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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2017-221133(P2017-221133A)
(43)【公開日】2017年12月21日
(54)【発明の名称】セルロース三次元構造体及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/04 20060101AFI20171124BHJP
C08B 11/04 20060101ALI20171124BHJP
C12M 3/00 20060101ALN20171124BHJP
C12N 11/12 20060101ALN20171124BHJP
【ＦＩ】
C12P19/04 Z
C08B11/04
C12M3/00 A
C12N11/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】28
(21)【出願番号】特願2016-118227(P2016-118227)
(22)【出願日】2016年6月14日
(71)【出願人】
【識別番号】000004444
【氏名又は名称】ＪＸＴＧエネルギー株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100091096
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100118773
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節
(74)【代理人】
【識別番号】100169579
【弁理士】
【氏名又は名称】村林 望
(72)【発明者】
【氏名】芹澤 武
(72)【発明者】
【氏名】澤田 敏樹
(72)【発明者】
【氏名】田中 浩士
(72)【発明者】
【氏名】野原 崇稔
(72)【発明者】
【氏名】三橋 秀一
(72)【発明者】
【氏名】高橋 季之
(72)【発明者】
【氏名】西澤 剛
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
4B064
4C090
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC02
4B033NA22
4B033NB45
4B033NB69
4B033ND16
4B064AF12
4B064BJ10
4B064CA21
4B064CD09
4C090AA02
4C090AA05
4C090BA34
4C090BC30
4C090CA43
4C090CA46
(57)【要約】
【課題】新規な特性を有するセルロース構造体を提供することを目的とする。【解決手段】セロデキストリンホスホリラーゼ(CDP)を用いたセルロースの合成において、繰り返し単位を有する親水性置換基を有するグルコース誘導体を利用することで、新規な特性を有するセルロース三次元構造体を合成する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次式(I):
[式中、
Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体。
【化1】
Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体。
【請求項2】
繰り返し単位を有する親水性置換基がオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマーから成る群より選択される、請求項１記載のセルロース三次元構造体。
【請求項3】
繰り返し単位を有する親水性置換基が分子量30〜2000を有する、請求項１又は２記載のセルロース三次元構造体。
【請求項4】
オリゴエチレングリコールが次式(II)：
(式中、nは、1〜40である)
で示される化合物である、請求項２又は３記載のセルロース三次元構造体。
【化2】
で示される化合物である、請求項２又は３記載のセルロース三次元構造体。
【請求項5】
nが2〜8である、請求項４記載のセルロース三次元構造体。
【請求項6】
溶媒を含む三次元網目構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のセルロース三次元構造体。
【請求項7】
溶媒を含む三次元網目構造が、溶媒を含むスポンジ状である、請求項６記載のセルロース三次元構造体。
【請求項8】
三次元網目構造におけるリボン構造が10〜800nmの幅を有する、請求項６又は７記載のセルロース三次元構造体。
【請求項9】
請求項１〜８のいずれか１項記載のセルロース三次元構造体を含む足場材。
【請求項10】
請求項１〜８のいずれか１項記載のセルロース三次元構造体を含むセンサー。
【請求項11】
α-D-グルコース一リン酸と、プライマーとして次式(III):
(式中、Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基である)
で示されるグルコース誘導体を、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、次式(I):
[式中、
Aは、前記と同一であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体の製造方法。
【化3】
で示されるグルコース誘導体を、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、次式(I):
【化4】
Aは、前記と同一であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体の製造方法。
【請求項12】
繰り返し単位を有する親水性置換基がオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマーから成る群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項13】
繰り返し単位を有する親水性置換基が分子量30〜2000を有する、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項14】
オリゴエチレングリコールが次式(II)：
(式中、nは、1〜40である)
で示される化合物である、請求項１２又は１３記載の方法。
【化5】
で示される化合物である、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項15】
nが2〜8である、請求項１４記載の方法。
【請求項16】
セルロース三次元構造体が溶媒を含む三次元網目構造を有する、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項17】
溶媒を含む三次元網目構造が、溶媒を含むスポンジ状である、請求項１６記載の方法。
【請求項18】
三次元網目構造におけるリボン構造が10〜800nmの幅を有する、請求項１６又は１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、例えば人工的に合成したセルロース三次元構造体並びにその製造方法及び利用に関する。
【背景技術】
【0002】
セルロースは、地球上で最も豊富に存在する有機高分子である。セルロースは、その資源性に加え、高いサステイナビリティをもつことから、注目されているマテリアル素材である。機械的処理や化学的処理によって天然物から得られるセルロースは、繊維状の形態であることが知られており、その構造や物性に応じた利用が展開されている。また、天然資源を酸処理することによって得られるセルロースナノ結晶(CNC)は、新たなセルロース素材としての利用が期待されている。CNCは、セルロース鎖が平行に配列したI型結晶構造を有し、高いアスペクト比や優れた機械的強度、熱的安定性等から複合材料のフィラーとして注目されている。
【0003】
一方、結晶性のセルロースが人工的にも合成できることが知られている（人工合成で得られるセルロースは一般にオリゴマーであることから、このようなセルロースはセロデキストリンと呼ばれる。ここでは、区別せずにすべてセルロースと呼ぶ）。下記の反応は、セロデキストリンホスホリラーゼ(CDP)の逆反応を利用したセルロースの酵素合成を示す。
【0004】
【化1】
【0005】
上記反応に示すように、加リン酸分解酵素であるCDPの逆反応を利用した酵素合成により、長さ数μm、幅数百nm、厚さ4.5nmのナノシート構造を有するセルロース結晶(セルロースナノシート；CNS)が得られる(非特許文献１)。当該合成においては、プライマーとして働くD-(+)-グルコースに対して、α-D-グルコース一リン酸(αG1P)がモノマーとして逐次的に重合される。CDPが本来加水分解する基質に対する認識能と比較し、セルロース合成に用いられるD-(+)-グルコースは認識されにくいものの、結果として首尾良く重合反応が進む。また、CNSは、天然由来のI型結晶とは異なり、より安定な逆平行鎖のII型結晶構造を有する。そのため、CNS内でセルロース鎖は厚さ方向に逆平行に配列しており、結果としてセルロースの還元末端及び非還元末端がシート表面に規則的に露出している。また、CNSは純水に安定に分散するが、NaOH水溶液に溶解する性質を有する。
【0006】
さらに、本発明者の一部は、上記CDPを利用したセルロースの酵素合成において、プライマーとしてC2-5-直鎖状アルキル基又はC2-5を主鎖とする分岐状アルキル基を有するグルコース誘導体を用いることで、スポンジ状の構造等の溶媒を含む三次元網目構造を有するセルロースナノ構造体を作製できること(国際出願番号PCT/JP2015/071047)、また水溶性高分子存在下で同様にセルロースを合成すると、その二次元結晶がさらに成長し、ナノリボン状のネットワーク構造を形成することを見出した(国際出願番号PCT/JP2016/057253)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Hiraishi, M. et al., Carbohydr. Res., 2009年, Vol. 344, pp. 2468-2473
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上述のCDPを用いたセルロースの合成において、多様な置換基を有するグルコース誘導体を利用することで、セルロース分子間の相互作用が変化し、新規な特性を有するセルロース構造体を合成できると考えられる。
【0009】
そこで、本発明は、これらの実情に鑑み、CDPを用いたセルロースの合成において、多様な置換基を有するグルコース誘導体を利用することで、新規な特性を有するセルロース構造体を合成することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、CDPを用いたセルロースの合成において、繰り返し単位を有する親水性置換基を有するグルコース誘導体を利用することで、新規な特性を有するセルロース三次元構造体を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本発明は、以下を包含する。（１）次式(I):
【化2】
Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体。
【0012】
（２）繰り返し単位を有する親水性置換基がオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマーから成る群より選択される、（１）記載のセルロース三次元構造体。（３）繰り返し単位を有する親水性置換基が分子量30〜2000を有する、（１）又は（２）記載のセルロース三次元構造体。
【0013】
（４）オリゴエチレングリコールが次式(II)：【化3】
で示される化合物である、（２）又は（３）記載のセルロース三次元構造体。
【0014】
（５）nが2〜8である、（４）記載のセルロース三次元構造体。（６）溶媒を含む三次元網目構造を有する、（１）〜（５）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体。
（７）溶媒を含む三次元網目構造が、溶媒を含むスポンジ状である、（６）記載のセルロース三次元構造体。
（８）三次元網目構造におけるリボン構造が10〜800nmの幅を有する、（６）又は（７）記載のセルロース三次元構造体。
（９）（１）〜（８）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体を含む足場材。
（１０）（１）〜（８）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体を含むセンサー。
【0015】
（１１）αG1Pと、プライマーとして次式(III):【化4】
で示されるグルコース誘導体を、CDPと反応させる工程を含む、次式(I):
【化5】
Aは、前記と同一であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体の製造方法。
【0016】
（１２）繰り返し単位を有する親水性置換基がオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマーから成る群より選択される、（１１）記載の方法。（１３）繰り返し単位を有する親水性置換基が分子量30〜2000を有する、（１１）又は（１２）記載の方法。
【0017】
（１４）オリゴエチレングリコールが次式(II)：【化6】
で示される化合物である、（１２）又は（１３）記載の方法。
【0018】
（１５）nが2〜8である、（１４）記載の方法。（１６）セルロース三次元構造体が溶媒を含む三次元網目構造を有する、（１１）〜（１５）のいずれか１記載の方法。
（１７）溶媒を含む三次元網目構造が、溶媒を含むスポンジ状である、（１６）記載の方法。
（１８）三次元網目構造におけるリボン構造が10〜800nmの幅を有する、（１６）又は（１７）記載の方法。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、足場材等の医療分野、及びセンサー等の環境・エネルギー分野において有用なセルロース三次元構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】反転倒立試験によるスポンジ化挙動の評価を示す。(a) Glc-EG2、(b) Glc-EG4、(c) Glc-EG6、(d) Glc-EG8、(e) D-グルコースをプライマーとして調製したサンプルの反転倒立試験の結果をそれぞれ示す。
【図2】OEG化セルロースの1H NMRスペクトルを示す。(a) Glc-EG2、(b) Glc-EG4、(c) Glc-EG6、(d) Glc-EG8をプライマーとして調製したスポンジ状セルロース構造体の構成成分を1H NMR測定した結果をそれぞれ示す。
【図3】OEG化セルロースのMALDI-TOF-MSスペクトルを示す。(a) Glc-EG2、(b) Glc-EG4、(c) Glc-EG6、(d) Glc-EG8をプライマーとして調製したスポンジ状セルロース構造体の構成成分をMALDI-TOF-MS測定した結果をそれぞれ示す。
【図4】OEG化セルロースのATR/FTIRスペクトルを示す。(a) Glc-EG2、(b) Glc-EG4、(c) Glc-EG6、(d) Glc-EG8をプライマーとして調製したスポンジ状セルロース構造体の構成成分をATR/FTIR測定した結果をそれぞれ示す。
【図5】OEG化セルロースのWAXDチャートを示す。(a) Glc-EG2、(b) Glc-EG4、(c) Glc-EG6、(d) Glc-EG8をプライマーとして調製したスポンジ状セルロース構造体の構成成分をWAXD測定した結果をそれぞれ示す。
【図6】OEG化セルロースのSEM像を示す。(a) Glc-EG2、(b) Glc-EG4、(c) Glc-EG6、(d) Glc-EG8をプライマーとして調製したスポンジ状セルロース構造体を溶媒置換し、凍結活断したサンプルをSEM観察した結果をそれぞれ示す。スケールバーは1 μmを示す。
【図7】OEG化セルロースを構成するナノリボンのAFM像を示す。(a, e) Glc-EG2、(b, f) Glc-EG4、(c, g) Glc-EG6、(d, h) Glc-EG8をプライマーとして調製したスポンジ状セルロース構造体を機械的に破壊してスピンキャストしたサンプルをAFM観察した結果をそれぞれ示す。スケールバーは(a)-(d)は5 μm、(e)-(h)は500 nmを示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
１．本発明に係るセルロース三次元構造体本発明に係るセルロース三次元構造体は、次式(I):
【化7】
Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するものである。天然由来のセルロース鎖が平行に配列したI型セルロース構造とは異なり、本発明に係るセルロース三次元構造体は、より安定な逆平行鎖のII型セルロース構造を有する。
【0022】
また、本発明に係るセルロース三次元構造体は、構成成分のセルロース誘導体における繰り返し単位を有する親水性置換基の存在により、溶媒を含む三次元構造体、より具体的には、溶媒を含むスポンジ状の構造(リボン状セルロースのネットワーク)等の溶媒を含む三次元網目構造を有する三次元構造体となる。当該三次元構造体においては、網目構造中の空隙が外面につながっている(よって、溶媒(水分)が外に出る)状態である。従って、当該三次元構造体は、押す(圧力をかける)と、圧力に応じた構造の崩壊を伴いながら、溶媒(水分)が外面に出る構造を有する。
【0023】
さらに、本発明に係るセルロース三次元構造体は、置換基としてオリゴエチレングリコール等の繰り返し単位を有する親水性置換基を有することで、国際出願番号PCT/JP2016/057253に記載するように天然セルロース、PEG等を合成中に添加しなくても三次元網目構造を形成できる。
【0024】
また、国際出願番号PCT/JP2015/071047に記載するように、アルキル基の直鎖数が大きくなると、三次元網目構造体を形成せずに、沈殿物を生じる問題があった。一方、本発明に係るセルロース三次元構造体によれば、繰り返し単位を有する親水性置換基の長さを調整する事で構造体のスポンジ形状を維持したまま、当該リボン構造の幅を変える事ができる。本発明に係るセルロース三次元構造体の三次元網目構造におけるリボン構造は、例えば10〜800nm、好ましくは50〜500nmの幅を有する。
【0025】
ここで、置換基Aの繰り返し単位を有する親水性置換基としては、例えばオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマー等が挙げられる。また、当該繰り返し単位を有する親水性置換基は、例えば分子量30〜2000、好ましくは60〜1000を有するものであって良い。特に、オリゴエチレングリコールとしては、次式(II)：【化8】
で示される化合物が挙げられる。
【0026】
式(I)の化合物の重合度は、例えば7以上、好ましくは8以上(すなわち、式(I)の化合物において、mが5以上、好ましくは6以上)であり、且つ12以下、好ましくは11以下(すなわち、式(I)の化合物において、mが10以下、好ましくは9以下)である。
【0027】
２．本発明に係るセルロース三次元構造体の製造方法以上に説明した本発明に係るセルロース三次元構造体は、以下に示される反応に準じて製造することができる。
【0028】
【化9】
【化10】
【0029】
αG1P及び式(III)のグルコース誘導体は、市販品として入手できるものであってよい。また、式(III)のグルコース誘導体は、例えばZ. Shiら, J. Agric. Food Chem., 2014年, 62, 3287-3292等に記載の方法に準じて合成することもできる。特に、繰り返し単位を有する親水性置換基Aとしてオリゴエチレングリコールを有する式(III)のグルコース誘導体(本明細書では、「Glc-EGn」(式中、Glcはグルコースであり、EGnは上記式(II)の化合物であり、且つnは当該式(II)の化合物におけるnと同一である)と称する場合がある)は、例えば下記実施例に示すように、B. Raoら, Chem. Commun., 2013年, 49, 10808-10810に記載の方法を参考にして合成することができる(なお、本明細書では、Glc-EGnをプライマーとして用いて作製した本発明に係るセルロース三次元構造体を、「OEG(オリゴエチレングリコール)化セルロース」と称する場合がある)。
【0030】
一方、CDPは、例えばM. Krishnareddyら, J. Appl. Glycosci., 2002年, 49, 1-8に記載の方法に準じて調製することができる。具体的には、M. Krishnareddyら, J. Appl. Glycosci., 2002年, 49, 1-8によれば、Clostridium thermocellum YM4株由来のCDPを調製することができる。
【0031】
また、CDPの酵素量は、例えばαG1PとD-(+)-セロビオース及びCDPをインキュベーションし、CDPにより生成されるリン酸を定量し、1分間当たり1 μmolのリン酸を遊離する酵素量を1Uとして求めることができる。
【0032】
例えば、10〜1000mM(好ましくは100〜300mM)のαG1P、10〜200 mM(好ましくは50〜60 mM)の式(III)のグルコース誘導体、及び0.01〜1.5U/mL(好ましくは0.05〜0.50 U/mL)のCDPを、100〜1000mM(好ましくは250〜750 mM)の2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液(pH 7.0〜8.0（好ましくはpH 7.5）)中で混合し、10〜80℃(好ましくは、20〜60 ℃)で0.5〜30日間(好ましくは、1〜14日間)インキュベートし、反応させる。このようにして、本発明に係るセルロース三次元構造体を製造することができる。
【0033】
３．本発明に係るセルロース三次元構造体の用途３−１．医療分野
３−１−１．細胞培養足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その表面に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。
【0034】
生育させる細胞としては、動物由来であれば良く、例えば哺乳類、爬虫類、又は昆虫由来の細胞が挙げられる。また、心臓、肝臓、脾臓、表皮等の臓器や組織から分離した初代培養細胞でも、継代培養した株化細胞、腫瘍細胞でも良い。さらに、間葉系幹細胞(MSC)等の体性幹細胞、人工多能性幹細胞、CHO細胞、BHK細胞、Vero細胞等の細胞株(Cell Line)等でも良い。
【0035】
細胞培養に用いる培地としては、平衡塩類溶液にアミノ酸やビタミン等の低分子化合物を加えた基礎培地が挙げられる。さらに、血清或いは血清・組織抽出物、加水分解物、成長因子、ホルモン、搬送体タンパク質、脂質、ポリアミン酸、微量元素、ビタミン、増粘剤、界面活性剤、細胞接着因子等を添加した培地を使用することもできる。
【0036】
当該セルロース三次元構造体を、薄膜状に成形して、薄膜の表面で細胞を培養できる。栄養成分を薄膜底面からも供給することで培養効率を高めることができる。
【0037】
当該セルロース三次元構造体上に単層状に生育した細胞は、細胞剥離剤にて剥離し回収することができる。細胞剥離剤には、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等の2価カチオン除去のためのキレート剤、細胞・基質間、細胞・細胞間接着タンパク質のためのトリプシン等のプロテアーゼを用いることもできるし、セルラーゼにより当該セルロース三次元構造体の一部又は全部を分解し、可溶化することで細胞を剥離することもできる。プロテアーゼを用いない後者の方法では、細胞・細胞間の接着は剥離することなく、また細胞への影響も無いことから、活性の高い懸濁細胞又は細胞シートを得ることができる。
【0038】
得られた細胞シートは、同様に得られた細胞シートと積層するか、或いは細胞シートの表面を細胞間接着タンパク質等でコートし、さらに細胞を培養することで、三次元的に厚みを持った細胞塊を得ることができる。
【0039】
３−１−２．高濃度細胞培養用足場材本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
【0040】
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。また、培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。
【0041】
当該セルロース三次元構造体中で細胞を培養することで、浮遊懸濁培養の際に起こる撹拌のせん断応力による細胞の傷害が起こらず、培養液当たりの細胞の高濃度化が可能となる。
【0042】
また、抗体やタンパク質等のバイオ医薬品の生成能を付与したrCHO細胞等を当該セルロース三次元構造体で高濃度に培養すれば、バッチ当たりの抗体やタンパク質等の生産量が増大し、バイオ医薬品の製造コスト低減が可能である。さらに、目的生産物を回収後、新しい培地を添加し、再度培養を行うか、或いは連続的に目的生産物を含む培地を回収し、新しい培地を追加添加することで、バッチ連続式又は連続式に生産物を得ることができる。
【0043】
さらに、高濃度培養した細胞は、足場材として利用したセルロース三次元構造体をセルラーゼ処理に供することで、プロテアーゼ処理の際に起こるような細胞への傷害を起こさずに細胞を遊離させ、回収することができる。iPS細胞やES細胞等の全能性幹細胞を当該手法で大量に培養し、再生医療や創薬産業のために必要な細胞を供給することができる。
【0044】
３−１−３．三次元構造体足場材本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
【0045】
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。
【0046】
当該セルロース三次元構造体を、細胞培養の前、途中又は後に、目的組織に合わせた形状に成形し、生体組織又は臓器の再生のために用いることができる。細胞培養の前に成形する場合、当該セルロース三次元構造体の重合反応時に目的の形状の型枠で反応させることもできるし、成形後に切断、積層、編み込み等で目的の形状にすることができる。
【0047】
当該セルロース三次元構造体は、セルラーゼ処理により、細胞へ影響することなく分解可溶化することができる。臓器への移植する前に、セルラーゼ処理に供し、部分的に、又は全部を分解可溶化しても良いし、セルラーゼ処理に供することなく足場材と共に移植しても良い。
【0048】
さらに、細胞を生育させた三次元構造体は、組織又は臓器の形状や機能を生体外(ex vivo)で再現したものとして、癌転移の機構解明、制癌剤の薬効評価等の基礎医学研究用、或いは、近年動物試験が禁止された化粧品の皮膚等の生体組織への影響を検討するための素材として利用することができる。
【0049】
３−１−４．骨欠損部位への移植材料本発明に係るセルロース三次元構造体は、動物の骨欠損部位への移植材料、歯周組織の再生誘導材料としても使用することができる。当該セルロース三次元構造体は、容易に望む形に成形加工することができ、高圧蒸気による滅菌も可能である。当該セルロース三次元構造体は、移植する前に細胞を生着させても良いし、そのまま移植しても良い。
【0050】
３−２．環境・エネルギー分野下記に説明するように、本発明に係るセルロース三次元構造体は、フィルム(例えば、微多孔性のフィルム(用途例：セパレータ、吸着材、バイオセンサー等）、緻密なフィルム(用途例：バリアフィルム等))として環境・エネルギー分野において使用することができる。
【0051】
３−２−１．電池セパレータ用途本発明に係るセルロース三次元構造体は、例えばリチウムイオン電池等の二次電池向けのセパレータとしても用いることができる。セパレータとして用いることにより、従来のポリオレフィン製のセパレータに比べ、高い耐熱性を有するため、例えば、過充電等により、電池が異常発熱した場合に、セパレータが融解し、内部短絡することを防ぐことができ、安全性を向上させることができる。また、親水性置換基の存在により、一般的に電池に用いられる極性溶媒等をより保持しやすく、安定したイオン伝導性、すなわち電池の入出力特性の維持が期待でき、寿命を向上させることが可能である。
【0052】
３−２−２．吸着材、濃縮(生分解性)本発明に係るセルロース三次元構造体は、シリカ、アルミナ、ゼオライト、プルシアンブルー等の吸着材微粒子を分散、担持させることにより、アンモニア、アルデヒド等の有毒ガス、放射性廃棄物等の有害物質、海水中の有価金属等を吸着回収することが可能である。
【0053】
また、当該セルロース三次元構造体は、分解酵素を用いて簡単に分解可能であることから、吸着回収した物質を必要に応じて簡単に濃縮することができるといった特長も有する。
【0054】
３−２−３．バイオセンサー本発明に係るセルロース三次元構造体は、酵素や抗体を担持することによってバイオセンサーとして使用することができる。例えば、グルコースオキシダーゼ等の酵素を担持すればグルコースセンサーとして使用することが可能であり、親水性置換基を活用し、例えば、ナトリウムイオン等のイオン伝導特性を観測すれば、血中のナトリウムイオン濃度等を計測するセンサーとして使用することが可能である。
【0055】
３−２−４．ガスバリアシート(構造体も含む)本発明に係るセルロース三次元構造体に無機ナノ材料を緻密に担持させることにより、例えば水蒸気等のガスを遮断するガスバリアシートとすることができる。無機ナノ材料としては、シリカ等のナノ粒子、又はモンモリロナイト等のクレイが挙げられる。これら無機ナノ材料と親水性置換基とは親和性が高く、強く相互作用するため、無機ナノ材料を強固に取り込んだ複合材料を形成し、バリア性を向上させることが可能である。
【0056】
３−２−５．放熱シート本発明に係るセルロース三次元構造体に高熱伝導率を持つ材料を緻密に担持させることにより、放熱材料として使用することが可能である。高熱伝導率を持つ材料としては、ダイヤモンド、グラフェン、カーボンナノチューブ等の炭素系材料、銀、銅、金、アルミニウム等の金属材料、アルミナ、マグネシア、六方晶窒化ホウ素等の無機材料等が挙げられる。また、親水性置換基により、シート表面を柔らかくすることが可能であり、発熱体との密着性を改善させ、熱界面抵抗を低減することにより、放熱性を改善することが可能である。
【0057】
３−２−６．蓄熱シート本発明に係るセルロース三次元構造体に蓄熱性を有する材料を分散、担持させることにより、蓄熱材として使用することが可能である。蓄熱材としては、エリスリトール、酢酸ナトリウム3水塩、硫酸ナトリウム10水塩、パラフィン、Fe-Co合金等の潜熱蓄熱材、その他、顕熱蓄熱材、化学蓄熱材等が挙げられる。潜熱蓄熱材は物質の相転移を利用するものであり、固液相転移を利用する蓄熱材の場合は、液状となった場合に漏洩が生じないように工夫する必要があり、例えば石油樹脂等のカプセル内に包含させる方法がある。
【0058】
３−２−７．分離精製の基材(カラムの充填剤、電気泳動)本発明に係るセルロース三次元構造体は、ナノサイズの空間を有しているため、当該空間を利用して分離精製カラムや電気泳動の充填剤として用いることが可能である。
【実施例】
【0059】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0060】
〔OEG化セルロースオリゴマーからなる三次元構造体の酵素合成〕１．実験方法
１−１．試薬
LB-BROTH LENNOX及びLB-AGAR LENNOXはフナコシより購入した。
グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル-β-D(-)-チオガラクトピラノシド (Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside: IPTG)、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (N,N,N',N'-Tetramethyl ethylenediamine: TEMED)、ジチオトレイトール (Dithiothreitol: DTT)、1-ブタノール、αG1P二ナトリウム・n水和物、40％重水酸化ナトリウム重水溶液、モレキュラーシーブス4A、ダウエクスTM50WX4 100-200メッシュ強酸性陽イオン交換樹脂は和光純薬より購入した。
【0061】
ジクロロメタン、酢酸エチル、シリカゲル60N (40-100 μm, 球状、中性) は関東化学より購入した。
【0062】
O-ペンタアセチル-β-D-グルコシド、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、テトラエチレングリコールモノメチルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノメチルエーテル、オクタエチレングリコールモノメチルエーテル、三ふっ化ホウ素ジエチルエーテル、p-アニスアルデヒドは東京化成より購入した。
【0063】
ニッケル-ニトリロ三酢酸 (Ni-NTA) アガロースゲルはQIAGENより購入した。Protein Molecular Weight Marker (Broad) はタカラバイオより購入した。
【0064】
アクリルアミド、N-N'-メチレンビスアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム (Sodium dodecyl sulfate: SDS)、過硫酸アンモニウム (Ammonium persulfate: APS)、重水、2,5-ジヒドロキシ安息香酸 (2,5-Dihydroxybenxonic acid: DHBA)、ProteoMassTMBradykinin fragment 1-7 MALDI-MSスタンダード (Bradykinin)、ProteoMassTM P14R MALDI-MSスタンダード(P14R)、ProteoMassTMACTH Fragment 18-39 MALDI-MSスタンダード (ACTH)、トリフルオロ酢酸 (TFA)、アセトニトリルはSigma-Aldrichより購入した。
【0065】
カーボンテープ、ドータイトは日新EMより購入した。その他の試薬は、特に表記しない限りナカライテスクより購入し、特級以上の試薬を使用した。
【0066】
超純水は、Milli-Qシステム (Milli-Q Advantage A-10, Merck Millipore) で精製された水を使用した。
【0067】
純水はTANK 60 Lite PE (Merck Millipore) で精製された水を使用した。乾燥ジクロロメタンはGlass Contour有機溶剤精製装置 (Nikko Hansen) で精製されたジクロロメタンを使用した。
【0068】
１−２．CDPの調製及び酵素活性評価CDPは、M. Krishnareddyら, J. Appl. Glycosci., 2002年, 49, 1-8に記載の方法と同様の方法により調製した。
【0069】
１−２−１．試薬の調製(1) 滅菌精製水
500 mL広口メディウム瓶に超純水500 mLを採取してオートクレーブ (121 ℃、20 min、BS-245、TOMY) して室温で保存した。
(2) 50 mg/mLカナマイシンストック溶液
カナマイシン硫酸塩1.5 gを滅菌精製水に溶解させ、30 mLにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン (Polyvinylidene difluoride: PVDF) 製0.22 μmフィルターで濾過滅菌し、1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して-20 ℃で保存した。
(3) 10 mM IPTGストック溶液
IPTG 71.5 mgを滅菌精製水に溶解させ、30 mLにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でPVDF製0.22 μmフィルターで濾過滅菌した。1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して-20 ℃で保存した。
(4) LB-AGAR/カナマイシンプレート
250 mL広口メディウム瓶にLB-AGAR LENNOX 2.8 gを採取し、超純水80 mLを添加して溶解させてオートクレーブした。60 ℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で50 mg/mLカナマイシンストック溶液80 μLを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、4 ℃で保存した。調製後1ヶ月以内に使用した。
(5) 50％グリセロール溶液
250 mL広口メディウム瓶にグリセロール50 mL、超純水50 mLを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
(6) LB培地
500 mL広口メディウム瓶にLB-BROTH LENNOX 10 gを純水500 mLに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
(7) MOPS-Na緩衝液(20 mM、pH 7.5)
3-モルホリノプロパンスルホン酸 (MOPS) 4.18 gを約600 mLの超純水に溶解させた。4 N水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、1 Lにメスアップした。PVDF製0.10 μmフィルターで濾過滅菌して4 ℃で保存した。
(8) 70％エタノール (バイオテクノロジーグレード)
エタノール (バイオテクノロジーグレード) 140 mL及び超純水60 mLを250 mL広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
(9) 洗浄バッファー (20 mM MOPS、300 mM NaCl、10 mMイミダゾール、pH 7.5)
MOPS 2.09 g、塩化ナトリウム8.77 g、イミダゾール340 mgを約350 mLの超純水に溶解させた。4 N水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、500 mLにメスアップした。PVDF製0.10 μmフィルターで濾過滅菌して4 ℃で保存した。
(10) 溶出バッファー (20 mM MOPS、300 mM NaCl、250 mMイミダゾール、pH 7.5)
MOPS 2.09 g、塩化ナトリウム8.77 g、イミダゾール8.51 gを約350 mLの超純水に溶解させた。4 N水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、500 mLにメスアップした。PVDF製0.10 μmフィルターで濾過滅菌して4 ℃で保存した。
(11) 5％ (w/v) アジ化ナトリウムストック溶液
アジ化ナトリウム500 mgをプラスチック製スパチュラにより秤量してMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) を添加して全量が10 mLとなるよう溶解させて4 ℃で遮光保存した。
(12) 30％アクリルアミド/ビス混合溶液
アクリルアミドは劇物であるため、調製には細心の注意を払った。アクリルアミド29.2 g、N-N'-メチレンビスアクリルアミド0.8 gを約70 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が100 mLになるようにメスアップして4 ℃で遮光保存した。
(13) Tris-HCl緩衝液 (1.5 M、pH 8.8)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris) 18.17 gを約80 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。6 N塩酸によりpH 8.8に調整後、全量が100 mLになるようにメスアップして4℃で保存した。
(14) Tris-HCl緩衝液 (0.5 M、pH 6.8)
Tris 6.06 gを約80 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。6 N塩酸によりpH 6.8に調整後、全量が100 mLになるようにメスアップして4 ℃で保存した。
(15) 10％ SDS水溶液
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS） 10 gを約90 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が100 mLになるようにメスアップして室温で保存した。
(16) 10％ APS水溶液
過硫酸アンモニウム (APS) 0.1 gを約1 mLの超純水に溶解させて4℃で保存した。
(17) 飽和1-ブタノール
1-ブタノールと超純水を2：1の割合で混合して室温で保存した。
(18) 5×泳動バッファー(125 mM Tris、960 mM グリシン、0.5％ SDS)
Tris 15.1 g、グリシン72.1 g、SDS 5.0 gを全量が1 Lとなるように超純水に溶解させて4 ℃で保存した。使用の際は超純水で5倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で2回とした。
(19) 5×Loadingバッファー (200 mM Tris、0.05％ブロモフェノールブルー、10％SDS、50％グリセロール)
Tris 2.42 g、SDS 10.0 g、ブロモフェノールブルー50 mgを50 mLのグリセロールと約40 mLの超純水を添加して溶解させた。6 N塩酸を用いてpH 6.8に調整後、100 mLにメスアップした。1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して4 ℃で保存した。
(20) 1 M DTT溶液
ジチオトレイトール (DTT) 約150 mgを1 Mとなるように約1 mLの超純水を添加して溶解させ、-20 ℃で保存した。
(21) 固定液
酢酸50 mL、エタノール200 mLを混合した後、超純水で500 mLにメスアップして室温で保存した。
(22) 脱色液
酢酸40 mL、エタノール125 mLを混合した後、超純水で500 mLにメスアップして室温で保存した。
(23) 染色液
クマシーブリリアントブルー R-250 0.25 gを脱色液100 mLに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
【0070】
１−２−２．大腸菌の培養及びCDPの発現(1) E. coli BL21-CDPグリセロールストックの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、CDPの遺伝子を含むプラスミドをもつEscherichia coli BL21-Gold(DE3)株 (E. coli BL21-CDP) のグリセロールストックからLB-AGAR/カナマイシンプレートに植菌し、37 ℃で8-12 h培養した。加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから、予め乾熱滅菌した試験管に加えた50 mg/mLカナマイシンストック溶液5 μLとLB培地5 mLの混合溶液に植菌した。OD660が0.6-0.8に達するまで振盪培養機（BR-23FP、TAITEC）で37 ℃で振盪培養（往復、200 rpm）した。その後、培養液800 μLを1.7 mLチューブに採取し、50 ％グリセロール溶液100 μLを添加して混合した。液体窒素で凍結して-80℃で保存した。
【0071】
(2) E. coli BL21-CDPマスタープレートの調製ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、E. coli BL21-CDPのグリセロールストックもしくは作製後1ヶ月以内のマスタープレートからLB-AGAR/カナマイシンプレートに植菌して37 ℃で8-12 h培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま4 ℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにLB-AGAR/カナマイシンプレートに植菌して37 ℃で8-12 h培養して4 ℃で保存した。
【0072】
(3) E. coli BL21-CDP前培養液の調製乾熱滅菌した試験管にLB培地3 mLを採取して50 mg/mLカナマイシンストック溶液3 μLを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、E. coli BL21-CDPマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて37℃で10-12 h振盪培養 (往復、200 rpm） した。
【0073】
(4) E. coli BL21-CDPの培養とCDPの発現2本の1 Lバッフル付きフラスコにLB-BROTH LENNOX 6 gをそれぞれ秤量して純水300 mLを加えてオートクレーブして放冷した。50 mg/mLカナマイシンストック溶液300 μLをそれぞれに添加して混合した後、E. coli BL21-CDP前培養液300 μLを加えた。振盪培養機を用いて30 ℃で振盪培養 (回転、600 rpm) してOD660が0.55-0.60に達したことを確認後、10 mM IPTGストック溶液3 mLをそれぞれ加えて25 ℃で20 h振盪培養 (回転、200 rpm) してCDPを発現させた。
【0074】
１−２−３．Hisタグ精製及び緩衝液置換(1) E. coli BL21-CDPの破砕によるCDPの抽出
１−２−２項(2)で調製したCDPを発現させたE. coli BL21-CDP懸濁液を50 mLチューブ12本に約50 mLずつ均等に分注し、遠心機 (遠心機：EX-126、TOMY、ローター：3850-04P、TOMY) を用いて遠心 (3500 rpm、20 min、4 ℃) した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したE. coli BL21-CDPペレットにMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) を加えてそれぞれ約15 mLにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。E. coli BL21-CDP懸濁液を4本の100 mL自立式チューブに約45 mLずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器 (Sonifier 250、BRANSON) を用いて超音波照射してE. coli BL21-CDPを破砕した。超音波照射は、power: 200 W (ダイヤル10)、duty cycle: 30％の条件で2サイクル (5 s超音波照射と25 sインターバルの4回繰り返しを1サイクル) 行った。E. coli BL21-CDP破砕液にはCDPの他にプロテアーゼ等が含まれていることから、それらによるCDPの分解を防ぐために、以降はE. coli破砕液は常に氷浴した。4本の100 mLチューブ中のE. coli BL21-CDP破砕液をそれぞれ50 mLチューブに移して遠心 (3500 rpm、>20 min、4℃)した。沈澱したE. coliペレットが舞わないよう注意を払いながら、デカンテーションにより上清を50 mLチューブに回収した。
【0075】
(2) Ni-NTAアフィニティーカラムによるCDPの精製コンタミネーションを避けるため、以後の精製操作で用いるマイクロピペットのチップ及び1.7 mLチューブはオートクレーブ後乾燥して用いた。
【0076】
予め70％エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径1.8 cm、長さ10 cmのプラスチック製カラムに、Ni-NTAアガロースゲル （GE Healthcare） 分散液9.8 mLを充填した。カラム内を１−２−１項(8)で調製した70％エタノールで満たして流すことでNI-NTAアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を2回繰り返した。MOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) 3 mLをアプライして流し、さらに3 mLアプライした。スパチュラで撹拌もしくはマイクロピペットでピペッティングしてNi-NTAアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、MOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) 5 mLで4回置換した。
【0077】
E. coli BL21-CDP破砕液の上清をカラムにアプライし、カラムより流出した溶液を回収してフロースルー溶液とした。洗浄バッファー3-5 mLをアプライして置換し、さらに3-5 mLアプライした。ピペッティングによりNi-NTAアガロースゲルを再分散させてゲル層の表面を均一にした後アプライした洗浄バッファーを流した。さらに洗浄バッファー5 mLをアプライして置換する操作を繰り返し、合計で30 mL以上をアプライした。洗浄バッファーをアプライした際に通過した溶液は全て回収し、洗浄液とした。その後、溶出バッファー3-5 mLをアプライし、1.7 mLチューブに1 mLずつフラクションに分けて回収し、溶出液とした。この操作を繰り返し、合計で溶出バッファー25 mLをアプライした。それぞれのフラクションの吸光度を微量紫外可視分光光度計(NanoDrop 2000c、Thermo Scientific) で測定し、280 nmの吸光度を指標にタンパク質の溶出を確認した。この際、バックグラウンド測定には超純水を用いた。タンパク質の溶出が完了していない場合は、280 nmの吸収が無くなるまでカラムに溶出バッファーをアプライした。回収した溶出液のうち、吸光度が高いフラクションを回収し、CDP溶液とした。
【0078】
(3) CDP溶液の緩衝液置換CDP溶液の緩衝液置換はPD10カラム (Sephadex G-25、GE Healthcare) を用いて、付属の説明書に従って行った。CDP溶液の容量に応じて、必要な数のPD10カラムを用いた。付属のアダプターを用いてPD10カラムを50 mLチューブに固定した。70％エタノール (バイオテクノロジーグレード) で満たし、遠心機 (MX-305、TOMY) を用いて遠心(1000 g、2 min、4℃) した。この操作を2回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。5％ (w/v) アジ化ナトリウムストック溶液をMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) で250倍希釈して調製した0.02％アジ化ナトリウム/20 mM MOPS-Na緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を4回繰り返すことでPD10カラムを緩衝液で置換した。さらに0.02％アジ化ナトリウム/20 mM MOPS-Na緩衝液を加え、遠心した。
【0079】
PD10カラムを新たな50 mLチューブに移し、遠心によるSephadexの斜面を崩さないようにCDP溶液をPD10カラム1本につき1.75-2.5 mLアプライした。前述の遠心時と同じ角度で遠心機に固定し、遠心した。溶出した溶液を回収してCDPストック溶液とし、CDPストック溶液の280 nmの吸光度をNanoDrop 2000cにより測定し、1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して4℃で保存した。なおCDPストック溶液を使用する際は、必要量を適宜クリーンベンチ内で分注した。
【0080】
カラム1本につき30 mLのMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) を加えて静置してカラムを洗浄した。次いで超純水で満たし、遠心する操作を2回繰り返した。同様に50%エタノール水溶液で2回洗浄した。PD-10カラムを50%エタノール水溶液で満たして4℃で保存した。
【0081】
１−２−４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 (SDS-PAGE) によるCDPの精製の確認(1) 10％アクリルアミドゲルの調製
50 mLチューブに30％アクリルアミド/ビス混合溶液3.33 mL、Tris-HCl緩衝液 (1.5 M、pH 8.8) 2.5 mL、超純水4.01 mLを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。10％ SDS水溶液100 μL、10％ APS水溶液50 μL、TEMED 10 μLを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液3.5 mLを2枚のガラスプレートの間隙 (0.75 mm) に加え、飽和1-ブタノール900 μLを静かに重層し、室温で1 h静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和1-ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
【0082】
50 mLチューブに30％アクリルアミド/ビス混合溶液0.44 mL、Tris-HCl緩衝液(0.5 M、pH 6.8) 0.44 mL、超純水2.03 mLを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。10％ SDS水溶液33 μL、10％ APS水溶液16.7 μL、TEMED 1.65 μLを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。溶液を分離ゲルの上に十分に加え、10ウェルのコームを空気が入らないように注意しながらセットし、室温で1 h静置して重合した。生成したゲルはガラスプレートごと十分に湿らせたキムワイプで挟み、さらにラップで包み4℃で保存した。ゲルは調製後1ヶ月以内に使用した。
【0083】
(2) 電気泳動による評価1.7 mLチューブにProtein Molecular Weight Marker (Broad) 5 μL、1 M DTT溶液2 μL、5×Loading バッファー 20 μL、滅菌精製水173 μLを加えて混合し、これをマーカーとし、-20℃で保存した。CDPストック溶液及びCDPの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ1 μLを5×Loadingバッファー2 μL、1 M DTT 1 μL、超純水6 μLと混合した。これらと室温で解凍したマーカー10 μLを105 ℃で熱処理し、卓上小型遠心機(R5-AQBD02、Recenttec) によりスピンダウンした。本項(1)で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器 (ミニプロティアン Tetraセル、BIO RAD) にセットし、超純水で5倍希釈した5×泳動バッファーを500 mL注ぎ、コームを外した。１ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置 (ミニプロティアンTetraシステム、BIO RAD) を用いて電圧150 Vで約40 min泳動した。バンドがゲルの下端より約1 cm上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー (Wave-PR、TAITECH) で30 min振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して60 min振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して30 min振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Gel Doc EZ Imager (BIO RAD) により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
【0084】
１−２−５．CDPの酵素活性測定CDPの活性は以下のように測定した。αG1P 50mMとD-(+)-セロビオース50 mM、及び所定倍率希釈されたCDPを含む3-モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液 (50 mM、pH7.5)を37 ℃でインキュベーションした。CDPにより生成されるリン酸を定量し、1分間あたり1 μmolのリン酸を遊離する酵素量を1Uと定義した際のU/mLを求め、酵素活性とした。CDPの希釈率は、反応時間が100分の際におけるαG1Pの転化率が10％以下になるように決定した。
【0085】
１−３．OEG-bearing β-D-グルコース (Glc-EGn; n = 2, 4, 6, 8) プライマーの合成Glc-EGnプライマーは、B. Raoら, Chem. Commun., 2013年, 49, 10808-10810に記載の方法を参考にして合成した。
【0086】
以下の全ての反応は、p-アニスアルデヒドTLC呈色試薬、又は1H NMR測定 (JEOL Model-ECP 400 (JEOL、磁場強度：400 MHz)) により反応の進行を確認しながら進めた。p-アニスアルデヒドTLC呈色試薬は、p-アニスアルデヒド13 mL、酢酸 5 mL、エタノール 478 mLを氷冷しながら混合し、マグネチックスターラーを用いて撹拌しながら濃硫酸 18 mLを滴下し、使用するまで4 ℃で保存した。
【0087】
１−３−１．O-テトラアセチルGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) の合成O-ペンタアセチル-β-D-グルコシド(1.0等量) とオリゴエチレングリコールモノメチルエーテル(1.2等量) を乾燥ジクロロメタンに溶解させた。脱水剤として350 ℃のヒーターで予め活性化させた粉状モレキュラーシーブ4Aを加え、アルゴン雰囲気下にてマグネチックスターラーを用いて室温で1 h撹拌した。氷冷した反応溶液に三ふっ化ホウ素ジエチルエーテル (5.0等量) を滴下し、反応溶液を室温に戻して一晩撹拌し、O-グリコシル化反応させた。原料であるO-ペンタアセチル-β-D-グルコシドの消失をp-アニスアルデヒド呈色試薬を用いてTLCにより確認した後、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液/酢酸エチル (50% (v/v)) に反応溶液を滴下し、反応を停止させた。反応溶液を分液漏斗に移し、激しく振盪した後、溶液が二層に分離するまで静置し、上層の油層を回収した。下層の水層を新たな分液漏斗に移し、酢酸エチルによって抽出し、油層を回収する操作を2回繰り返した。回収した油層を再度分液漏斗に移し、飽和食塩水を加え、激しく振盪し、油層に溶解した水を除去した。水層を流去し、乾燥剤として無水硫酸マグネシウムを油層に加えた。ガラスフィルターを用いて硫酸マグネシウムを除去し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去した。展開溶媒をアセトン/ヘキサン(20-50% (v/v))とし、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライし、35-60%の収率でオイル状のO-テトラアセチル Glc-EGnを得た。
【0088】
１−３−２．Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) の合成O-テトラアセチル Glc-EGn (1.0等量) をメタノールに溶解させ、反応溶液を氷冷し、触媒量のナトリウムメトキシド (0.1等量) を添加した。反応溶液を室温に戻して5-8 hマグネチックスターラーを用いて撹拌した後、Dowex陽イオン交換樹脂を加え、反応を停止させた。セライトを載せた濾紙を用いて反応溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去した。室温で1 d真空乾燥し、90-95%の収率でオイル状のGlc-EGnを得た。Glc-EGnを超純水に溶解させてGlc-EGnストック溶液とし、PVDF製 0.22 μmフィルターで濾過滅菌し、更なる精製操作なしでCDPによる酵素合成反応に用いた。Glc-EGnストック溶液の濃度は、メチル-β-D-グルコシド水溶液 (500 mM) を基準溶液として、1H NMR測定により算出した。Glc-EGnストック溶液およびメチル-β-D-グルコシド水溶液からそれぞれ50 μLずつ分取した混合溶液を凍結乾燥し、重水500 μLに溶解させて1H NMR測定し、それぞれのアノマー位の水素の積分比 (Glc-EGn: δ = 4.51, メチル-β-D-グルコシド: δ = 4.39) からGlc-EGnストック溶液の濃度を算出した。
【0089】
１−４．OEG化セルロースオリゴマーからなる三次元構造体の酵素合成１−４−１．CDPによるOEG化セルロースの酵素合成
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES) 23.8 gを約60 mLの超純水に溶解させた。4 N 水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、100 mLにメスアップしてPVDF製0.22 μmフィルターで濾過滅菌した。これをHEPES緩衝液 (1 M、pH 7.5) とし、4℃で保存した。
αG1P二ナトリウム n水和物を所定量秤量し、1 Mとなるよう超純水に溶解させた。
【0090】
HEPES緩衝液、1 M αG1P水溶液、１−３−２項で合成した所濃度のGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) ストック溶液を反応時の濃度がそれぞれ500 mM、200 mM、50 mMとなるよう4 mLチューブに加え、使用するCDPストック溶液の量を考慮し、超純水でメスアップした。超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。終濃度が0.2 U/mLになるようCDPストック溶液を適量加え、気泡が発生しないようピペッティングにより混合した。1.7 mLチューブあるいは1 mLマイティーバイアルあるいは24穴プレートに所定量分取し、60 ℃で3 dインキュベーションした。
【0091】
１−４−２．酵素合成されたOEG化セルロースの精製１−４−１項において調製された生成物を各種分析に用いるために超純水で精製した。走査型電子顕微鏡観察に用いる場合は、生成物を超純水に浸漬させ、4 ℃で1 w精製した。その他の測定に用いる場合は、超純水を加えてピペッティングによる水流により生成物を機械的に破壊して分散させ、遠心 (15000 rpm、>10 min、4℃) し、上清を除去した。超純水を加えて沈澱物を再分散させ、遠心する操作を5回以上繰り返し、溶液の置換率が99.999％以上となるまで精製した。精製した分散液を100℃のヒートブロックにより10 min加熱することで、残存するCDPを失活させた。
【0092】
生成物の収量は、精製後の水分散液を絶乾し、乾燥前後の重量変化から算出した。予め105℃で24 h乾燥させ、デシケーター内で放冷したサンプル管を秤量し、精製後の水分散液を加えて105℃で24 h乾燥させ、その後デシケーター内で放冷して秤量した。乾燥前後の重量の差から生成物の濃度を算出した。この操作は同時に3回行い、それらの平均値より生成物の収量を算出した。
【0093】
プロトン核磁気共鳴 (1H NMR) 法、全反射型赤外分光 (ATR/ FTIR) 法、広角X線回折 (WAXD) 法による測定に用いる場合は、精製後の水分散液を1.7 mLチューブに分注し、24 h凍結乾燥した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析 (MALDI-TOF-MS) 法による測定、原子間力顕微鏡 (AFM) 観察に用いる場合は凍結乾燥することなく、精製後の分散液を超純水により希釈して用いた。
【0094】
１−５．生成されたOEG化セルロースの特性評価１−５−１．生成物の反転倒立試験
1 mLマイティーバイアルを用いて調製したサンプルを用いて、反転倒立試験によりスポンジ化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物が流動しなかった場合にスポンジ状セルロース構造体が形成したと判断した。
【0095】
１−５−２．生成物の化学構造及び結晶構造の評価(1) 生成物の収量測定
１−４−１項で示した手法で、絶乾により収量を算出した。
【0096】
(2) 生成物の1H NMRスペクトル測定40％重水酸化ナトリウム重水溶液50 μL及び重水450 μLを混合して4％重水酸化ナトリウム重水溶液を調製した。凍結乾燥した生成物15 mg以上を4％重水酸化ナトリウム重水溶液500 μLに溶解させた。溶液をNMRチューブに移し、JEOL Model-ECP 400 (JEOL、磁場強度：400 MHz)により測定した。積算回数は128回とした。水のケミカルシフトをリファレンス(4.79 ppm)として校正した。
【0097】
(3) 生成物のMALDI-TOF-MS測定質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはBradykin fragment 1-7水溶液 (10 nmol/mL Bradykinin fragment 1-7、0.05％トリフルオロ酢酸(TFA)、50％アセトニトリル)、P14R水溶液 (10 nmol/mL P14R、0.1％ TFA)、ACTH fragment 18-39水溶液 (10 nmol/mL ACTH fragment 18-39、0.1% TFA) それぞれ5 μL、10 mg/mL DHBA水溶液 5 μL、1.0％ TFA水溶液 1 μL、アセトニトリル 4 μLを1.7 mLチューブ中で混合して調製した。
【0098】
生成物の測定サンプルは、0.05％ (w/v)とした生成物の水分散液 1 μL、10 mg/mL DHBA水溶液 1 μL、トリフルオロ酢酸/アセトニトリル溶液 (0.2% (v/v)) 3 μLをKOH/メタノール (3.3% (w/v)) により洗浄したマイティーバイアル中で混合して調製した。
【0099】
標準サンプル及び生成物の測定サンプルそれぞれ1 μLをサンプルプレートにマウントし、風乾させる操作を5回繰り返した。1 h以上真空乾燥し、MALDI-TOF-MS(AXIMA-performance、島津製作所)で測定した。測定条件はMode: Liner (positive)、Mass Range: 1.0-3000.0、Max Leaser Rap Rate: 10、power: 100 - 115、profiles: 100、shots: 2、Ion Gate (Da) : Blank 500、Pulsed Extraction optimized at (Da) : 1500.0とした。
【0100】
測定により得られたMSスペクトルは、Smoothing method: Gaussian, Smoothing filter width: 19, Baseline filter width: 1000の条件で処理した。平均重合度は、生成物のナトリウムイオン、又はカリウムイオン付加体のピーク強度が強い方のピーク面積を用いて算出した。
【0101】
(4) 生成物のATR/FTIRスペクトル測定凍結乾燥した生成物を全反射赤外分光光度計 (FT/IR-4100typeA、日本分光) のステージのダイヤモンドセルにスパチュラを用いて乗せ、押しこみユニットを下げてサンプルをダイヤモンドセルに押し付けて測定した。測定条件は、測定波長：350-7800 cm-1、分解能：2 cm-1、積算回数：100とした。
【0102】
(5) 生成物のWAXD測定凍結乾燥した生成物をシリコン無反射試料板の凹部にマウントし、表面を均して卓上粉末X線回折計 (MiniFlex 600、リガク) に設置して測定した。測定条件は、検出器：D/teX Ultra、X線出力：40 kV及び15 mA、フィルター：Kβ、スキャンスピード：2.0000 deg/min、ステップ幅：0.0200 deg、スキャン軸：2 θ/θ、スキャン範囲：5.0000-70.0000 deg、入射スリット：1.250 degとした。
【0103】
１−５−３．生成物の顕微鏡観察(1) 生成物のSEM観察
超純水に浸漬させて精製した生成物の一部を薬さじを用いて採取し、24穴プレート中で10％エタノール水溶液2 mLに浸漬させ、15 min静置した。その後、溶液を除去し、20％エタノール水溶液を加えて15 min静置した。同様に30、40、50、60、70、80、90、99.5％エタノール水溶液の順に浸漬させた。次いで溶液を除去し、99.5％エタノール水溶液を加えて15 min静置した。溶液を除去し、99% エタノール/tert-ブチルアルコール (50% (v/v)) 溶液に15 min浸漬させた。溶液を除去して99% tert-ブチルアルコールに15 min浸漬させ、溶液を除去する操作を2回繰り返した。
【0104】
溶媒が99% tert-ブチルアルコールに置換された生成物をパラフィルムで作製したカプセルに移し、99% tert-ブチルアルコールで満たしてカプセルの封をした。tert-ブチルアルコールの結晶が成長しないように速やかに液体窒素にカプセルごと沈めて10 min以上凍結した。液体窒素中でカプセルごと生成物をカミソリにより割断した。液体窒素中から生成物を取り出し、速やかに凍結乾燥した。
【0105】
SEMのステージ (直径26 mm) 上に小さく切ったカーボンテープを貼り、その上に凍結乾燥した生成物を割断面が上になるようにマウントし、側面にドータイトを塗布することでステージに固定した。3 h以上真空乾燥し、デシケーター内で8 h以上乾燥した。オスミウムコータ (Neoc-Pro、メイワフォーシス) を用いて、SEMのステージにマウントしたサンプルを10 mAで30 sコーティングし、走査型電子顕微鏡 (JSM-7500F、日本電子) により観察した。観察条件は、加速電圧は5 kV、エミッション電流：10 μA、照射電流：No.8、カラムモード：通常、r-フィルタ：SB[0] 、ワーキングディスタンス：8 mm前後とした。
【0106】
(2) 生成物のAFM観察生成物の濃度が0.001％ (w/v)となるよう希釈し、セロハンテープで表面を5回剥がしたマイカ基板に15 μLマウントして600 rpmで30 minスピンコートした。デシケーター内で12 h以上乾燥し、走査型プローブ顕微鏡 (SPM-9600、島津製作所) を用いてAFMにより観察した。測定条件はタッピングモード、操作速度：0.5-1 Hz、画素数：512×512、Zレンジ：×1、操作モード：力一定とした。それぞれの試料から10個の構造体を観察し、観察された構造体ひとつにつき9点の高さを算出し、それら全てを平均して構造体の高さを算出した。
【0107】
２．結果及び考察２−１．OEG化セルロースの酵素合成
２−１−１．酵素合成した生成物の反転倒立試験
異なる鎖長のEG基をもつGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) をCDPによる酵素合成系に適応した。モノマーとしてαG1P、プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用い、CDPを混合して60 ℃で3 dインキュベーションした結果、いずれのプライマーを用いた場合も反応後の溶液全体が白濁し、新たに適応したプライマーがCDPにより認識されることでセルロース誘導体が酵素合成されることが示唆された。さらに、いずれのプライマーを用いた場合も容器を反転させても溶液が流れ落ちず、スポンジ状セルロース構造体が形成することが明らかになった (図１)。
【0108】
２−１−２．酵素合成されたセルロース誘導体の化学構造の評価(1) 1H NMRスペクトル
セルロースは重合度15以下の低分子量であれば水酸化ナトリウム水溶液に溶解するため、重水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させることで1H NMR測定できることが知られている (A. Isogai, Cellulose, 1997年, 4, 99-107)。Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルを1H NMR測定することで、生成物の化学構造を解析した。その結果、全てのピークは既報のセルロースオリゴマー (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473、L. A. Fluggeら, J. Am. Chem. Soc., 1999年, 121, 7228-7238、H. Sugiyamaら, J. Mol. Struct., 2000年, 556, 173-177、B. Xiongら, Cellulose, 2013年, 20, 613-621、M. U. Roslundら, Carbohydr. Res., 2008年, 343, 101-112) と導入されたOEG鎖 (δ 〜3.5) に帰属でき、OEG化セルロースオリゴマーが酵素合成されていることが明らかになった (図２)。次いでOEG化セルロースオリゴマーの分子内に位置するアノマー位(δ = 4.3)、およびOEG鎖が結合したセルロース分子鎖末端に位置するアノマー位 (δ = 4.2) の水素の積分値を次式に適用して、平均重合度を算出した。
【0109】
【数1】
【0110】
その結果、プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用いた場合、平均重合度はそれぞれ9、10、10、11と算出され、同条件でD-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合のセルロースオリゴマーの平均重合度 (Average DP 〜10) とよく一致した (T. Serizawaら, Polym. J., 2016年, 48, 539-544)。より長鎖のEG基をもつGlc-EGnをプライマーとして用いた場合、セルロース誘導体の平均重合度がわずかながら増大することが明らかとなった。これは、セルロース分子鎖に導入されたEG基がより長鎖である程、合成されたセルロース誘導体の溶解性が増大するため、又はEG基の立体障害の寄与が大きくなることでセルロース誘導体の結晶化もしくは沈殿が抑制されるため、セルロース誘導体がより高重合度まで伸長したと推察される。
【0111】
(2) MALDI-TOF-MSスペクトルGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをMALDI-TOF-MSにより測定した。得られたMSスペクトルは、いずれもm/zの間隔がグルコシルユニット (162 Da) に対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が 6-12 量体のOEG化セルロースオリゴマーのナトリウム又はカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した (図３)。従って、MALDI-TOF-MS測定からもOEG化セルロースオリゴマーが正しく酵素合成されていることが明らかになった。さらに、合成されたOEG化セルロースオリゴマーは、D-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合と同様に、分子量分布をもつことが明らかになった。MSスペクトルのピークの積分比から平均重合度を算出した結果、プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用いた場合、それぞれ7.8、8.0、8.2、8.4と算出され、1H NMRから算出した平均重合度と比較して、1-3程度低い値を示した。MALDI-TOF-MS測定ではイオン化された分子のみが検出されるため、測定した条件では高重合度のOEG化セルロースオリゴマーが十分にイオン化していないことが示唆された。本発明者は酵素合成により調製されるセルロースオリゴマーの平均重合度の算出にはこれまで1H NMR測定を用いてきたことから、本実施例でも1H NMR測定により算出した平均重合度を用いることとした。
【0112】
(3) αG1Pの転化率絶乾により算出した生成物の収量と1H NMR測定から算出した平均重合度を用いて、モノマーであるαG1Pの転化率を算出した。プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用いた場合、αG1Pの転化率はそれぞれ60, 30, 40, 40%と算出された。Glc-EG2をプライマーとした場合、同条件でD-グルコースをプライマーとした場合のαG1Pの転化率 (約35％) よりも明らかに高く (T. Serizawaら, Polym. J., 2016年, 48, 539-544)、Glc-EGn (n = 4, 6, 8) をプライマーとした場合はD-グルコースをプライマーとした場合と同程度であった。従って、プライマーに導入されたEG基の鎖長はCDPによる酵素合成反応に影響を与え、Glc-EG2はその他のプライマーよりもCDPにより認識されやすいことが示唆された。
【0113】
２−１−３．OEG化セルロースの結晶構造(1) ATR/FTIRスペクトル
セルロースは複数の結晶形を形成し得ることが知られているため、ATR/FTIR測定により、生成されたOEG化セルロースオリゴマーが形成する結晶構造を解析した。Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをATR/FTIR測定した結果、いずれもセルロースのII型結晶に特徴的なOH伸縮振動に由来する2本の鋭いピーク (Q. Wuら, Carbohydr. Polym., 2015年, 133, 438-447) を3441ならびに3490 cm-1付近に示したことから、酵素合成されたOEG化セルロースオリゴマーはセルロースII型結晶形を形成することが明らかとなった (図４)。これは、D-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様であり、セルロース分子鎖に導入されたOEG鎖は形成する結晶形に影響を与えないことがわかった。さらに、850 cm-1付近に無秩序なコンフォメーションをもつOEG鎖の振動モードに由来するブロードなピーク (W. Parakら, Carbohydr. Chem.Mater., 2005年, 17, 4949-4957) を示したことから、OEG鎖はアモルファスであることが示唆された。
【0114】
(2) WAXDチャートGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをWAXD測定した結果、2θ = 12.3、19.9、 22.1°において鋭い回折ピークを示した (図５)。これらの回折ピークは、それぞれセルロースII型結晶の1-10、110、020面 (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473) に帰属された。WAXD測定からもD-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様に、セルロースII型の結晶形を形成することが支持された。さらに、2θ = 19.1、23.3°に結晶性のOEG鎖に由来する2本の回折ピーク (S. Kugaら, Langmuir, 2001年, 17, 21-27) を示さなかったことから、OEG鎖がアモルファスであることが支持された。OEG化セルロースオリゴマーが逆並行に配列することでセルロースII型結晶を形成することを考慮すると、ナノセルロース上のOEG鎖の密度はOEG鎖一分子あたり、約65 A2であると概算される。螺旋状のコンフォメーションをもつ結晶性のPEG鎖の断面積はPEG鎖一分子あたり21.3 A2であることが知られており (P. Labinisら, J. Phys. Chem. B, 1998年 102, 426-436)、概算されたOEG鎖の密度 (約65 A2/OEG chain) は隣接したOEG鎖が密にパッキングして結晶性のコンフォメーションを形成するために十分ではないと推察される。従って、形成する結晶構造からもOEG鎖はアモルファスであることが示唆された。
【0115】
２−１−４．セルロースのネットワーク構造(1) SEM像
Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成したセルロース構造体を超純水で1 w精製し、溶媒を超純水から徐々にtert-ブチルアルコールに置換し、凍結乾燥した生成物をSEMにより観察した。その結果、スポンジ状セルロース構造体は、長さが最大で数μmにも渡ってよく発達したリボン状の構造体 (ナノリボン) から構成されることが明らかとなった (図６)。観察されたナノリボン状のナノセルロースの形態は、D-グルコースをプライマーとした場合のプレート状の形態 (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473) とは大きく異なっていた。これは、導入されたOEG鎖が形成するコロイド状のナノセルロース前駆体を水中で分散安定化させることで、ナノセルロース前駆体がナノリボンへと３次元的に結晶成長し、スポンジ状セルロース構造体の形成に至ったと推察される。更に、EG基の鎖長の増大に伴い、構成するナノリボンの幅が減少する傾向を示した。SEM像からは枝分かれ構造が観察されず、ナノリボン状のナノセルロースが物理架橋することでスポンジ状セルロース構造体を形成していることが示唆された。
【0116】
(2) AFM像SEMによって観察されたスポンジ状セルロース構造体の構成要素であるナノリボンの形態を詳細に解析するために、Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成したセルロース構造体をピペッティングにより機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、スピンキャストしてAFM観察した。その結果、いずれのサンプルもマイカ基板上でよく分散した短いリボン状の構造体が観察された (図７a-d)。観察されたナノリボンの厚さは、Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) をプライマーとして用いた場合、それぞれ5.3 ± 0.3, 5.8 ± 0.4, 6.0 ± 0.3, and 6.1 ± 0.4 nmと算出された。厚さはEG基の鎖長の増大に伴い、わずかに上昇し、いずれも合成されたセルロース分子鎖の平均重合度を基に算出した分子鎖長よりもわずかながら大きな値であった (e.g. セルロースII型結晶を形成したセロデカオースの末端構造を除いた分子鎖長は5.2 nmと算出される (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473))。これは、ナノリボン表層にOEG鎖が存在していることを示唆しており、酵素合成されたセルロース誘導体はOEG鎖を表層に露出しながら、ナノリボンの底面に対して垂直に配列していることが推察された。ナノリボンの幅はGlc-EG2、Glc-EG4をプライマーとして用いた場合は数百nm、Glc-EG6をプライマーとした場合は100-200 nm、Glc-EG8をプライマーとした場合は100 nm以下であり、EG基の鎖長の増大に伴って減少する傾向を示し (図７e-h)、２−１−４項(1)のSEMにおける観察結果とよく一致した。更に、Glc-EG6、Glc-EG8をプライマーとして用いた場合、フレキシブルに屈曲したナノリボンが観察されており、Glc-EG2、Glc-EG4をプライマーとした場合と明らかに異なっていた。Glc-EGn (n = 4, 6, 8) をプライマーとした場合、２−１−２項(3)で示したαG1Pのコンバージョンは30〜40%であり、OEG化セルロースオリゴマーの生成量はそれぞれほぼ同程度である。従って、形成するナノリボンの形態の変化は、酵素合成されるOEG化セルロースオリゴマーの生成量ではなく、導入されたOEG鎖がセルロース誘導体の集合化に影響を与えていることに由来することが示唆された。