特開 2017-200488 内部標識プライマーを含む核酸の配列決定、増幅および検出のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-200488(P2017-200488A)

(43)【公開日】2017年11月9日

(54)【発明の名称】内部標識プライマーを含む核酸の配列決定、増幅および検出のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20171013BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20171013BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

   C12Q1/68 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2017-132022(P2017-132022)

(22)【出願日】2017年7月5日

(62)【分割の表示】特願2014-508823(P2014-508823)の分割

【原出願日】2012年5月4日

(31)【優先権主張番号】11165142.8

(32)【優先日】2011年5月6日

(33)【優先権主張国】EP

(71)【出願人】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】フランチェスカ ディ パスクアール

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル ミュラー

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するための、内部標識核酸プライマーの使用を含む方法を提供する。
【解決手段】本発明は、核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するための方法を提供し、この方法は：ｉ）少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの核酸プライマーを提供するステップと、ｉｉ）前記少なくとも１つの標識核酸プライマーを用いて、標的核酸を増幅するための酵素および試薬を提供するステップと、ｉｉｉ）標的核酸プライマーの増幅に適する条件下で反応の成分をインキュベートするステップと、ｉｖ）標識ヌクレオチドを介して、増幅された核酸を検出するステップとを含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書中に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物学および化学の分野、特に、分子生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、核酸を配列決定するか、または核酸を増幅および検出するための方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

今日、分子的方法は、診断法において重要な役割を果たし、例えば、法科学の分野または父系試験においても重要な役割を果たしている。これらの方法内では、標的領域の増幅が中心的な手順である。方法はさらに、大半がキャピラリー電気泳動などのゲル電気泳動による、増幅された標的領域の長さの解析を含む。増幅された材料の解析は、蛍光標識の検出を介して実施する。標識は、増幅に用いられる部位特異的プライマーの５’端へと付着する。しかし、増幅された産物を解析するとき、いわゆる「色素ブロブ」という小型で妨害的なアーチファクトピークが出現する結果、高い「バックグラウンドノイズ」を伴うベースラインがもたらされ、これが、方法の感度に干渉する。「色素ブロブ」とは、電気泳動図におけるピークであって、特定の増幅産物ではなく、標識を含む分解産物を表すピークである。色素ブロブを引き起こす分子は、遊離蛍光色素標識のほか、標識へと連結された１〜８ｂｐの長さのオリゴヌクレオチドでもある。後者は、分解されたプライマーまたは分解されたＰＣＲ産物を表しうる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明者らは今や、内部標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、色素ブロブの出現が減衰することを予測外に見出した。したがって、本出願は、核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するための方法を提供し、この方法は、内部標識核酸プライマーの使用を含む。内部標識プライマーを用いることの技法上の効果は、感度がより高い方法の提供である。

【課題を解決するための手段】

【0004】

よって、本発明は、上述の課題を解決し、核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するための方法を提供し、この方法は：
ｉ）少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの核酸プライマーを提供するステップと、
ｉｉ）前記少なくとも１つの標識核酸プライマーを用いて、標的核酸を増幅するための酵素および試薬を提供するステップと、
ｉｉｉ）標的核酸プライマーの増幅に適する条件下で反応の成分をインキュベートするステップと、
ｉｖ）標識ヌクレオチドを介して、増幅された核酸を検出するステップと
を含み、ここで、
核酸プライマーが、以下の配列：
５’−Ｎ_ａＸＮ_ｂ−３’
を含み、式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであることが可能であり、
ａおよびｂは、ヌクレオチドの数を表し、１〜１５０の範囲であることが可能であり、
Ｘは、前記少なくとも１つの標識ヌクレオチドである。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するための方法であって、上記方法は：
ｉ）少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む、少なくとも１つの核酸プライマーを提供するステップと、
ｉｉ）上記少なくとも１つの標識核酸プライマーを用いて、標的核酸を増幅するための酵素および試薬を提供するステップと、
ｉｉｉ）標的核酸プライマーの増幅に適する条件下で反応の成分をインキュベートするステップと、
ｉｖ）上記標識ヌクレオチドを介して、増幅された核酸を検出するステップと
を含み、ここで
上記核酸プライマーは、以下の配列：
５’−Ｎ_ａＸＮ_ｂ−３’
を含み、式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドであることが可能であり、
「ａ」および「ｂ」は、ヌクレオチドの数を表し、１〜１５０の範囲であることが可能であり、
Ｘは、上記少なくとも１つの標識ヌクレオチドである、方法。
（項目２）
ステップｉｖ）が、上記増幅された核酸をそれらの長さに従い分離するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
標識を、上記ヌクレオチドの環外アミノ基または２’−アミノ基を介して上記ヌクレオチドへと連結する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
「ａ」が３〜２５である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
「ｂ」が３〜２５である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記核酸プライマーの長さが１０〜３００ｎｔである、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記標識が、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、および化学発光物質からなる標識の群から選択され、そして５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアニン色素、例えば、ＣＹ３（商標）、ＣＹ５（商標）、ＣＹ３．５（商標）、ＣＹ５．５（商標）、Ｃｙ７（商標）、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ（登録商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ（商標））、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、Ｒｈｏｄａｍｉｎ ６Ｇ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、ウンベリフェロンなどのクマリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８などのベンズイミド；フェナントリジン、例えば、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＰＥＴ（登録商標）、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎ）色素、Ａｔｔｏ３９０、Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ ６４７Ｎ、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ ＲｈｏＧ６、Ａｔｔｏ Ｒｈｏ１１、Ａｔｔｏ Ｒｈｏ１２、Ａｔｔｏ Ｒｈｏ１０１、ＢＭＮ（商標）−５、ＢＭＮ（商標）−６、ＣＥＱ８０００ Ｄ２、ＣＥＱ８０００ Ｄ３、ＣＥＱ８０００ Ｄ４、ＤＹ−４８０ＸＬ、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＤＹ−４９５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５３０、ＤＹ−５４７、ＤＹ−５５０、ＤＹ−５５５、ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５１、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８１、ＤＹ−７００、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７５１、ＤＹ−７７６、ＤＹ−７８０、ＤＹ−７８１、ＤＹ−７８２、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ ＲＥＤ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６３５、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、６−（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジフェニル−３’，６’−ジピバロイルフルオレセイン−６−カルボキサミド）−ヘキシル−１−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト（ＳＩＭＡ）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６３５、Ｑｕａｓａｒ５７０、Ｑｕａｓａｒ６７０、ＬＩＺ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ Ｒｅｄ、ＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）６１０、ＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）６４０、ＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）６７０、およびＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）７０５を含むフルオロフォアの群から選択される、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記増幅の方法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）およびＱβ増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、スマート増幅法（ＳＭＡＰ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、サンガー配列決定からなる群より選択される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するためのキットであって、上記キットは：
少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む核酸プライマー
を含み、ここで、
上記核酸プライマーが、以下の配列：
５’−Ｎ_ａＸＮ_ｂ−３’
を含み、式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであることが可能であり、
ａおよびｂは、ヌクレオチドの数を表し、１〜１５０の範囲であることが可能であり、
Ｘは、上記少なくとも１つの標識ヌクレオチドである、キット。
（項目１０）
核酸を増幅するための酵素および試薬をさらに含む、項目９に記載のキット。
（項目１１）
核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するための方法における、項目９もしくは１０に記載のキットまたは少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む核酸プライマーの使用であって、上記核酸プライマーは、以下の配列：
５’−Ｎ_ａＸＮ_ｂ−３’
を有し、式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドであることが可能であり、
「ａ」および「ｂ」は、ヌクレオチドの数を表し、１〜１５０の範囲であることが可能であり、
Ｘは、上記少なくとも１つの標識ヌクレオチドである、使用。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】図１：内部標識プライマーによるベースラインの改善。０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの各々により、鋳型ＤＮＡを伴わないＰＣＲを実施した。その後、キャピラリー電気泳動により、ＰＣＲプローブを解析した。上方の電気泳動図では、標準的な標識プライマーによる鋳型を伴わない対照（ＮＴＣ）ＰＣＲの結果を示す（Ａ）。内部標識プライマーを用いるＮＴＣ−ＰＣＲの結果をＢに示す。内部標識プライマーは、７０〜５５０ｂｐの範囲で何ら偽陽性シグナルを引き起こさず、ベースラインが完全に平坦である。

【図2】図２：内部色素のカップリング位置の影響。プライマーＥＰＬ１１−Ｙを多様な内部プライマー位置において蛍光標識した（表１を参照されたい）。０．４μＭのプライマー（最終濃度）は伴うが、鋳型ＤＮＡは伴わないＰＣＲ後におけるキャピラリー電気泳動の結果を示す。色素のカップリングをプライマーの中央へと近づけるほど、アーチファクトピークの発生は減少する。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本明細書における「核酸プライマー」とは、増幅に適するオリゴヌクレオチドを意味する。当業者は、増幅に適切とするために、３’端は、ポリメラーゼによる伸長に利用可能とすることを理解するであろう。核酸プライマーは、例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法またはこれらの自動式実施形態など、任意の適切な方法を用いて調製することができる。このような自動式の一実施形態では、ジエチル−ホスホルアミダイトを出発物質として用い、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２巻：１８５９〜１８６２頁（１９８１年）により記載される通りに合成することができる。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４５８，００６号において記載されている。また、生物学的供給源（制限エンドヌクレアーゼ消化物など）から単離されたプライマーを用いることも可能である。核酸プライマーの長さは、変化しうる。長さは、必要に合わせることができる。

【0007】

本発明に従う方法の文脈では、「核酸」とは、特定のクラスの核酸、とりわけ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ＬＮＡ（ロックト核酸）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリア）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｎＲＮＡ（核ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（低分子核小体ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ））、ｓｃａＲＮＡ（低分子カハール体特異的ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ Ｃａｊａｌ Ｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ））、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ウイルスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｓｎＤＮＡ（低分子核ＤＮＡ）など、または試料中のバルク核酸から識別可能な他の任意のクラスまたはサブクラスの核酸を意味する。

【0008】

本発明者らは、内部標識核酸プライマーを使用することによって、色素ブロブを引き起こす断片の低減をもたらすことを見出した。この色素ブロブは、検出前に増幅産物をそれらの長さに従って分離しなければならない場合、特に望ましくない。よって、本発明に従う方法の一実施形態では、ステップｉｖ）が、それらの長さに従い増幅された核酸を、好ましくは、標識ヌクレオチドを介して増幅された核酸を検出する前に分離するステップを含む。当業者は、それらの長さに従い核酸を分離する多数の方法について承知している。一般に用いられる１つの方法は、ゲル電気泳動である。よって、本発明の一実施形態では、増幅された核酸のそれらのサイズに従う分離を、ゲル電気泳動を用いて実施する。ゲル電気泳動とは、ゲルマトリックスへと印加される電界を用いて核酸分子を分離するのに用いられる技法である。「ゲル」という用語は、標的分子を含有し、次いで、これを分離するのに用いられるマトリックスを指す。大半の場合に、ゲルとは、その組成および多孔性が、解析される標的の比重／長さ、および組成に基づき選択される架橋ポリマーである。小さな核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド）を分離する場合、ゲルは通常、異なる濃度のアクリルアミドおよびポリアクリルアミドによる異なるサイズのメッシュネットワークをもたらす架橋剤からなる。アクリルアミドは、例えば、アクリルアミド、直鎖状のポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、またはポリイソプロピルアクリルアミドの群のうちのものでありうる。より大きな核酸（数百塩基を超える）を分離する場合は、精製アガロースをマトリックスとして選択することができる。いずれの場合にも、ゲルは固体ではあるが、多孔性マトリックスを形成する。アガロースは、高分子および高分子複合体の分離を可能とする大きな孔（ｐｏｒｅ）を有するゲルを結果としてもたらす、架橋を伴わない非荷電炭水化物の長い非分枝状鎖からなる。よって、本発明の一実施形態では、核酸の分離に用いられるマトリックスは、ポリアクリルアミドまたはアガロースである。

【0009】

ゲル電気泳動は、法医学、分子生物学、遺伝学、微生物学、および生化学で用いられる。結果は、例えば、レーザーによって標識の蛍光を励起させる光源を通常含むイメージングデバイスを用いてゲル内の標識核酸を視覚化することにより、定量的に解析することができる。標識に由来するシグナルを検出デバイスで記録し、バンドまたはスポットの強度を測定する。測定および解析は大部分、検出されたシグナルを、核酸の長さおよび検出された核酸の量に従い電気泳動図へと変換する専門的なソフトウェアにより行う。本発明の好ましい実施形態では、増幅された核酸の分離を、キャピラリーゲル電気泳動により実施する。

【0010】

さらに、当業者には、内部位置においてオリゴヌクレオチドを標識する方法も公知である。１つの可能性は、標識の、核酸塩基、例えば、核酸塩基の環外アミノ基（本明細書ではまた、アミン基とも称する）への付着であり、別の可能性は、標識の、糖の２’−炭素への付着である。

【0011】

「環外」とは、環状化学構造の環の外側に位置する基を指し、例えば、環の置換基の部分は、環に対して環外にある。本明細書で用いられる環外アミンとは、複素環式塩基の環の置換基であるアミン基を指し、アミン基の窒素が環構造の環員へと直接付着される実施形態を包含し、また、アミン基の窒素が介在基を介して複素環式塩基の環構造へと連結されうる実施形態も包含する。

【0012】

さらに、例えば、アミン基を糖の２’−炭素へと直接付着するか、アミン基の窒素を、介在基を介して糖の２’−炭素へと連結することもできるなど、標識を２’−修飾ヌクレオチドへと連結することも可能である。

【0013】

本発明の一実施形態では、標識を、環外アミン基または標識ヌクレオチド（Ｘ）の修飾２’位を介して前記標識ヌクレオチド（Ｘ）へと連結する。好ましい実施形態では、標識を、標識ヌクレオチド（Ｘ）の環外アミノ基へと連結する。好ましい実施形態では、標識を、チミンの環外アミン基へと連結する。

【0014】

当業者には、オリゴヌクレオチドを標識する可能性が公知であり、アミノ−修飾剤−Ｃ６’−ｄＴ ＣＥＰ（また、５−［Ｅ−２−［Ｎ−［６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキシル］カルボキサミド］ビニル］としても公知である５−［Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）−３−アクリルイミド］など）、アミノ−修飾剤−Ｃ２−ｄＴ ＣＥＰ、５−アミノアリル−ｄＵ ＣＥＰ、アミノ−修飾剤−Ｃ６−ｄＡ ＣＥＰ、アミノ−修飾剤−Ｃ６−ｄＧ ＣＥＰ（３’−Ｏ−［（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−Ｎ８−［６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル］−２’−デオキシグアノシンなど）、アミノ−修飾剤−１５−ｄＴ ＣＥＰ（３’−Ｏ−［（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［Ｅ−２’−［Ｎ−［１５−（トリフルオロアセトアミド）−７−アザ−１０，１３−ジオキサ−８−オキソペンタデシル］カルボキサミド］ビニル］−２’−デオキシウリジンなど）、２’−Ｏ−アミノリンカー−Ｕ ＣＥＰ（３’−Ｏ−［（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−２−［２−（トリフルオロアセトアミド）エトキシ］エチルウリジンなど）、および２’−アミノ−Ｄ−ウリジンが含まれるがこれらに限定されない。

【0015】

核酸プライマー内の標識ヌクレオチド（Ｘ）の位置は、変化しうる。しかし、本発明者らは、内部標識された核酸プライマーが電気泳動図における色素ブロブの出現を減衰させることを見出したので、本発明に従う核酸プライマーを内部標識する、すなわち、標識ヌクレオチドは、核酸プライマーの５’位または３’位におけるヌクレオチドではない。よって、本発明に従う核酸プライマーでは、「ａ」および「ｂ」が少なくとも１である。「ａ」および「ｂ」の値は、標識ヌクレオチドの内部位置および核酸プライマーの全長に依存している。好ましい実施形態では、「ａ」および／または「ｂ」が、１〜１５０、好ましくは、２〜５０、なおより好ましくは、３〜２５、さらにより好ましくは、４〜１７である。さらなる実施形態では、「ａ」が、１〜１５０、好ましくは、２〜５０、なおより好ましくは、３〜２５、さらにより好ましくは、４〜１７である。さらなる実施形態では、「ｂ」が、１〜１５０、好ましくは、２〜５０、なおより好ましくは、３〜２５、さらにより好ましくは、４〜１７である。本発明者らは、標識ヌクレオチドがプライマーの中央位置に多いほど、色素ブロブの減衰効果が増強されることを予測外に見出した。よって、一実施形態では、「ａ」および「ｂ」が、１５以下だけ、好ましくは、１０以下だけ、より好ましくは、５以下だけ異なる。さらに好ましい実施形態では、「ａ」および「ｂ」が同じ値を有する。本発明者らは、「ａ」および「ｂ」が１０のときに、色素ブロブの減衰に関する最大の効果が達せられることを見出した。よって、本発明の一実施形態では、「ａ」および「ｂ」が１０である。しかし、当業者は、プライマーの長さおよび配列に依存する標識の正確な位置を変化させることができる。当業者は、ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド（Ｎ）は、必ずしも分子全体にわたり同じでなくともよいこと、例えば、「ａ」または「ｂ」が５であるとき、これは、結果として得られる配列ＮＮＮＮＮＸＮＮＮＮＮにおいて、全ての「Ｎ」が同じヌクレオチドであることを意味しないことを理解するであろう。さらに、当業者は、増幅される標的核酸に従い、核酸プライマーのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを選択するであろう、すなわち、当業者は、標的核酸の一部と相補的な配列を選択するであろう。

【0016】

核酸プライマーの長さは、必要に従って、また所望の特異性に応じて適合させることができ、例えば、長いプライマーほど高度の特異性を有する。本発明の好ましい実施形態では、核酸プライマーの全長が約３〜３００ｎｔであり、より好ましくは、約５〜１００ｎｔ、なおより好ましくは、約６〜５０ｎｔである。さらにまた好ましい実施形態では、核酸プライマーの全長が１５〜３４ｎｔである。

【0017】

本発明に従う方法によって達成される技術上の効果は、非常に多様な標識にわたって観察され得る。よって、それは、原則として、核酸を標識するのに適した任意の標識を用いて実行され得る。しかし、本発明の一実施形態では、標識が、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、化学発光物質、および酵素からなる標識の群より選択される。好ましい実施形態では、標識が、好ましくは、５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアニン色素、例えば、ＣＹ３（商標）、ＣＹ５（商標）、ＣＹ３．５（商標）、ＣＹ５．５（商標）、Ｃｙ７（商標）、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−１，４−ジクロロ−２’，７’−ジクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ（登録商標））、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ｄｉｍｅｔｈｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（ＪＯＥ（商標））、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、Ｒｈｏｄａｍｉｎ ６Ｇ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、ウンベリフェロンなどのクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８などのベンズイミド；フェナントリジン、例えば、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＰＥＴ（登録商標）、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎ）色素、Ａｔｔｏ ３９０、Ａｔｔｏ ４２５、Ａｔｔｏ ４６５、Ａｔｔｏ ４８８、Ａｔｔｏ ４９５、Ａｔｔｏ ５２０、Ａｔｔｏ ５３２、Ａｔｔｏ ５５０、Ａｔｔｏ ５６５、Ａｔｔｏ ５９０、Ａｔｔｏ ５９４、Ａｔｔｏ ６２０、Ａｔｔｏ ６３３、Ａｔｔｏ ６４７Ｎ、Ａｔｔｏ ６５５、Ａｔｔｏ ＲｈｏＧ６、Ａｔｔｏ Ｒｈｏ１１、Ａｔｔｏ Ｒｈｏ１２、Ａｔｔｏ Ｒｈｏ１０１、ＢＭＮ（商標）−５、ＢＭＮ（商標）−６、ＣＥＱ８０００ Ｄ２、ＣＥＱ８０００ Ｄ３、ＣＥＱ８０００ Ｄ４、ＤＹ−４８０ＸＬ、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＤＹ−４９５、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＤＹ−５３０、ＤＹ−５４７、ＤＹ−５５０、ＤＹ−５５５、ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５１、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８１、ＤＹ−７００、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７５１、ＤＹ−７７６、ＤＹ−７８０、ＤＹ−７８１、ＤＹ−７８２、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ ＲＥＤ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、６−（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジフェニル−３’，６’−ジピバロイルフルオレセイン−６−カルボキサミド）−ヘキシル−１−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト（ＳＩＭＡ）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｇｏｌｄ ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｑｕａｓａｒ ６７０、ＬＩＺ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ Ｒｅｄ、ＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）６１０、ＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）６４０、ＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）６７０、およびＬＣ Ｒｅｄ（登録商標）７０５を含むフルオロフォアの群より選択されるフルオロフォアである。さらに好ましい本発明の実施形態では、標識が、Ａｔｔｏ ４６５、ＤＹ−４８５ＸＬ、ＦＡＭ（商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＤＹ−４９５、Ａｔｔｏ ４９５、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＪＯＥ、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０、ＤＹ−５２１ＸＬ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ ６Ｇ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、Ａｔｔｏ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＨＥＸ、ＳＩＭＡ、Ａｔｔｏ ＲｈｏＧ６、ＶＩＣ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０、ＤＹ−５３０、ＴＡＭＲＡ（商標）、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｃｙ３（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＤＹ−５５０、Ａｔｔｏ ５５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＰＥＴ（登録商標）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ ＲＥＤ ５９０、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５、Ａｔｔｏ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３１、ＬＩＺ、Ｑｕａｓａｒ ６７０、ＤＹ−６３５、およびＣｙ５（商標）からなるフルオロフォアの群より選択される。さらにまた好ましい実施形態では、標識が、ＦＡＭ（商標）、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−５３０、およびＡｔｔｏ ５５０からなるフルオロフォアの群より選択される。

【0018】

一実施形態では、本発明に従う核酸プライマーが、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、本明細書の上記で概括した標識を含むヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脱塩基部位、および消光剤からなる群より選択される標識ヌクレオチドであるヌクレオチドを包含する。当業者は、必要に従い、適切なヌクレオチドを、包括的な数の異なるヌクレオチドの種類から選択することが可能である。好ましい実施形態では、各Ｎが独立して、チミジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、およびイノシンからなる群より選択される。また、例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、キサントシン（ｘａｎｔｈｉｎｏｓｉｎｅ）、７−メチルグアノシン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、５−メチルシチジンであるヌクレオチド塩基も包含される。よって、一実施形態では、１またはそれより多い「Ｎ」が、修飾ヌクレオチドである。

【0019】

本明細書における「修飾ヌクレオチド」とは、非天然ヌクレオチドを指す。当業者には「修飾ヌクレオチド」が公知である。しかし、本発明の一実施形態では、修飾ヌクレオチドが、ロックト核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、本明細書の上記で概括した標識ヌクレオチド、消光剤へと連結されたヌクレオチド、および脱塩基部位からなる群より選択される。

【0020】

消光とは、所与の物質の蛍光強度を減少させる任意の過程を指す。本発明の文脈における「消光剤」は、例えば、活性化を伴わない標識の基本的な蛍光を消光させるのに適する残基に関する。励起状態の反応物による消光、エネルギー移動による消光、複合体形成による消光、および衝突による消光など、多様な過程が、消光を結果としてもたらしうる。結果として、消光は、圧力および温度に大きく依存することが多い。酸素分子およびヨウ化物イオンは、一般的な化学消光剤である。消光は、レーザー誘起蛍光など、非即時的分光光度法の問題を提起する。消光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの基盤である。特定の分子生物学的標的との相互作用時における消光および脱消光は、分子イメージング用の活性化可能な光学造影剤の基盤である。エネルギーを２つの色素であるドナーとアクセプターとの間で非放射的に（光子の吸収または放射を伴わずに）移動させうる異なる機構がいくつか存在する：フェルスター共鳴エネルギー移動、デクスターエネルギー移動、エキシプレックス（励起状態錯体）の形成、および静的消光（また、接触消光とも称する）。当業者は、必要に従い消光剤を選択することができる。

【0021】

本発明の文脈における「脱塩基部位」（また、ＡＰ部位（脱プリン／脱ピリミジン部位）としても公知である）は、プリン塩基もピリミジン塩基も有さない核酸／オリゴヌクレオチド内の位置である。脱塩基部位については、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」（ＵＳ−Ｂ１ ６，３６１，９４０）のほか、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ＤＮＡ Ｔａｒｇｅｔ」（ＵＳ−Ｂ１ ６，５７９，６８０）および２００３年７月４日にウェブ上で公開された「Ｕｓｅ ｏｆ Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｔｒａｎｄｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｗａｔｅｒ」、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、ＪＡＣＳ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓにおいて言及されている。

【0022】

当業者は、本発明に従う核酸プライマーが、異なる種類の核酸または修飾核酸からなることをさらに認識するであろう。よって、好ましい実施形態では、核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはＬＮＡからなる。

【0023】

本発明者らは、標識を、リンカーにより核酸プライマー内のヌクレオチドへと付着すると、本発明に従う方法の技法上の効果をさらに増強しうることを予測外に見出した。よって、一実施形態では、標識を、リンカーを介してヌクレオチドへと付着する。適切なリンカーは、先行技術から公知のスペーサーを含みうる。標識と本発明に従うヌクレオチドとの間では、例えば、Ｃ_５リンカーまたはＣ_６リンカーなど、例えば、２〜１８個の炭素原子を含むリンカーを用いることができる。スペーサーは、分枝状アミノリンカーまたは非分枝状アミノリンカーであることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、スペーサーが、Ｃ_２〜Ｃ_１８リンカーまたはＣ_２〜Ｃ_１８アミノリンカーの群から選択され、好ましくは、スペーサーが、Ｃ_３〜Ｃ_１２リンカーまたはＣ_３〜Ｃ_１２アミノリンカーの群に由来する。リンカーまたはアミノリンカーは、直鎖状のアルキルであることが好ましい。極めて特殊な実施形態では、スペーサーが、Ｃ_５スペーサーまたはＣ_６スペーサーである。アミノリンカーを用いて、一級アミノ基を、オリゴヌクレオチドの５’端、３’端、環外アミノ基、または修飾２’位へと組み込むことができる。活性アミノ基は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態にある標識化剤を用いて、オリゴヌクレオチドを標識するのに用いることができる。

【0024】

本発明の方法は、核酸の増幅を含む。増幅は、公知の多様な増幅法により実施することができる。よって、本発明の一実施形態では、増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅（Ｗａｌｋｅｒら、「Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−−ａｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ， ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻（７号）：１６９１〜６頁（１９９２年）における等温増幅など）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、「Ａ Ｌｉｇａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：１０７７〜１０８０頁、１９８８年、またはＷｉｅｄｍａｎｎら、「Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＬＣＲ）−−Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ、１９９４年）、Ｓ５１〜Ｓ６４頁）におけるリガーゼ連鎖反応など）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ；Ｋｉｅｖｉｔｓら（１９９１年）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３５巻：２７３〜２８６頁）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；Ｌｉｕら、「Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｓｍａｌｌ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１８巻：１５８７〜１５９４頁（１９９６年）におけるローリングサークル増幅など）、転写媒介増幅（ＴＭＡ；Ｖｕｏｒｉｎｅｎら（１９９５年）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３３巻：１８５６〜１８５９頁）、自己持続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、Ｑβ増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら（１９９２年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２０巻（７号）：１６９１〜６頁）、多重置換増幅（ＭＤＡ）（Ｄｅａｎら（２００２年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻（８号）：５２６１〜５２６６頁）、制限支援ＲＣＡ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｉｄｅｄ ＲＣＡ）（Ｗａｎｇら（２００４年）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１４巻：２３５７〜２３６６頁）、単一プライマーによる等温増幅（ＳＰＩＡ；Ｄａｆｆｏｒｎら（２００４年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３７巻（５号）：８５４〜７頁）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ；Ｎｏｔｏｍｉら（２０００年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２８巻（１２号）：ｅ６３）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、熱安定性のＨＤＡ（ｔＨＤＡ）（Ａｎら（２００５年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８０巻（３２号）：２８９５２〜２８９５８頁）、スマート増幅法（ｓｍａｒｔ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳＭＡＰ；Ｍｉｔａｎｉら（２００７年）、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、４巻（３号）：２５７〜６２頁））、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、サンガー配列決定からなる群より選択される方法により実施する。

【0025】

本発明は、核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するためのキットにさらに関し、このキットは：
少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含む核酸プライマー
を含み、ここで、
この核酸プライマーは、以下の配列：
５’−Ｎ_ａＸＮ_ｂ−３’
を含み、式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであることが可能であり、
ａおよびｂは、ヌクレオチドの数を表し、１〜１５０の範囲であることが可能であり、そして
Ｘは、前記少なくとも１つの標識ヌクレオチドである。

【0026】

本発明に従う方法について上記で概括された核酸プライマーの実施形態はまた、本発明に従うキットの核酸プライマーにも適用される。

【0027】

上記で概括された通り、増幅法は、異なる方法から選択することができる。鋳型核酸および増幅法に応じて、本発明に従うキットには異なる酵素または試薬を組み込むことができる。さらなる実施形態では、キットはまた、核酸プライマーに加えて、緩衝液、ｄＮＴＰおよび／もしくはＮＴＰ、ならびに／または酵素も含む。

【0028】

本発明の一実施形態では、キットが、ポリメラーゼをさらに含む。ポリメラーゼは、キット内の別個の反応薬剤として存在させることもでき、組み合わせたアッセイミックス中、例えば、マスターミックス中で他のキット成分と併せてあらかじめ混合することもできる。ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、「熱安定性」であり、これは一般に、ＤＮＡ鎖の変性に用いられる高温で安定であることを意味する。より具体的には、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲにおいて用いられる高温で実質的に不活化されない。このような温度は、ｐＨ、塩濃度、および当技術分野で公知の他の条件を含めた多数の反応条件に応じて変化する。本発明の文脈では、好ましい実施形態は、５’−３’エクソヌクレアーゼ活性を保有しうる熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、または５’−３’エクソヌクレアーゼ活性が低下しているかもしくはこれを有さない熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを伴う。別の実施形態では、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エクソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性も加えて保有しうる。当技術分野では、多数の熱安定性のＤＮＡポリメラーゼが報告されている。特に、有用なポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなど、多様なＴｈｅｒｍｕｓ属細菌種から得られるポリメラーゼである。他の有用な熱安定性のポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属種、およびＷＯ−Ａ−８９／０６６９１（１９８９年７月２７日に公開）において記載される微生物供給源を含めた他の多様な微生物供給源から得られる。このようなポリメラーゼには、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐａｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ．（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ（Ｔｅｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ．ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属種ＫＤＤ２（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｅａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、ならびに室温では不活性であるが、高温におけるインキュベーションにより完全な活性が迅速に再獲得されうるホットスタート用ポリメラーゼを含めた、これらの変異体、改変体、および派生物が含まれるがこれらに限定されない。

【0029】

本明細書で用いられる「ｄＮＴＰ」という用語は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を指す。このようなｄＮＴＰの非限定的な例は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰであり、これらはまた、例えば、蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識を含む標識誘導体の形態でも存在しうる。また、修飾ヌクレオチド塩基を伴うｄＮＴＰであって、ヌクレオチド塩基が、例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、イノシン、キサントシン、７−メチルグアノシン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、５−メチルシチジンであるｄＮＴＰも包含される。本発明にはさらに、上記分子のｄｄＮＴＰも包含される。

【0030】

本明細書で用いられる「ＮＴＰ」という用語は、リボヌクレオシド三リン酸を指す。このようなＮＴＰの非限定的な例は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰであり、これらはまた、例えば、蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識を含む標識誘導体の形態でも存在しうる。

【0031】

本発明はまた、本発明に従うキットまたは核酸プライマーの、核酸を配列決定するかまたは核酸を増幅し、そして検出するための方法における使用にも関する。本明細書に記載された核酸プライマーの実施形態はまた、用いられる核酸プライマーの実施形態にも適用される。

【実施例】

【0032】

（実施例１）
これらの例におけるＰＣＲは、以下の通りに実行した：
０．２μｌのＭｕｌｔｉ Ｔａｑ２ ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ホットスタート用ＤＮＡポリメラーゼとして用いた。２．５μｌのＲｅａｃｔｉｏｎ ＭｉｘＢ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＣＲ緩衝液として用いた。全てＢｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ（Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製である、０．４μＭの未標識Ｄ１６＿ｒｅｖリバースプライマー（５’−ｇｔｔｔｇｔｇｔｇｔｇｃａｔｃｔｇｔａａｇｃａｔｇｔａｔｃ−３’；配列番号３）と組み合わせた、０．４μＭの内部標識フォワードプライマーであるＤ１６−Ｐ−ｉｎｔｅｒｎ（５’−ｇｇｇｇｇｔｃｔａａｇａｇｃＸｔｇｔａａａａａｇ−３’；配列番号１；配列中、Ｘは、チミジンヌクレオチドの環外アミノ基へと連結されたＡＴＴＯ５５０を表す）または０．４μＭの標識フォワードプライマーであるＤ１６−Ｐ−ＡＴＴＯ５５０（５’−ＡＴＴＯ５５０−ｇｇｇｇｇｔｃｔａａｇａｇｃｔｔｇｔａａａａａｇ−３’；配列番号２）を、ＰＣＲの実行に用いた。

【0033】

【表1】

【0034】

ヌクレアーゼ不含水（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、容積２５μｌにした。

【0035】

ＰＣＲは、以下のプロトコールにより、サーモサイクラー９７００ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実行した。

【0036】

【表2】

【0037】

１μｌのサイクリングされた（ｃｙｃｌｅｄ）ＰＣＲプローブを、１２μｌのＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）および０．５μｌのＤＮＡサイズ標準５５０（ＢＴＯ）（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へと添加し、９５℃で３分間にわたりインキュベートした。

【0038】

変性させたＰＣＲプローブを、標準的な条件下で３５００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いるキャピラリー電気泳動により解析した。

【0039】

図１に示される結果は、内部標識プライマーの使用が、通常のバックグラウンドノイズの望ましくないアーチファクトピークの低減を結果としてもたらすことを明確に裏付ける。７０〜５５０ｂｐの範囲におけるベースラインは、完全にノイズがない、すなわち、いかなるバックグラウンドピークも色素ブロブも伴わない。これに対し、５’端で標識された標準的なＰＣＲプライマーは、最大５００相対蛍光単位（ｒｆｕ）の、多数のアーチファクトピークを引き起こす。最小量の鋳型ＤＮＡによるＰＣＲ増幅は、約２００ｒｆｕのピークを与えるＰＣＲ産物を典型的に結果としてもたらす。標準的な標識プライマーを用いると、電気泳動図の解釈は、多数の高いアーチファクトピーク（色素ブロブ）により損なわれる結果、プローブの評価が不完全となる。内部標識プライマーを用いると、色素ブロブが目視できないので、２００ｒｆｕのＰＣＲ産物を明確に識別し、割り当てることができる。これらの改善は、方法の感度において極めて大きな利点をもたらす。

【0040】

（実施例２）
任意の内部塩基において標識されたプライマーを用いると、バックグラウンドノイズの大幅な低減が明らかである。しかし、さらなる実験では、プライマー内の内部標識の位置を選択することにより、効果をさらに増強しうることが示される。

【0041】

プライマーを、ＥＰＬ−１１−Ｙの配列（配列番号４〜９；表１を参照されたい）の異なる塩基対位置において標識する。解析は、リバースプライマーとしてのプライマーＥＰＬ１１／２（５’−ｇａａｃａａｃｔｃｔｇｇｔｔｇｔａｔｔｇｔｃｔｔｃ−３’；配列番号１０）および以下のサイクリング条件を用いて、実施例１で記載した通りに実施する。

【0042】

【表3】

【0043】

図２に示される結果は、プライマーの中央位置に近い標識の内部位置を選択することにより、ベースライン平滑化効果をさらに増強しうることを裏付ける。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【外国語明細書】

2017200488000001.pdf