特開2017-218408(P2017-218408A)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2022.1.31 β版

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2017-218408(P2017-218408A)
(43)【公開日】2017年12月14日
(54)【発明の名称】結合体
(51)【国際特許分類】
   A61K 47/50 20170101AFI20171117BHJP
   C12N 15/113 20100101ALI20171117BHJP
   A61K 45/00 20060101ALI20171117BHJP
   A61K 47/34 20170101ALI20171117BHJP
   A61K 31/7088 20060101ALI20171117BHJP
   A61K 9/08 20060101ALI20171117BHJP
【FI】
   A61K47/48
   C12N15/00 GZNA
   A61K45/00
   A61K47/34
   A61K31/7088
   A61K9/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】OL
【全頁数】17
(21)【出願番号】特願2016-113664(P2016-113664)
(22)【出願日】2016年6月7日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】(出願人による申告)平成28年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的バイオ医薬品創出基盤技術開発事業、「高分子ナノテクノロジーを基盤とした革新的核酸医薬シーズ送達システムの創出」、産業技術力強化法第19条の適用を受ける出願
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(74)【代理人】
【識別番号】100152146
【弁理士】
【氏名又は名称】伏見 俊介
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(72)【発明者】
【氏名】西山 伸宏
(72)【発明者】
【氏名】武元 宏泰
(72)【発明者】
【氏名】フアン チーハオ
(72)【発明者】
【氏名】野本 貴大
(72)【発明者】
【氏名】友田 敬士郎
(72)【発明者】
【氏名】松井 誠
【テーマコード(参考)】
4C076
4C084
4C086
【Fターム(参考)】
4C076AA12
4C076CC41
4C076EE23E
4C076EE23Q
4C076EE26E
4C076EE26Q
4C076EE59E
4C076EE59Q
4C076FF43
4C076FF65
4C084AA17
4C084MA05
4C084NA03
4C084NA13
4C084NA20
4C084ZC412
4C086AA01
4C086AA10
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086NA20
4C086ZC41
(57)【要約】
【課題】生理活性物質の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供する。
【解決手段】生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式(1)で表される基を含むリンカーで結合した、結合体。
[化1]

[式(1)中、Rはニトロ基又は炭素数1〜3のアルキル基を表し、nは0〜3の整数を表し、*は結合手を表す。nが2以上の整数である場合、複数存在するRはそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。]
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式(1)で表される基を含むリンカーで結合した、結合体。
【化1】
[式(1)中、Rはニトロ基又は炭素数1〜3のアルキル基を表し、nは0〜3の整数を表し、*は結合手を表す。nが2以上の整数である場合、複数存在するRはそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。]
【請求項2】
前記生理活性物質が、阻害性核酸又は低分子医薬である、請求項1に記載の結合体。
【請求項3】
前記生体適合性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸又はポリアクリルアミドである、請求項1又は2に記載の結合体。
【請求項4】
前記生理活性物質が阻害性核酸であり、前記生体適合性高分子の重量平均分子量が30,000〜200,000である、請求項2又は3に記載の結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、結合体に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞外で安定であり、薬理活性部位である細胞内でのみ活性を発揮する薬物送達システムが検討されている。例えば、非特許文献1には、エンドソーム内の酸性pHで切断されるマレイン酸アミド誘導体リンカーを用いて、siRNAとポリマーとを結合した、siRNAの送達システムが記載されている。また、非特許文献2には、細胞内の高い還元環境に応答して切断されるジスルフィド結合を用いて、siRNAとポリマーとを結合した、siRNAの送達システムが記載されている。非特許文献1や非特許文献2に記載された送達システムは、siRNAに結合したポリマーにより、細胞外ではsiRNAが安定に存在し、細胞内においてポリマーとsiRNAとが切断され、siRNAが活性を発揮することを目指したものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Takemoto H., et al., Acidic pH-responsive siRNA conjugate for reversible carrier stability and accelerated endosomal escape with reduced IFN-alpha-associated immune response, Angew. Chem. Int. Ed., 52 (24), 6218-6221, 2013.
【非特許文献2】Takemoto H., et al., Polyion complex stability and gene silencing efficiency with a siRNA-grafted polymer delivery system. Biomaterials, 31 (31), 8097-8105, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、非特許文献1や2に記載されたポリマー−siRNA結合体では、細胞外環境におけるsiRNAとポリマー間のリンカーの安定性が不十分な場合がある。例えば、ジスルフィド結合は細胞外における低還元環境においても切断されてしまうため(半減期にして数時間)、ポリマー−siRNA結合体が細胞内に取り込まれる前にポリマーとsiRNAが切断されてしまい、期待された機能を十分に発揮できない場合がある。
【0005】
そこで、本発明は、生理活性物質の結合体の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、以下の態様を含む。
[1]生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式(1)で表される基を含むリンカーで結合した、結合体。
【化1】
[式(1)中、Rはニトロ基又は炭素数1〜3のアルキル基を表し、nは0〜3の整数を表し、*は結合手を表す。nが2以上の整数である場合、複数存在するRはそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。]
[2]前記生理活性物質が、阻害性核酸又は低分子医薬である、[1]に記載の結合体。
[3]前記生体適合性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸又はポリアクリルアミドである、[1]又は[2]に記載の結合体。
[4]前記生理活性物質が阻害性核酸であり、前記生体適合性高分子の重量平均分子量が30,000〜200,000である、[2]又は[3]に記載の結合体。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、生理活性物質の結合体の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
図1】実験例1における、細胞外環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。
図2】実験例1における、細胞内環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。
図3】実験例2のリンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。
図4】(a)〜(c)は、実験例3のルシフェラーゼアッセイにおける発光量の測定結果を示すグラフである。
図5】(a)及び(b)は、実験例4のルシフェラーゼアッセイにおける発光量の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
1実施形態において、本発明は、生理活性物質と、生体適合性高分子化合物と、を備え、前記生理活性物質及び前記生体適合性高分子化合物が、下記式(1)で表される基を含むリンカーで結合した、結合体を提供する。
【0010】
【化2】
【0011】
式(1)中、Rはニトロ基又は炭素数1〜3のアルキル基を表し、nは0〜3の整数を表し、*は結合手を表す。nが2以上の整数である場合、複数存在するRはそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。
【0012】
上記式(1)で表される基を含むリンカーは、上記式(1)で表される基からなる2価の連結基であってもよく、上記式(1)で表される基と他の基を含む2価の連結基であってもよい。
【0013】
本実施形態の結合体において、上記式(1)中に2つ存在する結合手の一方に直接的に又は間接的に生理活性物質が結合し、他方に直接的に又は間接的に生体適合性高分子化合物が結合している。上記の結合手と生理活性物質との結合、又は上記の結合手と生体適合性高分子化合物との結合が間接的である場合、上記の結合手と生理活性物質との間、又は上記の結合手と生体適合性高分子化合物との間には、他の基が存在している。上記の他の基は、例えば、実施例において後述するように、生理活性物質と、生体適合性高分子化合物とを結合させる過程で導入される基であってもよい。
【0014】
本実施形態の結合体は、細胞外環境では生体適合性高分子化合物と生理活性物質との結合体が安定に存在することができる。ここで、安定に存在するとは、生体適合性高分子化合物と生理活性物質との結合体が、例えば、既存のジスルフィド結合により結合した結合体に比べて、その結合状態をより長時間維持することを意味する。実施例において後述するように、本実施形態の結合体は、細胞外環境において安定である。また、細胞内では選択的にリンカーが切断して生理活性物質が放出され、その活性を発揮することができる。したがって、本実施形態の結合体は、薬物送達システムであるということもできる。
【0015】
本実施形態の結合体において、生理活性物質としては、阻害性核酸又は低分子医薬が挙げられる。阻害性核酸としては、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA等が挙げられる。阻害性核酸の標的遺伝子は特に制限されず、目的に応じて選択すればよい。
【0016】
阻害性核酸がsiRNAである場合、siRNAは、例えば18〜25塩基対、例えば21〜23塩基対の二本鎖RNAであり、各RNA鎖の3’末端部分が2塩基分突出していることが好ましい。また、突出した2塩基分はDNAにより構成されていてもよい。
【0017】
低分子医薬としては、分子量が概ね1000以下である医薬が挙げられる。低分子医薬は、例えば、抗癌剤、造影剤、免疫抑制剤等であってもよい。抗癌剤としては、例えば、パクリタクセル、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン等が挙げられる。
【0018】
一般に、細胞内及び細胞外では、還元型グルタチオン(GSH)の濃度が数百倍異なっている。発明者らは、2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合が、細胞外に相当する環境下では安定であり、細胞内に相当する還元環境下では切断されることを見出し、本発明を完成させた。
【0019】
実施例において後述するように、2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合により生理活性物質と生体適合性高分子化合物とが結合した結合体は、還元環境に応答して切断される。更に、実施例において後述するように、癌細胞において過剰発現しているグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)の存在下では、2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合の切断が促進され、結合体からの生理活性物質の放出が促進される。したがって、本実施形態の結合体は、例えば抗癌剤の送達に好適に利用することができる。
【0020】
本明細書において、生体適合性高分子化合物とは、生体に投与した場合に、強い炎症反応等の悪影響を及ぼしにくい高分子化合物を意味する。生体適合性高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸又はポリアクリルアミド等が挙げられる。
【0021】
生体適合性高分子化合物がポリエチレングリコールである場合、生体適合性高分子化合物の末端にはアルコキシ基が結合していてもよい。
【0022】
生体適合性高分子化合物の重量平均分子量は1,000〜200,000であってもよく、10,000〜100,000であってもよく、30,000〜50,000であってもよい。また、生理活性物質が阻害性核酸である場合、生体適合性高分子の重量平均分子量は、30,000〜200,000であることが好ましく、30,000〜100,000であることがより好ましく、30,000〜50,000であることが更に好ましい。
【0023】
ここで、生体適合性高分子化合物の重量平均分子量としては、ゲルパーメーションクロマトグラフィー(GPC)法により測定した値を用いることができる。具体的には、生体適合性高分子化合物を溶媒に溶かした後、細孔(ポア)が数多く存在する充てん剤を用いたカラム内に移動相溶液と共に通液し、カラム内で分子量の大小によって分離させ、それを示差屈折率計やUV計、粘度計、光散乱検出器等を検出器として用いて検出する。GPC専用装置が広く市販されており、標準ポリエチレングリコール換算によって測定することが一般的である。本明細書における重量平均分子量は、この標準ポリエチレングリコール換算によって測定されたものである。
【0024】
実施例において後述するように、生体適合性高分子化合物の分子量が上記の範囲であると、結合体に含まれる生理活性物質の生理活性を抑制することができる。これは、生理活性物質が生体適合性高分子化合物により適度にマスクされていることによると考えられる。そして、生理活性物質と生体適合性高分子化合物が切断された場合に初めて生理活性物質が生理活性を発揮することが可能となる。これにより、薬理活性部位である細胞内でのみ生理活性物質の活性を発揮することができる。その結果、例えば、生理活性物質による副作用等を低減することができる。
【0025】
本実施形態の結合体の合成方法は特に制限されない。例えば、実施例において後述するように、生理活性物質及び生体適合性高分子化合物にそれぞれ反応性の官能基を導入し、これらを反応させることにより、生理活性物質と生体適合性高分子化合物とを結合させてもよい。
【0026】
このような反応性の官能基の組み合わせとしては、例えばアジド基とジベンゾシクロオクチン(DBCO)の組み合わせ、スクシンイミド基とアミノ基の組み合わせ、チオール基とマレイミド基の組み合わせ、アジド基とアルキン基の組み合わせ、ビオチン基とストレプトアビジン基の組み合わせ等が挙げられる。これらの組み合わせのうちいずれか一方を生理活性物質に導入し、他方を生体適合性高分子化合物に導入し、これらを反応させるとよい。
【実施例】
【0027】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【0028】
[実施例1]
(MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNAの合成)
下記合成スキーム(1)により、メトキシ−ポリエチレングリコールとsiRNAとを2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合を含むリンカーで連結した薬物送達システムを合成した。
【0029】
【化3】
【0030】
《4−(クロロスルホニル)−3−ニトロベンゾエートの合成》
まず、下記合成スキーム(2)により、4−(クロロスルホニル)−3−ニトロベンゾエートを合成した。
【0031】
【化4】
【0032】
0.13gのグリシルグリシン(0.001mol)を20mLのN,N−ジメチルホルムアミドに溶解した。続いて、上記の溶液に0℃で0.81mLのチオ酢酸(0.011mol)及び7.3gの炭酸セシウムを添加し、0℃で10分間撹拌した。続いて、上記の溶液に1.61gのメチル4−クロロ−3−ニトロベンゾエート(0.0075mol)を添加し、暗条件下、氷上で一晩撹拌した。続いて、酢酸エチル及び1M塩酸を用いて生成物を抽出し、脱イオン水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。続いて、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、黄色粉末を得た。
【0033】
続いて、得られた黄色粉末を10mLのアセトニトリルに溶解し、溶液を3.9gのN−クロロスクシンイミド(0.029mol)を含む20mLのアセトニトリルと4mLの2M塩酸の混合液に注いだ。得られた反応液を0℃で1時間撹拌した。続いて、上記と同様の抽出プロセスを行い、ロータリーエバポレーターを用いて有機相を除去し、粗生成物を得た。
【0034】
続いて、粗生成物を、ジクロロメタンを溶離液とするシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、1,4−ジオキサンを用いて凍結乾燥し、1.5368gの黄色粉末としてメチル4−(クロロスルホニル)−3−ニトロベンゾエートを得た(収率70.8%)。生成物は、CDCl中のH NMRスペクトルにより確認した。8.3−8.5ppm(3H,Ar);4.04ppm(3H,Methyl)。
【0035】
《MeO−PEG−スルホンアミド−DBCOの合成》
続いて、下記合成スキーム(3)により、メトキシ−ポリエチレングリコール(MeO−PEG)−スルホンアミド−DBCOを合成した。
【0036】
【化5】
【0037】
まず、PEGの末端にスルホンアミド結合によりメチル3−ニトロベンゾエートを導入した。200mgのMeO−PEG−NH(重量平均分子量40,000、0.005mmol)を3mLのピリジンに溶解し、0℃で10分間撹拌した。続いて、14.0mgのメチル4−(クロロスルホニル)−3−ニトロベンゾエート(0.025mmol)を0℃の2mLピリジンに溶解し、上記のメトキシ−PEG−NHの溶液に添加し、0℃で一晩撹拌した。
【0038】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析(分画分子量3500)し、過剰の反応物及びピリジンを除去した。透析後の溶液を凍結乾燥し、メチル3−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したPEG誘導体を190.3mgの白色粉末として得た(収率88.9%)。目的の生成物が得られたことをH NMRスペクトルで3.2ppmのメチル基由来のピークが検出されることにより確認した。
【0039】
得られたPEG誘導体の末端のメチルエステルを更なる修飾のために加水分解した。メチル3−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したPEG誘導体180mg(0.0045mmol)を、18mLの水/メタノール/5M水酸化ナトリウム(重量比:1/8/0.05)の混合物に溶解し、室温で一晩撹拌した。
【0040】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析(分画分子量3500)し、透析後の溶液を凍結乾燥し、3−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したPEG誘導体を156.8mgの白色粉末として得た(収率87.1%)。メチルベンゾエートが完全に加水分解したことを、H NMRスペクトルで4.0ppmのメチルプロトンのプロトンのシグナルが消失したことにより確認した。
【0041】
続いて、PEG誘導体にジベンゾシクロオクチン(DBCO)を導入し、MeO−PEG−スルホンアミド−DBCOを得た。まず、3−ニトロベンゾエートがスルホンアミド結合で末端に結合したPEG誘導体138mg(0.0034mmol)を7mLのテトラヒドロフランに溶解した。続いて、ジベンゾシクロオクチンアミン9.6mg(0.034mmol)を3mLのテトラヒドロフランに溶解し、上記のPEG誘導体の溶液に添加した。この溶液に、3mLのテトラヒドロフランに懸濁した9.6mgのDMTMM(0.034mmol)を添加し、室温で一晩撹拌した。
【0042】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析(分画分子量3500)し、フィルターを通して、未反応のジベンゾシクロオクチンアミンを除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、MeO−PEG−スルホンアミド−DBCOを117.4mgの白色粉末として得た(収率79.6%)。DBCOの導入は、H NMRスペクトルで7.3〜7.7ppmにピークが出現したことにより確認した。
【0043】
《MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNAの合成》
続いて、MeO−PEG−スルホンアミド−DBCOの末端のDBCOとアジド−siRNAのアジド基との間のクリック反応によりMeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNAを合成した。6mgのMeO−PEG−スルホンアミド−DBCO(0.00015mmol)を500μLのHEPESバッファー(10mM、pH7.3)に溶解した。
【0044】
65μLのsiRNA(3mg/mL)を上記のMeO−PEG−スルホンアミド−DBCOの溶液に添加し、更に335μLのHEPESバッファー(10mM、pH7.3)を添加した。
【0045】
siRNAとしては、ルシフェラーゼに対するsiRNA、及び対照のsiRNAとしてスクランブル配列からなるsiRNAを使用した。ルシフェラーゼに対するsiRNAのセンス鎖の塩基配列を配列番号1に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号2に示す。また、対照のsiRNAのセンス鎖の塩基配列を配列番号3に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号4に示す。いずれのsiRNAも、センス鎖の5’末端がアジド基で修飾されていた。
【0046】
続いて、溶液を−20℃で一晩凍結し、4℃で1時間解凍した。続いて、得られた溶液を直ちに解析し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製した。HPLCのカラムにはMono Q(商標)5/50GLカラム(GEヘルスケア社)を用いた。検出は波長260nmにおけるUV検出により行った。溶離液には、10mM HEPESバッファー(pH7.4)を用い、塩化ナトリウム不含溶液と、1M塩化ナトリウム含有溶液とのグラジエント溶出を行った。その結果、MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNAが得られたことが確認された。
【0047】
[参考例1]
(MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNAの合成)
MeO−PEG−NH(重量平均分子量40,000)の代わりにMeO−PEG−NH(重量平均分子量20,000)を使用した点以外は実施例1と同様にして、参考例1のMeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNAを合成した。siRNAとしては、実施例1と同様に、ルシフェラーゼに対するsiRNA及びスクランブル配列からなるsiRNA(対照)を使用した。
【0048】
[比較例1]
(MeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNAの合成)
下記合成スキーム(4)により、MeO−PEGとsiRNAとをカルボン酸アミド結合を含むリンカーで連結した薬物送達システムを合成した。
【0049】
【化6】
【0050】
《MeO−PEG−カルボン酸アミド−DBCOの合成》
まず、下記合成スキーム(5)により、MeO−PEG−カルボン酸アミド−DBCOを合成した。
【0051】
【化7】
【0052】
100mgのMeO−PEG−NH(重量平均分子量40,000、0.0025mmol)を4mLのジクロロメタンに溶解した。続いて、上記の溶液に16.2mgのDBCO−NHSエステル(0.025mmol)を添加し、室温で一晩撹拌した。トリエチルアミン2滴を添加し、反応を活性化させた。
【0053】
続いて、反応液をメタノール及び脱イオン水に対して透析(分画分子量3500)した。透析後の溶液を凍結乾燥し、MeO−PEG−カルボン酸アミド−DBCOを80.8mgの白色粉末として得た(収率69.5%)。目的の生成物が得られたことをH NMRスペクトルで7.3〜7.7ppmにピークが出現したことにより確認した。
【0054】
《MeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNAの合成》
続いて、MeO−PEG−カルボン酸アミド−DBCOの末端のDBCOとアジド−siRNAのアジド基との間のクリック反応によりMeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNAを合成した。6mgのMeO−PEG−カルボン酸アミド−DBCO(0.00015mmol)を500μLのHEPESバッファー(10mM、pH7.3)に溶解した。
【0055】
65μLのsiRNA(3mg/mL)を上記のMeO−PEG−カルボン酸アミド−DBCOの溶液に添加し、更に335μLのHEPESバッファー(10mM、pH7.3)を添加した。siRNAとしては、実験例1と同様のものを用いた。
【0056】
続いて、溶液を−20℃で一晩凍結し、4℃で1時間解凍した。続いて、得られた溶液を直ちに解析し、HPLCにより精製した。HPLCのカラムにはMono Q(商標)5/50GLカラム(GEヘルスケア社)を用いた。検出は波長260nmにおけるUV検出により行った。溶離液には、10mM HEPESバッファー(pH7.4)を用い、塩化ナトリウム不含溶液と、1M塩化ナトリウム含有溶液とのグラジエント溶出を行った。その結果、MeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNAが得られたことが確認された。
【0057】
[比較例2]
《MeO−PEG−ジスルフィド−5’−siRNAの合成》
下記合成スキーム(6)により、MeO−PEGとsiRNAとをジスルフィド結合を含むリンカーで連結した薬物送達システムを合成した。
【0058】
【化8】
【0059】
《MeO−PEG−ジスルフィド−COOHの合成》
まず、下記合成スキーム(7)により、MeO−PEG−ジスルフィド−COOHを合成した。
【0060】
【化9】
【0061】
3,3’−ジチオジプロピオン酸をMeO−PEGの末端に導入した。100mgのMeO−PEG−NH(重量平均分子量40,000、0.0025mmol)を4mLのテトラヒドロフランに溶解した。続いて、5.3mgの3,3’−ジチオジプロピオン酸(0.025mmol)を1mLのテトラヒドロフランに溶解し、上記のMeO−PEG−NHの溶液に添加した。この溶液に、2mLのテトラヒドロフランに懸濁した6.9mgのDMTMM(0.025mmol)を添加し、室温で一晩撹拌した。
【0062】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析(分画分子量3500)し、フィルターを通して、未反応の3,3’−ジチオジプロピオン酸を除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、MeO−PEG−ジスルフィド−COOHを87.5mgの白色粉末として得た(収率83.1%)。3,3’−ジチオジプロピオン酸の導入は、H NMRスペクトルで2.6〜3.0ppmにピークが出現したことにより確認した。
【0063】
《MeO−PEG−ジスルフィド−DBCOの合成》
続いて、下記合成スキーム(8)により、MeO−PEG−ジスルフィド−DBCOを合成した。
【0064】
【化10】
【0065】
まず、ジスルフィド結合を末端に導入した上記のPEG誘導体60mg(0.0015mmol)を3mLのテトラヒドロフランに溶解した。続いて、ジベンゾシクロオクチンアミン4.1mg(0.015mmol)を1mLのテトラヒドロフランに溶解し、上記のPEG誘導体の溶液に添加した。この溶液に、2mLのテトラヒドロフランに懸濁した4.2mgのDMTMM(0.015mmol)を添加し、室温で一晩撹拌した。
【0066】
続いて、反応液を脱イオン水に対して透析(分画分子量3500)し、フィルターを通して、未反応のジベンゾシクロオクチンアミンを除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、MeO−PEG−ジスルフィド−DBCOを45.5mgの白色粉末として得た(収率70.9%)。DBCOの導入は、H NMRスペクトルで7.3〜7.7ppmにピークが出現したことにより確認した。
【0067】
《MeO−PEG−ジスルフィド−5’−siRNAの合成》
続いて、MeO−PEG−ジスルフィド−DBCOの末端のDBCOとアジド−siRNAのアジド基との間のクリック反応によりMeO−PEG−ジスルフィド−5’−siRNAを合成した。6mgのMeO−PEG−ジスルフィド−DBCO(0.00015mmol)を500μLのHEPESバッファー(10mM、pH7.3)に溶解した。
【0068】
65μLのsiRNA(3mg/mL)を上記のMeO−PEG−ジスルフィド−DBCOの溶液に添加し、更に335μLのHEPESバッファー(10mM、pH7.3)を添加した。siRNAとしては、実験例1と同様のものを用いた。
【0069】
続いて、溶液を−20℃で一晩凍結し、4℃で1時間解凍した。続いて、得られた溶液を直ちに解析し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製した。HPLCのカラムにはMono Q(商標)5/50GLカラム(GEヘルスケア社)を用いた。検出は波長260nmにおけるUV検出により行った。溶離液には、10mM HEPESバッファー(pH7.4)を用い、塩化ナトリウム不含溶液と、1M塩化ナトリウム含有溶液とのグラジエント溶出を行った。その結果、MeO−PEG−ジスルフィド−5’−siRNAが得られたことが確認された。
【0070】
[比較例3]
(MeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNAの合成)
MeO−PEG−NH(重量平均分子量40,000)の代わりにMeO−PEG−NH(重量平均分子量20,000)を使用した点以外は比較例1と同様にして、比較例3のMeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNAを合成した。siRNAとしては、実施例1と同様に、ルシフェラーゼに対するsiRNA及びスクランブル配列からなるsiRNA(対照)を使用した。
【0071】
[実験例1]
(リンカー切断アッセイ1)
実施例1及び比較例2のPEG−siRNA(それぞれ、MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNA及びMeO−PEG−ジスルフィド−5’−siRNA)を用いてリンカー切断アッセイを行った。アッセイ条件としては、細胞内環境及び細胞外環境を模倣した条件を用いた。
【0072】
細胞外環境を模倣したリンカー切断アッセイでは、5μLのPEG−siRNA(10μM siRNA、10mM HEPES、pH7.3)を、20μMの還元型グルタチオン(GSH)を含む495μLのリン酸バッファー(0.1Mm、pH7.4)に添加し、37℃でインキュベートした。
【0073】
細胞内環境を模倣したリンカー切断アッセイでは、5μLのPEG−siRNA(10μM siRNA、10mM HEPES、pH7.3)を、10mMのGSHを含む495μLのリン酸バッファー(0.1Mm、pH7.4)に添加し、37℃でインキュベートした。
【0074】
PEG−siRNAからのsiRNAの遊離の割合はサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。カラムにはSuperdex75(GEヘルスケア社)を用いた。検出は波長260nmにおけるUV検出により行った。溶離液には、150mM塩化ナトリウムを含む10mM HEPESバッファー(pH7.4)を用いた。
【0075】
遊離したsiRNAの割合は、PEG−siRNA及び遊離したsiRNAのピーク強度比により計算した。
【0076】
図1及び図2は、リンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。図1は、細胞外環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示し、図2は、細胞内環境を模倣したリンカー切断アッセイの結果を示す。
【0077】
その結果、図1に示すように、細胞外環境に相当するGSH濃度(20μM)においては、MeO−PEG−ジスルフィド−5’−siRNA(比較例2、図1中、「ジスルフィド結合」と示す。)は6時間後に12%、72時間後に38%のsiRNAを放出した。
【0078】
これに対し、MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNA(実施例1、図1中、「2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合」と示す。)は72時間たっても6%しかsiRNAを放出しなかった。このことから、2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合を用いることで、細胞外環境において安定に核酸を結合出来ることが証明された。
【0079】
また、図2に示すように、細胞内環境に相当するGSH濃度(10mM)では、MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNA(実施例1、図2中、「2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合−siRNA」と示す。)は6時間後に40%、72時間後に約95%のsiRNAを放出した。
【0080】
以上の結果から、細胞内における高いGSH濃度に応答して、2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合が切断されてsiRNAが放出されることが確認された。
【0081】
[実験例2]
(リンカー切断アッセイ2)
続いて、癌細胞内において過剰発現しているGSTの存在下及び非存在下でリンカー切断アッセイを行った。5μLのMeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNA(実施例1、10μM siRNA、10mM HEPES、pH7.3)を、1mMのGSH及び0.0019mg/mLのグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)を含む又は含まない、495μLのリン酸バッファー(0.1Mm、pH7.4)に添加し、37℃でインキュベートした。続いて、siRNAの遊離の割合を実験例1と同様にして測定した。
【0082】
図3は、リンカー切断アッセイの結果を示すグラフである。その結果、図3に示すように、GSTの存在下では、GSTの非存在下と比較して、2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合の壊裂が促進されることが明らかとなった。この結果から、癌細胞内では2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合の切断が促進されることが明らかとなった。
【0083】
[実験例3]
(ルシフェラーゼアッセイ)
siRNAによる遺伝子発現抑制効果をルシフェラーゼアッセイにより検討した。ルシフェラーゼ遺伝子を発現するHeLa細胞(HeLa−Luc細胞)を1500個/ウェルの細胞密度で96ウェルプレートに播種した。培地には、10%ウシ胎児血清を含むDMEMを1ウェルあたり100μL用いた。続いて、37℃で24時間インキュベートした。
【0084】
続いて、ルシフェラーゼに対するsiRNA、又は対照のsiRNAがそれぞれ結合した、実施例1、比較例1及び比較例2のPEG−siRNA(MeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNA、MeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNA、MeO−PEG−ジスルフィド−5’−siRNA、PEGの重量平均分子量はいずれも40,000)を、siRNAの濃度が1〜100nMとなるように、リポフェクトアミンRNAi MAX(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて上記の細胞に導入し、更に72時間インキュベートした。
【0085】
続いて、培地を除去し、各細胞を100μLのリン酸バッファー(PBS)で洗浄した。続いて、20μL/ウェルの溶解バッファー(プロメガ社)を添加した。続いて、ルシフェラーゼアッセイシステム(プロメガ社)及びルミノメーター(型式「Glomax96」、プロメガ社)を用いて各細胞の発光量を測定した。siRNAを導入しなかった細胞の発光量を基準として、各細胞の発光量(相対値)を計算した。図4(a)〜(c)は、発光量の測定結果を示すグラフである。グラフの値は、6試料の平均値±標準誤差で示す。
【0086】
その結果、比較例1(カルボン酸アミド結合、図4(b))及び比較例2(ジスルフィド結合、図4(c))のPEG−siRNAは目立った薬理活性を示さなかったのに対し、実施例1(2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合、図4(a))のPEG−siRNAは、有意な遺伝子発現抑制を示した。この結果は、2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合を有するPEG−siRNAが細胞内選択的に切断され、生理活性を発揮することを示す。
【0087】
[実験例4]
(PEGの分子量の検討)
実施例3で用いたPEG−siRNAとはPEGの分子量が異なるPEG−siRNAを用いて実験例3と同様の検討を行った。具体的には、参考例1のMeO−PEG−スルホンアミド−5’−siRNA(PEGの重量平均分子量は20,000)、及び比較例3のMeO−PEG−カルボン酸アミド−5’−siRNA(PEGの重量平均分子量は20,000)をHeLa−Luc細胞に導入し、実験例3と同様の条件下でルシフェラーゼアッセイを行った。図5(a)及び(b)は、ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。グラフの値は、6試料の平均値±標準誤差で示す。
【0088】
その結果、参考例1(2−ニトロベンゼンスルホン酸アミド結合、図5(a))のPEG−siRNAだけでなく、比較例3(カルボン酸アミド結合、図5(b))のPEG−siRNAにおいても、対照のPEG−siRNAと比較して有意な遺伝子発現抑制が認められた。
【0089】
この結果は、PEG−siRNAにおけるPEGの重量平均分子量が40,000であった実験例3の結果と比較して、PEG−siRNAにおけるPEGの重量平均分子量が20,000では、細胞内におけるsiRNAの活性阻害が非効率的であることを示す。つまり、リンカーが切断された場合にのみsiRNAの活性を発現させるためには、PEGの重量平均分子量は20,000を超えるものである必要があることが明らかとなった。なお、生理活性物質がsiRNA以外の低分子医薬等である場合には、最適なPEGの重量平均分子量はより小さくなる可能性が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0090】
本発明によれば、生理活性物質の細胞外環境における安定性を向上させ、且つ生理活性物質が細胞内選択的に機能を発揮することができる技術を提供することができる。
図1
図2
図3
図4
図5
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]