特開 2017-221188 変異アルカリプロテアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-221188(P2017-221188A)

(43)【公開日】2017年12月21日

(54)【発明の名称】変異アルカリプロテアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171124BHJP

   C12N 9/56 20060101ALI20171124BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20171124BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20171124BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20171124BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20171124BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20171124BHJP

   C11D 3/386 20060101ALI20171124BHJP

   C11D 7/42 20060101ALI20171124BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/56

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/00 C

   C11D3/386

   C11D7/42

【審査請求】有

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2017-103390(P2017-103390)

(22)【出願日】2017年5月25日

(31)【優先権主張番号】特願2016-115734(P2016-115734)

(32)【優先日】2016年6月9日

(33)【優先権主張国】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】山田 耕造

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 剛

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

4H003

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050KK20

4B050LL04

4B064AG01

4B064CA19

4B064DA19

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA33

4B065CA57

4H003EC01

4H003FA47

(57)【要約】      （修正有）

【課題】キレート剤に対する安定性が向上した変異アルカリプロテアーゼの提供。
【解決手段】バチルスエスピー由来の分子量４３，０００のアルカリプロテアーゼＫＰ４３において、そのアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸残基が置換された変異アルカリプロテアーゼであって、特定のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基が置換されている、変異アルカリプロテアーゼ。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基がスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなる、変異アルカリプロテアーゼ。

【請求項2】

以下の（ａ´）〜（ｄｓ´）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基を有する、請求項１記載の変異アルカリプロテアーゼ：
（ａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ；
（ｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ又はＮ；
（ｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ又はＡ；
（ｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ；
（ｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＩ；
（ｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ；
（ｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ又はＳ；
（ｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＡ、Ｖ又はＩ；
（ｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ；
（ｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｄ又はＬ；
（ｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ又はＰ；
（ｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＨ又はＡ；
（ｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭ；
（ａａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｃ又はＡ；
（ａｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ；
（ａｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＨ；
（ａｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の９１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＣ；
（ａｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１００位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｒ、Ｋ又はＡ；
（ａｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｉ又はＦ；
（ａｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ又はＷ；
（ａｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１２０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１２４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＫ又はＡ；
（ａｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭ；
（ａｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ又はＡ；
（ａｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間のアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ａｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ、Ａ、Ｌ又はＭ；
（ａｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又は；
（ａｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１４０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｗ又はＦ；
（ａｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１４８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、ＦまたはＰ；
（ｂａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｂｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｂｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ；
（ｂｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ又はＬ；
（ｂｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ、Ｅ又はＡ；
（ｂｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１８７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ；
（ｂｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｒ又はＫ；
（ｂｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２００位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｂｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰ；
（ｂｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｂｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２１２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷ；
（ｂｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２２６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ；
（ｂｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｉ又はＷ；
（ｂｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｂｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ；
（ｂｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｌ又はＩ；
（ｂｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｂｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦ；
（ｂｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｂｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｂｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩ；
（ｃａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ又はＩ；
（ｃｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２６４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｃｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２７３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ又はＩ；
（ｃｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２７５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２７７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２８１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ；
（ｃｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ；
（ｃｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ；
（ｃｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３１３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｃｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３１９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｃｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＭ、Ｗ又はＦ；
（ｃｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ又はＶ；
（ｃｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ；
（ｃｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｃｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶ；
（ｃｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３４２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３４３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ；
（ｃｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３４６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ；
（ｃｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３５７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ；
（ｃｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３５９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３６１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｉ又はＷ；
（ｃｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３６９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｄａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｄｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ又はＷ；
（ｄｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＤ、Ｅ、Ｒ又はＫ；
（ｄｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｄｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｍ又はＰ；
（ｄｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＡ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｄｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｄｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３９０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦ；
（ｄｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３９３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ；
（ｄｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３９６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ；
（ｄｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ又はＫ；
（ｄｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｄｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｗ又はＦ；
（ｄｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ又はＣ；
（ｄｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ、Ｙ、Ｉ又はＷ；
（ｄｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ又はＷ；
（ｄｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４１１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＡ、Ｖ、Ｌ又はＰ；
（ｄｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４２７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ又はＶ；
（ｄｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４３３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ。

【請求項3】

請求項１又は２記載の変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項３記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。

【請求項5】

請求項３記載のポリヌクレオチド又は請求項４記載のベクターを含む形質転換体。

【請求項6】

請求項５記載の形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項7】

請求項１又は２記載の変異アルカリプロテアーゼを含有する洗剤組成物。

【請求項8】

配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換することを含む、変異アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項9】

配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換することを含む、アルカリプロテアーゼのキレート剤に対する安定性向上方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、変異アルカリプロテアーゼに関する。

【背景技術】

【0002】

洗剤はその形態により、粉末洗剤と液体洗剤に分類することが出来る。液体洗剤は、粉末洗剤に比べて、溶解性に優れ、また汚れ部分に原液を直接塗布出来るという利点がある。反面、液体洗剤は、プロテアーゼ等の酵素を液体中で常温保存しなければならないため、酵素の安定保存に関して粉末洗剤には無い技術的な困難さを伴う。

【0003】

さらに、液体洗剤は、界面活性剤、脂肪酸、溶剤、キレート剤等を含有するため、酵素にとって極めて厳しい条件になっている。例えば従来、液体洗剤中で酵素を安定化させる手段としてカルシウムイオンの添加が知られているが、液体洗剤に含まれるキレート剤は酵素に配位するカルシウムイオンを奪う性質を有するため、カルシウムイオンによる安定化効果を弱め、酵素を不安定化させる。

【0004】

洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着したタンパク質汚れを分解して低分子化し、汚れの除去を促進することである。洗剤用プロテアーゼとして、これまでに、タンパク質だけでなく脂質も混在する複合汚れに対して洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼが開発されている（特許文献１参照）。さらに、アルカリプロテアーゼを変異させて比活性又は安定性等を向上させることで、その洗浄性能を高める研究が行われている（特許文献２、３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第９９／１８２１８号パンフレット

【特許文献2】特開２０１０−２７３６７３号公報

【特許文献3】特許第５２０２６９０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、キレート剤に対する安定性が向上したアルカリプロテアーゼ変異体を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、分子量４３，０００のアルカリプロテアーゼＫＰ４３が、そのアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸残基を置換することによって、キレート剤を含む液体中での安定性が向上することを見出した。

【0008】

すなわち、一態様において、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基がスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなる、変異アルカリプロテアーゼを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含む形質転換体を提供する。
別の一態様において、本発明は、前記形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、前記変異アルカリプロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換することを含む、変異アルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換することを含む、アルカリプロテアーゼのキレート剤に対する安定性向上方法を提供する。

【発明の効果】

【0009】

本発明の変異アルカリプロテアーゼは、キレート剤に対して高い安定性を有し、キレート剤を含む組成物（例えば洗剤組成物）に配合する酵素として好適である。本発明の変異アルカリプロテアーゼを含む洗剤組成物は、洗剤液中でプロテアーゼ活性を安定に保持することができるため、タンパク質及び脂質を含む複合汚れに対して優れた洗浄性能を発揮することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】クエン酸塩水溶液中におけるアルカリプロテアーゼ変異体の残存相対活性。

【図2】ＥＤＴＡ水溶液中におけるアルカリプロテアーゼ変異体の残存相対活性。

【図3】ＥＤＴＡ水溶液中におけるアルカリプロテアーゼ変異体の残存相対活性。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。

【0012】

本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。

【0013】

本明細書において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上２０個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。また本明細書において、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、１個以上６０個以下、好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は複数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。

【0014】

本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。

【0015】

当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリジン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。

【0016】

上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置のアミノ酸残基」と称される。

【0017】

本明細書において、所与の変異ポリヌクレオチド又はポリペプチドの「親」ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、そのヌクレオチド又はアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチド又はポリペプチドとなるポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。

【0018】

また本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。

【0019】

本明細書において、別途限定がない限り、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。

【0020】

本明細書において、「キレート剤」とは、金属イオンと配位結合をすることができる化合物をいう。洗剤組成物に添加されたキレート剤は、洗濯用水又は汚れの中のカルシウムイオン、マグネシウムイオン等の洗浄に悪影響を及ぼす金属イオンを封鎖する作用を有する。洗剤組成物に添加されるキレート剤の例としては、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、及びこれらのアルカリ金属又は低級アミン塩、などが挙げられる。

【0021】

本発明は、変異アルカリプロテアーゼを提供する。本発明の変異アルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる。

【0022】

本発明の変異アルカリプロテアーゼの親アルカリプロテアーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼであり、２９４位に相当する位置のアミノ酸残基がスレオニンではないアルカリプロテアーゼが挙げられる。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼの例としては、ＫＰ４３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）〕由来のアルカリプロテアーゼが挙げられる（特許文献１を参照）。

【0023】

配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼの例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性、好ましくは９６％以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼの別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。

【0024】

配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのさらなる例としては、プロテアーゼＫＰ９８６０［バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０３］、及びプロテアーゼ９８６５〔バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）由来、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕が挙げられる。

【0025】

本発明で親アルカリプロテアーゼとして用いられる、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ由来の変異アルカリプロテアーゼであってもよい。当該変異アルカリプロテアーゼの例としては、上記ＫＰ−４３株由来のアルカリプロテアーゼに対して、特許５２０２６９０号公報、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、特開２００６−１２９８６５号公報、特開２００７−０６１１０１号公報、特開２００８−２１２０８４号公報、特開２００９−０３４０６２号公報、特開２０１０−２７３６７２号公報、特開２０１０−２７３６７３号公報、特開２０１２−２２８２１６号公報及び特開２０１３−２３３１４１号公報に記載の変異のうちの１つ以上を施した変異アルカリプロテアーゼが挙げられる。

【0026】

上述した本発明で親アルカリプロテアーゼとして用いられる変異アルカリプロテアーゼの好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して以下の（ａ）〜（ｄｓ）からなる群より選択される１つ以上の変異を有する変異アルカリプロテアーゼが挙げられる：
（ａ）６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂ）９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｃ）１１位又はそれに相当する位置におけるＤからＧ、Ｓ又はＮへの置換；
（ｄ）１５位又はそれに相当する位置におけるＳからＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｅ）１６位又はそれに相当する位置におけるＳから、Ｔ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｆ）２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦ又はＡへの置換；
（ｇ）２２位又はそれに相当する位置におけるＱからＷへの置換；
（ｈ）２３位又はそれに相当する位置におけるＧからＮへの置換；
（ｉ）３７位又はそれに相当する位置におけるＲからＴへの置換；
（ｊ）４０位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｋ）４１位又はそれに相当する位置におけるＳからＩへの置換；
（ｌ）４６位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｍ）４９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｎ）５２位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ又はＳへの置換；
（ｏ）５３位又はそれに相当する位置におけるＬからＡ、Ｖ又はＩへの置換；
（ｐ）５４位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｑ）５６位又はそれに相当する位置におけるＬからＶへの置換；
（ｒ）５７位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｓ）５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｔ）６０位又はそれに相当する位置におけるＮからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｕ）６３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｄ又はＬへの置換；
（ｖ）６５位又はそれに相当する位置におけるＴからＷ又はＰへの置換；
（ｗ）６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｘ）８０位又はそれに相当する位置におけるＧからＨ又はＡへの置換；
（ｙ）８１位又はそれに相当する位置におけるＳからＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｚ）８２位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭへの置換；
（ａａ）８３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｃ又はＡへの置換；
（ａｂ）８４位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ａｃ）８９位又はそれに相当する位置におけるＱからＨへの置換；
（ａｄ）９１位又はそれに相当する位置におけるＮからＣへの置換；
（ａｅ）１００位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｆ）１０１位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｇ）１０２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｈ）１０３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｉ）１０４位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｊ）１０５位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｋ）１０６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｌ）１０７位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｒ、Ｋ又はＡへの置換；
（ａｍ）１０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＦへの置換；
（ａｎ）１１３位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ａｏ）１１９位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｐ）１２０位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｑ）１２４位又はそれに相当する位置におけるＲからＫ又はＡへの置換；
（ａｒ）１３２位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭへの置換；
（ａｓ）１３３位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｔ）１３４位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｓ、Ｔ又はＡへの置換；
（ａｕ）１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間へのＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷの挿入；
（ａｖ）１３５位又はそれに相当する位置におけるＮからＲ、Ａ、Ｌ又はＭへの置換；
（ａｗ）１３６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｘ）１３８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｙ）１４０位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｚ）１４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、ＦまたはＰへの置換；
（ｂａ）１５１位又はそれに相当する位置におけるＫからＦへの置換；
（ｂｂ）１６３位又はそれに相当する位置におけるＥからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｂｃ）１６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｄ）１６７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶへの置換；
（ｂｅ）１７０位又はそれに相当する位置におけるＩからＶ又はＬへの置換；
（ｂｆ）１７１位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、Ｔ、Ｅ又はＡへの置換；
（ｂｇ）１８７位又はそれに相当する位置におけるＮからＳへの置換；
（ｂｈ）１９１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｉ）１９３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｊ）１９４位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｂｋ）１９５位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｌ）２００位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｂｍ）２０４位又はそれに相当する位置におけるＱからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰへの置換；
（ｂｎ）２０５位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｂｏ）２１２位又はそれに相当する位置におけるＫからＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｂｐ）２２６位又はそれに相当する位置におけるＦからＹへの置換；
（ｂｑ）２３３位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｂｒ）２３７位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｓ）２３８位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｂｔ）２４３位又はそれに相当する位置におけるＮからＹ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｂｕ）２４５位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｖ）２４６位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｗ）２４７位又はそれに相当する位置におけるＫからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｘ）２４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｂｙ）２５０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｂｚ）２５１位又はそれに相当する位置におけるＭからＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｃａ）２５６位又はそれに相当する位置におけるＭからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｂ）２５７位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ又はＩへの置換；
（ｃｃ）２６４位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｃｄ）２７３位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｔ又はＩへの置換；
（ｃｅ）２７５位又はそれに相当する位置におけるＮからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｆ）２７７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｇ）２８１位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｈ）２９６位又はそれに相当する位置におけるＩからＶへの置換；
（ｃｉ）２９７位又はそれに相当する位置におけるＧからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｊ）３０４位又はそれに相当する位置におけるＮからＳへの置換；
（ｃｋ）３１３位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｃｌ）３１９位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｍ）３２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｎ）３２６位又はそれに相当する位置におけるＳからＷへの置換；
（ｃｏ）３３０位又はそれに相当する位置におけるＳからＭ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｐ）３３２位又はそれに相当する位置におけるＫからＧ、Ｔ又はＶへの置換；
（ｃｑ）３３４位又はそれに相当する位置におけるＴからＬへの置換；
（ｃｒ）３３５位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃｓ）３３７位又はそれに相当する位置におけるＦからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶへの置換；
（ｃｔ）３４２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｕ）３４３位又はそれに相当する位置におけるＫからＴへの置換；
（ｃｖ）３４６位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｗ）３５７位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｃｘ）３５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｙ）３６１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｃｚ）３６９位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｄａ）３７６位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｄｂ）３７８位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ｄｃ）３７９位又はそれに相当する位置におけるＱからＤ、Ｅ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｄｄ）３８０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｄｅ）３８５位又はそれに相当する位置におけるＦからＹ、Ｍ又はＰへの置換；
（ｄｆ）３８６位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｄｇ）３８７位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、好ましくは、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｈ）３９０位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦへの置換；
（ｄｉ）３９３位又はそれに相当する位置におけるＷからＱへの置換；
（ｄｊ）３９６位又はそれに相当する位置におけるＲからＧへの置換；
（ｄｋ）４０３位又はそれに相当する位置におけるＦからＴ又はＫへの置換；
（ｄｌ）４０５位又はそれに相当する位置におけるＮからＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｄｍ）４０６位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｎ）４０７位又はそれに相当する位置におけるＰからＧ又はＣへの置換；
（ｄｏ）４０８位又はそれに相当する位置におけるＱからＮ、Ｙ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｄｐ）４０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ又はＷへの置換；
（ｄｑ）４１１位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｖ、Ｌ又はＰへの置換；
（ｄｒ）４２７位又はそれに相当する位置におけるＴからＲ又はＶへの置換；
（ｄｓ）４３３位又はそれに相当する位置におけるＶからＬへの置換。

【0027】

上記（ａ）〜（ｄｓ）の変異は、いずれか単独で適用してもいずれか２以上を組み合わせてもよい。好ましい例としては、該（ａｒ）；該（ａｓ）及び（ａｔ）及び（ａｕ）の組み合わせ；該（ｂｋ）；該（ｃｚ）；該（ｖ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；該（ｂｃ）及び（ｂｄ）の組み合わせ；該（ｅ）及び（ａａ）の組み合わせ；該（ｊ）、（ｓ）、（ｙ）、（ｂｈ）及び（ｄｌ）の組み合わせ、；該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；該（ｊ）、（ｓ）、（ｖ）、（ｙ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｈ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）、（ｄｇ）及び（ｄｌ）の組み合わせ；該（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｃｄ）、（ｃｌ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；ならびに、該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）、（ｄｃ）及び（ｄｇ）の組み合わせ、が挙げられる。

【0028】

好ましくは、当該本発明の変異体の親アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、６８位に相当する位置のアミノ酸残基はヒスチジンであり、かつ２５５位に相当する位置のアミノ酸残基はセリンである。より好ましくは、当該本発明の変異体の親アルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列における下記表１（ｉ）に記載の各位置に相当する位置に、表１（ｉｉ）に記載のアミノ酸残基を有する。表１に示すアミノ酸残基は、上記に例示した親アルカリプロテアーゼ間で高度に保存されているアミノ酸残基である（Ｓａｅｋｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７，１０３：５０１−５０８）。

【0029】

【表1】

【0030】

好ましくは、当該本発明の変異体の親アルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ（特許文献１）が有する次の酵素学的性質のいずれかを有する：１）酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定である。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素（５ｍＭ塩化カルシウムを含有）溶液中（２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃２０分間放置した後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上であることをいう；２）５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す；３）ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害される；４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。より好ましくは、当該親アルカリプロテアーゼは、上記１）〜４）の酵素学的性質を全て有する。

【0031】

好ましくは、本発明の変異アルカリプロテアーゼの親アルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置にアラニンを有する。

【0032】

当該本発明の変異体の親アルカリプロテアーゼの好ましい例としては、配列番号２〜１１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配に対して、それぞれ９９．８％、９７．７％、９７．５％、９７．５％、９６．３％、９７．７％、９７．５％、９７．２％及び９６.８％の同一性を有する。なお、配列番号３〜１１で示されるアミノ酸配列における配列番号２の２９４位アラニンに相当するアミノ酸残基は、２９４位アラニン（配列番号３〜５、８、１０）及び２９５位アラニン（配列番号６〜７、９、１１）である。

【0033】

本発明の変異アルカリプロテアーゼは、上述した親アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換することによって製造することができる。したがって、本発明の変異アルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基はスレオニンである。本発明の変異アルカリプロテアーゼは、その親アルカリプロテアーゼと比べて、キレート剤に対する安定性が向上している。したがって、本発明の変異アルカリプロテアーゼは、その親アルカリプロテアーゼと比べて、キレート剤含有液、例えば洗剤液中でより安定であり、その結果、当該キレート剤含有液中でより高いアルカリプロテアーゼ活性を保持することができる。

【0034】

好ましくは、本発明の変異アルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基がスレオニンであり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。より好ましくは、本発明の変異アルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基がスレオニンであり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、６８位に相当する位置のアミノ酸残基はヒスチジンであり、かつ２５５位に相当する位置のアミノ酸残基はセリンである。

【0035】

上述した親アルカリプロテアーゼの間で、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基は、それらのタンパク質の三次元構造中で、配列番号２で示されるアルカリプロテアーゼの２９４位アラニンと同等の位置に存在すると考えられる。したがって、親アルカリプロテアーゼにおける当該２９４位に相当する位置に存在するアミノ酸残基の変異は、それらの特異的機能に対して互いに類似した効果を及ぼすと推定される。

【0036】

なお、親アルカリプロテアーゼに上記（ａｕ）のように１アミノ酸残基が挿入されている場合、該親アルカリプロテアーゼの配列番号２の１３４位以降の位置に相当する位置は、配列番号２と比べて１残基下流に位置する。

【0037】

本発明の変異アルカリプロテアーゼは、上記２９４位に相当する位置における変異に加えて、そのキレート剤含有溶液中での安定性向上効果を妨げない限り、親アルカリプロテアーゼに対して他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有するものであってもよい。当該変異は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。

【0038】

例えば、本発明の変異アルカリプロテアーゼは、上記（ａ）〜（ｄｓ）に示した置換後のアミノ酸残基からなる群より選択される１つ以上を有していてもよい。例えば、本発明の変異アルカリプロテアーゼは、以下のアミノ酸残基を有していてもよい：該（ａｒ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ａｓ）、（ａｔ）及び（ａｕ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｂｋ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｃｚ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｖ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｂｃ）及び（ｂｄ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｅ）及び（ａａ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｊ）、（ｓ）、（ｙ）、（ｂｈ）及び（ｄｌ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｊ）、（ｓ）、（ｖ）、（ｙ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｈ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）、（ｄｇ）及び（ｄｌ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基；該（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｃｄ）、（ｃｌ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基；又は、該（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）、（ｄｃ）及び（ｄｇ）に示した置換後のアミノ酸残基。これらの変異アルカリプロテアーゼは、該（ａ）〜（ｄｓ）に示した変異のいずれか１つ以上を有する親アルカリプロテアーゼにおいて、その配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアラニンをスレオニンに置換することによって得てもよく、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列の親アルカリプロテアーゼにおいて、Ａ２９４Ｔ変異とともに、該（ａ）〜（ｄｓ）に示した変異のいずれか１つ以上を導入することによって得てもよい。

【0039】

例えば、本発明の変異アルカリプロテアーゼとしては、配列番号２〜５、８、１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのＡ２９４Ｔ変異体、及び配列番号６〜７、９、１１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのＡ２９５Ｔ変異体が挙げられる。

【0040】

本発明において、親アルカリプロテアーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異遺伝子からタンパク質を発現させることにより、目的の変異アルカリプロテアーゼを得ることができる。

【0041】

親遺伝子への目的の変異の導入は、例えば基本的には、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版 新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ８２−８８）の任意の手法により行うことができる。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。

【0042】

親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。

【0043】

親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したバチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、バチルス エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）等の菌、又はそれらの変異株から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。

【0044】

当該バチルス属菌株からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８９，８：１５１−１５６に記載の方法などを用いて行うことができる。親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡから切り出した親遺伝子を含むＤＮＡ断片を、任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。

【0045】

変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９−７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された変異アルカリプロテアーゼ遺伝子を得ることができる。

【0046】

したがって、本発明はまた、変異アルカリプロテアーゼ遺伝子を提供する。本発明の変異アルカリプロテアーゼ遺伝子は、当該本発明の変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドである。当該本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

【0047】

本発明はまた、当該本発明の変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異アルカリプロテアーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ ａｎｄ Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド；分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），１６３−１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。

【0048】

本発明の変異アルカリプロテアーゼを組換え生産する場合、当該ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位等の宿主生物における発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤（例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。

【0049】

本発明はまた、本発明の変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明の変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクター（好ましくは組換え発現ベクター）を宿主に導入することにより製造することができる。

【0050】

当該形質転換体の宿主としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞が挙げられる。該宿主は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。したがって、本発明の形質転換体は、組換えバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株の組換え体である。

【0051】

宿主の形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５−１９３７）、エレクトロポレーション法（Ｂｒｉｇｉｄｉ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５−１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０−１１３４）などが挙げられる。

【0052】

当該本発明の形質転換体を培養することにより、本発明の変異アルカリプロテアーゼを製造することができる。したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。変異アルカリプロテアーゼ製造のための当該形質転換体の培養は、当業者には一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、該微生物宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であればよい。該培地は、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ−マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。該培地には、形質転換体に導入した薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）の種類に対応した薬剤を添加してもよい。また、誘導性プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。

【0053】

あるいは、本発明の変異アルカリプロテアーゼは、無細胞翻訳系を使用して、本発明の変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。

【0054】

当該形質転換体又は無細胞翻訳系で製造された本発明の変異アルカリプロテアーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系の反応液などから取得することができる。あるいは、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮した培養上清や溶菌液上清等の溶液を、粗酵素液としてそのまま使用することができる。発現された変異アルカリプロテアーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。

【0055】

本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２００１，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。さらに、枯草菌の遺伝子組換え実験については、例えば吉川博文著、"７．２ 枯草菌系"「続生化学実験講座１．遺伝子研究法ＩＩ」，１９８６，東京化学同人社（東京），ｐ１５０−１６９等の、枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。

【0056】

本発明の製造方法により得られた変異アルカリプロテアーゼは、親アルカリプロテアーゼと比べて、キレート剤に対する安定性が向上しており、キレート剤含有液、好ましくは液体洗剤中でより安定性に存在することができる、したがって、本発明の別の態様は、上述した親アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基を置換することを含む、アルカリプロテアーゼのキレート剤に対する安定性向上方法であり得る。

【0057】

本発明の変異アルカリプロテアーゼはキレート剤に対する安定性が高いため、洗剤配合用酵素として有用である。本発明の変異アルカリプロテアーゼを含有する洗剤は、従来と比べてより高いプロテアーゼ活性を維持することが可能になり、結果としてより強力な酵素洗浄力を発揮することができる。従って、本発明はまた、本発明の変異アルカリプロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。該洗剤組成物は、粉末洗剤組成物であってもよいが、好ましくは液体洗剤組成物である。

【0058】

本発明の洗剤組成物は、キレート剤を含有する。本発明の洗剤組成物に含まれ得るキレート剤の例としては、上記に挙げたとおりである。本発明の洗剤組成物におけるキレート剤の含有量は、好ましくは０．１〜５質量％、より好ましくは０．１〜４質量％である。

【0059】

本発明の洗剤組成物における本発明の変異アルカリプロテアーゼの含有量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜２５０００Ｕが好ましく、０．１〜５０００Ｕがより好ましく、０．１〜２５００Ｕがさらに好ましい。なお、アルカリプロテアーゼの活性（Ｕ）は以下の方法により測定される：１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．９ｍＬ、４０ｍＭＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍＬを試験管に採り、３０℃で５分間保温する。これに酵素液０．０５ｍＬを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定する。ここで酵素１単位（Ｕ）は上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する量とする。

【0060】

本発明の洗剤組成物は、本発明の変異アルカリプロテアーゼに加えて、界面活性剤及び水を含有する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明の洗剤組成物における当該界面活性剤の含有量は、好ましくは１０〜８０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である。

【0061】

非イオン性界面活性剤としては、一般的に液体洗剤に配合されているＣ８〜Ｃ２２の炭化水素基を有し、Ｃ２オキシアルキレン基が数モル以上付加された非イオン性界面活性剤であればよいが、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ₁Ｏ−（ＡＯ）ｍ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６〜３５）〔特開２０１０−２７５４６８号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１〜５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１０−２６５４４５号公報、特開２０１１−６３７８４号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０〜３０、ｎ＝０〜５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−１８９５５１号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）ｌＯ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｒ₂（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０〜１、ｍ＝１４〜５０、ｎ＝１〜５、Ｒ₂＝水素（ｌ＝０）又はＣ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２２９３８５号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５〜３０、ｎ＝１〜５）〔特開２０１０−２２９３８７号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ−Ｈ及び／又はＲ₂−ＣＯＯ−（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素基、Ｒ₂＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０〜５、ｎ＝２〜１０、ｐ＝０〜５、ｑ＝２〜１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２５４８８１号公報〕；
Ｒ₁−ＣＯＯ−（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ−Ｒ₂（Ｒ₁＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３〜５、ｎ＝８〜２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２６５３３３号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＰＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＰＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ１０−Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５〜１５、ｎ＝１〜３）〔特開平８−１５７８６７号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）−（ＥＯ）ｍ−ＯＲ₂（Ｒ₁＝Ｃ１１−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０〜２０）〔特開２００８−７７０６号公報、特開２００９−７４５１号公報、特開２００９−１５５５９４号公報、特開２００９−１５５６０６号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）−（ＡＯ）ｍ−ＯＲ₂（Ｒ₁＝Ｃ９−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ｍ＝５〜３０）〔特開２００９−１４４００２号公報、特開２００９−１７３８５８号公報、特開２０１０−１８９６１２号公報〕；ならびに、
脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等。

【0062】

陰イオン界面活性剤としては、例えばカルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。

【0063】

陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。

【0064】

両性イオン活性剤としては、例えばアルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。

【0065】

本発明の洗剤組成物は、さらに、洗剤組成物に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、有機酸又はその塩、本発明の変異アルカリプロテアーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤、分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、可溶化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類、などを含み得る。

【0066】

水溶性ポリマーとしては、例えば、（i）炭素数２〜５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（i）又は（ii）のいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０−２７５４６８号公報、特開平１０−０６０４９６号公報）；アルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９−１５５６０６号公報）、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該水溶性ポリマーの含有量は、好ましくは０．２〜１０質量％、より好ましくは０．４〜５質量％である。

【0067】

水混和性有機溶剤としては、例えば、アルカノール類のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは１〜３５質量％である。

【0068】

アルカリ剤としては、例えば、Ｃ２−Ｃ４のアルカノールを１〜３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、好ましくは０〜２０質量％、より好ましくは０〜１０質量％である。

【0069】

有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの塩等の多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類、などが挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、好ましくは０〜５質量％、より好ましくは０〜３質量％である。

【0070】

再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸−酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができるが、配合に適さない場合は除外してもよい。

【0071】

色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１〜１０質量％が好ましい。

【0072】

漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤を、当該洗剤組成物中１〜１０質量％含有させることが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を、当該洗剤組成物中０．０１〜１０質量％含有させることができる。

【0073】

蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該蛍光剤の含有量は０．００１〜２質量が好ましい。

【0074】

本発明の変異アルカリプロテアーゼ以外の他の酵素としては、例えば、他のプロテアーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等の加水分解酵素、ならびにそれらの２種以上の混合物が挙げられる。

【0075】

酵素安定化剤としては、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ヒドロキシ化合物、蟻酸などが挙げられ、酸化防止剤としては、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられ、可溶化剤としては、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などが挙げられる。さらに、本発明の洗剤組成物は、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ−リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤などを含有していてもよい。

【0076】

本発明の変異アルカリプロテアーゼを配合することができる洗剤組成物の好ましい例としては、特開２０１０−２６５３３３号公報、特開２０１４−１４１６６２号公報、特開２００９−１９１１２８号公報、特開２０１２−２２４６５２号公報、特表２０１３−５０３９５０号公報、特表平１１−５１２７６８号公報の実施例に記載の液体洗剤組成物が挙げられる。例えば、特開２０１４−１４１６６２号公報の実施例４に記載される液体洗剤組成物〔界面活性剤を３０％（陰イオン界面活性剤を２０％、非イオン界面活性剤１０％）、クエン酸 ３％、水酸基を有する有機溶剤（ジエチレングリコールモノブチルエーテル）を１８％、組成物のｐＨを８．０にするのに必要なアルカリ剤（モノエタノールアミン）、イオン交換水、及び香料等を配合した組成物〕に本発明の変異アルカリプロテアーゼを配合することにより、本発明の洗剤組成物を調製することができる。

【0077】

本発明の洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましくは衣料又は布製品（シーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）の洗浄用のものである。本発明に係る洗剤組成物は、本発明の変異アルカリプロテアーゼを安定に保持することができるため、高い酵素洗浄力を発揮することができる。

【0078】

本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

【0079】

〔１〕配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基がスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなる、変異アルカリプロテアーゼ。
〔２〕好ましくは、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置にアラニンを有する、〔１〕記載の変異アルカリプロテアーゼ。
〔３〕好ましくは、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、プロテアーゼＫＰ９８６０又はプロテアーゼ９８６５のアミノ酸配列である、〔１〕又は〔２〕記載の変異アルカリプロテアーゼ。
〔４〕前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、
(i) 好ましくは、以下の（ａ´）〜（ｄｓ´）からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を有し：
（ａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ；
（ｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ又はＮ；
（ｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ又はＡ；
（ｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ；
（ｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＩ；
（ｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ；
（ｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ又はＳ；
（ｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＡ、Ｖ又はＩ；
（ｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ；
（ｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の５９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｄ又はＬ；
（ｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ又はＰ；
（ｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の６６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＨ又はＡ；
（ｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭ；
（ａａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｃ又はＡ；
（ａｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ；
（ａｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の８９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＨ；
（ａｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の９１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＣ；
（ａｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１００位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｒ、Ｋ又はＡ；
（ａｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１０９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｉ又はＦ；
（ａｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ又はＷ；
（ａｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１２０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ａｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１２４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＫ又はＡ；
（ａｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭ；
（ａｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ又はＡ；
（ａｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間のアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ａｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ、Ａ、Ｌ又はＭ；
（ａｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ａｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又は；
（ａｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１４０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｗ又はＦ；
（ａｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１４８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、ＦまたはＰ；
（ｂａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１５１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｂｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｂｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１６７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ；
（ｂｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ又はＬ；
（ｂｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ、Ｅ又はＡ；
（ｂｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１８７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ；
（ｂｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦ；
（ｂｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｒ又はＫ；
（ｂｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｂｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２００位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｂｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰ；
（ｂｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷ；
（ｂｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２１２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷ；
（ｂｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２２６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ；
（ｂｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｉ又はＷ；
（ｂｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｂｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２３８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ；
（ｂｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｌ又はＩ；
（ｂｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｂｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４６位又はそれに相当する位置におけるＹアミノ酸残基が、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦ；
（ｂｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｂｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２４８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｂｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｂｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩ；
（ｃａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ又はＩ；
（ｃｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２６４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｃｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２７３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ又はＩ；
（ｃｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２７５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２７７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２８１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ；
（ｃｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ；
（ｃｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、Ｗ又はＦ；
（ｃｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ；
（ｃｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３１３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｃｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３１９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｃｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＭ、Ｗ又はＦ；
（ｃｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｔ又はＶ；
（ｃｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３４位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ；
（ｃｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｃｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３３７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶ；
（ｃｔ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３４２位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｃｕ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３４３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ；
（ｃｖ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３４６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ；
（ｃｗ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３５７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ；
（ｃｘ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３５９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦ；
（ｃｙ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３６１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｉ又はＷ；
（ｃｚ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３６９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ；
（ｄａ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＷ；
（ｄｂ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ又はＷ；
（ｄｃ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３７９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＤ、Ｅ、Ｒ又はＫ；
（ｄｄ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＦ；
（ｄｅ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ、Ｍ又はＰ；
（ｄｆ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＡ、Ｌ、Ｉ又はＭ；
（ｄｇ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３８７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦ；
（ｄｈ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３９０位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦ；
（ｄｉ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３９３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＱ；
（ｄｊ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の３９６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ；
（ｄｋ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＴ又はＫ；
（ｄｌ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０５位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰ；
（ｄｍ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０６位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＶ、Ｗ又はＦ；
（ｄｎ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＧ又はＣ；
（ｄｏ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０８位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＮ、Ｙ、Ｉ又はＷ；
（ｄｐ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０９位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＹ又はＷ；
（ｄｑ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４１１位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＡ、Ｖ、Ｌ又はＰ；
（ｄｒ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４２７位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＲ又はＶ；
（ｄｓ´）配列番号２で示されるアミノ酸配列の４３３位又はそれに相当する位置におけるアミノ酸残基がＬ、
(ii)より好ましくは、以下のいずれか：
（ａｒ´）に示したアミノ酸残基；
（ａｓ´）、（ａｔ´）及び（ａｕ´）に示したアミノ酸残基；
（ｂｋ´）に示したアミノ酸残基；
（ｃｚ´）に示したアミノ酸残基；
（ｖ´）、（ｃｄ´）、（ｃｘ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基；
（ｂｃ´）及び（ｂｄ´）に示したアミノ酸残基；
（ｅ´）及び（ａａ´）に示したアミノ酸残基；
（ｊ´）、（ｓ´）、（ｙ´）、（ｂｈ´）及び（ｄｌ´）に示したアミノ酸残基；
（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｄ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基；
（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｄ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基；
（ｖ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｄ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基；
（ｊ´）、（ｓ´）、（ｖ´）、（ｙ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｈ´）、（ｂｋ´）、（ｃｄ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）、（ｄｇ´）及び（ｄｌ´）に示したアミノ酸残基；
（ｖ´）、（ａａ´）、（ａｒ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｄ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基；
（ｖ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｃｄ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基；
（ｅ´）、（ｖ´）、（ａａ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｋ´）、（ｂｍ´）、（ｃｄ´）、（ｃｌ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基；及び
（ｖ´）、（ａｓ´）、（ａｔ´）、（ａｕ´）、（ｂｃ´）、（ｂｄ´）、（ｂｊ´）、（ｂｋ´）、（ｂｏ´）（ｃｄ´）、（ｃｘ´）、（ｃｚ´）、（ｄｃ´）及び（ｄｇ´）に示したアミノ酸残基、
を有する、
〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼ。
〔５〕前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、
好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位に相当する位置にアスパラギン酸を、６８位に相当する位置にヒスチジンを、かつ２５５位に相当する位置にセリンを有し、
より好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表１（ｉ）記載の位置に相当する位置に、当該表１（ｉｉ）記載のアミノ酸残基を有する、
〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼ。
〔６〕好ましくは、配列番号２〜５、８、１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる変異アルカリプロテアーゼのＡ２９４Ｔ変異体であるか、又は配列番号６〜７、９、１１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる変異アルカリプロテアーゼのＡ２９５Ｔ変異体である〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼ。

【0080】

〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔８〕〔７〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔９〕外来の〔７〕記載のポリヌクレオチド又は〔８〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔１０〕好ましくは、前記ベクターがバチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである、〔８〕記載のベクター又は〔９〕記載の形質転換体。
〔１１〕好ましくは組換えバチルス属細菌である、〔９〕又は〔１０〕記載の形質転換体。
〔１２〕〔９〕〜〔１１〕記載の形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法。

【0081】

〔１３〕〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼを含有する洗剤組成物。
〔１４〕好ましくはキレート剤を含有する、〔１３〕記載の洗剤組成物。
〔１５〕好ましくは液体洗剤組成物である、〔１３〕又は〔１４〕記載の洗剤組成物。
〔１６〕界面活性剤の含有量が、好ましくは１０〜８０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である〔１５〕記載の洗剤組成物。

【0082】

〔１７〕配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換することを含む、変異アルカリプロテアーゼの製造方法。
〔１８〕配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換することを含む、アルカリプロテアーゼのキレート剤に対する安定性向上方法。
〔１９〕好ましくは、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２９４位に相当する位置にアラニンを有する、〔１７〕又は〔１８〕記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、プロテアーゼＫＰ９８６０又はプロテアーゼ９８６５のアミノ酸配列である、〔１７〕〜〔１９〕のいずれか１項記載の方法。
〔２１〕好ましくは、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して以下の変異を有するアミノ酸配列である、〔１７〕〜〔１９〕のいずれか１項記載の方法：
(i) 好ましくは、以下の（ａ）〜（ｄｓ）からなる群より選択される１つ以上：
（ａ）６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂ）９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｃ）１１位又はそれに相当する位置におけるＤからＧ、Ｓ又はＮへの置換；
（ｄ）１５位又はそれに相当する位置におけるＳからＨ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｅ）１６位又はそれに相当する位置におけるＳから、Ｔ、Ｑ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｆ）２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦ又はＡへの置換；
（ｇ）２２位又はそれに相当する位置におけるＱからＷへの置換；
（ｈ）２３位又はそれに相当する位置におけるＧからＮへの置換；
（ｉ）３７位又はそれに相当する位置におけるＲからＴへの置換；
（ｊ）４０位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｋ）４１位又はそれに相当する位置におけるＳからＩへの置換；
（ｌ）４６位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｍ）４９位又はそれに相当する位置におけるＫからＱへの置換；
（ｎ）５２位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ又はＳへの置換；
（ｏ）５３位又はそれに相当する位置におけるＬからＡ、Ｖ又はＩへの置換；
（ｐ）５４位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｑ）５６位又はそれに相当する位置におけるＬからＶへの置換；
（ｒ）５７位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｓ）５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｔ）６０位又はそれに相当する位置におけるＮからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｕ）６３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｄ又はＬへの置換；
（ｖ）６５位又はそれに相当する位置におけるＴからＷ又はＰへの置換；
（ｗ）６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｘ）８０位又はそれに相当する位置におけるＧからＨ又はＡへの置換；
（ｙ）８１位又はそれに相当する位置におけるＳからＱ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｚ）８２位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＭへの置換；
（ａａ）８３位又はそれに相当する位置におけるＮからＳ、Ｃ又はＡへの置換；
（ａｂ）８４位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ａｃ）８９位又はそれに相当する位置におけるＱからＨへの置換；
（ａｄ）９１位又はそれに相当する位置におけるＮからＣへの置換；
（ａｅ）１００位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｆ）１０１位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｇ）１０２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｈ）１０３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｉ）１０４位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｊ）１０５位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｋ）１０６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｌ）１０７位又はそれに相当する位置におけるＬからＳ、Ｒ、Ｋ又はＡへの置換；
（ａｍ）１０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＦへの置換；
（ａｎ）１１３位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ａｏ）１１９位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｐ）１２０位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｑ）１２４位又はそれに相当する位置におけるＲからＫ又はＡへの置換；
（ａｒ）１３２位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｉ又はＭへの置換；
（ａｓ）１３３位又はそれに相当する位置におけるＡからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｔ）１３４位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｓ、Ｔ又はＡへの置換；
（ａｕ）１３３位又はそれに相当する位置と１３４位又はそれに相当する位置との間へのＧ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷの挿入；
（ａｖ）１３５位又はそれに相当する位置におけるＮからＲ、Ａ、Ｌ又はＭへの置換；
（ａｗ）１３６位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｘ）１３８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ａｙ）１４０位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ａｚ）１４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｍ、Ｗ、ＦまたはＰへの置換；
（ｂａ）１５１位又はそれに相当する位置におけるＫからＦへの置換；
（ｂｂ）１６３位又はそれに相当する位置におけるＥからＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｂｃ）１６６位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｄ）１６７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶへの置換；
（ｂｅ）１７０位又はそれに相当する位置におけるＩからＶ又はＬへの置換；
（ｂｆ）１７１位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、Ｔ、Ｅ又はＡへの置換；
（ｂｇ）１８７位又はそれに相当する位置におけるＮからＳへの置換；
（ｂｈ）１９１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｉ）１９３位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｊ）１９４位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｂｋ）１９５位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｂｌ）２００位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｂｍ）２０４位又はそれに相当する位置におけるＱからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＰへの置換；
（ｂｎ）２０５位又はそれに相当する位置におけるＦからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＷへの置換；
（ｂｏ）２１２位又はそれに相当する位置におけるＫからＮ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｂｐ）２２６位又はそれに相当する位置におけるＦからＹへの置換；
（ｂｑ）２３３位又はそれに相当する位置におけるＳからＬ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｂｒ）２３７位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｓ）２３８位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｂｔ）２４３位又はそれに相当する位置におけるＮからＹ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｂｕ）２４５位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｂｖ）２４６位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ、Ｖ、Ｌ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｗ）２４７位又はそれに相当する位置におけるＫからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｂｘ）２４８位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｂｙ）２５０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｂｚ）２５１位又はそれに相当する位置におけるＭからＧ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩへの置換；
（ｃａ）２５６位又はそれに相当する位置におけるＭからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｂ）２５７位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ又はＩへの置換；
（ｃｃ）２６４位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｃｄ）２７３位又はそれに相当する位置におけるＶからＧ、Ｔ又はＩへの置換；
（ｃｅ）２７５位又はそれに相当する位置におけるＮからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｆ）２７７位又はそれに相当する位置におけるＧからＶ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｇ）２８１位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｈ）２９６位又はそれに相当する位置におけるＩからＶへの置換；
（ｃｉ）２９７位又はそれに相当する位置におけるＧからＬ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｊ）３０４位又はそれに相当する位置におけるＮからＳへの置換；
（ｃｋ）３１３位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｃｌ）３１９位又はそれに相当する位置におけるＡからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｍ）３２０位又はそれに相当する位置におけるＹからＧ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｎ）３２６位又はそれに相当する位置におけるＳからＷへの置換；
（ｃｏ）３３０位又はそれに相当する位置におけるＳからＭ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｃｐ）３３２位又はそれに相当する位置におけるＫからＧ、Ｔ又はＶへの置換；
（ｃｑ）３３４位又はそれに相当する位置におけるＴからＬへの置換；
（ｃｒ）３３５位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｃｓ）３３７位又はそれに相当する位置におけるＦからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ又はＶへの置換；
（ｃｔ）３４２位又はそれに相当する位置におけるＧからＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｃｕ）３４３位又はそれに相当する位置におけるＫからＴへの置換；
（ｃｖ）３４６位又はそれに相当する位置におけるＫからＲへの置換；
（ｃｗ）３５７位又はそれに相当する位置におけるＳからＬへの置換；
（ｃｘ）３５９位又はそれに相当する位置におけるＴからＧ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＦへの置換；
（ｃｙ）３６１位又はそれに相当する位置におけるＳからＶ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｃｚ）３６９位又はそれに相当する位置におけるＤからＮへの置換；
（ｄａ）３７６位又はそれに相当する位置におけるＮからＷへの置換；
（ｄｂ）３７８位又はそれに相当する位置におけるＴからＬ又はＷへの置換；
（ｄｃ）３７９位又はそれに相当する位置におけるＱからＤ、Ｅ、Ｒ又はＫへの置換；
（ｄｄ）３８０位又はそれに相当する位置におけるＹからＦへの置換；
（ｄｅ）３８５位又はそれに相当する位置におけるＦからＹ、Ｍ又はＰへの置換；
（ｄｆ）３８６位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｌ、Ｉ又はＭへの置換；
（ｄｇ）３８７位又はそれに相当する位置におけるＳからＧ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｈ）３９０位又はそれに相当する位置におけるＮからＧ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＦへの置換；
（ｄｉ）３９３位又はそれに相当する位置におけるＷからＱへの置換；
（ｄｊ）３９６位又はそれに相当する位置におけるＲからＧへの置換；
（ｄｋ）４０３位又はそれに相当する位置におけるＦからＴ又はＫへの置換；
（ｄｌ）４０５位又はそれに相当する位置におけるＮからＤ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ又はＰへの置換；
（ｄｍ）４０６位又はそれに相当する位置におけるＡからＶ、Ｗ又はＦへの置換；
（ｄｎ）４０７位又はそれに相当する位置におけるＰからＧ又はＣへの置換；
（ｄｏ）４０８位又はそれに相当する位置におけるＱからＮ、Ｙ、Ｉ又はＷへの置換；
（ｄｐ）４０９位又はそれに相当する位置におけるＳからＹ又はＷへの置換；
（ｄｑ）４１１位又はそれに相当する位置におけるＴからＡ、Ｖ、Ｌ又はＰへの置換；
（ｄｒ）４２７位又はそれに相当する位置におけるＴからＲ又はＶへの置換；
（ｄｓ）４３３位又はそれに相当する位置におけるＶからＬへの置換、
(ii) より好ましくは、以下のいずれか：
（ａｒ）；
（ａｓ）、（ａｔ）及び（ａｕ）の組み合わせ；
（ｂｋ）；
（ｃｚ）；
（ｖ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；
（ｂｃ）及び（ｂｄ）の組み合わせ；
（ｅ）及び（ａａ）の組み合わせ；
（ｊ）、（ｓ）、（ｙ）、（ｂｈ）及び（ｄｌ）の組み合わせ、；
（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；
（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；
（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；
（ｊ）、（ｓ）、（ｖ）、（ｙ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｈ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）、（ｄｇ）及び（ｄｌ）の組み合わせ；
（ｖ）、（ａａ）、（ａｒ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；
（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；
（ｅ）、（ｖ）、（ａａ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｋ）、（ｂｍ）、（ｃｄ）、（ｃｌ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）及び（ｄｇ）の組み合わせ；及び
（ｖ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｏ）（ｃｄ）、（ｃｘ）、（ｃｚ）、（ｄｃ）及び（ｄｇ）の組み合わせ。
〔２２〕前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、
好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位に相当する位置にアスパラギン酸を、６８位に相当する位置にヒスチジンを、かつ２５５位に相当する位置にセリンを有し、
より好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表１（ｉ）記載の位置に相当する位置に、当該表１（ｉｉ）記載のアミノ酸残基を有する、
〔１７〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の方法。
〔２３〕好ましくは、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号２〜１１のいずれかで示されるアミノ酸配列である、〔１７〕〜〔２２〕のいずれか１項記載の方法。

【実施例】

【0083】

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0084】

実施例１ アルカリプロテアーゼ変異体の作製
本発明のアルカリプロテアーゼ変異体の作製方法を、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ成熟酵素領域のアミノ酸配列（配列番号２）における２９４位のアラニン（Ａ２９４）をスレオニンに変異させた「Ａ２９４Ｔ」変異体の作製を例として以下に示す。

【0085】

配列番号２のアルカリプロテアーゼをコードするバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子（配列番号１）を含有する組換えベクターに対して、配列番号２の２９４位のアミノ酸残基をスレオニンに置換する部位特異的変異を導入した。変異用プライマーＡ２９４−Ｆ（配列番号１２：ＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＡＣＡＴＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＴＡＣ）及びＡ２９４−Ｒ（配列番号１３：ＧＡＴＧＴＣＡＧＴＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣ）を設計した。これらのプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）のプロトコルに従い、変異を導入したＰＣＲ産物を取得した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロッシュ）にて精製した後、宿主菌であるバチルス エスピー ＫＳＭ９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）を形質転換した。

【0086】

得られた形質転換体を、スキムミルク含有アルカリ寒天培地〔スキムミルク（ディフコ）１％（ｗ／ｖ）、バクトトリプトン（ディフコ）１％、酵母エキス（ディフコ）０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％、炭酸ナトリウム０．０５％、テトラサイクリン１５ｐｐｍ〕に生育させ、ハローの形成状況により、変異プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。該形質転換体は、５ｍＬの種母培地〔６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．０５％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．２５％炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン〕に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。次いで２０ｍＬの主培地〔８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン〕に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行なった。得られた培養液を遠心分離し、アルカリプロテアーゼ変異体を含む培養上清を取得し、そのタンパク質量を、プロテインアッセイラピッドキットワコー（和光純薬）を用いて測定した。

【0087】

実施例２ アルカリプロテアーゼ多重変異体の作製
特許５２０２６９０号公報、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、特開２００６−１２９８６５号公報、特開２００７−０６１１０１号公報、特開２００８−２１２０８４、特開２０１０−２７３６７２号公報、特開２０１０−２７３６７３号公報、及び特開２０１３−２３３１４１号公報の記載を参考に、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）に変異を導入し、以下のＫＰ４３プロテアーゼ変異体を作製した。

【0088】

（１）１重変異体（配列番号３）：
１３２位のアラニンをスレオニンに置換（特許５２０２６９０号公報）、
（２）１０重変異体−１（配列番号４）：
１９５位のチロシンをグルタミンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
１６位のセリンをバリンに置換、及び８３位のアスパラギンをアラニンに置換（特開２０１０−２７３６７２号公報、及び特開２０１０−２７３６７３号公報）、
（３）１１重変異体−１（配列番号５）：
１３２位のアラニンをスレオニンに置換（特許５２０２６９０号公報）；
１９５位のチロシンをグルタミンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
１６位のセリンをバリンに置換、及び８３位のアスパラギンをアラニンに置換（特開２０１０−２７３６７２号公報、及び特開２０１０−２７３６７３号公報）、
（４）１１重変異体−２（配列番号６）：
１９５位のチロシンをグルタミンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
１３３位のアラニンをセリンに置換、１３４位のバリンをトレオニンに置換、及び１３３位と１３４位の間にセリンを挿入（特開２００６−１２９８６５号公報）、
（５）１６重変異体（配列番号７）：
１９５位のチロシンをグルタミンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
１３３位のアラニンをセリンに置換、１３４位のバリンをトレオニンに置換、及び１３３位と１３４位の間にセリンを挿入（特開２００６−１２９８６５号公報）；
４０位のセリンをイソロイシンに置換、５９位のスレオニンをバリンに置換、８１位のセリンをロイシンに置換、１９１位のセリンをロイシンに置換、及び４０５位のアスパラギンをロイシンに置換（特開２０１３−２３３１４１号公報）。

【0089】

（６）１０重変異体−２（配列番号８）：
１３２位のアラニンをスレオニンに置換（特許５２０２６９０号公報）；
１９５位のチロシンをアルギニンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
８３位のアスパラギンをアラニンに置換（特開２０１０−２７３６７２号公報）、
（７）１１重変異体−３（配列番号９）：
１９５位のチロシンをアルギニンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
１３３位のアラニンをセリンに置換、１３４位のバリンをトレオニンに置換、及び１３３位と１３４位の間にセリンを挿入（特開２００６−１２９８６５号公報）、
（８）１２重変異体（配列番号１０）：
１９５位のチロシンをグルタミンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
８３位のアスパラギンをアラニンに置換、及び３１９位のアラニンをバリンに置換（特開２０１０−２７３６７２号公報）、
１６位のセリンをバリンに置換、及び２０４位のグルタミンをアスパラギン酸に置換（特開２０１０−２７３６７３号公報）、
（９）１４重変異体（配列番号１１）：
１９５位のチロシンをアルギニンに置換（特開２００２−２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２−３０６１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４−０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４−３０５１７６号公報）；
１３３位のアラニンをセリンに置換、１３４位のバリンをトレオニンに置換、及び１３３位と１３４位の間にセリンを挿入（特開２００６−１２９８６５号公報）；
１９４位のセリンをアルギニンに置換、２１２位のリジンをアルギニンに置換、３７９位のグルタミンをアルギニンに置換（特開２００８−２１２０８４号公報）。

【0090】

上記１重変異体（配列番号３）、１０重変異体−１（配列番号４）、１１重変異体−１（配列番号５）、１１重変異体−２（配列番号６）、１６重変異体（配列番号７）、１０重変異体−２（配列番号８）、１１重変異体−３（配列番号９）、１２重変異体（配列番号１０）及び１４重変異体（配列番号１１）は、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）対して、それぞれ９９．８％、９７．７％、９７．５％、９７．５％、９６．３％、９７．７％、９７．５％、９７．２％、及び９６.８％のアミノ酸配列の同一性を有していた。

【0091】

上記で得られた各変異体をコードするポリヌクレオチドに対して、実施例１と同様の手順で、配列番号２の２９４位に相当する位置のアラニンをスレオニンに置換する変異（配列番号３〜５、８、１０に対するＡ２９４Ｔ、及び配列番号６〜７、９、１１に対するＡ２９５Ｔ）を導入した後、宿主に形質転換し、該形質転換体を培養してアルカリプロテアーゼ変異体を含む培養上清を取得し、そのタンパク質量を測定した。以下の実施例では、実施例１及び２で得られた配列番号２の２９４位に相当する位置にＴを有するアルカリプロテアーゼ変異体を、まとめてＡ２９４Ｔ変異体と称する。

【0092】

実施例３ アルカリプロテアーゼ変異体のキレート剤含有液中での安定性評価
（１）クエン酸塩水溶液中での安定性評価
２ｍＭのクエン酸３Ｎａを含む、又は含まない２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に、実施例１で得たＡ２９４Ｔ変異体の培養上清を加えてよく混合し、酵素溶液を得た（酵素終濃度０．０１７ｍｇ／ｍＬ）。該酵素溶液を９６穴アッセイプレートに２００μＬ分取し、そこへ１０ｍＭのＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ・Ｈ_２Ｏ（ペプチド研究所）を１０μＬ添加し、マイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００Ｐｒｏ；ＴＥＣＡＮ）を用いて３０℃で１５分間振盪しながら４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定した。吸光度変化速度（ｍＯＤ４０５／ｍｉｎ）を酵素活性とみなし、初期活性値を得た。該酵素溶液を７０℃で１０分間加熱したものについて、初期活性値の測定と同様の方法で、残存活性値を取得した。下式を用いて、アルカリプロテアーゼの残存活性（％）を算出した：
残存活性（％）＝ 残存活性値 ／ 初期活性値 × １００
次いで、親アルカリプロテアーゼ（野生型ＫＰ４３プロテアーゼ；配列番号２）の残存活性を１００％とした場合における、該Ａ２９４Ｔ変異体の残存活性の相対値（残存相対活性（％））を求めた。

【0093】

同様に、実施例２で得た１重変異体（配列番号３）、１１重変異体−２（配列番号６）、１４重変異体（配列番号１１）、及び１６重変異体（配列番号７）のＡ２９４Ｔ変異体の残存活性（％）を算出し、それぞれの親アルカリプロテアーゼに対する残存相対活性（％）を求めた。

【0094】

（２）ＥＤＴＡ水溶液中での安定性評価
１ｍＭのＥＤＴＡを含む、又は含まない２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に、実施例１で得たＡ２９４Ｔ変異体の培養上清を加えてよく混合し、酵素溶液を得た（酵素終濃度０．０１７ｍｇ／ｍＬ）。当該酵素溶液を用いて、上記（１）と同様の条件でアルカリプロテアーゼの残存活性（％）を算出し、親アルカリプロテアーゼに対する残存相対活性（％）を求めた。

【0095】

同様に、実施例２で得た１重変異体（配列番号３）、１０重変異体−１（配列番号４）、１０重変異体−２（配列番号８）、１１重変異体−１（配列番号５）、１１重変異体−２（配列番号６）、１１重変異体−３（配列番号９）、１２重変異体（配列番号１０）及び１６重変異体（配列番号７）のＡ２９４Ｔ変異体の残存活性（％）を算出し、それぞれの親アルカリプロテアーゼに対する残存相対活性（％）を求めた。

【0096】

（３）結果
図１及び表２に、上記（１）で測定したクエン酸塩水溶液中でのＡ２９４Ｔ変異体の残存相対活性を示す。図２〜３及び表３〜４に、上記（２）で測定したＥＤＴＡ水溶液中でのＡ２９４Ｔ変異体の残存相対活性を示す。Ａ２９４Ｔ変異体は、それらの親アルカリプロテアーゼと比べて、キレート剤を含まない液中での残存活性は同等であったが、キレート剤含有液中ではより高い残存活性を有していた。これは、該Ａ２９４Ｔ変異体が親アルカリプロテアーゼと比べて、キレート剤含有液中での安定性が向上していることを示す。

【0097】

【表2】

【0098】

【表3】

【0099】

【表4】

【0100】

実施例４ アルカリプロテアーゼ変異体の洗剤組成物中での安定性評価
市販の衣料用液体洗剤組成物（ウルトラアタックＮｅｏ；花王、２０１５年発売、クエン酸塩配合）を、電子レンジ加熱して製品中の酵素を失活させた。これに実施例１のＡ２９４Ｔ変異体又は野生型ＫＰ４３プロテアーゼを１．０％（ｖ／ｖ）添加してよく混合し、酵素含有洗剤組成物を得た。該洗剤組成物をイオン交換水で１０倍に希釈した後、十分に撹拌した。得られた洗剤液を９６穴アッセイプレートに２００μＬ分取し、そこへ１０ｍＭのＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ・Ｈ_２Ｏ（ペプチド研究所）を１０μＬ添加し、マイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００Ｐｒｏ；ＴＥＣＡＮ）を用いて３０℃で１５分間振盪しながら ４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定した。吸光度変化速度（ｍＯＤ４０５／ｍｉｎ）を酵素活性とみなし、初期活性値を得た。また、該洗剤組成物を４０℃で２８日間保存した後、初期活性値の測定と同様の方法で残存活性値を取得し、下式を用いてアルカリプロテアーゼの残存活性（％）を算出した。
残存活性（％）＝ 残存活性値 ／ 初期活性値 × １００
次いで、野生型ＫＰ４３プロテアーゼの残存活性を１００％とした場合における該Ａ２９４Ｔ変異体の残存相対活性（％）を求めた。

【0101】

結果を表５に示す。Ａ２９４Ｔ変異体は、その親アルカリプロテアーゼである野生型ＫＰ４３プロテアーゼと比べて、洗剤組成物中での保存安定性を約２倍に向上させた。

【0102】

【表5】

【0103】

参考例１
実施例２において親アルカリプロテアーゼとして用いたＫＰ４３プロテアーゼの１重変異体及び多重変異体について、クエン酸耐性及びＥＤＴＡ耐性を実施例３及び４と同条件にて調べた。クエン酸耐性の結果を表６に、ＥＤＴＡ耐性の結果を表７に示す。表６及び７の値は、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）の残存活性を１００％としたときの各変異体の残存相対活性（％）を表す。各親アルカリプロテアーゼは、野生型ＫＰ４３プロテアーゼと比べて、同等以上のキレート剤耐性を有していた。これらの結果は、実施例３及び４で示したＡ２９４Ｔ変異体のキレート剤耐性が、親アルカリプロテアーゼ及び野生型のいずれと比べても優れていることを示す。

【0104】

【表6】

【0105】

【表7】

【0106】

以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]