特開 2017-197471 アトピー性皮膚疾患改善剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-197471(P2017-197471A)

(43)【公開日】2017年11月2日

(54)【発明の名称】アトピー性皮膚疾患改善剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/202 20060101AFI20171006BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20171006BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171006BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20171006BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20171006BHJP

   A61K 31/706 20060101ALI20171006BHJP

   C07H 15/04 20060101ALN20171006BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/202

   A61K9/06

   A61P43/00 111

   A61P17/00

   A61P37/08

   A61P43/00 121

   A61K31/706

   C07H15/04 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-89499(P2016-89499)

(22)【出願日】2016年4月27日

(71)【出願人】

【識別番号】594152675

【氏名又は名称】渡辺 俊之

(71)【出願人】

【識別番号】593229631

【氏名又は名称】内外薬品株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100083301

【弁理士】

【氏名又は名称】草間 攻

(72)【発明者】

【氏名】渡辺 俊之

【テーマコード（参考）】

4C057

4C076

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C057BB02

4C057DD02

4C057JJ03

4C076AA06

4C076BB31

4C076CC18

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA04

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA28

4C086MA63

4C086NA05

4C086ZA89

4C086ZB13

4C086ZC41

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206DA05

4C206DB09

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA48

4C206MA83

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZA89

4C206ZB13

4C206ZC41

(57)【要約】

【課題】 ＤＨＡ／ＥＰＡによるアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善について、分子レベルでの作用機序を解明し、ＦＫ５０６含有軟膏、すなわち、タクロリムス軟膏剤と併用することによる、有効なＤＨＡ／ＥＰＡ含有軟膏剤の効果的な使用方法を提供すること。
【解決手段】 ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤からなる、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生阻害によることを特徴とするアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善外用剤であり、特に、タクロリムス軟膏剤（ＦＫ５０６軟膏剤）とを併用することを特徴とする、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生阻害活性に基づくアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善剤である。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤からなる、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生阻害によることを特徴とするアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善外用剤。

【請求項2】

ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤と、タクロリムス軟膏剤の併用することを特徴とする、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生阻害活性に基づくアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善剤。

【請求項3】

ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤からなる、タクロリムス含有軟膏剤のアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の治療効果の改善・増強剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）による、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生を阻害することによるアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善剤に関する。

【背景技術】

【0002】

アトピー性皮膚疾患（Atopic Dermatitis：以下、「ＡＤ」と記載する場合もある）は、異常免疫反応、並びに皮膚の角質層のバリア崩壊により生ずる疾患であり、ＡＤ患者は、一般的に免疫グロブリンであるＩｇＥの上昇と、ヘルパーＴ細胞であるＴｈ１、Ｔｈ２細胞（ヘルパーＴ細胞の一種）の分化が強まっている。
例えば、ＡＤ患者は、ヘルパーＴ細胞のサブセットであり、サイトカインであるインターロイキン−１７(ＩＬ−１７)の産生能を有する、自己免疫疾患の病態形成に密接に関与するといわれているＴｈ１７細胞数を上昇させ、ＡＤ重症度を引き起こしている。

【0003】

一方、皮膚バリアの崩壊に関しては、表皮の顆粒細胞で産出され、皮膚のバリア機能を担う重要な塩基性蛋白質の一種であるフィラグリン（Filaggrin）の機能の喪失であり、これがアトピー性皮膚疾患の重要な発症因子であるといわれている。
事実、フィラグリン欠乏マウスでは皮膚炎症が生じるものであり、また、Ｔｈ１７細胞の分化を上昇させている。

【0004】

したがって、ＡＤの一般的な治療としては、ＡＤの症状の重症度に応じて、経口抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン剤（ロイコトリエン受容体拮抗薬）並びに、ステロイド剤、免疫抑制剤であるタクロリスム（以下、「ＦＫ５０６」と記す場合もある）軟膏［商品名：プロトピック（登録商標）軟膏］、或いは、非ステロイド性消炎鎮痛剤（非ス剤：NSAID）軟膏（例えば、アンダーム軟膏／有効成分：ブヘキサマック）等の投与が一般的である。
しかしながら、ステロイド剤、或いはＦＫ５０６の長期投与は、重篤な副作用を生じ、特に、小児〜若年層の患者にとっては大きな問題となっている。

【0005】

ところで、サプリメント或いは食物として、α−リノレン酸、エイコサペンタエン酸（以下、「ＥＰＡ」と記す場合もある）、ドコサヘキサエン酸（以下、「ＤＨＡ」と記す場合もある）に代表されるω−３遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の摂取は、炎症性疾患を抑制していることが知られている。これらの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）は、ＩＬ−６並びにプロスタグランジン及びロイコトリエンの産生を抑制することに対応して、炎症症状を抑制するとされている。
すなわち、ロイコトリエンの産生は、Ｔ細胞並びに好中球の活性化を促し、その活性化に伴い皮膚炎症を生じさせている。

【0006】

ロイコトリエンはＩ型アレルギー反応により産生される脂質メディエーターであり、細胞膜リン脂質からのアラキドン酸を材料として、細胞内で５−リポキシゲナーゼによってアラキドン酸から合成され、強力な気管支平滑筋収縮作用を持ち、また繊維芽細胞、気道上皮細胞、平滑筋の増殖にも関与しているといわれている。
リポキシゲナーゼの触媒作用は、アラキドン酸骨格の特定の位置に酸素残基を挿入する際に必要となり、リポキシゲナーゼ経路は、肥満細胞や好酸球、好中球、単球、好塩基球を含む白血球で活発である。これらの細胞が活性化すると、アラキドン酸はホスホリパーゼＡ２によって細胞膜リン脂質から放出され、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）によって５−リポキシゲナーゼが活性化される。５−リポキシゲナーゼの触媒作用により、アラキドン酸にＯ_２が付加して５−モノヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（ＨＰＥＴＥ）が生じ、これが脱水反応を経ることで不安定なエポキシドであるロイコトリエンＡ４（ＬＴＡ４）が生成する。
好中球や単球などのロイコトリエンＡ４加水分解酵素を備えている細胞中では、ロイコトリエンＡ４がロイコトリエンＢ４（ジヒドロキシロイコトリエン、ＬＴＢ４）へと変換され、このＬＴＢ４は、好中球や単球などの原形質膜上に存在するＢＬＴ１とＢＬＴ２受容体を刺激し、これらの細胞を活性化する強力な化学誘発因子である。

【0007】

事実、ロイコトリエンＢ４受容体アンタゴニスト（拮抗薬）であるＯＮＯ−４０５７は、アトピー性皮膚疾患モデルマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスにおける自発的なかゆみ表現を抑制したと報告されている。
かかる事実は、ＡＤの症状の進捗には、ロイコトリエンＢ４（ジヒドロキシロイコトリエン、ＬＴＢ４）が重要な要因であることを示唆しているものである。
本発明者らは、これまでに、ＤＨＡ及びＥＰＡ（以下、併せて、「ＤＨＡ／ＥＰＡ」と記す場合もある。）を含有する軟膏剤のアトピー性皮膚疾患に対する治療薬をしての開発を検討してきており（特許文献１）、この軟膏剤が、アトピー性皮膚疾患の治療に有効であることを見出し、商品化を行ってきた（商品名：ダイヤフラジン軟膏）。

【0008】

今回本発明者らは、当該ＤＨＡ／ＥＰＡを含有する軟膏剤の有効性に関する分子メカニズムを確立するために、ＤＨＡ／ＥＰＡの、アトピー性皮膚炎モデルマウスであるＮＣ／ＮｇａマウスにおけるＡＤ様皮膚炎に対する効果を検討した。

【0009】

その結果、ＤＨＡ／ＥＰＡは、ＦＫ５０６と併用することで、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の産生を抑制することにより、ＡＤ症状を改良することを見出した。これらの検討の結果は、ＡＤに対するＤＨＡ／ＥＰＡの特異的な治療効果を示唆するものであり、ＤＨＡ／ＥＰＡは、従来から使用されてきているＦＫ５０６含有軟膏、すなわち、タクロリムス軟膏剤と併用することにより、ＡＤの治療に際して、極めて有効な軟膏剤であることが判明し、本発明を完成させるに至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特許第３６８９１３７号掲載公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

したがって本発明は、ＤＨＡ／ＥＰＡによるアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善について、分子レベルでの作用機序を解明し、ＦＫ５０６含有軟膏、すなわち、タクロリムス軟膏剤と併用することによる、有効なＤＨＡ／ＥＰＡ含有軟膏剤の効果的な使用方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

すなわち本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤からなる、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生阻害によることを特徴とするアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善外用剤である。

【0013】

また、本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤と、タクロリムス軟膏剤の併用することを特徴とする、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生阻害活性に基づくアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善剤である。

【0014】

したがって、別の態様としての本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤からなる、タクロリムス含有軟膏剤のアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の治療効果の改善・増強剤である。

【発明の効果】

【0015】

本発明により、従来から使用されてきたドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）／エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有軟膏剤が、アレルギー反応を誘発する脂質メディエーターであるロイコトリエンＢ４の産生を抑制し、その結果、アトピー性皮膚疾患用皮膚炎の治療に効果的なものであることが確認された。
特に、ロイコトリエンＢ４の産生抑制は、アトピー性皮膚疾患治療剤であるタクロリムス軟膏（製品名：プロトピック軟膏）と併用することにより強く認められ、タクロリムス軟膏の治療効果をより増強・強化するものであり、ＡＤ疾患に罹患している患者に、治療上の光明を与える点で、極めて特異的なものである。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】試験１における結果を示した図であり、Ａは臨床スコアのデータを、Ｂは皮膚組織切片の顕微鏡写真である。

【図2】試験２におけるＴ細胞、Ｂ細胞、好中球及び好酸球の細胞数の結果を示した図である。

【図3】試験３における、血清免疫グロブリンの結果を示した図である。

【図4】試験３における、サイトカイン分泌の結果を示した図である。

【図5】試験４における結果を示した図である。なお、（ａ）はロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の結果を示した図であり、（ｂ）は臨床スコアの結果を示した図である。

【0017】

なお、図中において、本発明のＤＨＡ／ＥＰＡは、単に「ＤＨＡ」として表記している。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明で用いられるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸は、魚脂その他から得られる天然型グリセリンエステル類を加水分解してグリセリン部分を除去することにより、容易に入手することができる。本発明のドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸としては、その塩の形態であってもよく、例えばナトリウム、あるいはカリウムとの塩を選択することもできる。

【0019】

本発明で用いられるドコサヘキサエン酸又はエイコサペンタエン酸としては、そのエステル体をも意味し、具体的には、グリセリンエステル類及び低級アルキルエステル類を挙げることができる。
このうちグリセリンエステル類は、上記のとおり天然型グリセリンエステル類として天然資源から容易に抽出可能である。一方、低級アルキルエステル類は、ドコサヘキサエン酸又はエイコサペンタエン酸に脂肪族低級アルコールを脱水縮合させて容易に製造することができる。かかる低級アルキルエステル類としては、例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、イソブチルエステル、ｔ−ブチルエステル等を挙げることができ、好ましくはメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステルであり、特に好ましくはエチルエステルである。

【0020】

このようなドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸としては、日油株式会社製の、タラの肝油（ＤＨＡ２０％及びＥＰＡ１０％含有）、或いは、同じ日油株式会社から市販されている「Ｎネオパウダー」シリーズの製品を使用することができ、なかでもタラの肝油（ＤＨＡ２０％及びＥＰＡ１０％含有）を好ましく使用することができる。
また、Ｎネオパウダーシリーズとしては、「ＮネオパウダーＤＨＡ２０」を好ましく使用することができ、この「ＮネオパウダーＤＨＡ２０」は、ＤＡＨ／ＥＰＡを３５ｍｇ／ｇ含有する粉末油脂である。
これらのドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸を使用して、当業者に汎用されている製剤技術により軟膏剤を調製することができる。

【0021】

本発明の外用軟膏剤中のドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸（エステル体を包含する）の含有量は特に制限されるものではないが、これらを単独で用いる場合、その含有量は製剤全重量に対して０．０１〜８０重量％の範囲内であれば良く、０．１〜２０重量％の範囲内であればより好ましく、０．１〜１０重量％であれば特に好ましい。また、これらの中から選択される２種以上の成分を同時に含有させる場合は、これらの化合物の含有量の合計が製剤全重量に対して０．０１〜８０重量％の範囲内であれば良く、０．１〜２０重量％の範囲内であればより好ましく、０．１〜１０重量％であれば特に好ましい。

【0022】

本発明におけるＤＨＡ／ＥＰＡ（タラ肝油ＤＨＡ／ＥＰＡ）含有軟膏は、既に本発明者らにより開発された軟膏剤をそのまま使用することができる。
また、タクロリムス軟膏についても、製品名：プロトピック軟膏として、アトピー性皮膚炎治療剤として臨床的に使用されている軟膏をそのまま使用することができる。

【0023】

本願発明が目的とするアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善としてのアトピー性皮膚炎症の病態には、（ａ）皮膚のリンパ球・好中球などの免疫異常に代表される炎症反応、及び、（ｂ）皮膚（角層）のバリア機能障害、という二つの側面がある。また、最近では、アトピー性皮膚疾患を慢性化、難治化させているものとして（ｃ）リモデリングが挙げられている。

【0024】

上記（ａ）の免疫的な異常としては、Ｔｈ２サイトカイン異常が基盤にあり、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などの産生亢進が関与している。最近、Ｔｈ１７由来のＩＬ−１７ＡがＴｈ２サイトカインに促進的に作用してアトピーの病態に深く関与していることが明らかにされており、このことからアトピー性皮膚炎の最新治療のターゲットとして、ＩＬ−１７Ａ抑制薬の開発が非常に期待されている。
今回のモデルマウスを用いた動物実験においても、ＤＨＡ／ＥＰＡは、ＩＬ−１７Ａの産生を有意に抑制しているものであった。このことは、ＤＨＡ／ＥＰＡがＩＬ−１７Ａ産生抑制剤として有効なものであることを示していることに他ならない。

【0025】

一方、（ｂ）の皮膚（角層）のバリア機能の障害は、アトピー性皮膚炎の発症及び悪化の原因として非常に重要である。皮膚のバリア機能を担う重要なタンパク質がフィラグリンである。前述したＩＬ−１７Ａは、このフィラグリンの産生を抑制することが報告されており、今回のモデルマウスを用いた動物実験においても、ＤＨＡ／ＥＰＡは、ＩＬ−１７Ａの産生を有意に抑制するものであることから、ＤＨＡ／ＥＰＡが皮膚のバリア機能の障害を有意に改善することを示唆するものでもあった。
ところで、フィラグリンの欠乏は、乾燥肌誘引にもつながることから、フィラグリン減少の原因となるＩＬ−１７Ａの産生を抑制する本発明のＤＨＡ／ＥＰＡは、皮膚（角層）の保湿・保護材として有効であることも示唆された。

【0026】

（ｃ）のリモデリングは、（１）炎症による組織障害の再構築と修復過程として、（２）アレルギー炎症の不可逆性、難治化に関与し、（３）過剰なリモデリングが慢性炎症を持続させるという３つの要素から構成されており、組織修復に向かうプロセスというよりは、むしろ、慢性化、難治化に向かう組織反応と考えられ、ＩＬ−１７Ａは、このリモデリングの一因といわれている。
本発明のＤＨＡ／ＥＰＡは、今回のモデルマウス動物実験において、ＩＬ−１７Ａの産生を抑制していることから、上記のリモデリングに対する治療薬となり得ることが期待される。

【0027】

ところで、皮膚疾患の一つとして、乾癬がある。乾癬の症状としては、一般的には、皮膚から少し盛り上がった赤い発疹（紅斑）の上に、銀白色のフケのような鱗屑が付着し、ポロポロとはがれ落ちる皮膚疾患である。
乾癬の皮膚では、炎症を引き起こす細胞（炎症細胞）が集まって活性化しているため１０倍以上の速度で生まれ変わり、生産が過剰な状態になっている。この過剰に生産された表皮の細胞は厚く積み上がり、鱗屑となってはがれ落ちていく経緯をとる。

【0028】

最近に至り、乾癬の発症及び維持の有力な原因としてＴｈ１７細胞から産生されるＩＬ−１７Ａが判明し、このＩＬ−１７Ａの生物活性を中和する目的で、ヒト型抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体である「コセンティクス」（登録商標）が尋常乾癬と関節性乾癬の治療薬として発売されるに至っている。しかしながら、種々の副作用も指摘されており、より安全性の高い乾癬治療薬の開発が望まれている。
本発明のＤＨＡ／ＥＰＡは、モデルマウス動物実験において、ＩＬ−１７Ａの産生を有意に抑制している。このことは、乾癬の発症、維持の直接的な原因物質であるＩＬ−１７Ａの産生を抑制するものであることから、それにより、安全性の高い乾癬治療薬となるものである。

【0029】

以下に、本発明者らが検討した結果の具体的内容の詳細を、実施例に代えて記載していくことにより、本発明を説明していく。

【0030】

［材料及び方法］

【0031】

＜マウス＞
８〜１０週齢のＮＣ／Ｎｇａマウス（チャールズリバー社より購入）を使用した。
なお、マウスは、徳島大学の動物実験管理委員会の許可の下、徳島大学の無菌動物飼育管理室にて使用まで飼育した。

【0032】

＜ＤＨＡ／ＥＰＡ＞
日油株式会社より入手した、タラ肝油（ＤＨＡ２０％及びＥＰＡ１０％含有）を使用した。なお、このものを含有するＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、通常の製剤技術により、油性軟膏基剤を用いて調製した。

【0033】

＜皮膚モデル＞
マウス背部の吻側部の毛を脱毛クリームにより除去した。ついでコナヒョウダニ抽出物（Dermatophagoides farinae）含有軟膏（商品名：Ｂｉｏｓｔａ ＡＤ：アトピー性皮膚炎誘発試薬）を、週２回／３週間塗布し、アトピー性皮膚疾患を誘発させた。最初の塗布時（０日）に皮膚バリアを４％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で破壊し、ＦＫ５０６（０．３ｍｇ）軟膏及び／又はＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏（タラ肝油１００ｍｇ：ＥＰＡ８．３％／ＤＨＡ２４．６％）を、４、８、１２、１６、２０日に塗布した。

【0034】

＜皮膚からの細胞の単離・精製及びフローサイトメトリー＞
皮膚を、２．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩ（Roche社）、３ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼ（Worthington biochemidals社、UAS）および５μｇのＤＮａｓｅ（Roche社）により３７℃にて１２０分間消化させた。細胞破片を除去し、細胞を；
APC-conjugated anti-CD3（アロフィコシアニン抱合ＣＤ３抗体）、
FITC-conjugated anti-B220（フルオレセイン・イソチオシアネート抱合B220抗体：CD45R）、
PE-Cy7-conjugated Gr-1（抗体）
APC-Cy7-conjugated CD11b（抗体）或いは、
PE-conjugated Siglec-F antibody（フィコエリトリン抱合シグレックＦ抗体）、
により染色した。
フローサイトメトリーは、FCAS Canto II（Beckton Dickinson, Mountain View, CA）により行った。

【0035】

＜細胞培養＞
ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、流入領域リンパ節から、anti-B220、anti-CD32/16、anti-CD 11b、及びanti-CD8 mAbsと共に培養し、次いで抗ラットIgG-coated Dynabeads（Dynal Inc.）と共に培養した。
精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、１μg/mLのanti-CD3 mAb の存在下２日間照射脾臓細胞と共に刺激させた。

【0036】

＜ロイコトリエンの測定＞
皮膚（直径２ｃｍ）を単離し、ハサミで裁断し、インドメタシン及びジレウトン（注：モンテルカストナトリウム：ロイコトリエン受容体拮抗薬：気管支喘息治療薬）含有エタノール液に入れ、ホモジナイズした後、４℃にて５分間６００×ｇで遠心分離した。上清を水と混合し、C18 Sep-Pak カートリッジ（Waters, milford, MA, USA）に充填し、メタノールにて平衡化した。カートリッジをヘキサン、ついて水にて洗浄後、脂質をエタノールにて溶出させた。濃縮後、残渣をロイコトリエンＢ４分析キット（Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA）用の酵素免疫測定バッファーに懸濁させた。タンパク濃度を測定し、そして、ロイコトリエンＢ４の量を、タンパク質量から標準化した。

【0037】

＜ＥＬＩＳＡ測定＞
培養上清液中のＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−２２をＥＬＩＳＡキット（R&D systems）により測定した。

【0038】

マウスの血清、或いは標準ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＥ（いずれも、Southern Biotech, AL, USA）をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈し、９６ウェルマイクロプレートにコートし、４℃にて一夜放置した。プレートをPBS/0.1% Tween 20で洗浄後、alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＥ（いずれも、Southern Biotech, AL, USA）を加え、室温にて２時間培養した。プレートをPBS/0.1% Tween 20で洗浄後、alkaline phosphatase活性を、4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate（Sigma-Aldrich, MO, USA）を基質として使用し、測定した。

【0039】

＜皮膚領域の臨床学的スコアリング＞
以下の基準によりスコアリングした。
（１）紅斑／出血 ０（なし）
（２）瘢痕化／乾燥 １（軽度）
（３）浮腫 ２（中程度）
（４）皮剥／腐食 ３（重度）
全スキンスコアを個々のスコアのトータルで示した。

【0040】

＜組織学的所見＞
皮膚を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片を作成した。なお、組織片は、ヘマトキシリン及びエオシンにて染色した。

【0041】

＜統計学的解析＞
Student's t-テストにより行った。
有意差：p<0.05

【0042】

［結果］
以上に記載した材料及び方法に基づく試験結果について、以下に詳細に記載する。

【0043】

試験１：ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、アトピー性皮膚炎様疾患（ＡＤ）を軽減していた。
ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏を用いた、ＮＣ／Ｎｇａマウスにおけるアトピー性皮膚炎様疾患（ＡＤ）の効果を検討した。
コナヒョウダニ抽出物（Dermatophagoides farinae）含有軟膏（バイオスタＡＤ：Biosta AD）を、ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚に塗布することにより、ＡＤを惹起させた。
ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏、ＦＫ５０６軟膏の単独、並びにＤＨＡ／ＥＰＡ及びＦＫ５０６の併用投与を、ＡＤに塗布し、
（ａ）臨床スコア、
（ｂ）最初の誘発後３０日後にＨＥ染色を行い皮膚組織学的検討、
を行った。
結果は、ｎ＝８で行い、平均値±Ｓ．Ｄ．（有意差：p<0.01）で示した。
ＤＨＡ／ＥＰＡ単独では、ＡＤの改善は臨床スコア上並びに組織学的評価では認められなかった。
ＦＫ５０６投与群では、ＡＤを改善し、ＦＫ５０６とＤＨＡ／ＥＰＡの併用は、ＡＤをさらに改良するものであった（その結果を、図１Ａ，１Ｂ示した）。
これらのデータは、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、ＦＫ５０６軟膏と共に使用することにより、ＡＤを抑制する機能があることが判明した。

【0044】

試験２：ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、皮膚において浸潤したＴ細胞を減少させていた。
次いで本発明者らは、薬剤処理後の皮膚における、免疫関係細胞の数を評価した。
初期誘発後２０日後の皮膚について、コラーゲナーゼ及びディスパーゼにより消化し、ＣＤ３、ＩｇＭ、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒｌ或いは、ＳｉｇｌｅｃＦ抗体で染色させ、細胞数をカウントし、Ｔ−細胞（ＣＤ３^＋）、Ｂ細胞（ＩｇＭ^＋Ｂ２２０^＋）、好中球（ＣＤ１１ｂ^＋、Ｃｒｌ^＋）及び好酸球（ＣＤ１１ｂ^＋、ＳｉｇｌｅｃＦ^＋）の数を評価した。
Ｔ細胞（ＣＤ３^＋）、Ｂ細胞（ＩｇＭ^＋、Ｂ２２０^＋）、好中球（ＣＤ１１ｂ^＋、Ｇｒｌ^＋）及び好酸球（ＣＤ１１ｂ^＋、ＳｉｇｌｅｃＦ^＋）数を、全細胞数／皮膚組織（ｇ）として示した。
結果は、ｎ＝８で行い、平均値±Ｓ．Ｄ．（有意差：p<0.01）で示した。
その結果を、図２に示した。

【0045】

その結果より明らかなように、ＦＫ５０６軟膏の単独投与処理群では、いずれの細胞にも有意な変化（減少）はなかった。
これに対して、ＦＫ５０６軟膏とＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏の併用投与群では、Ｔ細胞、好中球並びに好酸球の数が有意に減少していた（図２）。
このことは、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、皮膚におけるＴ細胞、好中球並びに好酸球の浸潤を減少させるものであることを意味するものであった。

【0046】

試験３：ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、血清ＩｇＥを減少させ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＬ−１３及びＩＬ−１７Ａの産生を減少させていた。
次いで、本発明者らは、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏の投与後の血清免疫グロブリンレベルの評価を行った。
すなわち、コナヒョウダニ抽出物（Dermatophagoides farinae）含有軟膏（Biosta AD：アトピー性皮膚炎誘発試薬）を、ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚に塗布することにより、ＡＤを惹起させた。
ＦＫ５０６軟膏の単独投与、並びにＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏及びＦＫ５０６軟膏を併用投与し、３０日後における血清中のＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＭを評価した。
結果は、ｎ＝８で行い、平均値±Ｓ．Ｄ．（有意差：p<0.05）で示した。

【0047】

その結果を図３に示した。
ＩｇＥレベルは、ＤＨＡ／ＥＰＡ及びＦＫ５０６の併用投与群でのみ減少していた。しかしながら、ＤＨＡ／ＥＰＡ及びＦＫ５０６の併用投与群であっても、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ｂレベルは変化なかった。

【0048】

さらに、本発明者らは、ＦＫ５０６、ＦＫ５０６とＤＨＡ／ＥＰＡの併用投与群におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を比較した。
ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、draining lymph node（流入領域リンパ節）で精製し、プレートコートした抗−Ｄｄ３ｍＡｂと２日間刺激させた。
上清液について、ＥＬＩＳＡ法にて、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２及びＩＮＦ−γを測定した。
結果は、ｎ＝８で行い、平均値±Ｓ．Ｄ．（有意差：p<0.01）で示した。

【0049】

その結果を図４に示した。
ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮ−γはバイオスタ（Biosta AD）処理により亢進されていたが、バイオスタ（Biosta AD）処理後においても、ＩＬ−４を検出することはできなかった。
また、ＦＫ５０６及びＤＨＡ／ＥＰＡの併用投与群では、ＩＬ−１３及びＩＬ−１７Ａの産生を減少させているが、ＦＨ５０６の単独投与群では、いずれのサイトカインも減少は生じなかった。
これらの結果は、ＤＨＡ／ＥＰＡの投与は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−１３及びＩＬ−１７Ａの産生を有意に減少させるものであった。
特に、ＩＬ−１７Ａの産生に関しては、ＦＫ５０６単独投与群では減少を認められなかったが、ＦＫ５０６及びＤＨＡ／ＥＰＡの併用投与群においてはＦＫ５０６単独投与群と比べて、有意なＩＬ−１７Ａの産生抑制が認められた。
このことは、本発明のＤＨＡ／ＥＰＡには、顕著なＩＬ−１７Ａ産生抑制作用があることを証明するものであり、乾癬治療に対して有効なものであることを示しているものであった。

【0050】

試験４：ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、ロイコトリエンＢ４を減少させていた
ＤＨＡ／ＥＰＡは、インターロイキン（ＩＬｓ）産生を抑制することが知られている。したがって、本発明者らは、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏投与後の皮膚におけるロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の評価を行った。
すなわち、コナヒョウダニ抽出物（Dermatophagoides farinae）含有軟膏（Biosta AD：アトピー性皮膚炎誘発試薬）を、ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚に塗布することにより、ＡＤを惹起させた。
（ａ）ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏、ＦＫ５０６軟膏の単独投与、並びにＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏及びＦＫ５０６軟膏を併用投与し、２０日後に皮膚を単離し、ＥＬＩＳＡ法にてタンパクに対するロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）を測定し、また、
（ｂ）ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏、ＦＫ５０６軟膏の単独、並びにＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏及びＦＫ５０６軟膏を併用投与し、皮膚の１０カ所にロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）を注射し、臨床スコアを評価した。
試験は、ｎ＝８で行い、結果は、平均値±Ｓ．Ｄ．（p<0.05）で示した。

【0051】

その結果を図５に示した。
図中、（ａ）はロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の結果を示した図であり、（ｂ）は臨床スコアの結果を示した図である。
図中に示した結果からも判明するように、ＦＫ５０６単独投与群では、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の減少は認められなかったが、ＤＨＡ／ＥＰＡ及びＦＫ５０６の併用投与群では、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）レベルは有意に減少しており、ＤＨＡ／ＥＰＡがロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の産生抑制に効果的であることを示唆している。

【0052】

ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の産生抑制が、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏投与により、ＡＤ（アトピー性様皮膚疾患）の抑制に寄与するものであるか否かを評価するため、本発明者らは、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏投与モデルマウスの皮膚へロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）を注射し、臨床スコアを検討したが、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の注射は、ＤＨＡ軟膏治療の効果を相殺するものであり、このことは、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏投与により生じたＡＤの抑制は、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）産生の抑制に起因するものであることを示唆していた。

【0053】

［結果の考察と検討］
生物活性である脂質、例えば、ロイコトリエン（ＬＴｓ）及びプロスタグランジン（ＰＧｓ）、エイコサノイドは、５−リポオキシナーゼ及びシクロオキシナーゼにより、アラキドン酸から生成される。
ロイコトリエン（ＬＴｓ）及びプロスタグランジン（ＰＧｓ）は、皮膚炎症を含む各種炎症を引き起こすメディエーターである。
本発明者らは、既に、ＤＨＡ／ＥＰＡがマウスモデルＡＤで治療効果があることから、ＤＨＡ／ＥＰＡの投与によりＡＤ患者における種々の症状を抑制するものであることを提案してきた。
今回、ＤＡＨ／ＥＰＡ軟膏単独投与では、ＡＤに対しては、病理学的に効果は認められなかったが、ＦＫ５０６軟膏と併用することで、ＡＤモデルに対して高い治療効果を有するものであることが判明した。
さらに、ＤＨＡ／ＥＰＡの効果は、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の産生抑制に起因するものであり、これらのデータは、ＤＨＡ／ＥＰＡ軟膏は、炎症性の主要エイコサノイドの産生を抑制することによりＡＤを有効に抑制するものであることを示唆しているものであった。

【0054】

先の研究では、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の炎症症状の抑制効果は、細胞脂質における遊離脂肪酸（ＦＦＡ）組成物の変化に起因することを示したものである。ＦＦＡは、アラキドン酸に代わって細胞膜中に取り込まれる。
ＦＦＡは、５−リポオキシナーゼ及びシクロオキシナーゼのための弱い基質であることから、ＦＦＡの取り込みは、エイコサノイドメディエーターの産生を抑制する。ＤＨＡ／ＥＰＡ投与によるロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の抑制に関する本発明者らの先の研究は、アラキドン酸に対するＤＨＡ／ＥＰＡの抑制効果を示唆した。

【0055】

他のメカニズムとして、ＤＨＡ／ＥＰＡ、及び他のＦＦＡは、細胞表面でのＧＰＲ１２０を活性化することによる。このＧＰＲ１２０は、ＴＡＫ１のリン酸化を阻害するものであり、ＲＮＡｉによるＴＡＫ１の抑制は、ターゲッティング骨髄性細胞（myeloid cells）によるＴｈ１及びＴｈ１７を抑制する。したがって、ＤＨＡ／ＥＰＡが生体においてＴＡＫ１に効果があるか否かは、ＡＤの病理学的抑制と同調するか否かで重要なことである。

【0056】

ＤＨＡ／ＥＰＡの治療効果を、ＦＫ５０６と併用することで確認した（ＤＨＡ／ＥＰＡ単独ではＡＤの病理学的な効果は無かった）。
この点については、二つの可能性があると思われる。
最初の可能性は、ＤＨＡ／ＥＰＡの単独投与は、ＡＤの抑制効果であるが、ＡＤモデルにおける病理学的な改善は、弱いものである。
第二の可能性は、ＦＫ５０６は、このＡＤモデルにおけるＤＨＡ／ＥＰＡの効果に影響を与えるものであり、ＡＤの病理学的進行に関係する引っ掻き行動を阻害した。ＦＫ５０６は、引掻き行動を抑制するが、ＤＨＡ／ＥＰＡとの併用投与を必要とするものであった。
これに対して、ＤＨＡ／ＥＰＡ単独投与ではＡＤ患者の治療に有効である。
このことは、ＮＣ／Ｎｇａマウスに比較して、ヒトにおいては、引っ掻き行動が少ない点に起因しているものであった。

【0057】

結論的に、本発明により、ＤＨＡ／ＥＰＡによるＡＤ患者の症状を抑制させることに成功した。ＡＤモデルマウスでは、ＤＨＡ／ＥＰＡは、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）産生を阻害することによりＡＤ病変を抑制させていた。しかしながら、ＤＨＡ／ＥＰＡがどのようにロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）を抑制するかＡＤモデルで検討する必要があり、これらのデータは、ＤＨＡ／ＥＰＡがＦＫ５０６と併用することにより、ＡＤ患者に適用することで、ＦＫ５０６の治療効果がより効果的なものであることを示唆するものであった。

【産業上の利用可能性】

【0058】

以上に記載したように、本発明により、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）／エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）による、ジヒドロキシロイコトリエン（ＬＴＢ４）の産生阻害によるアトピー性皮膚炎様皮膚疾患の改善が認められ、特に、アトピー性皮膚疾患治療剤であるタクロリムス軟膏（ＦＫ５０６軟膏：製品名：プロトピック軟膏）と併用することにより、その改善効果は強いものであり、タクロリムス軟膏の治療効果をより増強・強化する点で、ＡＤ疾患に罹患している患者に、治療上の光明を与え、医療上の効果は特異的なものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】