0067】

（２）ラセミ混合物から式［１−１−１］で表される化合物の分離精製
ラセミ混合物である式［１−１−１’］で表される化合物（２０ｍｇ）を２００μＬのメタノールに溶解した。高速液体クロマトグラフィー装置（日本分光ＰＵ−１５８０ポンプ、ＵＶ１５７５紫外吸収検出器）に装着した光学活性支持体カラム（（株）ダイセル ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ−ＩＡ，１０ｍｍ×２５０ｍｍ）に２００μＬ中５０μＬを負荷し、エタノール−ヘキサン（３：７）５ｍＬ／分で展開することで、（２Ｒ，３Ｒ）体と（２Ｓ，３Ｓ）体を分離及び分画した。さらに、残りの１５０μＬについて、５０μＬずつ上記操作を３回繰り返した。保時時間は、（２Ｒ，３Ｒ）体が４分２５秒、（２Ｓ，３Ｓ）体が２分４５秒であった。
分離したエナンチオマーについては、エタノール中でナトリウムＤ線による旋光度を測定した。（２Ｒ，３Ｒ）体は［α］^１２_Ｄ＝ ９．４°、（２Ｓ，３Ｓ）体は［α］^１２_Ｄ＝−７．３°であった。

【0068】

［実施例２］式［１−１−２］で表される化合物の合成
（１）ラセミ混合物の合成
下記は、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（式［８］で表される化合物）及び３，５−ジヒドロキシベンズアルデヒドからラセミ混合物である式［１−１−２’］で表される化合物を合成する工程を示した反応式である。

【0069】

【化11】

【0070】

実施例１と同様にして、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（式［８］で表される化合物）から２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）アセトフェノン（式［９］で表される化合物）を得た。
次に、氷冷下で、３，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド（式［１４］で表される化合物）（１．０ｇ）を無水アセトン２０ｍＬに溶かし、ついで炭酸カリウム（２０ｇ，２０当量）を加えた。反応液の温度を５℃以下に保ちながら、クロロメチルメチルエーテル（１．７５ｇ，１．５当量）を少量ずつ加えた。ついで反応液を室温で３０分攪拌した。氷冷した精製水を加え反応を停止し、酢酸エチルで生成物を抽出した。酢酸エチル画分を水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ液を減圧下において、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、淡黄色のオイルとして、３，５−ビス（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド（式［１５］で表される化合物）を得た（１．４７ｇ，収率９０％）。

【0071】

２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（式［８］で表される化合物）（０．５ｇ）のエタノール溶液２０ｍＬに、水酸化カリウム（０．２８ｇ，３当量）エタノール溶液を加えた。５分攪拌後に、３，５−ビス（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド（式［１５］で表される化合物）（０．３８ｇ，１当量）を加えた（室温）。室温で３時間反応させた後、氷冷した精製水を加え反応を停止し、酢酸エチルで生成物を抽出した。酢酸エチル画分を水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ液を減圧下において、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、淡黄色のオイルとして、カルコン誘導体 である３−（３，５−ビス（メトキシメトキシ）フェニル）−１−（２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）フェニル）プロプ−２−エン−１−オン（式［１６］で表される化合物）を得た（０．６８ｇ，収率８０％）。

【0072】

３−（３，５−ビス（メトキシメトキシ）フェニル）−１−（２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）フェニル）プロプ−２−エン−１−オン（式［１６］で表される化合物）（０．５ｇ）のメタノール溶液１０ｍＬに３０％過酸化水素水２ｍＬと２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍＬを加え、室温で３時間攪拌した。減圧下で、メタノールを留去したのち、精製水を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を、精製水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下において溶媒を除去し、エポキシド体 である（３−（３，５−ビス（メトキシメトキシ）フェニル）オキシラン−２−イル）（２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）フェニル）メタノン（式［１７］で表される化合物）を無色のオイルとして得た（０．４９ｇ，収率９５％）。

【0073】

（３−（３，５−ビス（メトキシメトキシ）フェニル）オキシラン−２−イル）（２，４，６−トリス（メトキシメトキシ）フェニル）メタノン（式［１７］で表される化合物）（０．５ｇ）を、１Ｍ塩酸−無水メタノール１０ｍＬ中で、５５℃２５分攪拌し、減圧下においてメタノールを留去した。精製水を加え、酢酸エチルで抽出した。減圧下において溶媒を蒸去して残った赤黄色のオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、フラバノノール誘導体である３，５，７−トリヒドロキシ−２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン（式［１−１−２’］で表される化合物）を白色粉末として得た（０．０９ｇ，収率３２％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：４．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−３），５．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，Ｈ−２），５．９７ （ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈz，Ｈ−６），５．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−８），６．３８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−４’），６．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−２’，Ｈ−６’）．^１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）δ：７３．３（３−Ｃ），８４．６（２−Ｃ），９６．１（６−Ｃ），９７．２（８−Ｃ），１０１．６（１０−Ｃ），１０３．８（４’−Ｃ）， １０７．４（２’，６’−２Ｃ），１４０．４（１’−Ｃ），１５９．４（３’，５’−２Ｃ），１６４．１（５−Ｃ），１６５．１（９−Ｃ），１６８．０（７−Ｃ），１９８．０（４−Ｃ）．ＨＲ−ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｓ ３０４．０５８０４［Ｍ］^＋（Ｃａｌｃｄ ３０４．０５８３０ ｆｏｒ Ｃ_１５Ｈ_１２Ｏ_７）．

【0074】

（２）ラセミ混合物から式［１−１−２］で表される化合物の分離精製
ラセミ混合物である式［１−１−２’］で表される化合物（２０ｍｇ）を２００μＬのメタノールに溶解した。高速液体クロマトグラフィー装置（日本分光ＰＵ−１５８０ポンプ、ＵＶ１５７５紫外吸収検出器）に装着した光学活性支持体カラム（（株）ダイセル ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ−ＩＡ，１０ｍｍ×２５０ｍｍ）に２００μＬ中５０μＬを負荷し、エタノール−ヘキサン（４５：５５）５ｍＬ／分で展開することで、（２Ｒ，３Ｒ）体と（２Ｓ，３Ｓ）体を分離及び分画した。さらに、残りの１５０μＬについて、５０μＬずつ上記操作を３回繰り返した。保時時間は、（２Ｒ，３Ｒ）体は７分２５秒、（２Ｓ，３Ｓ）体は４分２５秒であった。
分離したエナンチオマーについては、エタノール中でナトリウムＤ線による旋光度を測定した。（２Ｒ，３Ｒ）体は［α］^１２_Ｄ＝１０．９°、 （２Ｓ，３Ｓ）体は［α］^１２_Ｄ＝−９．０°であった。

【0075】

［試験例１］ＭＴＴ法による小胞体ストレス制御剤の評価
実施例１および２で合成された化合物、並びに比較例としてシアニジン（Ｗａｋｏ社製）を用いて、以下の通り試験を行った。
ＨＴ２２（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）細胞等の細胞を９６ウェルプレートへ４０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータにて２４時間培養した。培養後、培地を捨てて、新しい培地と共に実施例１および２で合成された化合物、並びに比較例としてシアニジンンを１０，３０，１００μＭずつ各ウェルに添加した。１０分後、小胞体ストレス誘導剤として、５０ｎｇ／ｍＬ Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）を半分のウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータにて２４時間培養した。測定波長５７０ｎｍを測定し、生細胞を計測した。コントロールとして、何も化合物を添加していない細胞と、小胞体ストレス誘導剤のみを添加した細胞とを準備した。何も化合物を添加していない細胞の生存率を１００％として、その他のウェルにおける細胞生存率を計算した。結果を図１に示した。

【0076】

図１から、実施例１及び実施例２で合成された化合物、並びにシアニジンの濃度依存的にＨＴ２２細胞の小胞体ストレスによる細胞死が抑制されていることが明らかとなった。さらに、シアニジンと比較して、実施例１及び実施例２で合成された化合物では、小胞体ストレスによる細胞死の抑制効果が有意に高いことが明らかとなった。

【0077】

以上の結果から、本発明によれば、簡便に小胞体ストレスによる細胞死を抑制・制御することができることが明らかとなった。

【図1】