特開 2017-53799 細胞分析装置および細胞分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-53799(P2017-53799A)

(43)【公開日】2017年3月16日

(54)【発明の名称】細胞分析装置および細胞分析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20170224BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20170224BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/48 M

   G01N33/48 P

   G01N33/574 D

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2015-179602(P2015-179602)

(22)【出願日】2015年9月11日

(71)【出願人】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000280

【氏名又は名称】特許業務法人サンクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】木村 考伸

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA02

2G045AA24

2G045FA14

2G045FB12

2G045GA01

2G045GB01

2G045GC22

2G045JA01

2G045JA03

(57)【要約】      （修正有）

【課題】体液中の腫瘍細胞を検出することができる細胞分析装置を提供する。
【解決手段】体液を含む測定試料を流すためのフローセルと、フローセルを流れる測定試料に光を照射する光照射部と、光が照射された測定試料中の細胞から生じる前方散乱光を検出する光検出部と、光検出部において検出された前方散乱光信号に基づいて体液中の細胞を検出する解析部と、出力部と、を備える。解析部は、前方散乱光信号強度および前方散乱光信号幅に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力部に出力する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

体液を含む測定試料を流すためのフローセルと、
前記フローセルを流れる前記測定試料に光を照射する光照射部と、
光が照射された前記測定試料中の細胞から生じる前方散乱光を検出する光検出部と、
前記光検出部において検出された前方散乱光信号に基づいて前記体液中の細胞を検出する解析部と、
出力部と、を備え、
前記解析部は、前方散乱光信号強度および前方散乱光信号幅に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を前記出力部に出力する、細胞分析装置。

【請求項2】

前記解析部は、
白血球細胞の分布領域よりも前方散乱光信号強度および前方散乱光信号幅が大きい凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数し、
計数された前記凝集細胞検出領域に属する細胞数の情報に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を前記出力部に出力する、請求項１に記載の細胞分析装置。

【請求項3】

前記フローセルは、体液中の有核細胞の核酸を蛍光染色した測定試料を流し、
前記光検出部は、光が照射された前記測定試料中の細胞から生じる蛍光を検出し、
前記解析部は、蛍光信号強度および前方散乱光信号強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を前記出力部に出力する、請求項１または２に記載の細胞分析装置。

【請求項4】

前記解析部は、
蛍光信号強度が白血球細胞の分布領域と中皮細胞の分布領域の間の領域に位置する非凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数し、
計数された前記凝集細胞検出領域に属する細胞数に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を前記出力部に出力する、請求項１乃至３何れか一項に記載の細胞分析装置。

【請求項5】

前記体液中の赤血球を溶血させた測定試料を調製する試料調製部を更に備える、請求項１乃至４何れか一項に記載の細胞分析装置。

【請求項6】

前記試料調製部は、前記体液中の有核細胞の核酸を蛍光染色した測定試料を調製する、請求項５に記載の細胞分析装置。

【請求項7】

体液中の有核細胞の核酸を蛍光染色した測定試料を流すためのフローセルと、
前記フローセルを流れる前記測定試料に光を照射する光照射部と、
光が照射された前記測定試料中の細胞から生じる蛍光を検出する光検出部と、
前記光検出部において検出された蛍光信号強度に基づいて前記体液中の細胞を検出する解析部と、
出力部と、を備え、
前記解析部は、蛍光信号強度および前方散乱光信号強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を前記出力部に出力する、細胞分析装置。

【請求項8】

前記解析部は、
蛍光信号強度が白血球細胞の分布領域と中皮細胞の分布領域の間の領域に位置する非凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数し、
計数された前記非凝集細胞検出領域に属する細胞数の情報に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を前記出力部に出力する、請求項７に記載の細胞分析装置。

【請求項9】

体液を含む測定試料に光を照射し、
光が照射された前記測定試料中の細胞から生じる前方散乱光を検出し、
前方散乱光信号強度および前方散乱光信号強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する細胞分析方法。

【請求項10】

白血球細胞の分布領域よりも前方散乱光信号強度および前方散乱光信号幅が大きい凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数し、
計数された前記凝集細胞検出領域に属する細胞数の情報に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する、請求項９に記載の細胞分析方法。

【請求項11】

体液中の赤血球を溶血させて測定試料を調製する、請求項９または１０に記載の細胞分析方法。

【請求項12】

前記測定試料中の細胞から生じる蛍光を検出し、
蛍光信号強度および前方散乱光信号強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を前記出力部に出力する、請求項１１に記載の細胞分析方法。

【請求項13】

蛍光信号強度が白血球細胞の分布領域と中皮細胞の分布領域の間の領域に位置する非凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数し、
計数された前記非凝集細胞検出領域に属する細胞数の情報に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する、請求項１２に記載の細胞分析方法。

【請求項14】

体液中の有核細胞の核酸を蛍光染色して測定試料を調製する、請求項１２または１３に記載の細胞分析方法。

【請求項15】

体液中の有核細胞の核酸を蛍光染色した測定試料を調製し、
前記測定試料に光を照射し、
前記測定試料中の細胞から発せられた蛍光を検出し、
蛍光信号強度および前方散乱光強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する細胞分析方法。

【請求項16】

蛍光信号強度が白血球細胞の分布領域と中皮細胞の分布領域の間の領域に位置する非凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数し、
計数された前記非凝集細胞検出領域に属する細胞数の情報に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する、請求項１５に記載の細胞分析方法。

【請求項17】

体液を含む測定試料に光を照射し、
光が照射された前記測定試料中の細胞から得られる光を検出し、
検出した光情報により生成した細胞の分布情報に基づいて、少なくとも白血球、マクロファージおよび中皮細胞から、腫瘍細胞を分離して計数し、
体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する、細胞分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細胞分析装置および細胞分析方法に関する。さらに詳しくは、脳脊髄液、体腔液等の体液中の細胞を分析する細胞分析装置および細胞分析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、疾患を診断するために患者の体液を分析することが行われている。例えば、特許文献１には、血液中の白血球細胞の情報を得るための血球分析装置および体液分析方法が開示されている。特許文献１記載の方法では、体液中の白血球を、白血球以外の粒子であるマクロファージ、中皮細胞および腫瘍細胞等の異粒子と分離して解析している。白血球が出現する領域として、縦軸を側方蛍光強度とし、横軸を側方散乱光強度とするスキャッタグラムにおいて、前記異粒子が存在する、蛍光強度が大きい領域と、溶血により生じた赤血球ゴーストが分布する、蛍光強度が小さい領域とを除いた領域が設定されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００８−２０９３８６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

特許文献１には、異粒子としての腫瘍細胞が体液中に存在することは記載されているが、体液中に出現した異粒子がマクロファージ、中皮細胞または腫瘍細胞の何れかであることは判断ができなかった。このため、体液中に腫瘍細胞が含まれていることを検出することはできなかった。

【0005】

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、体液中の腫瘍細胞を検出することができる細胞分析装置および細胞分析方法を提供に向けられたものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

（１）本発明の第１の観点に係る細胞分析装置は、体液を含む測定試料を流すためのフローセルと、フローセルを流れる測定試料に光を照射する光照射部と、光が照射された測定試料中の細胞から生じる前方散乱光を検出する光検出部と、光検出部において検出された前方散乱光信号に基づいて体液中の細胞を検出する解析部と、出力部と、を備える。解析部は、前方散乱光信号強度および前方散乱光信号幅に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力部に出力する。

【0007】

（２）本発明の第２の観点に係る細胞分析装置は、体液中の有核細胞の核酸を蛍光染色した測定試料を流すためのフローセルと、フローセルを流れる測定試料に光を照射する光照射部と、光が照射された測定試料中の細胞から生じる蛍光を検出する光検出部と、光検出部において検出された蛍光信号強度に基づいて体液中の細胞を検出する解析部と、出力部と、を備える。解析部は、蛍光信号強度および前方散乱光信号強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力部に出力する。

【0008】

（３）本発明の第３の観点に係る細胞分析方法は、体液を含む測定試料に光を照射し、光が照射された測定試料中の細胞から生じる前方散乱光を検出し、前方散乱光信号強度および前方散乱光信号強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する。

【0009】

（４）本発明の第４の観点に係る細胞分析方法は、体液中の有核細胞の核酸を蛍光染色した測定試料を調製し、測定試料に光を照射し、測定試料中の細胞から発せられた蛍光を検出し、蛍光信号強度および前方散乱光強度に基づいて、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する。
（５）本発明の第５の観点に係る細胞分析方法は、体液を含む測定試料に光を照射し、光が照射された測定試料中の細胞から得られる光を検出し、検出した光情報により生成した細胞の分布情報に基づいて、少なくとも白血球、マクロファージおよび中皮細胞から、腫瘍細胞を分離して計数し、体液中の腫瘍細胞に関する情報を出力する。

【発明の効果】

【0010】

本発明の細胞分析装置および細胞分析方法によれば、体液中の腫瘍細胞を検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の細胞分析装置の一実施形態の外観を示す斜視図である。

【図2】図１に示される細胞分析装置における測定ユニットの構成を示す模式図である。

【図3】図１に示される細胞分析装置における光学検出器の構成を示す模式図である。

【図4】図１に示される細胞分析装置における情報処理ユニットの構成を示す説明図である。

【図5】陰性検体のスキャッタグラムの一例を示す図である。

【図6】凝集細胞検出領域で凝集腫瘍細胞が検出されるスキャッタグラムの一例を示す図である。

【図7】非凝集細胞検出領域で凝集腫瘍細胞が検出されるスキャッタグラムの一例を示す図である。

【図8】第１実施形態に係る細胞分析方法における測定ユニットおよび情報処理ユニットによる処理を示すフローチャートである。

【図9】第１実施形態に係る細胞分析方法で用いられるスキャッタグラムの模式図である。

【図10】第２実施形態に係る細胞分析方法における測定ユニットおよび情報処理ユニットによる処理を示すフローチャートである。

【図11】第２実施形態に係る細胞分析方法で用いられるスキャッタグラムの模式図である。

【図12】第３実施形態に係る細胞分析方法における測定ユニットおよび情報処理ユニットによる処理を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、添付図面を参照しつつ、本発明の細胞分析装置および細胞分析方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、本発明はこれらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

【0013】

〔細胞分析装置〕
本実施形態に係る細胞分析装置１は、体液検体に含まれる白血球、マクロファージ、中皮細胞、腫瘍細胞等の有核細胞を検出し、各細胞を計数する細胞分析装置である。なお、本発明における「体液」は、血液を除く、脳髄液、腹水、胸水、滑液、腹膜透析排液等を意味する。細胞分析装置１は、図１に示されるように、測定ユニット２と、測定ユニット２の前面側に配置された搬送ユニット３と、情報処理ユニット４とを備えている。患者から採取された体液検体は、検体容器Ｔに収容される。複数の検体容器ＴがサンプルラックＬに支持される。サンプルラックＬが搬送ユニット３により搬送されることで、体液検体が測定ユニット２へ供給される。

【0014】

情報処理ユニット４は、出力部４１と入力部４２とを備えている。情報処理ユニット４は、測定ユニット２、搬送ユニット３、およびホストコンピュータ５（図２参照）に対して、通信可能に接続されている。情報処理ユニット４は、測定ユニット２および搬送ユニット３の動作を制御し、測定ユニット２で行われた測定結果に基づいて解析を行い、解析結果をホストコンピュータ５に送信する。

【0015】

測定ユニット２は、図２に示されるように、ハンド部２１と、検体容器セット部２２と、バーコードユニット２３と、検体吸引部２４と、試料調製部２５と、検出部２６とを備えている。検体吸引部２４は、ピアサ２４ａを備えており、検体容器Ｔから検体を吸引する。試料調製部２５は、混合チャンバＭＣとヒータＨとを備えており、検体に試薬を混和することにより測定に用いられる測定試料を調製する。検出部２６は、光学検出器Ｄを備えており、測定試料から細胞を検出する。測定ユニット２の各部は、情報処理ユニット４により制御される。

【0016】

搬送ユニット３により位置Ｐ１に位置付けられた検体容器Ｔは、ハンド部２１により把持され、サンプルラックＬから上方向に抜き出される。ハンド部２１が揺動されることにより、検体容器Ｔ内の検体が撹拌される。攪拌が終了した検体容器Ｔは、ハンド部２１により、位置Ｐ１に位置付けられた検体容器セット部２２にセットされる。その後、検体容器Ｔは、検体容器セット部２２により位置Ｐ２まで搬送される。

【0017】

検体容器Ｔが位置Ｐ２に位置付けられると、位置Ｐ２の近傍に設置されたバーコードユニット２３により、検体容器Ｔに貼付されたバーコードラベルから検体番号が読み取られる。その後、検体容器Ｔは、検体容器セット部２２により位置Ｐ３まで搬送される。検体容器Ｔが位置Ｐ３に位置付けられると、検体吸引部２４によりピアサ２４ａを介して検体容器Ｔから所定量の検体が吸引される。検体の吸引が終了すると、検体容器Ｔは、検体容器セット部２２により前方に搬送され、ハンド部２１により元のサンプルラックＬの支持位置に戻される。ピアサ２４ａを介して吸引された検体は、ピアサ２４ａが混合チャンバＭＣの位置へ移送された後、検体吸引部２４により混合チャンバＭＣに所定量だけ吐出される。

【0018】

試料調製部２５は、第１試薬を収容する試薬容器２５１と、第２試薬を収容する試薬容器２５２と、シース液（希釈液）を収容する試薬容器２５３とに、それぞれチューブを介して接続されている。試料調製部２５は、コンプレッサ（図示せず）に接続されており、前記コンプレッサにより生成される圧力により試薬容器２５１〜２５３から、それぞれの試薬を分取することが可能である。試料調製部２５は、混合チャンバＭＣ内で、体液検体と、第１試薬と、第２試薬とを混合し、この混合液を所定時間だけヒータＨにより加温して測定試料を調製する。試料調製部２５で調製された測定試料は、検出部２６の光学検出器Ｄに供給される。

【0019】

検出部２６は、シース液（希釈液）を収容する試薬容器２５３に、チューブを介して接続されている。検出部２６は、コンプレッサ（図示せず）に接続されており、前記コンプレッサにより生成される圧力により試薬容器２５３からシース液（希釈液）を分取することが可能である。

【0020】

光学検出器Ｄは、図３に示されるように、フローセルＤ１と、シースフロー系Ｄ２と、ビームスポット形成系Ｄ３と、前方散乱光受光系Ｄ４と、側方散乱光受光系Ｄ５と、蛍光受光系Ｄ６とを備えている。

【0021】

シースフロー系Ｄ２は、フローセルＤ１内に測定試料をシース液に包まれた状態で送り込み、フローセルＤ１中に液流を発生させる。ビームスポット形成系Ｄ３は、光照射部である半導体レーザＤ３１から照射された光が、コリメータレンズＤ３２とコンデンサレンズＤ３３とを通って、フローセルＤ１に照射されるよう構成されている。これにより、フローセルＤ１内を通過する液流に含まれる細胞にレーザ光が照射される。ビームスポット形成系Ｄ３は、ビームストッパＤ３４も備えている。

【0022】

前方散乱光受光系Ｄ４は、前方への散乱光（前方散乱光）を前方集光レンズＤ４１によって集光し、ピンホールＤ４２を通った光をフォトダイオードＤ４３で受光するように構成されている。フォトダイオードＤ４３は、受光した前方散乱光のピーク値に基づいて前方散乱光信号（ＦＳＣ）を出力する。側方散乱光受光系Ｄ５は、側方への散乱光（側方散乱光）を側方集光レンズＤ５１にて集光するとともに、一部の光をダイクロイックミラーＤ５２で反射させ、フォトダイオードＤ５３で受光するよう構成されている。フォトダイオードＤ５３は、受光した側方散乱光のピーク値に基づいて側方散乱光信号（ＳＳＣ）を出力する。

【0023】

光散乱は、光の進行方向に細胞のような粒子が障害物として存在すると、粒子により光がその進行方向を変えることによって生じる現象である。この散乱光を検出することによって、粒子の大きさと材質とに関する情報を得ることができる。特に、前方散乱光からは、粒子（細胞）の大きさに関する情報を得ることができる。また、側方散乱光からは、粒子内部の情報を得ることができる。細胞にレーザ光が照射された場合、側方散乱光強度は細胞内部の複雑さ（核の形状、大きさ、密度および顆粒の量）に依存する。

【0024】

蛍光受光系Ｄ６は、側方散乱光のうちダイクロイックミラーＤ５２を透過した光（蛍光）をさらに分光フィルタＤ６１に通し、アバランシェフォトダイオードＤ６２で受光するよう構成されている。アバランシェフォトダイオードＤ６２は、受光した蛍光のピーク値に基づいて蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。

【0025】

蛍光物質により染色された細胞に光を照射すると、照射した光の波長より長い波長の蛍光が発せられる。蛍光の強度は、細胞がよく染色されていれば強くなり、この蛍光強度を測定することによって細胞の染色度合いに関する情報を得ることができる。
本実施形態では、フォトダイオードＤ４３、フォトダイオードＤ５３、およびアバランシェフォトダイオードＤ６２が、光検出部を構成している。

【0026】

図２に戻り、光学検出器Ｄにより取得された前方散乱光信号、側方散乱光信号、および蛍光信号は、情報処理ユニット４に送信される。情報処理ユニット４は、受信したこれら信号に基づいて解析を実行する。

【0027】

情報処理ユニット４は、図４に示されるように、パーソナルコンピュータからなり、本体４０と、出力部４１と、入力部４２とで構成されている。本体４０は、ＣＰＵ４０１と、ＲＯＭ４０２と、ＲＡＭ４０３と、ハードディスク４０４と、読出装置４０５と、画像出力インターフェース４０６と、入出力インターフェース４０７と、通信インターフェース４０８とを備えている。本実施形態における出力部４１は、画像等を表示することができるディスプレイであるが、紙で情報を出力をするプリンタ等も出力部として採用することができる。

【0028】

解析部を構成するＣＰＵ４０１は、ＲＯＭ４０２に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ４０３にロードされたコンピュータプログラムを実行する。ＲＡＭ４０３は、ＲＯＭ４０２およびハードディスク４０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ４０３は、前記コンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ４０１の作業領域としても利用される。

【0029】

ハードディスク４０４には、オペレーティングシステム、ＣＰＵ４０１に実行させるためのコンピュータプログラム、およびコンピュータプログラムの実行に用いるデータが記憶されている。ハードディスク４０４には、図８、図１０および図１２に示される情報処理ユニット４の処理を実行させるためのプログラム４０４ａが記憶されている。読出装置４０５は、ＣＤドライブまたはＤＶＤドライブ等によって構成されており、記録媒体４０５ａに記録されたコンピュータプログラムおよびデータを読み出すことができる。プログラム４０４ａが記録媒体４０５ａに記録されている場合には、読出装置４０５により記録媒体４０５ａから読み出されたプログラム４０４ａが、ハードディスク４０４に記憶される。

【0030】

画像出力インターフェース４０６は、画像データに応じた映像信号を出力部４１に出力する。出力部４１は、画像出力インターフェース４０６から出力された映像信号に基づいて画像を表示する。ユーザは、入力部４２を介して指示を入力する。入出力インターフェース４０７は、入力部４２を介して入力された信号を受け付ける。通信インターフェース４０８は、測定ユニット２と、搬送ユニット３と、ホストコンピュータ５とに接続されており、ＣＰＵ４０１は、通信インターフェース４０８を介して、これら装置との間で指示信号およびデータの送受信を行う。

【0031】

試料調製部２５では、体液中に含まれていることがある赤血球を溶血させ、白血球等の細胞の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、細胞（有核細胞）の核酸を染色するために、体液検体と試薬とが混合されて測定試料が調製される。具体的には、以下の第１試薬および第２試薬が体液検体に混合されて測定試料が調製される。

【0032】

第１試薬は、有核細胞の核酸を染色可能な蛍光色素を含有し、後述する第２試薬で処理された体液試料中の有核細胞の核酸を蛍光染色するための試薬である。血液試料を第１試薬で処理することにより、核酸を有する白血球等の細胞が染色される。

【0033】

蛍光色素は、核酸を染色できるのであれば本発明において特に限定されず、光源（半導体レーザＤ３１）から照射される光の波長に応じて適宜選択することができる。そのような蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス［［３‐［［４‐［［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］メチレン］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐１‐イル］プロピル］ジメチルアミニウム］・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−１）、４‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐２（３Ｈ）‐イリデン）メチル］‐１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］キノリニウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'‐テトラメチル‐Ｎ，Ｎ'‐ビス［３‐［４‐［３‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］‐２‐プロペニリデン］‐１，４‐ジヒドロキノリン‐１‐イル］プロピル］‐１，３‐プロパンジアミニウム・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−３）、または２‐［３‐［［１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐４‐イリデン］‐１‐プロペニル］‐３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−３）および以下の一般式（Ｉ）で表される蛍光色素が挙げられる。それらの中でも、以下の一般式（Ｉ）で表される蛍光色素が好ましい。

【0034】

【化1】

【0035】

式（Ｉ）中、Ｒ_１およびＲ_４は、互いに同一または異なっており、水素原子、アルキル基、ヒドロキシ基を有するアルキル鎖、エーテル基を有するアルキル鎖、エステル基を有するアルキル鎖、または置換基を有していてもよいベンジル基である。Ｒ_２およびＲ_３は、互いに同一または異なっており、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルスルホニル基またはフェニル基である。Ｚは、硫黄原子、酸素原子、またはメチル基を有する炭素原子であり、ｎは、０、１、２または３であり、Ｘ⁻はアニオンである。

【0036】

本実施形態では、アルキル基は直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。式（Ｉ）中、Ｒ_１およびＲ_４のいずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基である場合、他方は水素原子または炭素数６未満のアルキル基であることが好ましい。炭素数６〜１８のアルキル基の中でも、炭素数が６、８または１０のアルキル基が好ましい。

【0037】

式（Ｉ）中、Ｒ_１およびＲ_４のベンジル基の置換基として、例えば、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルケニル基または炭素数２〜２０のアルキニル基が挙げられる。それらの中でも、メチル基またはエチル基が特に好ましい。

【0038】

式（Ｉ）中、Ｒ_２およびＲ_３のアルケニル基として、例えば、炭素数２〜２０のアルケニル基が挙げられる。Ｒ_２およびＲ_３のアルコキシ基としては、炭素数１〜２０のアルコキシ基が挙げられる。それらの中でも、特にメトキシ基またはエトキシ基が好ましい。

【0039】

式（Ｉ）中、アニオンＸ⁻として、Ｆ⁻、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻およびＩ⁻のようなハロゲンイオン、ＣＦ_３ＳＯ_３⁻、ＢＦ_４⁻等が挙げられる。
第１試薬中の蛍光色素は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。

【0040】

第１試薬中の蛍光色素の濃度は、蛍光色素の種類に応じて適宜設定できるが、通常０．０１〜１００ｐｇ／μＬ、好ましくは、０．１〜１０ｐｇ／μＬである。例えば、第１試薬の蛍光色素として、式（Ｉ）で表される蛍光色素を用いる場合、第１試薬中の該蛍光色素の濃度は、好ましくは０．２〜０．６ｐｇ／μＬであり、より好ましくは０．３〜０．５ｐｇ／μＬである。

【0041】

第１試薬は、前述した蛍光色素を前記濃度になるように適切な溶媒に溶解させることにより得ることができる。溶媒としては、前述した蛍光色素を溶解させることができるものであれば特に限定されないが、例えば、水、有機溶媒およびこれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、例えば、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。蛍光色素は、水溶液中での保存安定性が悪い場合があるので、有機溶媒に溶解させることが好ましい。

【0042】

第１試薬として、市販されている白血球分類用の染色試薬を用いてもよい。そのような染色試薬としては、例えば、シスメックス株式会社製のフルオセル（登録商標） ＷＤＦが挙げられる。フルオセル ＷＤＦは、式（Ｉ）で示される蛍光色素を含む染色試薬である。

【0043】

第２試薬は、赤血球を溶血させ、細胞の細胞膜に前記第１試薬中の蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための界面活性剤、すなわち、カチオン性界面活性剤および／またはノニオン性界面活性剤を含有する。第２試薬は、２０ｍＭ以上５０ｍＭ以下の濃度で芳香族の有機酸を含有する。ここで、第２試薬は、芳香族の有機酸の濃度が２０ｍＭ以上３０ｍＭ未満の場合は、第２試薬のｐＨが５．５以上６．４以下であり、芳香族の有機酸の濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下の場合は、第２試薬のｐＨが５．５以上７．０以下であることを特徴とする。

【0044】

本実施形態では、第２試薬中の芳香族の有機酸の濃度が２０ｍＭ以上３０ｍＭ未満の場合、第２試薬のｐＨは５．５以上６．４以下が好ましく、５．５以上６．２以下がより好ましい。第２試薬中の芳香族の有機酸の濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下、好ましくは４０ｍＭ以上５０ｍＭ以下である場合、第２試薬のｐＨが５．５以上７．０以下である。さらに好ましくは、第２試薬中の芳香族の有機酸の濃度が４０ｍＭ以上５０ｍＭ以下である場合、第２試薬のｐＨが５．５以上６．２以下である。

【0045】

本実施形態では、芳香族の有機酸とは、分子中に少なくとも１つの芳香環を有する酸およびその塩を意味する。芳香族の有機酸としては、例えば、芳香族カルボン酸、芳香族スルホン酸等が挙げられる。本実施形態では、フタル酸、安息香酸、サリチル酸、馬尿酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびそれらの塩が好適に用いられる。第２試薬中の芳香族の有機酸は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。第２試薬中に芳香族の有機酸を２種類以上含む場合、それらの濃度の合計が２０ｍＭ以上５０ｍＭ以下であればよい。

【0046】

カチオン性界面活性剤として、第四級アンモニウム塩型界面活性剤、または、ピリジニウム塩型界面活性剤を用いることができる。

【0047】

第四級アンモニウム塩型界面活性剤としては、例えば以下の式（ＩＩ）で表される、全炭素数が９〜３０の界面活性剤が挙げられる。

【0048】

【化2】

【0049】

（ＩＩ）中、Ｒ_１は、炭素数６〜１８のアルキル基またはアルケニル基である。Ｒ_２およびＲ_３は、互いに同一または異なっており、炭素数１〜４のアルキル基またはアルケニル基である。Ｒ_４は、炭素数１〜４のアルキル基若しくはアルケニル基、またはベンジル基であり、Ｘ⁻はハロゲン原子である。

【0050】

式（ＩＩ）中、Ｒ_１としては、炭素数が６、８、１０、１２および１４のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ_１としては、オクチル基、デシル基およびドデシル基が挙げられる。Ｒ_２およびＲ_３としては、メチル基、エチル基およびプロピル基が好ましい。Ｒ_４としては、メチル基、エチル基およびプロピル基が好ましい。

【0051】

ピリジニウム塩型界面活性剤としては、例えば以下の式（ＩＩＩ）で表される界面活性剤が挙げられる。

【0052】

【化3】

【0053】

式（ＩＩＩ）中、Ｒ_１は、炭素数６〜１８のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｘ⁻はハロゲン原子である。

【0054】

式（ＩＩＩ）中、Ｒ_１としては、炭素数が６、８、１０、１２および１４のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ_１としてはオクチル基、デシル基およびドデシル基が挙げられる。

【0055】

第２試薬中のカチオン性界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類により適宜調節できるが、通常１０〜１００００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１０００ｐｐｍである。

【0056】

ノニオン性界面活性剤として、以下の式（ＶＩ）で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい。
Ｒ_１−Ｒ_２−(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｎ−Ｈ （ＶＩ）

【0057】

式（ＶＩ）中、Ｒ_１は炭素数８〜２５のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Ｒ_２は酸素原子、−ＣＯＯ−または

【0058】

【化4】

であり、ｎは１０〜５０の整数である。

【0059】

前記ノニオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル等が挙げられる。

【0060】

第２試薬中のノニオン性界面活性剤の濃度は、通常１０〜１０００００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１００００ｐｐｍ、より好ましくは１０００〜５０００ｐｐｍである。

【0061】

第２試薬は、ｐＨを一定に保つために緩衝剤を含んでいてもよい。そのような緩衝剤としては、例えばクエン酸塩、ＨＥＰＥＳおよびリン酸塩等が挙げられる。前記芳香族の有機酸が緩衝作用を示す場合がある。そのような芳香族の有機酸を用いる場合は、第２試薬への緩衝剤の添加は任意である。

【0062】

第２試薬の浸透圧は、本発明において特に限定されないが、赤血球を効率よく溶血させる観点から２０〜１５０ｍＯｓｍ／ｋｇであることが好ましい。

【0063】

第２試薬は、前記界面活性剤および芳香族の有機酸またはその塩と、所望により前記緩衝剤とを、前記芳香族の有機酸濃度になるように適切な溶媒に溶解し、ｐＨをＮａＯＨ、ＨＣｌ等を用いて調製することにより得ることができる。溶媒としては、前述した成分を溶解させることができれば、本発明において特に限定されないが、例えば水、有機溶媒およびそれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、例えばアルコール、メタノール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ等が挙げられる。

【0064】

第２試薬として、市販されている白血球分類用の溶血試薬を用いてもよい。そのような溶血試薬としては、例えばシスメックス株式会社製のライザセル（登録商標） ＷＤＦが挙げられる。ライザセル ＷＤＦは、前述したカチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤を含む溶血試薬である。

【0065】

前記のように構成された第２試薬により、赤血球が溶血され、細胞の細胞膜に第１試薬中の蛍光色素が通過できる程度の損傷が与えられる。前記のように構成された第１試薬により、第２試薬によって細胞膜に損傷を受けた細胞が染色される。

【0066】

〔細胞分析方法〕
次に、前述した構成を有する細胞分析装置を用いて体液検体中の腫瘍細胞を検出する方法について説明する。
本発明は、腫瘍細胞の種類と、それぞれの腫瘍細胞の分布図（スキャッタグラム）における分布領域との間に相関関係が存在するという知見に基づいている。本発明は、スキャッタグラムにおいて、異なる種類の腫瘍細胞がそれぞれ特異的に分布する領域を設定し、前記領域に属する細胞の数を計数し、計数された細胞数に基づいて体液中の腫瘍細胞を検出している。

【0067】

本実施形態では、腫瘍細胞には、細胞同士が凝集した凝集腫瘍細胞と、凝集していない非凝集腫瘍細胞とがあることに鑑み、これら凝集腫瘍細胞と非凝集腫瘍細胞とを異なる種類の腫瘍細胞としている。凝集腫瘍細胞と非凝集腫瘍細胞とは、スキャッタグラムにおいて、それぞれ或る特定の領域に特異的に分布する。

【0068】

凝集腫瘍細胞は、白血球、マクロファージおよび中皮細胞を含む有核細胞よりも大きく、スキャッタグラムの「凝集細胞検出領域」に特異的に分布する。したがって、凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数することで体液中の凝集腫瘍細胞を、体液中の他の細胞から識別して検出することができる。例えば、前方散乱光信号強度と前方散乱光信号幅とによるスキャッタグラムにおいて、非凝集粒子が分布する領域よりも前方散乱光信号幅が大きい領域を凝集細胞検出領域として設定することができる。

【0069】

一方、非凝集腫瘍細胞は、蛍光信号強度が白血球細胞の分布領域と中皮細胞の分布領域の間の領域に位置する、スキャッタグラムの「非凝集細胞検出領域」に特異的に分布する。したがって、非凝集細胞検出領域に属する細胞数を計数することで体液中の非凝集腫瘍細胞を、体液中の他の細胞から識別して検出することができる。例えば、蛍光信号強度と前方散乱光信号強度とによるスキャッタグラムにおいて、白血球細胞が分布する領域よりも蛍光信号強度が大きく且つ中皮細胞が分布する領域よりも蛍光信号強度が小さい領域を非凝集細胞検出領域として設定することができる。

【0070】

凝集細胞検出領域および非凝集細胞検出領域、さらにはマクロファージ等の有核細胞が、スキャッタグラムにおいて分布する領域は、例えば、次のようにして求めることができる。すなわち、細胞の塗抹標本を顕微鏡で目視にて観察することで、体液中における凝集腫瘍細胞やマクロファージ等の割合（％）を求める。ついで、前記割合の情報に基づいて、スキャッタグラムにおける或る領域に何が分布しているのかを特定する。例えば、体液中にマクロファージが３０％の割合で存在している場合、スキャッタグラムにおいて全体の３０％の個数がまとまって分布している領域を、マクロファージが分布していると推認する。この作業を複数の検体について行うことで、或る有核細胞がスキャッタグラム上においてどのあたりの領域に分布するのかを特定することができる。

【0071】

図５は、腫瘍細胞を含まない陰性検体のスキャッタグラムの例を示している。図５および後出する図６〜７において、（ａ）は縦軸を前方散乱光信号強度（ＦＳＣ）とし、横軸を前方散乱光信号幅（ＦＳＣＷ）とするスキャッタグラムであり、（ｂ）は縦軸を蛍光信号強度（ＳＦＬ）とし、横軸を前方散乱光信号強度（ＦＳＣ）とするスキャッタグラムである。
前記陰性検体における腫瘍細胞の割合は０．００％であり、中皮細胞の割合は２１．２１％である。なお、「％」は、白血球数に対する割合を示しており、中皮細胞の割合が２１．２１％とは、白血球１００個当たり中皮細胞が２１．２１個含まれていることを意味している。
前記陰性検体からは、凝集細胞検出領域および非凝集細胞検出領域のいずれにおいても腫瘍細胞が検出されない。

【0072】

図６は、凝集腫瘍細胞を含む検体のスキャッタグラムの例を示している。この検体における腫瘍細胞の割合は６６．２％であり、中皮細胞の割合は１３．１４％である。
この検体からは、図６の（ａ）において太い黒矢印で示される凝集細胞検出領域において凝集腫瘍細胞が検出されている。

【0073】

図７は、非凝集腫瘍細胞を含む検体のスキャッタグラムの例を示している。この検体における腫瘍細胞の割合は６６２．０％であり、中皮細胞の割合は８．００％である。
この検体からは、図７の（ｂ）において太い黒矢印で示される非凝集細胞検出領域において非凝集腫瘍細胞が検出されている。

【0074】

［第１実施形態］
図８は、第１実施形態に係る細胞分析方法における測定ユニット２および情報処理ユニット４による処理を示すフローチャートである。第１実施形態では、腫瘍細胞のうち、凝集腫瘍細胞を検出することができる。凝集腫瘍細胞は、白血球、マクロファージおよび中皮細胞を含む有核細胞よりも大きく、前方散乱光信号強度と前方散乱光信号幅とによるスキャッタグラムにおいて、非凝集粒子が分布する領域よりも前方散乱光信号幅が大きい領域（凝集細胞検出領域）に特異的に分布している。前記領域に特異的に分布することを利用して、腫瘍細胞のうち、凝集腫瘍細胞を検出する。

【0075】

まず、測定ユニット２は、ステップＳ１において、体液検体に含まれる赤血球を溶血させ、有核細胞の核酸を蛍光染色するために、測定試料の調製処理を行う。具体的には、前述したように、患者から採取された体液検体と、第１試薬と、第２試薬とが混合され、この混合液がヒータＨにより加温されることにより、測定試料が調製される。

【0076】

ついで、測定ユニット２は、ステップＳ２において、ステップＳ１において調製された測定試料に基づいて細胞の検出処理を行う。具体的には、前述したように、光学検出器Ｄにより、各細胞に関する前方散乱光尊号と、側方散乱光信号と、蛍光信号とが取得される。
測定ユニット２により取得された信号は、ステップＳ３において、情報処理ユニット４に送信される。

【0077】

情報処理ユニット４のＣＰＵ４０１は、ステップＳ１１において、測定ユニット２から、各細胞に関する前方散乱光尊号と、側方散乱光信号と、蛍光信号とを受信して、受信した信号をハードディスク４０４に記憶させる。
ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ１２において、受信した信号に基づいて第１スキャッタグラムを作成する。第１スキャッタグラムは、前方散乱光信号の強度（ＦＳＣ）を縦軸とし、前方散乱光信号の幅（ＦＳＣＷ）を横軸とするスキャッタグラムである。

【0078】

図９は、作成された第１スキャッタグラムの模式図である。凝集腫瘍細胞は、白血球、マクロファージおよび中皮細胞を含む有核細胞よりも大きいので、前述したように、白血球細胞等の非凝集粒子が分布する領域（非凝集細胞検出領域）よりも前方散乱光信号強度および前方散乱光信号幅が大きい領域（凝集細胞検出領域）に特異的に分布している。なお、前方散乱光信号強度が所定の値以上であり、スキャッタグラムからスケールアウトする大きな粒子は、スキャッタグラム上の最も高強度の位置に表示されている。

【0079】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ１３において、凝集細胞検出領域に分布する細胞の数Ｃ１を計数する。
ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ１４において、ステップＳ１３で計数された細胞の数Ｃ１が所定値Ｔ１以上であるか否かの判定を行う。細胞の数Ｃ１が所定値Ｔ１以上であると判定される（ＹＥＳ）と、ステップＳ１５に進み、ＣＰＵ４０１は、ＲＡＭ４０３またはハードディスク４０４に記憶されている判定フラグの値に１をセットする。一方、細胞の数Ｃ１が所定値Ｔ１未満であると判定される（ＮＯ）と、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ１６に処理を進める。

【0080】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ１６において、出力部４１に分析結果画面を表示する。この分析結果画面には、例えば検体番号、リサーチ項目、作成された第１スキャッタグラム、後述する警告等を表示させることができる。

【0081】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ１６において、判定フラグの値が１であるか否かの判断を行う。判定フラグの値が１であると判断される（ＹＥＳ）と、ステップＳ１８に進み、ステップＳ１８において、ＣＰＵ４０１は、測定した体液検体には凝集腫瘍細胞が含まれている可能性がある旨の警告を出力部４１の分析結果画面に表示させる。一方、判定フラグの値が１でないと判断される（ＮＯ）と、処理は終了する。

【0082】

［第２実施形態］
図１０は、第２実施形態に係る細胞分析方法における測定ユニット２および情報処理ユニット４による処理を示すフローチャートである。第２実施形態では、腫瘍細胞のうち、非凝集腫瘍細胞を検出することができる。非凝集腫瘍細胞は、蛍光信号強度と前方散乱光信号強度とによるスキャッタグラムにおいて、単核白血球細胞および中皮細胞の出現する領域にまたがって出現する。しかしながら、単核白血球細胞が分布する領域よりも蛍光信号強度が大きく且つ中皮細胞が分布する領域よりも蛍光信号強度が小さい領域（非凝集細胞検出領域）において特異的に分布している。前記領域に特異的に分布することを利用して、腫瘍細胞のうち、非凝集腫瘍細胞を検出する。この方法では、非凝集腫瘍細胞が単核白血球細胞および中皮細胞の出現領域のみに出現した場合には検出することができない。しかし、非凝集腫瘍細胞は非凝集細胞検出領域を中心として単核白血球細胞および中皮細胞の出現する領域にまたがって出現するため、非凝集細胞検出領域における細胞の出現数を計数することにより、体液検体中の非凝集腫瘍細胞の出現を高い特異度で検出することができる。

【0083】

測定ユニット２における測定試料の調製処理（ステップＳ１）、細胞の検出処理（ステップＳ２）、および取得信号の情報処理ユニット４への送信（ステップＳ３）は、第１実施形態におけるステップＳ１からステップＳ３までと同じである。したがって、簡単のため、これらについての説明は省略する。

【0084】

情報処理ユニット４のＣＰＵ４０１は、ステップＳ２１において、測定ユニット２から、各細胞に関する前方散乱光信号と、側方散乱光信号と、蛍光信号とを受信して、受信した信号をハードディスク４０４に記憶させる。

【0085】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ２２において、受信した信号に基づいて第２スキャッタグラムを作成する。第２スキャッタグラムは、蛍光信号の強度（ＳＦＬ）を縦軸とし、前方散乱光信号の強度（ＦＳＣ）を横軸とするスキャッタグラムである。

【0086】

図１１は、作成された第２スキャッタグラムの模式図である。非凝集腫瘍細胞は、蛍光信号の強度（ＳＦＬ）を縦軸とし、前方散乱光信号の強度（ＦＳＣ）を横軸とするスキャッタグラムにおいて、白血球細胞が分布する領域よりも蛍光信号強度が大きく且つ中皮細胞が分布する領域よりも蛍光信号強度が小さい領域（非凝集細胞検出領域）に特異的に分布している。

【0087】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ２３において、非凝集細胞検出領域に分布する細胞の数Ｃ２を計数する。前記のような非凝集細胞検出領域を設定することにより、検出した蛍光信号等の光情報により作成された第２スキャッタグラムに基づいて、図１１に示されるように、少なくとも白血球、マクロファージおよび中皮細胞から、非凝集腫瘍細胞を分離して計数することができる。
ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ２４において、ステップＳ２３で計数された細胞の数Ｃ２が所定値Ｔ２以上であるか否かの判定を行う。細胞の数Ｃ２が所定値Ｔ２以上であると判定される（ＹＥＳ）と、ステップＳ２５に進み、ＣＰＵ４０１は、ＲＡＭ４０３またはハードディスク４０４に記憶されている判定フラグの値に１をセットする。一方、細胞の数Ｃ２が所定値Ｔ２未満であると判定される（ＮＯ）と、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ２６に処理を進める。

【0088】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ２６において、出力部４１に分析結果画面を表示する。この分析結果画面には、例えば検体番号、リサーチ項目、作成された第２スキャッタグラム、後述する警告等を表示させることができる。

【0089】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ２６において、判定フラグの値が１であるか否かの判断を行う。判定フラグの値が１であると判断される（ＹＥＳ）と、ステップＳ２８に進み、ステップＳ２８において、ＣＰＵ４０１は、測定した体液検体には凝集腫瘍細胞が含まれている可能性がある旨の警告を出力部４１の分析結果画面に表示させる。一方、判定フラグの値が１でないと判断される（ＮＯ）と、処理は終了する。

【0090】

［第３実施形態］
図１２は、第３実施形態に係る細胞分析方法における測定ユニット２および情報処理ユニット４による処理を示すフローチャートである。第３実施形態では、腫瘍細胞のうち、凝集腫瘍細胞および非凝集腫瘍細胞のそれぞれを個別に検出することができる。すなわち、第１実施形態と同様にして凝集腫瘍細胞の検出を行い、第２実施形態と同様にして非凝集腫瘍細胞の検出を行う。このため、第３実施形態に係る細胞分析方法は、第１実施形態または第２実施形態に係る細胞分析方法よりも腫瘍細胞の検出精度を向上させることができる。また、凝集腫瘍細胞および非凝集腫瘍細胞の両方が所定数以上検出された場合を確度の高い警告（高）とし、いずれか一方の腫瘍細胞が所定数以上検出された場合をやや確度の低い警告（低）とする等、分析の信頼度に応じて警告の内容を変えてもよい。

【0091】

測定ユニット２における測定試料の調製処理（ステップＳ１）、細胞の検出処理（ステップＳ２）、および取得信号の情報処理ユニット４への送信（ステップＳ３）は、第１実施形態または第２実施形態におけるステップＳ１からステップＳ３までと同じである。したがって、簡単のため、これらについての説明は省略する。

【0092】

情報処理ユニット４のＣＰＵ４０１は、ステップＳ３１において、測定ユニット２から、各細胞に関する前方散乱光尊号と、側方散乱光信号と、蛍光信号とを受信して、受信した信号をハードディスク４０４に記憶させる。

【0093】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ３２において、受信した信号に基づいて第１スキャッタグラムを作成する。第１スキャッタグラムは、前方散乱光信号の強度（ＦＳＣ）を縦軸とし、前方散乱光信号の幅（ＦＳＣＷ）を横軸とするスキャッタグラムである（図９参照）。

【0094】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ３３において、凝集細胞検出領域に分布する細胞の数Ｃ１を計数する。
ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ３４において、ステップＳ３３で計数された細胞の数Ｃ１が所定値Ｔ１以上であるか否かの判定を行う。細胞の数Ｃ１が所定値Ｔ１以上であると判定される（ＹＥＳ）と、ステップＳ３５に進み、ＣＰＵ４０１は、ＲＡＭ４０３またはハードディスク４０４に記憶されている判定フラグの値に１をセットする。一方、細胞の数Ｃ１が所定値Ｔ１未満であると判定される（ＮＯ）と、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ３６に処理を進める。

【0095】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ３６において、受信した信号に基づいて第２スキャッタグラムを作成する。第２スキャッタグラムは、蛍光信号の強度（ＳＦＬ）を縦軸とし、前方散乱光信号の強度（ＦＳＣ）を横軸とするスキャッタグラムである（図１１参照）。

【0096】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ３７において、非凝集細胞検出領域に分布する細胞の数Ｃ２を計数する。
ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ３８において、ステップＳ３７で計数された細胞の数Ｃ２が所定値Ｔ２以上であるか否かの判定を行う。細胞の数Ｃ２が所定値Ｔ２以上であると判定される（ＹＥＳ）と、ステップＳ３９に進み、ステップＳ３９において、判定フラグが１であるか否かの判断を行う。判定フラグが１であると判断される（ＹＥＳ）と、ステップＳ４０に進み、ステップＳ４０において、ＣＰＵ４０１は、ＲＡＭ４０３またはハードディスク４０４に記憶されている判定フラグの値に２をセットする。一方、判定フラグが１ではないと判断される（ＮＯ）と、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ４１に処理を進める。

【0097】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ４１において、出力部４１に分析結果画面を表示する。この分析結果画面には、例えば検体番号、リサーチ項目、作成された第１スキャッタグラムおよび第２スキャッタグラム、後述する警告（高）または警告（低）等を表示させることができる。

【0098】

ついで、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ４２において、判定フラグの値が２であるか否かの判断を行う。判定フラグの値が２であると判断される（ＹＥＳ）と、ステップＳ４３に進み、ステップＳ４３において、ＣＰＵ４０１は、測定した体液検体には凝集腫瘍細胞が含まれている可能性が大である旨の警告（高）を出力部４１の分析結果画面に表示させる。一方、判定フラグの値が２でないと判断される（ＮＯ）と、ＣＰＵ４０１は、ステップＳ４４に処理を進め、ステップＳ４４において、判定フラグの値が１であるか否かの判断を行う。ステップＳ４４において判定フラグの値が１であると判断される（ＹＥＳ）と、ステップＳ４５に進み、ステップＳ４５において、ＣＰＵ４０１は、測定した体液検体には凝集腫瘍細胞が含まれている可能性がある旨の警告（低）を出力部４１の分析結果画面に表示させる。一方、判定フラグの値が１でないと判断される（ＮＯ）と、処理は終了する。

【0099】

本実施形態では、第１スキャッタグラムを作成し、この第１スキャッタグラムの凝集細胞検出領域中の細胞数Ｃ１を計数した後に、第２スキャッタグラムを作成し、この第２スキャッタグラムの非凝集細胞検出領域中の細胞数Ｃ２を計数して、体液中の腫瘍細胞を検出しているが、第２スキャッタグラムを作成し、この第２スキャッタグラムの非凝集細胞検出領域中の細胞数Ｃ２を計数した後に、第１スキャッタグラムを作成し、この第１スキャッタグラムの凝集細胞検出領域中の細胞数Ｃ１を計数して、体液中の腫瘍細胞を検出することもできる。
また、本実施形態では、２種類の警告を発するようにしているが、１種類の警告とすることもできる。すなわち、計数された凝集腫瘍細胞および非凝集腫瘍細胞の数の少なくとも一方が所定値以上である場合に警告を発するようにしてもよい。この場合でも、凝集腫瘍細胞および非凝集腫瘍細胞のいずれか一方のみの判定により腫瘍細胞の有無の警告を行う場合と比較して、体液検体中の腫瘍細胞の有無をより正確に検出できる。

【0100】

〔実施例〕
次に本発明の細胞分析方法の実施例を説明するが、本発明は、もとよりかかる実施例にのみ限定されるものではない。
［実施例１］
２２０の検体について、第１実施形態に係る細胞分析方法に従って、腫瘍細胞の検出を行った。検体の種類は、脳髄液、胸水であり、凝集することが考えられる腺癌を対象とした。第１試薬としてフルオセル ＷＤＦを用い、第２試薬としてライザセル ＷＤＦを用いた。目視法との比較結果を表１に示す。表１において、「１」は陽性判定（凝集腫瘍細胞あり）、「０」は陰性判定（凝集腫瘍細胞なし）を示している。

【0101】

【表1】

【0102】

実施例１における感度は７２．２％であり、特異度は９８．０％であった。陽性的中率（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ、ＰＰＶ）は７６．５％であり、陰性的中率（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ、ＮＰＶ）は９８．６％であった。

【0103】

［実施例２］
２０９の検体について、第２実施形態に係る細胞分析方法に従って、腫瘍細胞の検出を行った。検体の種類は、脳髄液、胸水であり、腺癌以外の腫瘍を対象とした。第１試薬としてフルオセル ＷＤＦを用い、第２試薬としてライザセル ＷＤＦを用いた。目視法との比較結果を表２に示す。

【0104】

【表2】

【0105】

実施例２における感度は３７．５％であり、特異度は９５．０％であった。陽性的中率ＰＰＶは２３．１％であり、陰性的中率ＮＰＶは９７．４％であった。

【0106】

［実施例３］
２２０の検体について、第３実施形態に係る細胞分析方法に従って、腫瘍細胞の検出を行った。検体の種類は、脳髄液、胸水であり、第１試薬としてフルオセル ＷＤＦを用い、第２試薬としてライザセル ＷＤＦを用いた。目視法との比較結果を表２に示す。凝集腫瘍細胞および非凝集腫瘍細胞の少なくとも一方が所定数以上検出された場合を陽性判定とした。

【0107】

【表3】

【0108】

実施例３における感度は７２．２％であり、特異度は９８．０％であった。陽性的中率ＰＰＶは７６．５％であり、陰性的中率ＮＰＶは９７．５％であった。

【0109】

〔その他の変形例〕
本発明は前述した実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内において種々の変更が可能である。

【符号の説明】

【0110】

１ ：細胞分析装置
２ ：測定ユニット
３ ：搬送ユニット
４ ：情報処理ユニット
５ ：ホストコンピュータ
２１ ：ハンド部
２２ ：検体容器セット部
２３ ：バーコードユニット
２４ ：検体吸引部
２４ａ：ピアサ
２５ ：試料調製部
２６ ：検出部
４０ ：本体
４１ ：出力部
４２ ：入力部
２５１ ：試薬容器（第１試薬）
２５２ ：試薬容器（第２試薬）
２５３ ：試薬容器（シース液）
４０１ ：ＣＰＵ
４０２ ：ＲＯＭ
４０３ ：ＲＡＭ
４０４ ：ハードディスク
４０４ａ：プログラム
４０５ ：読取装置
４０５ａ：記録媒体
４０６ ：画像出力インターフェース
４０７ ：入出力インターフェース
４０８ ：通信シンターフェース
Ｄ ：光学検出器
Ｄ１：フローセル
Ｄ２：シースフロー系
Ｄ３：ビームスポット形成系
Ｄ４：前方散乱光受光系
Ｄ５：側方散乱光受光系
Ｄ６：蛍光受光系
Ｈ ；ヒータ
Ｌ ：サンプルラック
Ｔ ：検体容器

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】