特開 2017-46710 遺伝子療法適用のためのスーパーコイル状ミニサークルＤＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-46710(P2017-46710A)

(43)【公開日】2017年3月9日

(54)【発明の名称】遺伝子療法適用のためのスーパーコイル状ミニサークルＤＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170217BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170217BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170217BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170217BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170217BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170217BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20170217BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20170217BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170217BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20170217BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K48/00

   A61K31/7088

   A61K31/7105

   A61P35/00

   A61K35/76

【審査請求】有

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2016-214390(P2016-214390)

(22)【出願日】2016年11月1日

(62)【分割の表示】特願2012-534410(P2012-534410)の分割

【原出願日】2010年10月15日

(31)【優先権主張番号】61/252,455

(32)【優先日】2009年10月16日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】391058060

【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(72)【発明者】

【氏名】ゼチードリッチ，イー・リン

(72)【発明者】

【氏名】フォグ，ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】カタニーズ，ダニエル・ジェームズ，ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】バッカルバシ，エロル

(72)【発明者】

【氏名】ギルバート，ブライアン・イー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB262

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】      （修正有）

【課題】遺伝子療法のためのベクターおよび該ベクターを細胞に送達するための効率的な方法の提供。
【解決手段】核酸配列として、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、細菌の複製起点と抗生物質選択遺伝子の両方を欠いたｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒあるいは該ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含む核酸分子組成物。ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを細胞と接触させることを含む、細胞において遺伝子を発現させる方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含む核酸分子組成物であって、前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしている、前記組成物。

【請求項2】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

その核酸配列が、タンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される構成要素により結合されることができる、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが化学的部分、修飾されたオリゴヌクレオチド、および／または修飾された主鎖を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

その化学的部分が、フルオレセイン、ビオチン、色素、およびコレステロールからなるグループから選択される、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

細胞において遺伝子の発現をサイレンシングする方法であって、前記の細胞をｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒと接触させることを含み、前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしており、その核酸配列がその遺伝子の発現をサイレンシングする、前記方法。

【請求項8】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

その核酸配列が、タンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される構成要素により結合されることができるＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒをそれを必要とする哺乳類に投与することを含み、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしている、遺伝子療法の方法。

【請求項12】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

その核酸配列が、タンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される構成要素により結合されることができるＤＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

その哺乳類がヒトである、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

細胞に療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを投与することを含み、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしている、遺伝子療法の方法。

【請求項17】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

その核酸配列が、タンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される構成要素により結合されることができるＤＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

その細胞が哺乳類細胞である、請求項１６に記載の方法。

【請求項21】

哺乳類細胞において未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子の発現をサイレンシングする方法であって、その哺乳類細胞に有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを投与することを含み、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしており、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子の発現をサイレンシングする、前記方法。

【請求項22】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

その核酸配列が、タンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される構成要素により結合されることができるＤＮＡを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

その哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。

【請求項26】

それを必要とする哺乳類において癌を処置する方法であって、その哺乳類に療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒまたはｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含む哺乳類細胞を投与することを含み、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしている、前記方法。

【請求項27】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

その核酸配列が、タンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される構成要素により結合されることができるＤＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

その哺乳類がヒトである、請求項２６に記載の方法。

【請求項31】

その癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項２６に記載の方法。

【請求項32】

その非ホジキンリンパ腫が未分化大細胞リンパ腫である、請求項２６に記載の方法。

【請求項33】

細胞における遺伝子発現の方法であって、前記の細胞をｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒと接触させることを含み、前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしており、その核酸配列が遺伝子を発現する、前記方法。

【請求項34】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

その細胞が哺乳類細胞である、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

哺乳類の気道中の細胞に療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを送達することを含み、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしている、遺伝子療法の方法。

【請求項37】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

その核酸配列が、タンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される構成要素により結合されることができるＤＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

その核酸配列が遺伝子を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

その哺乳類がヒトである、請求項３６に記載の方法。

【請求項41】

そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが噴霧装置の使用により送達される、請求項３６に記載の方法。

【請求項42】

そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒがキャリヤー分子の非存在下で送達される、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒがその哺乳類の気道の鼻粘膜に送達される、請求項３６に記載の方法。

【請求項44】

請求項１に記載の組成物を含む、哺乳類細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
この出願は、２００９年１０月１６日に出願された米国仮出願第６１／２５２，４５５号の利益を主張する。上記の出願の全教示を本明細書に援用する。

【0002】

政府援助
本発明は全て、または部分的に、国立衛生研究所からの助成金番号Ｒ０１−ＡＩ０５４８３０により援助された。政府は本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

遺伝子療法には、疾患に関係していることが示されている欠陥遺伝子を修正するための、疾患にかかった器官または細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの送達が含まれる。これはいくつかの異なるアプローチにより達成することができる。その病気が遺伝子産物が存在しない、または機能しないことによる場合、その遺伝子の機能するコピーをその疾患部位に送達することができる。あるいは、ＲＮＡ干渉技術、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を用いて遺伝子発現を制御することができる。それにより特定のｍＲＮＡが相補的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による分解の標的となる天然の細胞プロセスであるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞レベルでの単一の遺伝子の特異的なサイレンシングを可能にする。様々な生物医学的^１および臨床的研究^２−４により、ＲＮＡｉは効率的な療法的アプローチとしての大きな可能性を有することが示されてきた。典型的には、ＲＮＡ干渉は病原性遺伝子の発現を下方制御するために用いられるが、遺伝子プロモーター中の制御領域を標的とすることにより、遺伝子の上方制御も可能である^１５。

【0004】

遺伝子療法にはとても大きな療法的可能性があり、多数の障害が好適な候補として同定されているにも関わらず、その分野は今のところ上手くいっていない。これらの失敗は、大部分は遺伝子送達と関係する厄介な問題によるものである。送達の効率は、最も一般的な送達法であるウイルスベクターに関して高いが、毒性、免疫および炎症性応答、標的化および用量の制御が困難であることを含む、臨床試験で観察された問題のため、これらは限られた療法的可能性しか有しない。加えて、そのベクターがゲノムの中に組み込まれて未知の長期の作用をもたらすであろうというもっともな懸念、およびそのウイルスが疾患を引き起こすその能力を取り戻すかもしれないという可能性が存在する。

【0005】

従って、多くの努力が非ウイルスベクターシステム、例えばプラスミドＤＮＡに向けられてきた。これらのベクターは、それらの製造および保管が簡単であり、細胞中で安定して残存することができるため魅力的であるが、それらは免疫毒性応答を誘発する可能性のある細菌のＤＮＡ配列を含有する。樹状細胞およびＴ細胞を含む一部のヒトの細胞は、現行のプラスミドベクターでは効率的に形質移入することができない。短い線状のＤＮＡベクターおよび小さいＲＮＡ、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、プラスミドよりも容易に細胞の中に導入される。しかし、線状のＤＮＡおよびＲＮＡの末端は細胞による急速な分解を誘発し、継続的な補充を必要とする。さらに、そのＤＮＡ末端は修復および組み替え経路にシグナルを送り、アポトーシスを引き起こし得る。これらの理由のため、ＲＮＡｉおよびｍｉＲＮＡに基づく技術はまだ臨床において非常に上手く行ってはいない。明らかに、遺伝子療法ベクターを細胞に療法的に送達するための新規の効率的な方法に関する必死の必要性が存在する。

【0006】

プラスミドＤＮＡベクターは、それらは生成および単離が簡単であるため、基礎研究に
おいてかなりの有用性を有する。それらは細菌株の中で増殖され、その細菌細胞から回収される。しかし、上記のように、これはそれらが細菌のＤＮＡ配列、特に原核生物の複製起点およびプラスミドの維持のための抗生物質耐性マーカーを含有することを必要とする。これらの細菌の配列の存在は、いくつかの非常に深刻かつ有害な結果をもたらす。最も明白なのは、それはそのプラスミドをどれだけ小さく作ることができるかを制限する。数ｋｂｐの大きなプラスミドは非常に低い効率でしか形質移入されない。また、それらの大きい大きさは、それらが（例えばエアロゾル化による）送達に伴う、または血流中での流体力学的剪断力の影響を受けやすくする。剪断に誘導される分解は生物学的活性の低下につながり、それは少なくとも部分的に、現在の遺伝子療法のための非ウイルスベクターの使用における成功の欠如の原因である。形質移入に伴うこれらの問題に取り組み、それを軽減するために、様々な陽イオン性およびリポソーム性形質移入試薬が設計されてきたが、これらは細胞毒性の問題に悩まされている。加えて、プラスミド上のその細菌配列はプラスミド上にある遺伝子のサイレンシングを誘導する可能性があり^１４、それは例えそのプラスミドがうまく形質移入されても有効性の低下につながる。真核生物のＤＮＡ配列よりも細菌のＤＮＡ配列においてより一般的であるＣｐＧモチーフも、哺乳類細胞において免疫応答を誘発する。ＤＮＡベクターの大きさを低減することは、細胞の形質移入効率を増大させるための理にかなったアプローチのようである。プラスミド上の細菌の配列は物理的に除去することができ、結果として得られた療法的配列のみを含有する短い線状のＤＮＡ断片は一般に用いられるプラスミドベクターよりも容易に細胞の中に導入することができるであろうと想像するかもしれない。残念ながら、線状ＤＮＡの末端はインビボで非常に生体反応性であり、細胞のＤＮＡ修復および組み換えのプロセスならびにアポトーシスを誘発する。従って、生物学的環境において安定であり、より多量の細胞形質移入および導入遺伝子の発現を可能にする遺伝子ターゲッティング療法に関する必要性が存在する。

【発明の概要】

【0007】

本発明はｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含む核酸分子組成物を提供し、ここで前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは核酸配列をコードしている。１態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。さらなる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。さらに別の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は遺伝子を含む。追加の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は、別の細胞の構成要素により、例えばタンパク質、異なるＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、または細胞膜により結合されることができるＤＮＡを含む。

【0008】

あらゆる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、望まれるならば化学的部分（例えばコレステロール、フルオレセイン、ビオチン、色素、または他の部分）で標識することができ；あるいは、または加えて、追加の修飾、例えば修飾された塩基または修飾された主鎖が含まれることもできる。

【0009】

別の態様において、本発明は、細胞において遺伝子の発現をサイレンシングする方法であって、前記の細胞をｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒと接触させることを含み、ここで前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは核酸配列をコードしており、ここでその核酸配列はその遺伝子の発現をサイレンシングする、前記方法を提供する。１態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。さらなる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。さらに別の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は遺伝子を含む。追加の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は、別の細胞の構成要素により、例えばタン
パク質、異なるＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、または細胞膜により結合されることができるＤＮＡを含む。あらゆる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、望まれるならば上記のように（例えば化学的部分で、あるいは、または加えて、修飾された塩基および／または修飾された主鎖で）標識することができる。さらなる態様において、その細胞は哺乳類（例えばヒト）細胞である。

【0010】

１態様において、本発明は、療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒをそれを必要とする哺乳類に投与することを含む遺伝子療法の方法に関し、ここでそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは核酸配列をコードしている。１態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。さらなる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。さらに別の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は遺伝子を含む。追加の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は、別の細胞の構成要素により、例えばタンパク質、異なるＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、または細胞膜により結合されることができるＤＮＡを含む。あらゆる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、望まれるならば上記のように（例えば化学的部分で、あるいは、または加えて、修飾された塩基および／または修飾された主鎖で）標識することができる。さらなる態様において、その哺乳類はヒトである。

【0011】

別の態様において、本発明は、療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを細胞に投与することを含む遺伝子療法の方法に関し、ここでそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは核酸配列をコードしている。１態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。さらなる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。さらに別の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は遺伝子を含む。追加の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は、別の細胞の構成要素により、例えばタンパク質、異なるＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、または細胞膜により結合されることができるＤＮＡを含む。あらゆる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、望まれるならば上記のように（例えば化学的部分で、あるいは、または加えて、修飾された塩基および／または修飾された主鎖で）標識することができる。さらに別の態様において、その細胞は哺乳類（例えばヒト）細胞である。

【0012】

別の態様において、本発明は、哺乳類の気道中の細胞に療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを送達することを含む遺伝子療法の方法に関し、ここでそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは核酸配列をコードしている。そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは噴霧装置の使用により気道に投与することができ、キャリヤー分子の非存在下で投与することができる。１態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは哺乳類の気道の鼻粘膜に投与することができる。これらの態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むことができる。他の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は遺伝子を含む。追加の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は、別の細胞の構成要素により、例えばタンパク質、異なるＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、または細胞膜により結合されることができるＤＮＡを含む。あらゆる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、望まれるならば上記のように（例えば化学的部分で、あるいは、または加えて、修飾された塩基および／または修飾された主鎖で）標識することができる。

【0013】

さらなる態様において、本発明は、哺乳類細胞に有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを投与することを含む、哺乳類細胞において未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子の発現をサイレンシングする方法に関し、ここでそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは核酸配列をコードしており、こ
こでそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子の発現をサイレンシングする。１態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。さらなる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。さらに別の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は遺伝子を含む。追加の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は、別の細胞の構成要素により、例えばタンパク質、異なるＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、または細胞膜により結合されることができるＤＮＡを含む。あらゆる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、望まれるならば上記のように（例えば化学的部分で、あるいは、または加えて、修飾された塩基および／または修飾された主鎖で）標識することができる。さらに別の態様において、その哺乳類細胞はヒト細胞である。

【0014】

１態様において、本発明は、それを必要とする哺乳類において癌を処置する方法であって、その哺乳類に療法上有効量のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒまたはｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含む哺乳類細胞を投与することを含み、ここでそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしている、前記方法に関する。１態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。さらなる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。さらに別の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は遺伝子を含む。追加の態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによりコードされている核酸配列は、別の細胞の構成要素により、例えばタンパク質、異なるＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、または細胞膜により結合されることができるＤＮＡを含む。あらゆる態様において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、望まれるならば上記のように（例えば化学的部分で、あるいは、または加えて、修飾された塩基および／または修飾された主鎖で）標識することができる。さらなる態様において、その哺乳類はヒトである。１態様において、その癌は非ホジキンリンパ腫である。さらに別の態様において、その非ホジキンリンパ腫は未分化大細胞リンパ腫である。

【0015】

別の態様において、本発明は、細胞における遺伝子発現の方法であって、前記の細胞をｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒと接触させることを含み、ここで前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしており、ここでその核酸配列がその遺伝子を発現する、前記方法に関する。１態様において、その核酸配列は遺伝子を含む。別の態様において、その細胞は哺乳類（例えばヒト）細胞である。

【0016】

上記のことは、付随する図面において図説されているような、以下の本発明の実施態様のより詳細な記述から明らかであると考えられ、ここで、異なる図の全てを通して同じ参照符号は同じ部品（ｐａｒｔｓ）を指す。その図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、むしろ本発明の態様を説明することに重点が置かれている。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は遺伝子サイレンシングのためのｓｈＲＮＡをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの調製を示す。合成されたｓｈＲＮＡをコードするオリゴＤＮＡを、改変したｐＭＣ−Ｈ１ベクターの中に、Ｈ１プロモーターの制御下にサブクローニングした。インテグラーゼに仲介される組み換えを経ることにより、Ｈ１プロモーターおよびｓｈＲＮＡに関する配列のみからなり、約３８５ｂｐの大きさを有する環状ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを生成した。

【図2】図２は、形質移入しにくいリンパ腫細胞におけるそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの高い細胞形質移入／遺伝子サイレンシング能力を示す。上段：安定してＧＦＰを発現する接着２９３ＦＴ細胞に、遺伝子サイレンシングのためにそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ、合成ｓｉＲＮＡ、またはＤＮＡプラスミドベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法により形質移入した。３日間培養した後、フローサイトメトリーを実施し、細胞のＧＦＰ発現の平均蛍光強度の変化を未処理の細胞の平均蛍光強度（１００％）と比較した。下段：同じ処理のセットを、形質移入しにくいＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサスからのヒトＴ−リンパ腫／白血病細胞株）において実施し、結果としてもたらされた細胞のＧＦＰ発現の変化を算出した。

【図3】図３Ａ〜Ｂは、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒに誘導されるＡＬＫ遺伝子のサイレンシングおよびＫａｒｐａｓ２９９細胞（（ドイツ生物物質資源センター（ＤＳＭＺ）からのヒトＡＬＣＬ細胞株）の増殖停止を示す。図３Ａは、細胞のＡＬＫ遺伝子のサイレンシングを示す。療法的価値の可能性を検証するため、形質移入しにくいＫａｒｐａｓ２９９細胞に、ｐＭＣベクター対照、無関係な対照のｓｉＲＮＡ、一般に用いられるｐＭＣ−Ｈ１−ＡＬＫ／ｓｈＲＮＡプラスミドベクター、ＡＬＫ ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ、およびＡＬＫに特異的な合成されたｓｉＲＮＡを形質移入した。４日間の形質移入の後、細胞のＡＬＫ融合タンパク質の発現をＦＩＴＣコンジュゲート抗ＡＬＫ抗体を用いたフローサイトメトリーにより調べ、細胞のＡＬＫタンパク質に結合した（ｂｏｎｄ）抗体の平均蛍光強度により計算した。図３Ｂはリンパ腫細胞の増殖の阻害を示す。一方で、結果としてもたらされた細胞増殖の変化も、細胞形質移入の４日目にＭＴＴ細胞増殖アッセイにより同時に試験した。それぞれの処理を受けた細胞における相対的増殖速度をそのグラフに示した。^**Ｐ＜．０１。

【図4】図４は、ＧＦＰに対するｓｈＲＮＡをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによるＧＦＰのサイレンシングを示す。ＧＦＰを安定して発現する２９３ＦＴ細胞に、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを３時間形質移入した。形質移入の後、示した時点において細胞を集め、それに蛍光顕微鏡観察（データは示していない）およびフローサイトメトリーを同時に行った。

【図5】図５は、非ウイルス性ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの概略図である。スーパーコイル状ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡは、そのミニサークルを生成するために用いられた方法(Fogg et al. 2006)からの残存したａｔｔＲ部位、Ｈ１ ＲＮＡプロモーター、およびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含有している。遺伝子発現を制御するために、そのミニサークルは核の中に取り込まれ、そこでヒトＲＮＡポリメラーゼ（ＩＩまたはＩＩＩ）がそれをｓｈＲＮＡへと転写する。そのｓｈＲＮＡは細胞質へと運び出され、そこで酵素Ｄｉｃｅｒがそれをプロセシングする。続いて、ＲＩＳＣ複合体がセンス鎖と置き換わり、残ったｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を用いてｍＲＮＡを標的化し、それがｍＲＮＡの分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。そのｓｈＲＮＡは複数のクラスの遺伝子を制御するためのｍｉＲＮＡをコードすることもできる。

【図6】図６Ａ〜Ｅは、ヒトリンパ腫細胞におけるＧＦＰのサイレンシングに関するベクターの比較を示す。ＧＦＰを安定して発現するヒトＫａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、ＧＦＰをサイレンシングするようにコードした伝統的なプラスミドベクター（Ｃ）、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（Ｄ）、または合成されたｓｈＲＮＡを形質移入した。細胞を形質移入の４日後に集め、それに対してフローサイトメトリーを行った。ＧＦＰ発現の変化を、処理した細胞（白いピーク）および未処理の細胞（灰色のピーク）の間で比較した。対照として、無関係のｓｈＲＮＡ（図７Ｂ）および挿入断片無しのｐＭＣベクター（図７Ａ）を用いた。

【図7】図７Ａ〜Ｂは、ヒト樹状細胞およびＴ細胞のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによる形質移入が増進された遺伝子発現をもたらすことを示す。ヒトの未成熟ＤＣ（図７Ａ）またはＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞（図７Ｂ）に、膜擬の（ｍｏｃｋ）（Ｃｏ）、ＧＬｕｃをコードしている伝統的な、通常の（Ｒｅｇ）プラスミド、またはｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅを用いて形質移入した。形質移入の後、成熟カクテルをＤＣに添加した。ランダム光単位（ＲＬＵ）でのルシフェラーゼの活性を、形質移入の４８ｈ後に決定した。２つの独立した実験（灰色および黒色）において、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを有する細胞では、通常のプラスミドと比較してより高い遺伝子発現があった。

【図8】図８Ａ〜Ｂは、ＤＮＡの剪断を長さの関数として要約したグラフ表現である（少なくとも３回の別の実験に関して平均した）。（図８Ａ）曲線はシグモイド関数への当てはめを表す。噴霧生存時間をそれぞれのＤＮＡベクターに関して決定した。ベクターの５０％が生存していた時間（Ｓｕｒｖｉｖａｌ_５０（Ｎｅｂ））をプロットした（図８Ｂ）。それぞれのＳｕｒｖｉｖａｌ_５０（Ｎｅｂ）の値は、少なくとも３回の別の実験からの平均である。エラーバーは標準偏差を表す。

【図9】図９Ａ〜Ｂは、ＤＮＡのトポロジーのＤＮＡの生存への影響を示す。図９Ａは、プラスミドＤＮＡのトポロジーがどのようにそれの噴霧の間の生存に影響を及ぼすかを示す。それぞれの時点におけるそれぞれのトポロジーのＤＮＡベクターの割合を示す。シグモイド関数に当てはめた曲線を示す。環状のプラスミドは線状のＤＮＡよりもはるかに長く持ちこたえた。スーパーコイル形成は、剪断力に対する追加の耐性を提供した。図９Ｂは、Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ（３８５ｂｐ）のトポロジーがどのようにそれの超音波処理の間の生存に影響を及ぼすかを示す。ＤＮＡの割合を図９Ａと同じように定量化した。スーパーコイル状Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡは、ニックの入った、または線状のＤＮＡよりも有意に長く生存した。

【図10】図１０は、スーパーコイル状ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒに化学的部分を給合させるためのプロセスを示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本明細書で記述される発明、例えば遺伝子療法のための（遺伝子の発現のサイレンシングおよび遺伝子の発現を引き起こすことを含む）遺伝子発現の改変における使用のためのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡは、興奮させるような有望さを有する。その環状ＤＮＡは細胞の中で存続するため、継続的な、更新可能なｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたは導入遺伝子の発現が可能である。本明細書で記述される発明は、新規の非ウイルス性遺伝子療法ベクター、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ、小さいスーパーコイル状のＤＮＡベクターに関し、それはほとんど完全に細菌の配列を欠いている（ｄｅｖｏｉｄ ｏｓ）。それらの小さい大きさのため、これらのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは高い効率で形質移入される。細菌の配列の欠如は、プラスミドＤＮＡベクターと関係するサイレンシングおよび免疫応答無しで、永続的な導入遺伝子の発現を可能にする。

【0019】

第１の例において、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを、プロモーターおよび遺伝子サイレンシングを仲介するためのｓｈＲＮＡをコードする配列を含む最小限のコンストラクトを送達するそれらの能力に関して試験した。ＲＮＡ干渉に仲介される遺伝子サイレンシングは、あるいは合成された低分子干渉ＲＮＡを送達することにより誘導することができる。しかし、これらのＲＮＡは環境のヌクレアーゼの影響を非常に受けやすく、非常に一過性の応答しかもたらさず、従ってそれらの療法的価値を失う。それに対し、ＤＮＡベクターは生物学的環境において比較的安定である。従って、代替案としてｓｈＲＮＡを発現することができるＤＮＡベクター系が遺伝子ターゲッティング療法のために開発されてきた^５。ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡベクターは合成されたｓｉＲＮＡにより達成される細胞への作用よりもかなり長い期間細胞への作用を有し、標的化された遺伝子を数ヶ月の間下方制御することができる^６。さらに、誘導可能なｓｈＲＮＡ発現系はＤＮＡベクターをより扱いやすくする^７。

【0020】

しかし、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒはｓｈＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）のための輸送手段であることに限定されない。大きな抗生物質耐性遺伝子および複製起点を必要としないことに起因する万能性のため、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは小さい遺伝子（この場合ではＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）およびプロモーターを含有し、なお小さい大きさ（例えば約２０００ｂｐ未満、これは遺伝子療法のための機能性遺伝子を有するあらゆるプラスミドよりもはるかに小さい）を維持するように設計することができる。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒのヒト樹状細胞およびＴ細胞中への形質移入は、結果として同じ遺伝子およびプロモーターを含有する通常のプラスミドと比較し
てはるかに高い遺伝子発現をもたらした。これらの結果は２つの重要なことを示している。第１に、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、転写され、機能するタンパク質へと翻訳されることができる小さい遺伝子を送達するために用いることができる。第２に、そしてこれらのベクターの大きな有望さを示すものであるが、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは非ウイルス性の形質移入が以前にほとんど〜全く成功していなかった樹状細胞およびＴ細胞株に形質移入することができる。

【0021】

加えて、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは遺伝子療法の重要な課題：そのベクターを疾患にかかった器官に標的化することを克服する。例えば、肺は、それらが容易にアクセス可能であるため遺伝子療法を適用しやすいが、薬物送達のためのエアロゾルを作り出すための噴霧は多大な剪断を引き起こし、プラスミドＤＮＡのようなベクターを効果のないものにする。しかし、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは例え凝縮剤の非存在下でも噴霧の際の剪断力を生き延び、これは肺組織への標的化された送達に関するそれらの有効性を示している。

【0022】

スーパーコイル状ＤＮＡミニサークルおよびミニサークルを製造するための方法が、Ｚｅｃｈｉｅｄｒｉｃｈらによる米国出願第１１／４４８，５９０号（米国公開第ＵＳ ２００７００２０６５９ Ａ１号）；表題：“生理的スーパーコイル形成を伴うミニサークルＤＮＡの生成”において記述されており、それをそのまま本明細書に援用する。遺伝子療法適用に関して、スーパーコイル状ミニサークルを本明細書において“ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ”と呼ぶ。本明細書で記述されるように、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは生体内安定性、高い細胞形質移入率、高い遺伝子サイレンシング能力を有することが試験されて分かっており、遺伝子療法における療法的可能性を有することが分かった。本明細書で記述されるその発見は、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが遺伝子療法のための利点を有することを示している。

【0023】

本明細書で用いられる際の“ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ”は、小さい大きさの環状ＤＮＡベクター系（ミニサークル）を指し、それは以前にＺｅｃｈｉｅｄｒｉｃｈらによる米国出願第１１／４４８，５９０号（米国公開第ＵＳ ２００７００２０６５９ Ａ１号）；表題：“生理的スーパーコイル形成を伴うミニサークルＤＮＡの生成”において記述されており、それをそのまま本明細書に援用する。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒはスーパーコイル状の環状ＤＮＡ分子であり、それは大腸菌においてインビボでのインテグラーゼに仲介される部位特異的組み換えにより得られる。それは例えば、導入遺伝子発現カセット（プロモーターおよび核酸配列が含まれ、ここでその核酸配列は、例えば特定のｍＲＮＡ転写産物に対して標的化されたｓｈＲＮＡをコードする配列であることができ、またはその核酸配列は特定のタンパク質の発現のための遺伝子をコードするものであることができる）のみを有し、重要なことだが、細菌由来の配列を有しない核酸分子を含有する^{８、９、１０}。

【0024】

遺伝子療法における使用のためのＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、約１００塩基対（ｂｐ）から約２．５キロ塩基（ｋｂ）まで、例えば約２００ｂｐから約２．２ｋｂまで、例えば約３００ｂｐから約２．０ｋｂまで、例えば約４００ｂｐから約１．９ｋｂまで、例えば約５００ｂｐから約１．８ｋｂまで、例えば約６００ｂｐから約１．７ｋｂまで、例えば約７００ｂｐから約１．６ｋｂまで、例えば約８００ｂｐから約１．５ｋｂまで、例えば約９００ｂｐから約１．４ｋｂまで、例えば約１ｋｂから約１．３ｋｂまで、例えば約１．１ｋｂから約１．２ｋｂまでの大きさの二本鎖の環状ＤＮＡ分子である。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは約１００ｂｐ以下の大きさの増加分（ｓｉｚｅ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）で作ることができる。

【0025】

そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、例えば化学的部分を用いて、望まれるように標識することができる。代表的な標識には、フルオレセイン、ビオチン、コレステロール、色素、修飾塩基および修飾主鎖が含まれる。代表的な色素には、以下のものが含まれる：６−カル
ボキシフルオレセイン、５−／６−カルボキシローダミン、５−／６−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシ−２’−，４−，４’−，５’−，７−，７’−ヘキサクロロフルオレセイン）、６−カルボキシ−２’−，４−，７−，７’−テトラクロロフルオレセイン）、６−カルボキシ−４’−，５’−ジクロロ−２’−，７’−ジメトキシフルオレセイン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、ＢＯＤＩＰＹ色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ。追加の修飾には、修飾塩基（例えば２−アミノプリン、メチル化された塩基）、または修飾主鎖（例えばホスホロチオエート類、ここで、非架橋酸素の１個が硫黄により置換されている；２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド類；メチル−ホスフェートオリゴヌクレオチド類）も含まれることができる。望まれるならば、化学的部分および／または修飾塩基および／または修飾主鎖が含まれる多重標識を同時に用いることができる。ヌクレオチドを標識する方法は、例えばRobert E. Farrellによる“核
酸プローブ技術”；RNA Methodologies (第３版), 2005, pp. 285-316；ならびにCurrent
Protocols in Immunology 2001 May;第10章:単位10.10におけるStanley TaborおよびAnn
Boyleによる“核酸の酵素標識”において記述されている。これらの参考文献の教示をそのまま本明細書に援用する。

【0026】

本明細書で用いられる際、用語“ＲＮＡ干渉”または“ＲＮＡｉ”は、それにより、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングが、そのサイレンシングされる遺伝子に配列が相同であるＲＮＡにより開始されるプロセスを指す。植物からヒトまでの多種多様な生きた生物およびそれらの細胞で起こるＲＮＡｉは、異なる生物系では転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）およびコサプレッション（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）とも呼ばれてきた。ＲＮＡｉにおいて観察されるｍＲＮＡの配列特異的分解は、低分子（または短鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により仲介される。

【0027】

本明細書で用いられる際、用語“干渉ＲＮＡ”は、その少なくとも一部が実質的にその干渉ＲＮＡのヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ転写産物の分解を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の機構を通して方向づけることができるＲＮＡ分子を意味する。当技術で既知であるように、干渉ＲＮＡは、分子間の二本鎖を形成する２本の相補的な一本鎖ＲＮＡからなる“低分子干渉ＲＮＡ”またはｓｉＲＮＡであることができる。干渉ＲＮＡは、そのＲＮＡがそれ自身の上に折り返されて、分子内二本鎖領域および対合していないループ領域を有するステムループ構造を形成することを可能にする２つの自己相補的領域を有する一本鎖ＲＮＡからなる“ショートヘアピンＲＮＡ”またはｓｈＲＮＡであることもできる。

【0028】

本明細書で用いられる際、用語“遺伝子サイレンシング”は、標的遺伝子の発現産物の低減を指す。サイレンシングは、最終的な遺伝子産物が生成されないという点で完全であってよく、または遺伝子産物の量の実質的な低減が起こるという点で部分的であってよい。

【0029】

哺乳類は、本明細書で用いられる際、霊長類（例えばヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシの、ヒツジの、ウマの、イヌの、ネコの、げっ歯類の、もしくはマウスの種を含むがそれらに限定されない動物を指す。１態様において、その哺乳類はヒトである。

【0030】

哺乳類細胞は、本明細書で用いられる際、霊長類（例えばヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシの、ヒツジの、ウマの、イヌの、ネコの、げっ歯類の、もしくはマウスの種を含むがそれらに限
定されない動物からの細胞を指す。１態様において、その哺乳類細胞はヒト細胞である。

【0031】

用語“処置する”には、療法的処置および予防的処置（発現の可能性を低減する）の両方が含まれる。その用語は、疾患（例えば本明細書で描写される疾患または障害）の発現もしくは進行を減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、抑制する、減じる（ａｔｔｅｎｕａｔｅ）、減らす（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）、止める、もしくは安定化する、その疾患の重篤さを和らげる、またはその疾患と関係する症状を改善することを意味する。

【0032】

本明細書で記述される際、遺伝子療法における使用のためのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは有効量で存在する。本明細書で用いられる際、用語“有効量”は、適切な投与計画で投与された場合に標的の障害を（療法的に、または予防的に）処置するのに十分である量を指す。例えば、有効量は処置されている障害の重篤さ、持続期間または進行を低減する、もしくは改善する、処置されている障害の前進を防ぐ、処置されている障害の後退を引き起こす、または別の療法の予防的もしくは療法的作用（単数または複数）を増進する、もしくは向上させるのに十分である。

【0033】

本明細書で記述されるように、わずかにＨ１プロモーターおよび遺伝子療法のためのｓｈＲＮＡをコードする配列からなる環状ＤＮＡ ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ系を試験した。そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ系の生体内安定性、細胞形質移入率、および遺伝子サイレンシング能力を、従来のＤＮＡプラスミドベクターおよび合成されたｓｉＲＮＡと比較した。加えて、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの療法的能力を、形質移入しにくい懸濁Ｊｕｒｋａｔ（リンパ腫／白血病）細胞およびＫａｒｐａｓ２９９（ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ））細胞において試験した。ＡＬＣＬ細胞は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子を含む異常な染色体転座を有する（１−３）。結果としてもたらされるキメラＡＬＫ融合タンパク質（４−６）の異常な発現は、ＡＬＣＬの発現に関する重要な発病因子であることが示されている（７−９）。この研究において、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの細胞のＡＬＫ遺伝子の発現およびリンパ腫細胞の増殖への作用を同時に試験した。

【0034】

その生体内安定性アッセイは、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒがヒト血清中で２４時間を超えて安定であり、それに対し、合成されたｓｉＲＮＡは４時間の保温の後に完全に消化されたことを示した。細胞形質移入試験のため、ＧＦＰのｓｈＲＮＡをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを安定なＧＦＰ発現細胞中にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの方法論を用いて導入した。フローサイトメトリー分析は、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの形質移入が２９３ＦＴ細胞（５２％の低減）および形質移入しにくいＪｕｒｋａｔ懸濁リンパ腫細胞（４６％の低減）の両方において有意なＧＦＰ遺伝子のサイレンシングを誘導することができることを明らかにした。療法的価値の可能性を試験するため、ヒト未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）の重要な病原因子である未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子のサイレンシングのためのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを生成した。培養したＫａｒｐａｓ２９９ＡＬＣＬ細胞にそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ、従来のプラスミドベクター、および合成されたｓｉＲＮＡを形質移入し、結果としてもたらされた遺伝子サイレンシングをＦＩＴＣコンジュゲート抗ＡＬＫ抗体を用いるフローサイトメトリーにより監視した。ＡＬＫタンパク質発現の有意な減少が、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（２５％の低減）および合成ｓｉＲＮＡ（２６％の低減）を形質移入した細胞において検出され、それは従来のプラスミドにより誘導された減少（０．８％の低減）よりも３０倍高かった。さらに、同時ＭＴＴアッセイはｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒまたは合成ｓｉＲＮＡにより誘導されたＡＬＣＬ細胞の有意な増殖停止を示したが（Ｐ＜．０１）、従来のプラスミドでは示されなかった。発見は、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ系が血清中で安定であり、高い細胞形質移入能力を有することを示しており、これはインビボでの、特に形質移入しにくい細胞における遺伝子療法に関する価値の可能性を示唆している。

【0035】

これも本明細書で記述されるように、３００塩基対未満から５，０００塩基対を超えるまで異なるｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒに、噴霧器によるエアロゾル化または超音波処理により生じる剪断力をかけた。スーパーコイル形成および長さの両方が、剪断力生存に劇的に影響を及ぼした。ＤＮＡのスーパーコイル形成はＤＮＡを剪断から保護した。興味深いことに、ニックの入った分子は緩んだ無傷のＤＮＡと同等に剪断された。ＤＮＡの剪断はＤＮＡの長さと逆相関しており；ＤＮＡがより短いほど、そのＤＮＡは剪断に対してより耐性であった。凝縮剤の非存在下においてさえも、１，２００塩基対未満のスーパーコイル状ＤＮＡは、いくつかの療法に関する典型的な処置計画時間と等しい時間の間生存した。これらの結果は、遺伝子療法のための標的化された送達に関するｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの価値の可能性を示す。

【0036】

遺伝子療法適用に加え、ミニサークルはＤＮＡのスーパーコイル形成、ＤＮＡのスーパーコイル形成に依存する代替構造、またはＤＮＡのスーパーコイル形成に依存するタンパク質の機構を研究するために用いることもできる。例えば、５９回のＣＡＧリピートの区域を含む脊髄小脳変性症１型の疾患遺伝子座からの配列を含有する挿入断片を、５８２ｂｐのミニサークルの中にクローニングした。より高いスーパーコイル形成のレベルにおいて、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによる限られた、しかし有意な量の切断が検出され、これはスーパーコイルで安定化された代替構造の存在を示唆している。

【0037】

ミニサークルは、ＤＮＡトポイソメラーゼを標的とする抗生物質および抗癌薬の機構を評価するためのアッセイとして用いることもできる。さらに、ミニサークルは疾患に関わっていることが示されている遺伝子を制御するために、ならびにヒト樹状細胞およびヒトＴ細胞の遺伝子修飾において用いることができる。

【0038】

本明細書で記述される態様の全てにおいて、多種多様な細胞型または生物を用いることができる。例えば、上記で記述したような哺乳類を用いることができる。あるいは、細菌、古細菌、および真核生物（例えば植物）を含む他のタイプの細胞／生物を用いることができる。

【0039】

本明細書で記述される態様の全てにおいて、単一の系において複合型のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを、および多数の標的を有するｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを用いることも可能である。例えば、それぞれの個々のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが単一のタンパク質の部分またはドメインを含む異なる核酸配列をコードしており、単一の細胞中でその個々のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが発現した時にその部分またはドメインが一体となって単一の活性なタンパク質を形成するように、２種類（またはより多く）の別個のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを設計することができる。加えて、インビボでの組み替えの間にｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの多量体の形が形成されることもできる。さらに、多数の療法的ｓｈＲＮＡをコードする配列を挿入し、形質移入された細胞中で同時に多数の遺伝子を標的とする能力を有するｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを生成し、結果として非常に高感度かつ特異的な遺伝子療法をもたらすことが可能である。

【0040】

以下は本発明の態様の記述である。

【実施例】

【0041】

実施例１：細胞形質移入および遺伝子サイレンシング
材料および方法
オリゴヌクレオチド合成およびｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの調製
ＧＦＰサイレンシングのため、合成ｓｉＲＮＡを対になった対照のｓｉＲＮＡと共に購入した（Ａｍｂｉｏｎ、カリフォルニア州フォスターシティーからのカタログ番号ＡＭ４６２６）。ＡＬＫ遺伝子のためのｓｉＲＮＡは、報告された配列^１１に従ってＡｍｂｉｏ
ｎにより以下の配列を有するように合成された：センス：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）

【0042】

【化1】

【0043】

および（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）アンチセンス：

【0044】

【化2】

【0045】

。ｓｈＲＮＡを発現するＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒを生成するために用いられた親プラスミドは、以下のように生成された。ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｄ）をｐＭＣ３３９−ＢｂｖＣＩ(Fogg et al. 2006)の中に組み込んだ。そのＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にｐＳＵＰＥＲ−ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ−３（参考文献）からのＨ１プロモーターおよびｓｈＲＮＡ発現配列を含有するＫａｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を挿入することにより、Ｈ１プロモーターをそのｐＭＣベクターの中にサブクローニングした。続いてＢｇｌＩＩ部位をそのｓｈＲＮＡ発現配列の前に組み込んでｐＭＶ−ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ３−ＢｇｌＩＩを生成した。これは、そのＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入することによりｓｈＲＮＡ発現配列を容易に交換することを可能にする（図１）。

【0046】

【化3】

【0047】

^１２のセンス配列を有するＧＦＰ ｓｈＲＮＡおよび

【0048】

【化4】

【0049】

のセンス配列を有するＡＬＫ ｓｈＲＮＡ(Ito M, Zhao N, Zeng Z, Chang CC, Zu Y. Cancer Gene Ther 2010; 17: 633-644.)をコードするＤＮＡ挿入断片を、それぞれ２つのオリゴヌクレオチドとして合成し、アニーリングさせてスープレックス（ｓｕｐｌｅｘｅｓ）を形成し、改変されたｐＭＶベクター（ｅｃｔｏｒ）の中に、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に、Ｈ１プロモーターの制御下にサブクローニングした（図１）。結果として得られたプラスミドを、ｐＭＶ−Ｈ１−ＧＦＰｓｈＲＮＡおよびｐＭＶ−Ｈ１−ＡＬＫｓｈＲＮＡと名付けた。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡの親プラスミドを大腸菌株ＬＺ５４(Zechiedrich et al. (1997), Genes Dev. 11, 2580-2592)の中に形質転換し、ラージ
スケールでのλ−インテグラーゼ（Ｉｎｔ）に仲介される（ｍｅｄｉａｔｅｄ）を、以前に記述されたように^１３、以下の少しの修正を加えて実施した。純粋な、スーパーコイル状の、単量体のＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡを、多数回のゲルＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００濾過（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）により単離した。スーパーコイル状の単量体の形のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒのみを、遺伝子サイレンシングの研究のために用いた。プラスミドの名前の前の“ｐ”の慣習に従って、我々はｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡを“ｍｖ”を付けて名付け、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを生成するために用いられる親プラスミドを“ｐＭＶ”と名付ける。

【0050】

生体内安定性アッセイ
生成されたＧＦＰ ｓｈＲＮＡをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（１μｇ）ならびに等質量（ｅｑｕｉｍａｓｓ ａｍｏｕｎｔｓ）の親プラスミドｐＭＶ−Ｈ１−ＧＦＰｓｈＲＮＡおよび合成ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを、１００μｌの１００％ヒト血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ． ジョージア州ローレンスビル）中で３７℃で保温した。様々な時点において、残留するＤＮＡベクターまたはｓｉＲＮＡ製品をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、クロロホルムで抽出し、９５％エタノール中で沈殿させた。次いで残留するＲＮＡまたはＤＮＡ製品を、それぞれ１０％ポリアクリルアミドおよび１．５％アガロースゲル、それに続く臭化エチジウム染色で調べた。ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ製品のバンドを、ＴｏｔａｌＬａｂソフトウェア（ＦｏｔｏＤｙｎｅ Ｉｎｃ．，ウィスコンシン州ハートランド）を用いて定量化し、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ペンシルバニア州レディング）を用いてプロットした。

【0051】

細胞形質移入および遺伝子サイレンシング
ＧＦＰ遺伝子のサイレンシングのためのレポーター系として、接着２９３ＦＴ細胞（形質転換したヒト胎児腎臓細胞株、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および形質移入しにくいＪｕｒｋａｔ細胞（ヒトリンパ腫／白血病細胞株）に由来する安定してＧＦＰを発現する細胞を確立した。そのＧＦＰを発現する細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの方法論を用いて、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）の説明書に従ってＤＮＡベクターまたはｓｉＲＮＡを形質移入した。結果としてもたらされた細胞のＧＦＰの発現のサイレンシングを、３日目にフローサイトメトリーを用いて定量化し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カリフォルニア州サンノゼ）を用いてデータを分析した。細胞のＧＦＰの平均蛍光強度の変化を、未処理の細胞を対照として用いて算出した（％）。

【0052】

加えて、培養したＫａｒｐａｓ２９９細胞（ヒトＡＬＣＬ細胞株）に、合成ＡＬＫ ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡ、ｐＭＶ−Ｈ１ベクター、ｐＭＶ−Ｈ１−ＡＬＫｓｈＲＮＡ、またはＡＬＫ ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（ｍｖ−Ｈ１−ＡＬＫｓｈＲＮＡ）を上記のように形質移入した。細胞を３日目に集め、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの細胞調製キットを用いて製造業者の説明書に従って固定し、透過処理した。細胞のＡＬＫ融合タンパク質をＦＩＴＣ−コンジュゲート抗−ＡＬＫ抗体（１：２０希釈、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により染色し、フローサイトメトリーにより定量化した。

【0053】

ＭＴＴ細胞増殖アッセイ
細胞のＳＬＫ遺伝子のサイレンシングの際の細胞成長／増殖における変化を同時に調べた。形質移入したＫａｒｐａｓ２９９細胞の分割量（Ａｌｉｑｕｏｔｓ）（１００μｌ／試料）を９６ウェルプレートに移し、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カリフォルニア州テメキュラ）からのＭＴＴアッセイキットのアッセイ緩衝液１０μｌと混合し、３７℃で４時間保温し、次いで製造業者の説明書に従って溶解させた。ＭＴＴ細胞増殖アッセイを、ＢｉｏＲａｄマイクロプレートリーダーを用いて、それぞれの標本において検出されたＯＤ_５４０の吸光度により分析した。相対的な細胞増殖（％）を、未処理の細胞をバックグラウンド対照として用いることにより算出した。全ての実験を少なくとも３回行い、その結果を平均±標準偏差で表した。

【0054】

結果
そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒはヒト血清中で安定であった
ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを生成するため、ＧＦＰ遺伝子またはＡＬＫ遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡをコードする合成オリゴＤＮＡを、改変されたｐＭＶ−Ｈ１親プラスミドの中に
サブクローニングした（図１）^１３。インビボでのインテグラーゼに仲介される組み換えを経ることにより、わずかにＨ１プロモーター、ｓｈＲＮＡに関する配列のみを含有し、ほとんど完全に細菌の配列を欠いている約３８５ｂｐの環状ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが得られた。遺伝子サイレンシングの研究のため、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの単量体およびスーパーコイル状の形態を分画し、精製した。

【0055】

生体内安定性の研究のため、精製したＧＦＰｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを１００％ヒト血清中で３７℃において３日間保温した。対照グループにおいて、親のｐＭＶ−ＧＦＰｓｈＲＮＡベクターおよび合成ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを同じ条件で試験した。様々な時点で、残留したＤＮＡベクターおよび合成ｓｉＲＮＡを抽出し、電気泳動により分析した。そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒはヒト血清中で少なくとも４８時間安定であったが、一方で親のベクターのプラスミドＤＮＡは約４時間後に５０％より多く分解していた。それに対し、合成ｓｉＲＮＡは３０分未満で消化された。

【0056】

形質移入しにくいリンパ腫細胞におけるｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの高い遺伝子サイレンシング効率
遺伝子サイレンシングに関する細胞形質移入の可能性を評価するため、２タイプの安定してＧＦＰを発現する細胞は、接着２９３ＦＴ細胞（形質転換されたヒト腎臓線維芽細胞細胞株）に、および懸濁Ｋａｒｐａｓ２９９細胞（ヒトＡＬＣＬ細胞株）に由来していた。“材料および方法”において記述したように、そのＧＦＰを発現する細胞にＧＦＰｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの方法論を用いて形質移入し、３日間の形質移入の後、結果として生じた細胞のＧＦＰ発現の変化をフローサイトメトリーにより定量化した。接着２９３ＦＴ細胞では、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの形質移入は有意なＧＦＰ遺伝子のサイレンシングを誘導し（４９％）、それはｐＭＶ−Ｈ１−ＧＦＰｓｈＲＮＡプラスミドベクター（３０％）および合成ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（６８％）により誘導されるサイレンシングに匹敵していた（図２の上段）。興味深いことに、形質移入しにくいＪｕｒｋａｔ細胞では、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの形質移入は結果としてＧＦＰ遺伝子の有意なサイレンシング（細胞のｅＧＦＰ発現の４６％低減）をもたらし、それはｐＭＶ−Ｈ１−ＧＦＰｓｈＲＮＡプラスミドベクターにより誘導されるサイレンシング（４．５％）より１０倍高く、合成ＧＦＰ ｓｉＲＮＡによるサイレンシング（６１％）よりほんのわずかに低かった（図２の下段）。

【0057】

ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによるＡＬＫ遺伝子のサイレンシングは、Ｋａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞の増殖停止を誘導した。
ＡＬＫ融合タンパク質の異常発現はＡＬＫ陽性ＡＬＣＬの発現に関する重要な病原因子であり、ｓｉＲＮＡに誘導されるＡＬＫ遺伝子のサイレンシングは結果としてＡＬＣＬ細胞の増殖阻害をもたらしたことが示されている。ＡＬＣＬに関する療法的役割の可能性を検証するため、ＡＬＫ ｓｈＲＮＡをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを、形質移入しにくいＫａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞の中に形質移入した。３日間の形質移入の後、結果として生じたＡＬＫ遺伝子のサイレンシングを、細胞のＡＬＫ融合タンパク質の発現を上記のようにＦＩＴＣコンジュゲート抗ＡＬＫ抗体を用いたフローサイトメトリーにより定量化することにより評価した。ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの形質移入は結果として培養されたＫａｒｐａｓ２９９細胞におけるＡＬＫ遺伝子の有意なサイレンシングをもたらし、細胞のＡＬＫ融合タンパク質の発現が２５％低減しており、それは合成ＡＬＫ ｓｉＲＮＡの形質移入により誘導されるサイレンシング（２７％）と同じくらい効率的であった（図３Ａ）。それに対し、従来のプラスミドベクターであるｐＭＶ−Ｈ１−ＡＬＫｓｈＲＮＡは形質移入しにくいＫａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞においてほとんど遺伝子サイレンシング作用を示さず、無視できる程度の細胞のＡＬＫ融合タンパク質の発現の減少（０．８％）をもたらした。発見は、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが形質移入しにくいＫａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞において従来のプラスミドベクターよりも３０倍効率的にＡＬＫ遺伝子
のサイレンシングを誘導したことを示した。

【0058】

加えて、誘導されたＡＬＫ遺伝子のサイレンシングの結果もたらされる細胞への作用を確かめるため、それぞれの３日間の処置の後、対応する細胞増殖を同時に調べた。相対的細胞増殖速度（％）は、“材料および方法”の下で記述したように、ＭＴＴ細胞増殖アッセイにより検出された。Ｋａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞の、ＡＬＫ／ｓｈＲＮＡをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒおよび合成ＡＬＫ ｓｉＲＮＡによる形質移入は、結果として有意な細胞増殖の阻害（４０％近くの減少およびＰ＜．０１）をもたらした。それに対し、ｐＭＶ−Ｈ１−ＡＬＫ／ｓｈＲＮＡのプラスミドベクターは、ビヒクルのみ、ｐＭＣ−Ｈ１、または対照のｓｉＲＮＡを形質移入した対照の細胞と比較して、細胞増殖への検出される作用を有しなかった（図３Ｂ）。まとめると、これらの発見は、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが特に形質移入しにくい細胞における細胞の遺伝子のサイレンシングのための強力な手段であることを示している。

【0059】

この研究では、遺伝子ターゲッティング療法に関するｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの生体内安定性および使用の可能性を形質移入しにくいリンパ腫細胞において検証した。その発見は、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが合成ｓｉＲＮＡおよび従来のプラスミドＤＮＡベクターの両方を超える利点：（従来のプラスミドベクターと比較して）高い細胞形質移入／遺伝子サイレンシング率およびヒト血清中での高い生体内安定性を有していることを示している。加えて、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ系を用いることは、従来のプラスミドベクターのバックボーンの細菌の配列からの細胞毒性の可能性も排除する。その結果は、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ系がインビボでの遺伝子ターゲッティング療法のための有望な送達ベクターであることを示唆している。

【0060】

本明細書で記述したような環状ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、わずかに転写プロモーター（Ｈ１）、ターゲッティング遺伝子のための療法的ｓｈＲＮＡをコードする設計された配列、およびインテグラーゼに仲介されるインビボ組み換え部位のみからなる（図１）。その小さい大きさ（例えばこの実施例ではＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒは約３８５ｂｐである）により、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、所与の体積／質量に対してより多い数の分子、および従来のＤＮＡプラスミドベクターの細胞形質移入効率よりも高い細胞形質移入効率を有することができる。加えて、形質移入された細胞内でのＨ１プロモーターからの繰り返される遺伝子の転写により、ｓｈＲＮＡのコピー数が著しく増幅されることが可能である。それに対し、形質移入された合成ｓｉＲＮＡは細胞中でコピー数を増大させることはできない。また、合成ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉に仲介される遺伝子サイレンシングの間に完全に破壊され、従って絶えず補充する必要がある。遺伝子サイレンシングに関するｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの単量体の形態に加えて、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの多量体の形態もインビボでの組み換えの間に形成される可能性があり、それは類似の技法を用いて精製することができる。そのようなｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの二量体／多量体の形態は、それらの遺伝子サイレンシングの可能性に関して、本明細書で記述した技法を用いて試験することができる。さらに、多数の療法的ｓｈＲＮＡをコードする配列を挿入し、形質移入された細胞において同時に多数の遺伝子を標的とする可能性を有するｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを生成し、結果として非常に高感度かつ特異的な遺伝子療法をもたらすことが可能である。

【0061】

実施例２：ｓｈＲＮＡをコードするＭＩＮＩＶＥＣＴＯＲはヒト線維芽細胞においてＧＦＰの発現を妨害する
ＧＦＰに対して標的化されたｓｈＲＮＡをコードするミニサークル（ミニサークルｓｈＲＮＡ−ＧＦＰ）の形質移入効率を、安定してＧＦＰを発現するヒト胎児由来腎臓細胞（２９３ＦＴ／ＧＦＰ）においてアッセイした。２９３ＦＴ細胞では見られないＣＣＲ５に対するｓｈＲＮＡをコードするＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒが陰性対照としての役目を果たした。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いた形質移入の後、ＧＦＰの発現を蛍光活性化細胞選
別法を用いて定量化した。ＧＦＰに仲介される蛍光への作用を有しなかった対照のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを形質移入した細胞と比較して、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを与えられた細胞は用量および時間依存方式での蛍光の減少を示し、蛍光が４４％まで減少した（図４）。従って、ＧＦＰ遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードするｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、図５において図式化されているようにＤｉｃｅｒ経路を通って処理されてＧＦＰ発現をサイレンシングするようである。

【0062】

ｓｈＲＮＡをコードするＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、Ｊｕｒｋａｔリンパ腫細胞においてＧＦＰの発現を従来のｓｈＲＮＡプラスミドベクターよりも効果的にサイレンシングする。ＧＦＰを安定して発現するヒトｋａｒｐａｓ２９９細胞を生成した。この細胞株を用いてｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒと従来のプラスミドの形質移入およびサイレンシング効率を比較した。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ｍｖ−Ｈ１−ＧＦＰｓｈＲＮＡ（図６Ｄ）を、同じＧＦＰに対するｓｈＲＮＡをコードする従来のプラスミドベクターであるｐＭＶ−Ｈ１−ＧＦＰｓｈＲＮＡ（図６Ｃ）と比較した。加えて、ＤＮＡベクター中で用いられた配列と同じ配列を有する合成ｓｉＲＮＡを試験した（図６Ｅ）。

【0063】

図６Ａ〜Ｂにおいて示されているように、対照のｐＭＶ−Ｈ１ベクターおよび対照のｓｈＲＮＡを発現するＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒは細胞のＧＦＰの発現への作用を有しなかった。従来のプラスミドベクターｐＭＶ−Ｈ１−ＧＦＰｓｈＲＮＡを用いた細胞の形質移入は、処理された細胞のＧＦＰ遺伝子の発現を４．５％サイレンシングした（図６Ｃ）。しかし、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ処理は処理された細胞のＧＦＰを４６％サイレンシングし（図６Ｄ）、それはオリゴマー性ｓｈＲＮＡにより誘導されるサイレンシング（６１％）（図６Ｅ）に匹敵する。

【0064】

実施例３：ヒト樹状細胞およびＴ細胞の形質移入
ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼをコードするＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒはヒト樹状細胞および活性化されたＴ細胞に高い効率で形質移入された。活性化されたＴ細胞が腫瘍と戦う能力を測定するための系が確立された(Ahmed et al. 2007, J Immunother. 30(1):96-107)
。短いルシフェラーゼ遺伝子であるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを、ｍｖＧＬｕｃを作るためにｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの中にクローニングした。利用可能である最も小さい容易に追跡可能な遺伝子の１つであるにも関わらず、そのルシフェラーゼ遺伝子は結果として比較的大きいｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（約１．２ｋｂ）をもたらし、それは上記のＧＦＰ発現の制御を示した実験において用いられた約３８５ｂｐのミニサークルよりもはるかに大きい。しかし、そのＧＬｕｃをコードするミニサークルは典型的なＤＮＡプラスミドベクターよりもまだ小さく、そして重要なことだが、選択または複製のためのあらゆる細菌の配列を欠いている。示したように、ヒト樹状細胞（ＤＣ）（図７Ａ）およびＴ細胞（図７Ｂ）中へのＧＬｕｃの送達は結果として通常のプラスミドと比較してより高い遺伝子発現をもたらした。これらの結果は２つの重要なことを示している。第１に、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは、転写され、機能するタンパク質へと翻訳されることができる小さい遺伝子を送達するために用いることができる。第２に、そしてこれらのベクターの大きな有望さを示すものであるが、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは非ウイルス性の形質移入が以前にほとんど〜全く成功していなかったＤＣおよびＴ細胞株に形質移入することができる。

【0065】

実施例４：マウスの肺におけるＧＡＵＳＳＩＡルシフェラーゼの活性
ＣＭＶプロモーターの制御または様々な制御下のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの非分泌型をコードする１，６１３ｂｐのＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒを、非近交系メスＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウスに鼻腔内投与した（５μｇ）。そのマウスの半分は水中のＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（ｍｃＧＬｕｃ＋Ｈ_２Ｏ）を与えられ、その他の半分はＰＥＩ中のＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（ｍｃＧＬｕｃ＋ＰＥＩ）を与えられた。対照のマウスはＤＮＡを全く与えられなかった。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの投与の７２時間後に、マウスを屠殺し、それらの肺を集め
た。肺全体をビーズおよび溶解緩衝液を用いてホモジナイズし、次いでＥＬＩＳＡを用いてルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは両方ともたとえＰＥＩの非存在下であってもマウスの肺に形質移入され、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現した。これらの結果は、それは処置の間に通常毒性のある形質移入ビヒクルが必要とされない可能性があることを示しているため、重要である。追加の実験には、肺細胞内で異なるタンパク質または特定の遺伝子をサイレンシングするためのｓｈＲＮＡを発現する他のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを用いること、およびＡｅｒｏｔｅｃｈＩＩ噴霧器を用いるエアロゾル化によりそのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを投与することが含まれる。

【0066】

実施例５ ＭＩＮＩＶＥＣＴＯＲへの剪断力の評価
材料および方法
化学物質、試薬および装置
アクリルアミド（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，ダルムシュタット、ドイツ）、アガロース（ＩＳＣ ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ，ユタ州ケイズビル）、およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州ハーキュリーズ）を除く全ての化学物質はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム）を通して購入した。全ての制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）から購入した。Ｐｌａｓｍｉｄ ＭａｘｉキットはＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）からのものであり、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ビレリカ）からのものであった。Ａｅｒｏｔｅｃｈ ＩＩジェット噴霧器はＰｈａｒｍａｌｕｃｅｎｃｅ（マサチューセッツ州ベッドフォード）から購入し、Ａｒｉｄｙｎｅ ２０００圧縮機はＡｌｌｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。１／８”プローブ超音波処理器（モデル６０ソニックディスメンブレーター（Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ））はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム）からのものであった。ＰＣ ＩｍａｇｅおよびＴｏｔａｌ ＬａｂのソフトウェアプログラムはそれぞれＦｏｔｏｄｙｎｅ（ウィスコンシン州ハートランド）およびＴｏｔａｌＬａｂ（ノースカロライナ州ダーラム）から購入した。

【0067】

ＤＮＡの生成および取り扱い
２８１ｂｐから５，３０２ｂｐまでに及ぶ広い範囲の大きさを含むいくつかのプラスミドおよびＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒに、Ａｅｒｏｔｅｃｈ ＩＩ噴霧器を通したエアロゾル化により生じる剪断力を、または超音波処理により生じる剪断力をかけた。文全体を通して、これらのベクターはそれらの長さのみにより参照され、これはそれが評価される主な変数であるためである。プラスミドの名前の前に“ｐ”を用いる慣習に従って、Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡを“ｍｖ”を付けて名付ける。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡを生成するために用いられる親プラスミドを“ｐＭＶ”と名付ける。親プラスミドであるｐＭＶ−ＫＢ４ＴＡＬ−ＧＬｕｃＫＤＥＬおよびｐＭＶ−ＣＭＶ−ＧＬｕｃＫＤＥＬはＤｒ．Ｄａｖｉｄ Ｓｐｅｎｃｅｒ（ベイラー医科大学）から頂いたものであり、ｐＭＶ−ＫＢ４ＴＡＬ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびｐＭＶ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙはＤｒ．Ｍａｒｔｉｎ ＭａｔｚｕｋおよびＤｒ．Ｚｈｉｆｅｎｇ Ｙｕ（ベイラー医科大学）から頂いたものである。ｐＱＲ４９９はＤｒ．Ｊｏｈｎ Ｗａｒｄ（ユニヴァーシティ・カレッジ・ロンドン、英国）から頂いたものである。ｐＤＪＣ１はｐＱＲ４９９をＴｆｉＩおよびＡｆｌＩＩＩで消化することにより構築された。消化されたｐＱＲ４９９の陥凹末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより埋め、続いてＴ４ ＤＮＡリガーゼによりライゲーションした。大腸菌ＤＨ５α細胞中でプラスミドを生成し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを製造業者の説明書通りに用いて単離し、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターを用いて脱塩および濃縮した。ＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒのＤＮＡを以下のように得た。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒの親プラスミドを大腸菌株ＬＺ５４(Zechiedrich et al. 1997)
中に形質転換し、大規模λ Ｉｎｔ仲介組み換えおよびＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）Ｄ
ＮＡ単離を、記述された(Fogg et al. 2006; Zhao et al. 2010)通りに行った。ニックの入ったＤＮＡベクターを生成するため、ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩを製造業者のプロトコルに従って用いた。線状化は、ＰｖｕＩ、ＢｓｐＨＩ、またはＳｅａＩを製造業者のプロトコル通りに用いて行った。

【0068】

ＤＮＡの剪断
噴霧のため、１０ｍＬのＴＥ（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中１ｎｇμＬ^−１のＤＮＡをＡｅｒｏｔｅｃｈ ＩＩジェット噴霧器に添加した。Ａｒｉｄｙｎｅ ２０００圧縮機により１０Ｌ／分の速度および５０ｐ．ｓ．ｉ．のゲージ圧で空気を噴霧器に送達した。噴霧の間、全ガラス製インピンジャー（ＡＧＩ）を用いて０．５〜３．５分、７〜１０分、２０〜２３分、および２５〜２８分の時点で３分間エアロゾルを捕捉し、ここでＡＧＩのリザーバーは２０ｍＬのＴＥを保持していた。エアロゾルの排出量はおおよそ０．３ｍＬ分^−１であった。同時に、１５μＬの試料を噴霧器のリザーバーから取り出した。

【0069】

ＤＮＡの長さの噴霧における生存への作用の残りの研究のため、１５μＬの分割量を、噴霧の前およびＤＮＡ溶液が使い果たされた時点である３０分までの噴霧の間を通した合間に噴霧器のリザーバーから取り出した。早期に起きた劇的な変化のため、分割量は最初１または２分間隔で取り出された。

【0070】

超音波処理のため、エッペンドルフチューブ中の１ｍＬのＴＥ中１ｎｇμＬ^−１のＤＮＡを超音波処理の間氷上で保温し、１／８”プローブ超音波処理器を７ワット（２乗平均の平方根）の電力出力に相当する“５”に設定した。１５μＬの分割量を、超音波処理の前および超音波処理の間のデータに示した時点において取り出した。全てのＤＮＡ剪断実験は最低でも３回別々に行った。ＤＮＡを、１，０００ｂｐを超える長さに関して１％アガロースゲル、または１，０００ｂｐ未満のＤＮＡに関して５％アクリルアミド（２９：１アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）ゲル上で、４０ｍＭトリス−アセテートおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ中でゲル電気泳動により分析した。全てのゲルに１２５ボルトを２時間かけ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州ハーキュリーズ）で２０分間染色し、ＰＣ Ｉｍａｇｅを用いて可視化した。Ｔｏｔａｌ Ｌａｂを利用して残存するＤＮＡを定量化した。

【0071】

結果
ＤＮＡの長さの剪断に対する耐性への作用
細いゲージの針を通る通過、ＨＰＬＣポンプを通る循環、噴霧、および超音波処理を含む、流体力学的剪断を生じる多数のプロセスが存在し；これらの方法は配列決定のため、またはショットガンクローニング(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2006)のためのＤＮＡ断片を生成するために日常的に用いられている。噴霧は、その再現性および臨床的適切さのため、最初に選択される。ＤＮＡベクターが噴霧からの剪断力に耐えた場合、超音波処理が用いられ、これはそれが噴霧器よりもはるかに高い剪断力をより長い時間の間生じさせることができる一方で再現性を維持しているためである。異なるＤＮＡの間の比較を容易にするためにＳｕｒｖｉｖａｌ_５０という用語が用いられ、これはそのＤＮＡの半分を分解するのに必要な時間を示す。カッコ中の用語（Ｎｅｂ）および（Ｓｏｎ）は、それぞれ噴霧および超音波処理を指す。下記で記述するように得られたそれぞれのＤＮＡに関するＳｕｒｖｉｖａｌ_５０の値も表１に列挙する。

【0072】

ＤＮＡ試料にＣｏｌｌｉｓｏｎ様ジェット噴霧器(May K.R. (1973) Collison噴霧器。
説明、性能および適用 J. of Aerosol Science, Vol. 4, #3, p. 235)において噴霧を施
した。その噴霧器は以下のように作動する：高圧の空気がノズル中の小さな開口部を通してポンプで押し出される。ノズルおよびリザーバーの間の圧力の差が療法溶液をリザーバ
ーから吸い出して高速のジェット噴流にし、そうして１５〜５００μｍの大きさの一次液滴を生成する(Lentz et al. 2005, Aerosol Science 36, 973-990)。この一次液滴形成の間には最小限のＤＮＡの分解しか起こらない(Lentz et al. 2005, Aerosol Science 36, 973-990)；しかし、その液滴は大きすぎて肺の中に深く浸透することができない(Eberl et al. 2001, Eur J Nucl Med. 2001 Sep;28(9): 1365-72)。阻流板（ｂａｆｆｌｅ）内のプラスチックの錐体がその一次液滴を壊して肺の中に深く浸透することができるより小さな（１〜１０μｍ）液滴にする(Bennet et al. 2002, Journal of Aerosol Medicine, 15, 179-188)。ＤＮＡの剪断は、ほぼ排他的にその阻流板内のプラスチックの錐体との衝突の間に起こる(Lentz et al. 2005, Aerosol Science 36, 973-990)。そのより小さな液滴は阻流板領域を逃れてエアロゾルの形で噴霧器を出る。取り外し可能な蓋がリザーバーからの試料採取を可能にする。

【0073】

その小さい液滴のごく小さな割合が気流により吸い口から運び出され；その液滴の大部分は凝縮されてリザーバー中に戻され、そこでそれらはノズルを通って再循環する。結果として、リザーバー中のＤＮＡは時間が経つにつれてますます剪断された状態になる。

【0074】

その凝縮およびエアロゾル化が急速であるため、リザーバー中のＤＮＡの状態はエアロゾル中のＤＮＡの状態と同じである(Knight et al, 1988, J of Infect Diseases, 158(2):443-8)。試料をリザーバーから集めることはエアロゾルを捕捉することよりも容易であり、面倒でなく、そのためエアロゾルからの試料とリザーバーからの試料を比較した（データは示していない）。実際、両方の部位からのＤＮＡの分解は、この研究において試験された長さのスペクトルの両方の末端に相当するＤＮＡである３，８６９ｂｐのプラスミドまたは３８５ｂｐのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒに関して同じであった。従って、残りの噴霧実験において、試料をリザーバーから吸い出した。

【0075】

２８１から５，３０２ｂｐまでに及ぶスーパーコイル状ＤＮＡに噴霧を施し、それらの生存をゲル電気泳動により定量化した。ＤＮＡの剪断の程度を、時間の経過に伴う完全長の（無傷の）ＤＮＡベクターの消失から決定した。その結果は高度に再現性があり、ＤＮＡの濃度と無関係であった。１，８７３ｂｐのＤＮＡに関して、１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまでの範囲のＤＮＡ濃度は同じ結果を与えた（データは示していない）。ＤＮＡの長さと剪断の間の関係は、強く比例していた。加えて、ＤＮＡの分解は長さに依存して異なっていた（図８Ａ〜Ｂ）。２，６００ｂｐを超えるスーパーコイル状ＤＮＡは急速に断片化し、擬似指数的分解を示した。１，５８０〜２，２３２ｂｐのスーパーコイル状ＤＮＡベクターは、図８Ａ〜ＢにおけるＳ字の形状の曲線により理解できるように最初は剪断に抵抗を示し、次いで分解した。１，２４３ｂｐ以下のスーパーコイル状Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡは測定可能な程度に分解せず、水性溶媒の蒸発のため、時間と共にわずかな濃縮作用を示した。

【0076】

比較的大きいＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡであるｐＭＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ２（２，６７９ｂｐ）は、噴霧器において類似の大きさのプラスミドと比較可能な比較的短い生存時間を有しており、これはプラスミドとＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡの間の剪断生存時間の差は配列の違い（例えばプラスミド上の複製起点、抗生物質耐性をコードする遺伝子）のためではないことを示している。

【0077】

噴霧の間の濃縮作用は、以前に剪断に耐性である小さい薬物について観察されている。この濃縮作用は、噴霧の終わりごろにそのリザーバーの体積が小さい時により顕著になる。３，０００ｂｐを超えるＤＮＡは噴霧の初期の間に完全に剪断される。従って、その濃縮作用はこれらの大きいＤＮＡベクターの剪断の定量化に関しては無視することができたが、その濃縮作用は１，２４３ｂｐ以下のＤＮＡに関するデータ定量に問題を引き起こした。

【0078】

１，２４３〜１，７１４ｂｐのスーパーコイル状Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡは噴霧の後に大部分が無傷であったが、剪断された断片がそのスーパーコイル状のバンドの前を泳動するより短いＤＮＡ断片のスメアとして見ることができた（データは示していない）。プラスミドおよびこれらのより大きいｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒからのこれらの断片の典型的な分解産物の長さは、２００〜１，０００ｂｐであった。

【0079】

噴霧器において３８５ｂｐのＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒの検出可能な剪断は無かったため、超音波処理により生じる剪断力に対するこれらのＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒの耐性を試験した；次いで１，２４３ｂｐ未満のＤＮＡベクターに関するＳｕｒｖｉｖａｌ５０（Ｓｏｎ）を測定した。３８５ｂｐのベクターのＳｕｒｖｉｖａｌ_５０（Ｓｏｎ）は２８分であった。比較すると、同じ条件下での超音波処理の間の３，８６９ｂｐのプラスミドのＳｕｒｖｉｖａｌ_５０（Ｓｏｎ）はわずか０．３７分であり、これは従来のプラスミドベクターと比較してはるかに高いＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒの剪断耐性を示している。

【0080】

ＤＮＡのトポロジーの剪断力に対する耐性への作用
線状の、ニックの入った、および弛緩した形状の１，８７３ｂｐのｐＱＲ４９９プラスミドおよび３８５ｂｐのｍｖ−Ｈ１−ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡを生成し、ＤＮＡのトポロジーの剪断力に対する耐性への作用を調べた。これらのトポロジー的形状のＤＮＡに、（１，８７３ｂｐに関して）噴霧または（３８５ｂｐに関して）超音波処理を施し、それらの生存を時間に関して定量化した（図９）。予想されたように、ＤＮＡのスーパーコイル形成は剪断力生存への強い保護作用を有していた。その線状の形状の１，８７３ｂｐのＤＮＡに関するＳｕｒｖｉｖａｌ_５０（Ｎｅｂ）は、その負にスーパーコイル形成した形状における約２２分と比較して、約４分であった。従って、スーパーコイル形成に仲介されるコンパクト化の利益がないため、線状ＤＮＡはおそらくはるかに大きな流体力学的径を有し；線状になった１，８７３ｂｐのＤＮＡははるかに大きな（３，０００ｂｐを超える）スーパーコイル状ＤＮＡプラスミドの剪断と同様に剪断された。ニックの入った（開環状）ＤＮＡは線状よりも約４倍長く持ちこたえ、これは環状であることがいかに流体力学的径を低減させるかを反映している。予め存在しているニックはＤＮＡベクターの生存を低減させるであろうと予想するかもしれない。弛緩した（両方の鎖が共有結合により閉じている）１，８７３ｂｐのプラスミドは、ニックの入った１，８７３ｂｐのプラスミドと同じだけ生存した。従って、ニックはそれ以上ＤＮＡを剪断力に晒さない。ニックの入った、弛緩した、またはスーパーコイル状のＤＮＡが噴霧により剪断された際、我々は完全長の線状の形状に対応する分解産物を全く観察しなかった。これは線状のＤＮＡの短い寿命の結果である可能性が最も高く、完全長の線状の形状になるとすぐにそれは急速に剪断され、従って蓄積しないと考えられる。負のスーパーコイル形成は、剪断生存において、ニックの入った、および弛緩した１，８７３ｂｐのＤＮＡを超える（約１．３倍）再現性のある向上をもたらした。

【0081】

３８５ｂｐのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒに関して、ＤＮＡトポロジーへの類似の依存が観察された。線状の３８５ｂｐのＤＮＡは超音波処理の間に急速に分解した。ニックの入った３８５ｂｐのＤＮＡは、線状よりも約７倍長く生存した。スーパーコイル状の３８５ｂｐのＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡはニックの入った３８５ｂｐのＤＮＡよりも約４倍長く生存し、それはスーパーコイル状の１，８７３ｂｐのＤＮＡに関して観察された向上よりも劇的な向上であった。

【0082】

論考
２，０００ｂｐ未満のＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡは、噴霧器において有意に分解しない。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡの剪断力への耐性は、主にその小さい大きさに起因するようである。噴霧器における生存時間は、そのプラスミドの大きさが３
，０００ｂｐより下まで下がると急激に増大する（図９）。

【0083】

ＤＮＡを剪断力から保護するための努力
もろい伝統的なプラスミドＤＮＡベクターまたはｓｉＲＮＡを送達の間保護するためのビヒクル系の組成の向上において、多くの努力がなされて来ており、なされ続けている。陽イオン性薬剤、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）はＤＮＡを凝縮させ、流体力学的径を低減させ、それによりＤＮＡを剪断から保護するのを助ける(Belur et al. 2007, Nat Protoc 2: 146-52、およびLentz et al. 2005, Aerosol Science 36, 973-990)。残念
なことに、これらのビヒクルのほとんどは細胞毒性であり、(Brunot et al. 2007. Biomaterials 28:632-40; Moghimi et al. 2005, Molecular therapy 11 : 990-5)、それがそ
れらの有用性を制限している。ＰＥＩは血液に送達された場合細胞毒性であるが、エアロゾルにより送達された場合、全身投与と比較して毒性が低い(Di Giola and Conese, 2009, Drug Des Devel Ther. 2009 Feb 6;2: 163-88)。Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡの送達に伴う剪断力に耐える能力は、凝縮剤の非存在下においてさえも、毒性のビヒクルの必要性を低減するはずである。ＤＮＡが肺において細胞の中に入ることを可能にするために、おそらくいくらかのビヒクルがなお必要であると考えられるが、これは従来のプラスミドＤＮＡベクターに関して必要とされるであろうよりも少ないはずである。

【0084】

ＤＮＡの剪断の遺伝子療法への療法的結果
ＤＮＡの剪断の明らかな損失は、療法のために残存している無傷の生物学的に活性なベクターの量の低減である。スーパーコイル状ベクターの喪失を埋め合わせるために、送達されるＤＮＡの用量を単純に増大させることができるであろうと主張することが可能であろう。これを行うことは２つの好ましくない結果をもたらすであろう。第１に、ベクターの量を増大させることは細胞毒性の送達ビヒクルの量の同等の増大を必要とする。第２に、大きなプラスミドＤＮＡは壊れてより小さな線状のＤＮＡ断片になる。その短い線状のＤＮＡ断片の送達の結果、ベクターに関係する毒性がもたらされる可能性がある。剪断されたＤＮＡの送達のさらなる結果には、ＤＮＡの分解、ならびにＤＮＡ修復および組み替え経路の誘導が含まれ、それは結果としてゲノムの不安定性をもたらす可能性がある。遊離のＤＮＡ末端は細胞中で迅速に処理される。極端な例として、ＤＮＡの末端は、特に大量に送達された場合、アポトーシスの引き金を引く可能性がある。別の極端な例として、細胞はそのＤＮＡを修復し、ランダムな方式でライゲーションして大きなエピソーム性コンカテマーを形成する可能性がある。これはマウスの肝臓に送達された線状ＤＮＡに関して報告されており、その事例では結果として数週間持続する安定な長期導入遺伝子発現がもたらされた(Chen et al, 2001, Molecular Therapy, 3, 403-410)。ＤＮＡの剪断の結
果もたらされるランダムなＤＮＡ断片が一緒につながり、新しい毒性の遺伝子産物に関する潜在性を有する新しい配列を生成する可能性がある。

【0085】

従って、Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ（商標）ＤＮＡが噴霧の間伝統的なプラスミドベクターよりも長い間噴霧および超音波処理を生存しただけではなく、無傷で、たとえあったとしても非常に少ないＤＮＡの分解で生存したのは重要である。従って、短い線状のＤＮＡ断片を送達する危険性は、より小さい、スーパーコイル状ＤＮＡベクターを用いることによりかなり低減される。

【0086】

ＤＮＡの剪断に関するモデル
ＤＮＡのスーパーコイル形成は、剪断生存への相反する作用を有する可能性がある。スーパーコイル状ＤＮＡにおける捻れ歪みはその分子をより剪断を受けやすくする可能性がある一方で、コンパクト化は剪断耐性を増大させる(Lengsfeld and Anchordoquy, 2002, Journal of Pharmaceutical Sciences, 91, 1581-1589)。本明細書中のデータは、コンパクト化の有益な作用が優勢な作用であることを示している。スーパーコイル形成により提供される利点は、ＤＮＡがより大きくなるにつれて減少する。

【0087】

肺へのＤＮＡベクターの送達
剪断力を生き延びるＤＮＡベクターの長さを同定することは、どの送達経路であろうとも、遺伝子療法送達に関する重要な関わり合いを有する；しかし、Ｃｏｌｌｉｓｏｎ様ジェット噴霧器の使用は、我々のデータを特に肺への療法的送達に密接に関連するものにする。肺は静脈内、気管内、鼻腔内およびエアロゾル送達法により容易にアクセス可能であり、これらの経路のいずれもＤＮＡベクター送達を適用しやすい。しかし、エアロゾルによる核酸の送達は非侵襲的であり、冒された組織に直接送達し、そして非標的器官における合併症を防ぐのを助ける可能性がある。加えて、エアロゾル送達はＤＮＡが肺に全身投与により得ることのできる量よりもはるかに高い量で送達されることを可能にする(Bennet et al. 2002, Journal of Aerosol Medicine, 15, 179-188)。肺疾患の処置に関して、いくつかの有望な遺伝子療法標的が同定されてきた。嚢胞性線維症の処置を目標とする幾ダースもの遺伝子療法臨床試験が進行中である；しかし、残念ながらその療法は今のところ成功していない(O'Sullivan and Freedman, 2009, Lancet, 373, 1891-1904)。喘息も
ＲＮＡ干渉(Duncan et al, 2008, Molecular Pharmaceutics, 5, 559-566)、ｓｈＲＮＡ(Kozma et al, 2006, J. Immunol 176: 819-26)またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に関する疾患標的としての高い可能性を有する。

【0088】

実施例６ スーパーコイル状ＭＩＮＩＶＥＣＴＯＲへの化学的部分の結合
一本鎖環状ＤＮＡの鋳型を、まずニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩを用いてスーパーコイル状Ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡにニックを入れることにより生成した。次いでＴ７エキソヌクレアーゼがそのニックにおいてニックの入った鎖が完全に消化されるまでヌクレオチドの除去を開始することができた。無傷の鎖はそのエキソヌクレアーゼが作用するための５’末端を欠いており、従って消化されないまま残った。次いで、内部に標識された、５’リン酸化されたオリゴヌクレオチドプライマーをその環状ｓｓＤＮＡ鋳型にアニーリングさせた。続いてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて２番目の鎖を再合成し、それはプライマーの位置で開始および終了し、結果としてニックの入った環状の標識されたＤＮＡが得られた。スーパーコイルを復元するため、部分的にＤＮＡらせんを解くインターカレーターである臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を添加した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるニックの密閉がその解けた状態を留めた（ｔｒａｐｐｅｄ）。それに続くブタノール抽出によるＥｔＢｒの除去は、負にスーパーコイル形成された標識されたＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡを生成した。そのプロセスの流れ図を図１０に示す。

【0089】

その手順の様々な段階における生成物を、５％ポリアクリルアミドゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ＤＮＡをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色することにより可視化し、またはＴｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて５３２ｎｍのレーザーで励起し、蛍光Ｃｙ３標識の存在に関して検出することにより可視化した。Ｃｙ３の蛍光は、その手順の後の段階において、その標識されたプライマーのアニーリングおよび第２の鎖の再合成の後にのみ検出される。

【0090】

Ｃｙ３標識された３３９ｂｐのＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＮＤＡを、完成したＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒと無関係な標識プライマーを除去するため、５０Ｋ ＭＷカットオフ排除フィルターカラムを通して精製した後、リポソーム性形質移入試薬である“Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００”によりＨｅＬａ細胞の中に形質移入した。蛍光標識を欠く同じ３３９ｂｐのＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒを、並行する実験において陰性対照としてＨｅＬａの中に形質移入した。形質移入の３時間後の画像は、４５７ｎｍにおける青色発光チャンネルにより同定されたＤＡＰＩで染色された核を示した。Ｃｙ３標識されたＤＮＡは、６１７ｎｍにおける近赤色発光チャンネルにより同定された。画像は、Ｃｙ３標識されたＤＮＡの存在および蛍光画像化法によりＭｉｎｉｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡを可視化する能力を確証した（データは示していない）。

【0091】

参考文献

【0092】

【化5】

【0093】

【化6】

【0094】

本明細書で引用された全ての特許、公開された出願および参考文献の教示を、そのまま援用する。
この発明は特にその実施態様に関連して示され、記述されたが、それにおいて添付された特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく形式および詳細における様々な変更がなされてよいことは当業者には理解されるであろう。

【図1】

【図8】

【図9】

【図10】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【手続補正書】

【提出日】2016年11月2日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含む核酸分子組成物であって、前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしており；
ここでｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは細菌の複製起点と抗生物質選択遺伝子の両方を欠いており、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは部位特異的組み換えの産物であり；および
ここでｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒは１１００ｂｐまでの大きさである、前記組成物。

【請求項2】

請求項１に記載の組成物であって、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによってコードされる核酸配列がタンパク質、タンパク質の部分、またはペプチドの発現をコードする遺伝子を含む、組成物。

【請求項3】

ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒによってコードされる核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

その核酸配列が、所望のタンパク質；異なるＤＮＡ配列；ＲＮＡ配列；および細胞膜からなるグループから選択される細胞構成要素により結合されることができるＤＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれかに記載の組成物であって、ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒがさらに化学的部分、修飾された塩基または修飾された主鎖を含む、組成物。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれかに記載のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含む細胞。

【請求項7】

細胞が細菌細胞、真核細胞、及び古細菌細胞からなる群より選択される細胞である、請求項６に記載の細胞。

【請求項8】

請求項１〜５のいずれかに記載のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを細胞と接触させることを含む、細胞において遺伝子を発現させる方法。

【請求項9】

請求項８に記載の方法であって、ここで細胞が細菌細胞、真核細胞、及び古細菌細胞からなる群より選択される細胞である、方法。

【請求項10】

請求項８に記載の方法であって、ここで細胞が哺乳類細胞であり、所望によりここで哺乳類細胞がヒト細胞である、方法。

【請求項11】

遺伝子療法において用いるための、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子組成物。

【請求項12】

細胞において遺伝子の発現をサイレンシングする方法であって、前記の細胞を請求項１で定義されたｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒと接触させることを含み、前記のｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしており、その核酸配列がその遺伝子の発現をサイレンシングする、前記方法。

【請求項13】

その核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

療法上有効量の請求項１で定義されたｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒを含み、そのｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒが核酸配列をコードしている、遺伝子療法のために哺乳類に投与される医薬組成物。

【請求項15】

核酸配列がショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

哺乳類がヒトである、請求項１４に記載の医薬組成物。