特開 2017-218423 カロテノイドを含む、空間認知機能の向上組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-218423(P2017-218423A)

(43)【公開日】2017年12月14日

(54)【発明の名称】カロテノイドを含む、空間認知機能の向上組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/122 20060101AFI20171117BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20171117BHJP

   A61K 36/05 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171117BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20171117BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/122

   A61P25/28

   A61K36/05

   A61P43/00 105

   A23L33/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-114467(P2016-114467)

(22)【出願日】2016年6月8日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）平成２７年１２月８日 ウェブサイト ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ｍｎｆｒ．２０１５００６３４／ａｂｓｔｒａｃｔにて発表 （２）平成２７年１２月２２日 ウェブサイト ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｓｕｋｕｂａ．ａｃ．ｊｐ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／１５１２２２ｓｏｙａ．ｐｄｆにて発表 （３）ウェブサイト及び刊行物 平成２８年１月７日及び３月３日 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌｕｍｅ ６０（３），ｐｐ５８９−５９９，２０１６及びｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ｍｎｆｒ．２０１５００６３４／ａｂｓｔｒａｃｔにて発表 （４）平成２８年２月１３日 アスタリール▲Ｒ▼シンポジウム２０１６にて発表 （５）平成２８年４月１日 予防医学２０１６ アスタリール▲Ｒ▼シンポジウム特集 第２〜３頁にて発表

(71)【出願人】

【識別番号】516170901

【氏名又は名称】アスタリール株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】征矢 英昭

(72)【発明者】

【氏名】陸 彰洙

【テーマコード（参考）】

4B018

4C088

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B018MD08

4B018MD89

4B018ME14

4B018MF01

4C088AA15

4C088BA32

4C088NA14

4C088ZA15

4C088ZC41

4C206AA01

4C206AA02

4C206CB25

4C206KA01

4C206KA18

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA15

4C206ZC41

(57)【要約】      （修正有）

【課題】アスタキサンチンの脳、より具体的には海馬における機能を解明し、アスタキサンチンの新たな用途を見出すこと。
【解決手段】カロテノイド、特にはアスタキサンチンが、空間認知機能を向上させることを見出した。従来には知られていなかった、カロテノイド、特にはアスタキサンチンの新たな用途が提供される。空間認知機能の向上組成物は、濃度依存的に海馬神経新生を促進し、空間認知機能の向上に顕著に寄与する。前記アスタキサンチンがヘマトコッカス藻由来であることが好ましい、組成物。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カロテノイドを含む、空間認知機能の向上組成物。

【請求項2】

カロテノイドが、アスタキサンチンである、請求項１記載の組成物。

【請求項3】

アスタキサンチンが、ヘマトコッカス藻由来である、請求項２記載の組成物。

【請求項4】

少なくとも４週間連続摂取するための、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。

【請求項5】

Ｐｒｌ、Ｉｔｇａ４及びＩｌ４遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つ以上の遺伝子の上方制御による、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。

【請求項6】

医薬又は食品である、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、カロテノイドを含む、空間認知機能の向上組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ヒトに対する有効性や安全性が高い上に副作用もない天然由来成分のなかでも、身体の健康維持に役立つ作用に加えて脳機能を高める効果が明らかとされているブレインフードの開発が注目を集めている。カロテノイドであるアスタキサンチンは、エビ、カニなどの甲殻類やサケに豊富に含まれている天然の赤い色素であり、強力な抗酸化効果をもたらす次世代の天然サプリメントとして期待されている。アスタキサンチンは、血液脳関門を通過して脳内へ移動する。

【0003】

インビトロでは、アスタキサンチンが神経前駆細胞の増殖を高めることが報告されている（非特許文献１）。また、アスタキサンチンは、てんかんによる神経損傷から保護することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、アスタキサンチンが、海馬機能にもたらす効果については、知られていない。

【0004】

また、ニュートリゲノミクスの研究分野では、マイクロアレイを用いた遺伝子発現の網羅的解析が行われている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Kim J. H., Nam S.W., Kim B, W., Choi W. et al., Astaxanthin improves stem cell potency via an increase in the proliferation of neural progenitor cells. Int. J. mol. Sci. 2010, 11, 5109-5119

【非特許文献2】Lu Y., Xie T., He X. X., Mao Z. F. et al., Astaxanthin rescues neuron loss and attenuates oxidative stress induced by amygdala kindling in adult rat hippocampus. Neurosci. Lett. 2015, 597, 49-53.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

アスタキサンチンの脳、より具体的には海馬における機能は、これまでよく知られていなかった。本発明の目的は、アスタキサンチンの脳、より具体的には海馬における機能を解明し、アスタキサンチンの新たな用途を見出すことを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は鋭意研究の末、カロテノイド、特にはアスタキサンチンが、空間認知機能を向上させることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0008】

すなわち、本発明の要旨は以下である。

【0009】

［１］カロテノイドを含む、空間認知機能の向上組成物。
［２］カロテノイドが、アスタキサンチンである、前記［１］記載の組成物。
［３］アスタキサンチンが、ヘマトコッカス藻由来である、前記［２］記載の組成物。
［４］少なくとも４週間連続摂取するための、前記［１］〜［３］のいずれか記載の組成物。
［５］Ｐｒｌ、Ｉｔｇａ４及びＩｌ４遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つ以上の遺伝子の上方制御による、前記［１］〜［４］のいずれか記載の組成物。
［６］医薬又は食品である、前記［１］〜［５］のいずれか記載の組成物。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、従来には知られていなかった、カロテノイド、特にはアスタキサンチンの新たな用途が提供される。本発明による空間認知機能の向上組成物は、濃度依存的に海馬神経新生を促進し、空間認知機能の向上に顕著に寄与する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例における実験設計を示す。

【図2】実施例における免疫組織化学試験の結果を示す。

【図3】実施例におけるモリス水迷路試験の結果を示す。

【図4】実施例におけるＩＰＡ分析の結果を示す。

【図5】実施例における相対的なｍＲＮＡ発現の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、カロテノイドを含む、空間認知機能の向上組成物を提供する。

【0013】

本発明における認知機能とは、内的・外的環境からの刺激を認識する一連の作業であり、知覚、判断、注意、記憶、思考、言語理解などの知的活動として総合的な能力と定義される。

【0014】

カロテノイドは、黄色から赤のテルぺノイド類の色素であり、植物類、藻類およびバクテリア由来のものを含む。

【0015】

本発明におけるカロテノイドとしては、アスタキサンチン、アクチニオエリスロール、ビキシン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、β−８’−アポ−カロテナール（アポカロテナール）、β−１２’−アポ−カロテナール、α−カロテン、β−カロテン、カロテン（α−及びβ−カロテン類の混合物）、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、リコピン、ビオレリトリン、ゼアキサンチン、フィトエン、フィトフルエン及びそれらのヒドロキシル基又はカルボキシル基を含有するもののエステル類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明におけるカロテノイドは、好ましくはアスタキサンチン、リコピン、β−カロテン、γ−カロテン、フィトフルエン、フィトエン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、カプサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン又はそれらの脂肪酸エステルであり、最も好ましくはアスタキサンチンである。

【0016】

アスタキサンチンは、天然アスタキサンチン又は合成アスタキサンチンであればよい。好ましくは、アスタキサンチンは、天然アスタキサンチンであり、より好ましくは、ヘマトコッカス藻（Haematococcus）由来である。

【0017】

天然アスタキサンチンは、例えばヘマトコッカス藻、具体的にはヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（Haematococcus capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバゲンシス（Haematococcus deroebakensis）、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス（Haematococcus zimbabwiensis）などから抽出されるが、これらに限定されない。

【0018】

前記ヘマトコッカス藻の培養方法は、特開平８−１０３２８８号公報に開示された様々な方法などを採用することができるが、これらに限定されず、栄養細胞から休眠細胞であるシスト細胞に形態変化していればよい。

【0019】

前記ヘマトコッカス藻を、必要に応じて、特開平５−６８５８５号公報に開示された方法などにより細胞壁を破砕して、アセトン、エーテル、クロロホルム及びアルコール（エタノール、メタノールなど）などの有機溶剤や、超臨界状態の二酸化炭素などの抽出溶剤を加えて抽出する。

【0020】

ヘマトコッカス藻抽出物は、主にアスタキサンチン類及びアシルグリセロールからなる。ヘマトコッカス藻抽出物におけるアスタキサンチン含量は、３重量％以上、好ましくは３〜４０重量％、より好ましくは５〜１２重量％である。

【0021】

ヘマトコッカス藻から高含量のアスタキサンチンを得る方法としては、異種微生物の混入・繁殖がなく、その他の夾雑物の混入が少ない密閉型の培養方法が好ましく、培養液から常法に従って得ることができる。

【0022】

本発明の組成物におけるアスタキサンチン又はアスタキサンチン原料としては、市販品、例えばＡＳＴＯＴＳ−Ｓ、ＡＳＴＯＴＳ−１０Ｏ、ＡＳＴＯＴＳ−ＥＣＳ、ＡＳＴＯＴＳ−２．０ＰＷ、ＡＳＴＯＴＳ−３．０ＭＢ（登録商標）（武田紙器株式会社、千葉県）、アスタリールオイル５０Ｆ、アスタリールオイル５Ｆ、アスタリールパウダー２０Ｆ、水溶性アスタリール液、アスタリールＷＳ液、アスタリール１０ＷＳ液（登録商標）（富士化学工業株式会社、富山県）、ＢｉｏＡｓｔｉｎ（登録商標）（東洋酵素化学株式会社、千葉県）、Ａｓｔａｚｉｎｅ ＴＭ（ＢＧＧ Ｊａｐａｎ株式会社）、アスタキサンチンパウダー１．５％、２．５％、アスタキサンチンオイル５％、１０％（バイオアクティブズジャパン株式会社）、アスタキサンチン（オリザ油化株式会社）、サンアクティブＡＸ（登録商標）（太陽化学株式会社）又はヘマトコッカスＷＳ３０（ヤエガキ発酵技研）などを利用することもできる。

【0023】

合成アスタキサンチンとしては、ＡｓｔａＳａｎａ（商標）（ＤＳＭ、スイス）、Ｌｕｃａｎｔｉｎ Ｐｉｎｋ（登録商標）（ＢＡＳＦ、ドイツ）などを利用することもできる。

【0024】

本発明の組成物におけるアスタキサンチン含量は、アスタキサンチンフリー体に換算した重量に基づく。

【0025】

本発明の組成物は、少なくとも４週間摂取するとよく、長期に摂取すればするほどよい。また、一日あたりの摂取は一度でもよいが、複数に別けてもよい。

【0026】

本発明の組成物における、カロテノイド、特にはアスタキサンチンの含量は、例えば医薬品においては、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜９０重量％の量で含有させることができる。また、飲食品においては、０．００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％の量で含有させることができる。

【0027】

一日当たりのアスタキサンチン摂取量は、成人では、アスタキサンチンフリー体換算で０．５ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜３０ｍｇであればよい。

【0028】

本発明の組成物は、摂取期間が長ければ長いほど、含量が高ければ高いほど、一日当たりの摂取量が多ければ多いほど、高い空間認知機能を発揮する。

【0029】

本発明の組成物は、好ましくは、Ｐｒｌ（プロラクチン）、Ｉｔｇａ４（インテグリンアルファ４）及びＩｌ４（インターロイキン４）遺伝子からなる群より選択される、少なくとも１つ以上の遺伝子の上方制御により、空間認知機能を向上する。

【0030】

本発明の組成物は、医薬又は食品であってよい。

【0031】

前記医薬としては、常法により、カプセル剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、注射剤、坐剤、吸入剤、経鼻剤、経皮剤などに製剤化されるとよいが、これらに限定されない。

【0032】

前記食品としては、常法により、サプリメント、固形食品、流動食品、飲料などに製造されるが、これらに限定されない。

【実施例】

【0033】

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。

【0034】

実験
１．動物
１１週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄マウス（日本エスエルシー株式会社、静岡県）を標準的なポリカーボネート製ゲージにて、室温２１〜２３℃、相対湿度５０％、そして１２時間の明暗サイクル（午前７時に点灯；午後７時に消灯）に制御して、個別に飼育した。全ての動物は、筑波大学動物実験指針に基づき、動物実験委員会の承認を得て行われた。

【0035】

２．飼料
まず、マウスには、１週間の順化期間中、非精製基本飼料としてＭＦ粉末飼料（オリエンタル酵母工業株式会社、東京都）及び水を自由摂取させた。マウスを４群分け、その後４週間、アスタキサンチンの代わりにプラセボ粉末を混ぜたＭＦ飼料、又はアスタキサンチン（アスタリール（登録商標）パウダー２０Ｆ；Haematococcus pluvialis由来のアスタキサンチンをフリー体換算値で２重量％含有する；富士化学工業株式会社、富山県）を様々な量で含有するＭＦ飼料のいずれかを与えた。

【0036】

すなわち、マウスに与えた飼料は以下に示す４種のうちの１種である。
ＰＬ群：アスタキサンチン含量は０重量％であり、代わりにプラセボ粉末を含有させたＭＦ粉末飼料
０．０２％群：アスタキサンチンを０．０２重量％含有するＭＦ粉末飼料
０．１％群：アスタキサンチンを０．１重量％含有するＭＦ粉末飼料
０．５％群：アスタキサンチンを０．５重量％含有するＭＦ粉末飼料

【0037】

３．実験設計
個別に２種の実験を行った（図１）。アスタキサンチン摂取による急性効果を除くために、各飼料を摂取させた最終日の翌日にサンプルをあつめた。

【0038】

４．ＢｒｄＵ投与及びサンプリング
５−ブロモ−２’デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、チミジンアナログ分子として細胞周期のＳ期に細胞核へ取り込まれ、細胞の分裂や増殖、その後の生存を評価するのに用いられる。海馬神経新生を評価するためには、アスタキサンチン含有飼料を与える前日に、マウスに２回（午前８時及び午後８時）ＢｒｄＵ５０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内注射した。免疫組織化学のために、マウスに深麻酔を施し（ペントバルビタール、１００ｍｇ／ｋｇ体重）、０．９％生理食塩水を経心腔的に潅流させて血液を取り除いた。潅流後、すぐに脳を取り出した。脳を、免疫組織化学用（左脳）と、ＤＮＡマイクロアレイ用（右脳）とに分けた。すぐに右脳の海馬を解剖し、−８０℃で保存した。左脳は４％パラホルムアルデヒド溶液（ナカライテスク株式会社、京都府）において４℃で２４時間固定した。

【0039】

５．免疫組織化学
選択した連続脳切片を免疫蛍光染色により調べた。サンプルを凍結組織切片作成装置を用いて５０μｍの冠状切片とし、リンスした後、インキュベーションした。一次抗体には、ラットモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体及びマウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体を用いた。二次抗体には、Ｃｙ３ロバ抗ラット抗体及びＡｌｅｘａ４８８ロバ抗マウス抗体を用いた。

【0040】

Ｋｉ６７陽性細胞を調べるために、様々な連続切片を免疫蛍光染色に供した。切片を２％正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液（２％ＮＧＳ−ＰＢＴ）を用いてインキュベーションした。切片を４℃で４８時間２％ＮＧＳ−ＰＢＴで希釈した一次抗体とともにインキュベーションした。一次抗体は、ウサギモノクローナル抗Ｋｉ６７抗体及びマウスモノクローナル抗ＮｅｕＮであった。切片を４℃で２４時間適切な二次抗体とともにインキュベーションした。二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８抱合ロバ抗マウス抗体及びＣＦ５５５抱合ロバ抗ウサギ抗体であった。切片をＬｅｉｃａ ＤＭＲＢ光学顕微鏡で分析した。歯状回内の増殖細胞（Ｋｉ６７^＋）、新生細胞の生存（ＢｒｄＵ^＋）及び新生成熟細胞（ＢｒｄＵ^＋／ＮｅｕＮ^＋）といった標識細胞を計数した。細胞の総数は、全切片における平均細胞密度と歯状回総体積の積から計算した。

【0041】

６．モリス水迷路
モリス水迷路を日中（午後１時と午後４時の間）行った。非毒性顔料を添加して不透明化した水道水（２０〜２２℃）を入れた黒色プラスティック円形プール（直径１５０ｃｍ、バイオリサーチセンター株式会社、愛知県）でマウスを試験した。四分円のうちの１つの表面から０．５ｃｍ下には、透明のエスケーププラットフォーム（直径１５ｃｍ）があった。空間学習逃避訓練を、１０分間の休憩をはさんで、１日４回４日間おこなった。各訓練では、隠されたプラットフォームにたどり着くまで、又は最大６０秒間経過するまでマウスを泳がせた。マウスがプラットフォームを見つけられなかった場合には、プラットフォームへ誘導補助した。各訓練後に、マウスをプラットフォーム上で１０秒間待機させた。

【0042】

空間記憶力を評価するプローブテストでは、隠されたプラットフォームを取出し、マウスを６０秒間泳がせた。各四分円についやした総時間を記録した。各学習訓練及びプローブテストについての行動パラメータはビデオで記録した。

【0043】

７．ＤＮＡマイクロアレイ分析及びIngenuity Pathway Analysis（ＩＰＡ）
総ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、米国）を用いて粉末化サンプルから抽出した。総ＲＮＡの量及び質を、分光光度的に及びホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動により決定した。４種のランダムに選択したマウスから同量の総ＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ分析用にプールした。Agilent Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit （Agilent Technologies、米国）を用いてＤｙｅ−ｓｗａｐ法と組み合わせて、総ＲＮＡをＣｙ３又はＣｙ５の色素で標識した。ＰＬ群及びアスタキサンチン０．５％群サンプルの蛍光標識ターゲットを６０ｍｅｒのプローブとともに、同じマイクロアレイスライドにハイブリダイズさせた。生物学的機能及び遺伝子相互作用ネットワークを、ＩＰＡソフトウェアにより生成した。

【0044】

８．逆転写酵素ＰＣＲ
ｃＤＮＡ合成は、１μｇの総ＲＮＡを用いてAffinity Script QPCR cDNA Synthesis Kit（Agilent Technologies、米国）により実施した。反応混合物は一本鎖ｃＤＮＡ０．６μＬ、各プライマーセット７ｐｍｏｌ及びEmerald Amp PCR Master Mix（宝酒造株式会社、京都府）６．０μＬを含み、総量は１２μＬであった。Thermal cycling（C1000（商標）； Thermal Cycler; Bio-Rad Laboratories、米国カリフォルニア州）のパラメータは、９７℃５分間の最初の変性後、２２〜３８サイクルとして、サンプルを増幅させた。ＰＣＲ完了後、総反応混合物を１．６％アガロース（ナカライテスク株式会社、京都府）ゲルのウェルにのせた。次に、電気泳動を２０分間１００ボルトで、１×ＴＡＥ緩衝液においてMupid-exU 電気泳動装置（株式会社アドバンス、東京都）を用いて実施した。ゲルをエチジウムブロミドで７分間染色し、染色したバンドをImage Quant LAS 4000 system（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社、日本）を用いて可視化した。ｍＲＮＡ発現を各サンプルについて、Ｇａｐｄｈの ｍＲＮＡレベルに正規化した。

【0045】

９．統計分析
免疫組織化学及びプローブテストを、一元配置分散分析法により、続いてBonferroni's多重比較検定により分析した。ＲＴ−ＰＣＲについての群間（ＰＬ群ｖｓ０．５％群）の差の結果を、unpaired t-testにより分析した。逃避潜時及び遊泳速度を、二元配置反復測定分散分析法により、続いてpost-hocとしてのBonferroni's多重比較検定により分析した空間記憶とｍＲＮＡ発現との間の相関は、ピアソン相関分析法により計算した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５であった。

【0046】

結果
１．アスタキサンチンは成体海馬神経新生を高める
アスタキサンチン摂取が生体海馬神経新生を増大するのか否かを決定するため、マウスに種々含量（０％、０．０２％、０．１％及び０．５％）のアスタキサンチンを混ぜた餌を４週間与えた。多段階の生体海馬神経新生がアスタキサンチンにより影響されるのか否かを検討した。０．１％及び０．５％アスタキサンチンは、両者ともに対照に比べて、有意にＫｉ６７陽性細胞数を増加させた（神経前駆細胞の増殖）（Ｆ（_３，１９）＝７．９２、Ｐ＜０．０１）。同様に、０．１％及び０．５％のアスタキサンチンは、両者ともに対照よりも、新生神経の生存を示すＢｒｄＵ陽性細胞数が有意に高かった（Ｆ（_３，１９）＝１０．６５、Ｐ＜０．００１）。また、０．５％のアスタキサンチンは、０．０２％のアスタキサンチンに比べて、有意にＢｒＤＵ陽性細胞を増加させた（Ｐ＜０．０１）。他方、新生神経の成熟を示すＢｒｄＵ／ＮｅｕＮの二重陽性細胞数は、対照に比べて、０．５％アスタキサンチンでのみ有意に増大したが（Ｆ_{（３，１９）}＝４．７５、Ｐ＜０．０５）、０．１％アスタキサンチンではそうではなかった（図２）。これらの所見から、アスタキサンチンは用量依存的に全ての段階で成体海馬神経新生を高めることが示唆された。成体海馬神経新生という結果に基づき、０．５％のアスタキサンチンによる海馬での認知を評価したが、それは特には新生成熟神経の増大において、成人海馬神経新生に最も効果があった。

【0047】

２．アスタキサンチンは海馬依存認知機能を高める
用量依存的な実験の結果を受けて、新生神経の成熟を最も促進させるアスタキサンチンの摂取が海馬依存的な機能、例えば空間学習や記憶も高めるのか否かをモリス水迷路を用いて検討した。反復測定のための二元配置反復測定分散分析（群×日）により、逃避潜時について、日（Ｆ_{（３，５７）}＝２６．１１、Ｐ＜０．０００１）及び群（Ｆ_{（１，１９）}＝５．１６、Ｐ＜０．０５）に主な効果が示された（図３Ａ）。０．５％のアスタキサンチンの群はずっと早い学習曲線を描いたが、続くpost-hoc試験では、両群での学習パフォーマンスが向上した。また、０．５％のアスタキサンチンの群は、４日目のみ対照群よりも速い逃避潜時を示した（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、遊泳速度においては、両群間で、有意差はなく（Ｆ_{（１，１９）}＝０．６８、Ｐ＝０．４２）、遊泳能は学習時に観察された差異には影響しなかった（図３Ｂ）。学習期間の終わりに参照記憶を確認するため、隠されたプラットフォームを、最終訓練日後に、プローブテストのために取り除いた。プローブテストでは、他のいずれかの四分円に比べて、ターゲットとした四分円（ＮＷ）で、０．５％のアスタキサンチンの群のみが有意な時間を費やした（Ｆ_{（３，３９）}＝４．０７、Ｐ＜０．０５）（図３Ｃ）。これらの所見から、アスタキサンチンの摂取により、神経回路として成体海馬神経新生が増大したことによるであろう学習能力の向上だけでなく、空間記憶の保持が示唆された。

【0048】

３．アスタキサンチンは海馬遺伝子発現変化を差異的に誘導する
０．５％アスタキサンチンが誘導した成体海馬神経新生のうらにあるであろう分子機構を特定するために、ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いてマウス海馬で様々に発現される遺伝子を、０．５％アスタキサンチン群及びその対照群（０％アスタキサンチン）において比較した。多数のアスタキサンチン調節遺伝子を同定した。アスタキサンチンを４週間摂取後、３４８の遺伝子が上方制御（＞＝１．５倍変化）され、２２９の遺伝子が下方制御（＜＝０．７５倍変化）されていた。本研究で用いたＤＮＡマイクロアレイ分析の結果は、ＧＳＥ６２１９７のアクセッション番号でGene Expression Omnibus（ＧＥＯ）に寄託された。

【0049】

４．ＩＰＡでは遺伝子相互作用ネットワークのアスタキサンチンによる生物学的機能が明らかとなる
ＤＮＡマイクロアレイによりアスタキサンチンが誘導した遺伝子発現のデータセットが明らかとなったが、アスタキサンチン摂取に応答して、アノテーションされた遺伝子の生物学的機能、そして考えられる分子ネットワークを同定するためにＩＰＡを行った。アノテーションされた遺伝子は、１４１の上方制御遺伝子、そして１７６の下方制御遺伝子を明らかにした。

【0050】

本発明者らは２つの重要なネットワーク（２及び９）を選択し、アスタキサンチンにより高められる成体海馬神経新生に関連する可能性のある分子因子／経路を研究した（図４）。ネットワーク２では、広く脳機能のための神経内分泌ホルモンであるＰｒｌ遺伝子が、主な分子であった。Ｍａｐｋ（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）及びＣｒｅｂ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合）遺伝子が、このネットワークでのＰｒｌ遺伝子の可能性のある下流分子であると考えられた。ネットワーク９では、Ｉｔｇａ４（インテグリンアルファ４）遺伝子が上方制御され、Ｆａｋ（焦点接着キナーゼ）のための考えられる下流遺伝子がマッピングされた。他の上方制御遺伝子としては、抗炎症サイトカインであるＩｌ４（インターロイキン４）がその下流分子であるＰｉ３ｋ（ホスホイノシチド３キナーゼ）に関連していた。半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、各サンプルにおけるＰｒｌ、Ｉｔｇａ４及びＩｌ４関連下流因子の発現を確認した。

【0051】

５．ＲＴ−ＰＣＲによるアスタキサンチン特異的遺伝子発現の確認
ＩＰＡネットワーク分析によりアスタキサンチン摂取による成体海馬神経新生の増大に貢献しているであろうと考えられる分子経路が明らかとなった。確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを行い、１２の遺伝子を確認した。Ｉｔｇａ４、Ｉｌ４、Ｉｌ４ｒａ（インターロイキン４受容体アルファ）、Ｍａｐｋ１、Ｍａｐｋ７、Ｆａｋ、Ｊａｋ１（ヤーヌスキナーゼ１）、Ａｋｔ及びＣｒｅｂ（Ｐ＜０．５）のｍＲＮＡ発現が、対照に比べて０．５％のアスタキサンチンにより有意に増大していた。しかしながら、Ｐｒｌ（Ｐ＝０．１２）、ＰｒｌＲ（プロラクチン受容体）（Ｐ＝０．２８）及びＰｉ３ｋ（Ｐ＝０．０６）のｍＲＮＡ発現については、群間に有意差は見られなかった。これにより、ＤＮＡマイクロアレイ及びバイオインフォマティクス分析の充分な検証がなされた。

【0052】

６．アスタキサンチン特異的であると考えられる空間記憶に関連した分子
モリス水迷路の後に、空間学習及び記憶の根底にありアスタキサンチンにより誘導されると考えられる機構を調べるために、ＩＰＡ分析から仮定された遺伝子を確認した。モリス水迷路の後に、海馬組織を解剖し、アスタキサンチン誘導遺伝子を反復してＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ｍＲＮＡ発現を図５に示す。さらに、標的四分円についやした時間のパーセンテージは、Ｍａｐｋ７（ｒ＝０．５３、Ｐ＜０．０５）、Ｆａｋ（ｒ＝０．５８、Ｐ＜０．０５）、Ｊａｋ１（ｒ＝０．４９、Ｐ＜０．０５）及びＡｋｔ（ｒ＝０．５６、Ｐ＜０．０５）についてポジティブに相関していた。これらの所見から、アスタキサンチンにより高められた空間記憶は部分的に可能性のある分子因子の増大が介在していると実証された。

【0053】

考察
アスタキサンチン摂取は成体海馬神経新生を高め、空間分子回路による空間記憶を向上させた。ＤＮＡマイクロアレイ及びバイオインフォマティクス分析では、Ｐｒｌ、Ｉｔｇａ４及びＩｌ４遺伝子が成体海馬神経新生を促進すると考えられる因子であることが明確となり、空間記憶に関連して上方制御され、これらの遺伝子のいくつかの下流因子はアスタキサンチンにより空間記憶のパフォーマンスが高められることとポジティブに関連していた。これらの結果は、アスタキサンチン摂取が、関連すると考えられる分子を誘導することにより、空間記憶の向上のために、成体海馬神経新生の段階的な進行を促すことに効果的な役割を果たしていることを示す。

【0054】

本発明者らは、まずアスタキサンチン摂取が成体海馬神経新生について、ポジティブで用量依存的な効果を有するのか否かを調べた。結果は、明らかに用量依存的に、アスタキサンチンが成体海馬神経新生の２つの発達段階（増殖及び成熟／生存）において効果を奏することを示し、０．５％で最も効果的であった。脳、特には海馬に及ぼすアスタキサンチンの有益な効果は、末梢での抗酸化効果（０．０２％アスタキサンチン）に必要とされるよりも高い用量を必要とするようであった。効果は、アスタキサンチンが、インビボでの細胞増殖及び成熟を含む、多段階による成体海馬神経新生を高めるということに特有であった。新生細胞の増殖を示すＫｉ６７陽性細胞数は、０．１％及び０．５％アスタキサンチンで増大した。しかしながら、新生神経の成熟（ＢｒｄＵ⁻／Ｎｅｕ^＋）は０．５％アスタキサンチンでのみ増大しており、特には新生成熟神経の増大、成体海馬神経新生の進行のための最も有効な用量として０．５％アスタキサンチンが海馬機能に直接関係することが示された。

【0055】

新たな証拠から、マウスにおけるアスタキサンチン誘導成体海馬神経新生による海馬依存性の空間学習及び記憶に有益な効果が示された。０．５％アスタキサンチン群は、モリス水迷路での記憶習得の４日目に優れた学習を発揮し、プローブテストの間、空間記憶の保持を高めた。新生神経は海馬依存性の学習及び記憶に機能的に決定的な役割を担うことを示す証拠は増えている。本実施例により、０．５％アスタキサンチンの機能的な結果を空間行動実験とともに特定したが、アスタキサンチンにより高められた成体海馬神経新生は特異的な用量で海馬依存性の学習及び記憶において支配的な役割を果たすことが示された。この結果はモリス水迷路における空間記憶が歯状回での新生神経とポジティブに関連することにより支持されている。これまでに、海馬依存性の認知機能についての効果が示されたことはなかった。本発明者らはモリス水迷路を用いて海馬依存性の空間記憶についてのアスタキサンチンの新たな効果を示した。よって、アスタキサンチンは成体マウスで海馬神経新生とともに、空間学習及び記憶を高めるのに有益な化合物であった。

【0056】

ニュートリゲノミクス研究によれば、栄養性の化合物により導かれる適応性変化の背景にある分子メカニズムを理解するための優れた機会が与えられる。本発明者らは、４１，２５２個のプローブからなる全ゲノムＤＮＡマイクロアレイチップを用いて、０．５％アスタキサンチンにより導かれる特有の海馬遺伝子プロファイルを得、そして続くＩＰＡにより成体海馬神経新生及び空間記憶に関する２つの顕著な分子ネットワーク２及び９を特定した。多数の遺伝子のうち、Ｐｒｌは最も上方制御された遺伝子であり、ネットワーク２では鍵となる因子も見つかった。成体海馬神経の進行に深く関与するＭａｐｋ及びＣｒｅｂ遺伝子も、Ｐｒｌ遺伝子の下流にありうる因子としてこのネットワークに現れた。ＰＲＬタンパク質は、ＭＡＰＫ７発現により介在する成体海馬神経新生及び海馬神経可塑性における重要な制御因子として報告されてきた。別の顕著な遺伝子候補はＣｓｈ１（絨毛性乳腺刺激ホルモン様１）であり、これはマウスにおけるＧｈ（成長ホルモン）としてよく知られている。海馬におけるＧｈのｍＲＮＡ及びその受容体の存在は、成体海馬神経新生及び空間記憶の制御に関係していると以前に報告されている。よって、ＰＲＬやＧＨといった神経内分泌ホルモンが、アスタキサンチンにより高められた成体海馬神経新生や空間記憶に制御因子として関与する可能性がある。

【0057】

さらには、０．５％アスタキサンチンは、ＬＩＭホメオドメイン転写ファミリーのメンバーであるＬｈｘ８（ＬＩＭホメオボックス８）、Ｉｓｌ１（ＩＳＬ ＬＩＭホメオボックス１）及びＨｏｘｂ２（ホメオボックスＢ２）遺伝子を下方制御した。これらの因子は出生後段階では神経発達の重要な制御因子であるが、いくつかのＬＩＭホメオボックス遺伝子は神経活性による出生後及び成体海馬の両者で差次的に制御される。

【0058】

ネットワーク９では、海馬での機能があまり知られていないＩｔｇａ４遺伝子も同定された。抗炎症サイトカインであるＩｌ４遺伝子も鍵モジュールであるとして同定され、神経活性の潜在的な制御因子として働くので、その欠損は空間記憶の障害に至るであろう。

【0059】

まとめると、アスタキサンチン摂取によれば、成体海馬神経新生及び空間記憶が高められる。ＤＮＡマイクロアレイ及びバイオインフォマティクス分析により、海馬依存性の認知機能についてアスタキサンチンの神経原性効果に新たな分子見識が得られた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】