特開 2017-57158 神経突起形成促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-57158(P2017-57158A)

(43)【公開日】2017年3月23日

(54)【発明の名称】神経突起形成促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/351 20060101AFI20170303BHJP

   A61K 31/202 20060101ALI20170303BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20170303BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170303BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/351

   A61K31/202

   A61P25/28

   A61P25/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2015-182658(P2015-182658)

(22)【出願日】2015年9月16日

(71)【出願人】

【識別番号】390015004

【氏名又は名称】日本澱粉工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100080609

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 正孝

(74)【代理人】

【識別番号】100109287

【弁理士】

【氏名又は名称】白石 泰三

(72)【発明者】

【氏名】吉永 一浩

【テーマコード（参考）】

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA07

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA16

4C206AA01

4C206AA02

4C206DA05

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA13

4C206MA72

4C206NA14

4C206ZA01

4C206ZA16

(57)【要約】

【課題】１，５−ＡＧのアルツハイマーや認知症の改善作用あるいはその改善に有効である神経突起形成促進作用。
【解決手段】本発明は、第１に、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含有することを特徴とする神経突起形成促進剤であり、
第２に、医薬品または食品もしくは飼料の補助剤である神経突起形成促進剤を製造するために、当該神経突起形成促進剤に神経突起形成促進活性物質として含有させるための、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの使用である。
本発明によれば、アルツハイマーや認知症の改善に有効な神経突起促進作用を有する１，５−ＡＧを含有する医薬品、食品、飼料が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含有することを特徴とする神経突起形成促進剤。

【請求項2】

ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸またはリノレン酸をさらに含有する請求項１に記載の神経突起形成促進剤。

【請求項3】

アルツハイマー病または認知症のための請求項１または２に記載の神経突起形成促進剤。

【請求項4】

医薬品または食品もしくは飼料の補助剤である請求項１〜３のいずれかに記載の神経突起形成促進剤。

【請求項5】

医薬品または食品もしくは飼料の補助剤である神経突起形成促進剤を製造するために、当該神経突起形成促進剤に神経突起形成促進活性物質として含有させるための、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経突起形成促進剤に関する。さらに詳しくは、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含有する神経突起促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）はさまざまな動植物例えば哺乳類や食品中に微量ではあるが見いだされる物質である。その量はごく微量ではあるが牛乳では１ｍｌあたり０．６μｇ、大豆では１ｇあたり２２μｇ、魚や肉などには１μｇ／ｇ以下で含まれると報告されている（非特許文献１）。また、１，５−ＡＧは１，５−アンヒドロフルクトース（１，５−ＡＦ）を還元することで調製できる。近年になって澱粉から１，５−ＡＦを工業的に生産する方法が開発され、商品として販売されている。また、１，５−ＡＦに微生物を作用させること（特許文献１）や化学的に水素を添加（非特許文献２）させることにより１，５−ＡＧが合成できること、また、結晶化させ高純度の１，５−ＡＧを調製する方法も提案されている（特許文献２）。１，５−ＡＧの生体内での真の機能についてはまだ解明されていないが、膵臓細胞を用いた試験系（非特許文献３）で１，５−ＡＧがインスリン分泌を促進することが見いだされている。さらに２型糖尿病モデルマウスを用いた試験系では１，５−ＡＧが抗炎症作用を示し糖尿病患者に有効な糖である可能性が見出されている（非特許文献４）。さらに、２型糖尿病モデルを用いた試験では抗糖尿病作用も報告されている（非特許文献５）。このように１，５−ＡＧはヒトに対しても重要な物質であり生理機能が期待される物質である。

【0003】

ヒトの血液中には１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）が存在する。正常なヒトの血液中には１４〜４０μｇ／ｍｌ程度の１，５−ＡＧが含まれ、その量は一定に保たれているが、糖尿病などで血中グルコース量が高くなると、血中の１，５−ＡＧ量が下がる。この血中１，５−ＡＧ量は直近の血糖値の推移を反映することから、血中グルコース量のように血中１，５−ＡＧ量も臨床の場では血糖コントロールの指標に用いられる場合もある（非特許文献６）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００９−２１５２３１号公報

【特許文献2】特開２００８−５４５３１号公報

【特許文献3】特開２０１１−３７８０６号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】リアーゼによるグリコーゲン分解と１，５−アンヒドログルシトール．生化学 ６９（１９９７）１３６１−１３７２

【非特許文献2】１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ；ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｈｉｒａｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７（２００２）８７３−８９０

【非特許文献3】１，５−ａｎｈｙｄｏｒｏｇｌｕｃｉｔｏｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６２３（２００３）ｐ８２−８７

【非特許文献4】１，５−ａｎｈｙｄｒｏｇｌｕｃｉｔｏｌ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３（２０１０）１０５−１１９

【非特許文献5】Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ １，５−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ ａｓ ａ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｊ Ａｒｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２３（２０１３）６１１−７

【非特許文献6】１，５−アンヒドログルシトール 検査と技術 １９（１０）８６１−８６３，１９９１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、１，５−ＡＧがアルツハイマーや認知症の改善作用を有することあるいはその改善に有効である神経突起形成促進作用を有することは未だ知られていない。
本発明者らは、１，５−ＡＧの生理活性作用について鋭意研究しているところ、この度、１，５−ＡＧが優れた神経突起形成促進作用を有することを究明して、本発明に到達したものである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

それ故、本発明は、第１に、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含有することを特徴とする神経突起形成促進剤である。
また、本発明は、第２に、医薬品または食品もしくは飼料の補助剤である神経突起形成促進剤を製造するために、当該神経突起形成促進剤に神経突起形成促進活性物質として含有させるための、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールの使用である。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、アルツハイマーや認知症の改善に有効な神経突起促進作用を有する１，５−ＡＧを含有する医薬品、食品、飼料が提供される。また、当該神経突起形成促進作用は１，５−ＡＧとともにドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸またはリノレン酸を併用することにより、顕著に改善することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】１，５−ＡＧおよび／またはＤＨＡのラット褐色腫由来細胞（ＰＣ１２細胞）についての神経突起伸長への影響または効果を示す図である。

【図2】１，５−ＡＧ経口投与によるラット血中１，５−ＡＧ量の変化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

１，５−ＡＧは微量であるが、多くの植物や動物などに存在することから、様々な食品に含まれている。食品からの１，５−ＡＧの摂取量は成人で一日あたり５−１０ｍｇ（血中１，５−アンヒドログルシトール値の変化に対する臨床研究、臨床検査 ３８（１９９４）４８５−４８８、）であると考えられ、ヒトの血液中の１，５−ＡＧには食品から摂取したものも含まれると推測される。一方で、ラット肝細胞質画分の６０％硫安沈殿画分をα−１，４−グルカンに作用させることで１，５−ＡＧの前駆体である１，５−ＡＦが生成すること（非特許文献１）から、ヒトの体内の１，５−ＡＧは、食品として摂取したもの以外に、生体内でグリコーゲンから合成されるものも存在すると推測される。ラットに放射能ラベルした１，５−ＡＧを投与し放射活性を測定した研究が報告されている。１，５−ＡＧ投与後に放射活性は肝臓、腎臓、筋肉、血漿にほぼ同濃度で分布していること（非特許文献１）から、経口摂取した１，５−ＡＧはさまざまな組織に移行すると考えられる。本発明者らの実験でラットに１，５−ＡＧを水に溶解し１，５−ＡＧとして５ｇ／ｋｇで経口投与した場合、投与前の血中１，５−ＡＧ量は１ｍｇ／ｄｌ以下であったのに対して、２時間後の血中１，５−ＡＧ濃度は１８３ｍｇ／ｄｌと投与前の２００倍以上に一過的に高まった。この結果より経口摂取した１，５−ＡＧが血中に移行することが分かった。

【0011】

ヒトは通常、上記のとおり、一日あたり食品から５−１０ｍｇの１，５−ＡＧを摂取していると推測されている。本発明者らの実験によれば、６名の志願者に２０ｇの１，５−ＡＧを水に溶解したもの（通常の摂取量の２０００倍量程度）全量を摂取してもらい、１週間後の血中１，５−ＡＧを測定したところ（この試験はヘルシンキ宣言に則り、倫理委員会の審査を受け、承認された後に実施した）、投与前は６名の平均値が２８μｇ／ｍｌ程度であったのに対して、投与後は３８μｇ／ｍｌと有意に高く、１，５−ＡＧの摂取から１週間経過しても過剰摂取した１，５−ＡＧの一部は体内に残っていることが推測された。これらのラットとヒトによる試験の結果は、過剰摂取した１，５−ＡＧはそのほとんどがすぐに体外に排出されるが、必要な１，５−ＡＧは体内に残留すると考えられるというものであった。従って、１，５−ＡＧを経口摂取することで体内に必要な１，５−ＡＧ量を増やすことができることが明らかになった。

【0012】

１，５−ＡＧは血中のグルコース濃度が高くなると、尿細管での再吸収がグルコースと競合するので、再吸収が抑制され１，５−ＡＧが尿に排泄され、結果として血中１，５−ＡＧ量が下がる（１，５−アンヒドログルシトール、検査と技術 １９（１９９１）８６１−８６３）ことになる。しかしながら、血糖値に関係なく血中１，５−ＡＧ量が下がる場合がある。例えば、妊婦では胎児に母体の１，５−ＡＧが移行するために母体の１，５−ＡＧ濃度が下がると推測されているが（正常および軽度耐糖能異常妊婦における１，５−ａｎｈｙｄｒｏｇｌｕｃｉｔｏｌ（ＡＧ）低値の意義、産婦人科の世界 ４４（１９９２）７７−８２）、その詳細な研究は進んでいない。また、正常なヒトでも血中の１，５−ＡＧ量はヒトによってばらつきがある。１，５−ＡＧの体内分布や放射ラベルした１，５−ＡＧの放射活性の分布の試験結果から考えると血中１，５−ＡＧの低い人は、脳組織などの１，５−ＡＧ量も低いと考えられる。本発明者らの実施したＰＣ１２細胞を用いた１，５−ＡＧの神経突起形成促進作用の試験では培地中の１，５−ＡＧ濃度を０、１．６、８、４０、２００、１０００μｇ／ｍｌとした結果、４０や２００μｇ／ｍｌの際に最も強く神経突起形成促進作用を示し、それらより低くても、高くてもその効果は低くなった。４０μｇ／ｍｌは正常な人の中で高い方の１，５−ＡＧ血中濃度と一致することから１，５−ＡＧの血中１，５−ＡＧ量の最適量があるのかもしれない。

【0013】

先に記載のとおり、ヒトは１日に５−１０ｍｇの１，５−ＡＧを食品から摂取していると考えられる。一方、最近、１，５−ＡＧの有効な製造技術が開発され、食品素材や機能性素材として利用することができるようになった。１，５−ＡＧは甘味を示す素材であることから１日あたり最大で５０ｇ程度を摂取することが可能である。体内１，５−ＡＧ量を増やす方法としては通常の１，５−ＡＧの摂取量の５倍、１，５−ＡＧとしては最低でも５０ｍｇ以上を摂取することが望ましいと考えられる。

【0014】

さて、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やリノレン酸はω３の位置に不飽和結合を有する脂肪酸であり、リノレン酸やＥＰＡはヒトの体内でＤＨＡに変換されることから（人間科学研究、文教大学人間科学部 第３０号 ２００８年）、これらはＤＨＡの前駆体として摂取することができる。魚油などに含まれる不飽和脂肪酸の１種であるＥＰＡやリノレン酸は脳内にほとんど存在しないが、ＤＨＡは脳や神経に多く存在している。またＤＨＡの経口投与で認知症やアツルハイマーの改善効果があると報告されている（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｍｅｄｉｃａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．３０４（２０１０）１９０３−１９１１）。このような機能を期待しＤＨＡは乳児用の調整粉乳に添加されたり、健康食品の素材として利用されたりしている。

【0015】

上記した内容から推測しヒトが１，５−ＡＧを経口摂取した場合には脳幹を通過し、脳内にも到達すると考えられる。そこで、本発明者らは１，５−ＡＧの脳への機能を調べる目的で神経関係の動物細胞試験によく利用されるラット褐色腫由来細胞（ＰＣ１２細胞）を用いて１，５−ＡＧの神経細胞の突起の形成を調べた。ＰＣ１２細胞の培養には牛血清を用いた。本発明者らの研究で牛の血中１，５−ＡＧ量はヒトと比較して極端に少なく１μｇ／ｍｌ以下である。従って、牛血清を用いて試験すれば血清中の１，５−ＡＧ濃度を１μｇ／以下から、ヒトの正常値、１４から４０μｇ／ｍｌ、さらには４０μｇ／以上に設定した試験が可能である。

【0016】

ＤＨＡは神経発達に関係することが報告されていることから１，５−ＡＧとＤＨＡを同時に添加した場合の相乗効果についても調べた。その結果、１，５−ＡＧに神経突起形成の促進作用を見出し、さらにＤＨＡと併用した場合に高い相乗効果が認められた。神経突起の形成促進作用を活かせばアルツハイマーや認知症の予防や改善効果が期待される。この用途としてはカプセル状の機能性食品や食品、さらには医薬品などに利用できる。さらには動物での効果も期待できる。豚、牛、鳥などの家畜飼料、また、犬や猫を代表とするペットフードなどがある。
また、ＤＨＡは脳の組織に分布していることからＤＨＡと１，５−ＡＧを併用しなくとも１，５−ＡＧのみの摂取で、神経突起の形成促進効果が得られることも期待できる。特に、血中１，５−ＡＧ量が低い、血中濃度が２０μｇ／ｍｌ以下の人に１，５−ＡＧ摂取は有効である。

【0017】

平成１７年および平成１８年の厚生労働省が実施した国民健康・栄養調査では日本人のＤＨＡの摂取量は全年齢平均で０．２６ｇ／日となっている。一方で複数の試験などの結果を総合して日本人のＤＨＡの推奨摂取量は１ｇ／日となっており、一日あたり０．７４ｇが不足している計算となる。これに対してＤＨＡ摂取で推奨しているサプリメントなどの健康食品では１日あたり０．３〜０．４ｇ程度を摂取できる商品が多く販売されている。
上記のとおり、１，５−ＡＧは植物や動物などに微量に含まれていることから、様々な食品に１，５−ＡＧが含まれていると考えられるので、食品からの１，５−ＡＧの摂取量は成人で一日あたり５−１０ｍｇであると考えられ、一方で最近、１，５−ＡＧの有効な製造技術が開発され、食品素材や機能性素材として利用することができるようになった。また、１，５−ＡＧは甘味を示す素材であることから１日あたり最大で５０ｇ程度を摂取することが可能である。

【0018】

血中１，５−ＡＧ量を増やす方法として１，５−ＡＧを最低でも１日あたり５０ｍｇ以上を摂取することが望ましい。ＤＨＡの一般の加工食品からの摂取量を０．１ｇから１ｇとし、１，５−ＡＧは５０ｍｇから１００ｇとする。１，５−ＡＧが１００ｇを超えると１，５−ＡＧを溶解する水も摂取しなくてはならず、例えば、１０％溶液で摂取した場合には一日あたり１Ｌとなる。従って１，５−ＡＧの摂取量の上限は１００ｇ程度となる。この範囲で１，５−ＡＧとＤＨＡの比率を自由に設計することができる。ＤＨＡ／１，５−ＡＧの比率は０．００１〜２０の範囲となる。

【実施例】

【0019】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に且つ詳細に説明する。

【0020】

実施例１
神経突起形成促進作用
・試薬
本試験に用いた１，５−ＡＧは日本澱粉工業株式会社にて１，５−アンヒドロフルクトースを酵母で還元し、精製し結晶化させた標品であり、高速液体クロマトグラフィーでその純度は１００％を示したものである。結晶１，５−ＡＧを水に溶解し４０ｍｇ／Ｍｌとした。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）はＳｉｇｍａ社製（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ２５３４）を用いた。
・動物細胞
ラット褐色腫由来細胞（ＰＣ１２細胞、理研細胞バンク、ＲＣＢ０００９，Ｌｏｔ Ｎｏ．５１）
・培地
増殖培地：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ウマ血清（ＨＳ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＥＭＥＭ培地）
試験培地：０．１％ ＦＢＳ、０．１％ ＨＳ、１ｎｇ／ｍＬ 神経成長因子（ＮＧＦ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ添加ＤＭＥＭ培地

【0021】

・方法
１）ＰＣ１２の継代培養
ＰＣ１２細胞は、増殖培地を用いて、Ｔ−７５フラスコに起眠し、ＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃、湿潤）で培養した。培地交換は２日おきに行い、８０％コンフルエントに達した時点で細胞を回収し、継代数２の細胞を本試験に用いた。具体的には、細胞をＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎを用いて細胞を剥離し、増殖培地を加えてトリプシンを中和した。次に、遠心（１８０ｇ，５分）して上清を除き、増殖培地を加えて細胞を撹拌し、血球計算盤を用いて細胞数をカウントし、増殖培地を用いて目的濃度（２．０ｘ１０^３個／１００μＬ）に調整した。
２）サンプル調整
陰性対照、１，５−ＡＧ（４０μｇ／ｍＬ）、ＤＨＡ（２５μＭ）、１，５−ＡＧ（４０μｇ／ｍＬ）＋ＤＨＡ（２５μＭ）の４試験群で試験を行った。具体的には、まず、１，５−ＡＧに関しては、４０ｍｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ水溶液を試験培地に１／１０００量添加して終濃度４０μｇ／ｍＬとし、フィルター滅菌して試験に用いた。次に、ＤＨＡに関しては、５００ｍＭエタノール溶液を作成し、これを試験培地で１／１００、１／２００と順次希釈して終濃度２５μＭとし、フィルター滅菌して試験に用いた。１，５−ＡＧ＋ＤＨＡに関しては、上記で作成した２５μＭ ＤＨＡ含有試験培地に４０ｍｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ水溶液を１／１０００量添加し、フィルター滅菌して試験に用いた。陰性対照として水を培地に１／１０００量添加し、フィルター滅菌して試験に用いた。なお、ＤＨＡ添加区でのエタノール終濃度は０．００５％と非常に低濃度であるため、溶媒対照区は設定しなかった。
３）本試験細胞培養およびサンプル処理
増殖培地を用いて、ＰＣ１２細胞を２．０ｘ１０^３個／１００μＬ／ウェルとなるよう調整し、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに播種してＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃、湿潤）内で２４時間培養した。培養後、サンプル含有試験培地（１００μＬ）に交換し、ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した。培養終了時に位相差顕微鏡で、各ウェル１枚ずつ細胞像を撮影し、神経突起伸長量を測定した。細胞体と同程度以上の神経突起伸長を示した細胞を、神経突起有りと判定した。各ｎ＝１５で実施した。

【0022】

１．結果
１）ＤＨＡ濃度の決定
ＰＣ１２細胞（Ｌｏｔ．５１）の生存性と神経突起伸長性に対するＤＨＡ濃度の影響を解析した。具体的にはＤＨＡ濃度を６．２５、１２．５、２５、５０、１００μＭの５濃度とし、無添加区との間で、細胞生存率（ｗｓｔ−８法）および神経突起伸長率を比較した。各ｎ＝３で行った。サンプル処理時間は４８時間で行った。その結果、ＤＨＡ濃度が５０μＭ以上の場合は細胞死が観察された（表−１）。２５μＭの場合には生細胞数の低下が見られず、神経突起伸長率も有意に増加した（表−２）。そこで、ＤＨＡ濃度が２５μＭとして本試験を行うこととした。
２）１，５−ＡＧ濃度の決定
ＰＣ１２細胞の神経突起伸長性に対する１，５−ＡＧ濃度の影響を解析した。具体的には１，５−ＡＧ濃度は１．６、８、４０、２００、１０００μｇ／ｍＬとし、無添加区との間で細胞生存率および執権突起伸長率を比較した。細胞生存率はどの１，５−ＡＧ濃度でも対照区と差が認められなかった（表−３）。神経突起伸長率では４０μｇ／ｍＬと２００μｇ／ｍＬが最も高かった（表−４）。ヒトの血中１，５−ＡＧ量は正常で２０−４０μｇ／ｍＬであることから、本試験では１，５−ＡＧ濃度は４０μｇ／ｍＬを採用した。
また、対照の試験区の１，５−ＡＧ濃度は検出限界が１μｇ／ｍｌの試験系で検出されなかった。
３）本試験
神経突起伸長率解析結果を図１に示す。まず、１，５−ＡＧ単独処理区では、神経突起伸長を示した細胞の割合が８．９％であり、無添加区（６．０％）と比較して有意（Ｐ＜０．０５）に増加した。次にＤＨＡ単独処理区に関しては、神経突起伸長を示した細胞の割合が１７．３％であり、無添加区と比較して有意（Ｐ＜０．００１）に増加した。次に、１，５−ＡＧとＤＨＡの同時処理区では、神経突起伸長を示した細胞の割合が２８．７％と大きく増加し、それぞれの単独処理区と比較して、有意差（Ｐ＜０．００１）が検出された。
２．まとめ
本試験結果により、１，５−ＡＧは神経突起伸長促進作用を持ち、そして、その作用はＤＨＡと相乗的に高まることが示された。

【0023】

【表1】

【0024】

【表2】

【0025】

【表3】

【0026】

【表4】

【0027】

実施例２ １，５−ＡＧ経口摂取後の血中１，５−ＡＧ濃度の変化
ラットＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）１１週齢のオスを１週間馴化飼育し１２週齢で実験を行った。実験日の前日の夕刻から絶食させ、実験日に体重測定し投与液量を算出した。投与量は１，５−ＡＧとして５ｇ／ｋｇとした。投与液量は２０ｍｌ／ｋｇとなるように結晶１，５−ＡＧを注射用水で希釈し、強制経口投与した。１，５−ＡＧの投与前と投与後に採血した。採血はヘパリン処理した注射筒を用いて静脈から０．２ｍｌ以上採血し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ，４℃）し、１，５−ＡＧ量の測定まで−２０℃以下で保存した。採血は投与前、投与後、０．２５、０．５、１、２、２４時間後とした。また、２４時間まで尿を全量、採取した。本試験のラット数は６匹とした。
１，５−ＡＧの測定は血液試料は日本化薬（株）製の動物用１，５−ＡＧキットを用いた。

【0028】

尿試料は高速液体クロマトグラフィーで測定した。カラムはＭＩＴＳＵＢＩＳＨＩ ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８Ｓ，カラム温度４０℃、溶離水は水、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器は示差屈折計で２０μｌインジェクトし測定した。定量は５％１，５−ＡＧを同様の条件で測定し試料の１，５−ＡＧピークのエリア面積の比率から尿中の１，５−ＡＧ量を求めた。このＨＰＬＣ条件ではグルコースと１，５−ＡＧは殆ど同じ保持時間であり、それらのピークは重なるため、ＨＰＬＣで求めた１，５−ＡＧが溶出する保持時間のピーク面積から１，５−ＡＧとＧｌｃの合計量を求め、グルコース測定キット（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社輸入の「Ｆ−キット グルコース／フルクトース」測定キット）で求めたグルコース量を差し引き１，５−ＡＧ量とした。

【0029】

１，５−ＡＧ経口投与による血中１，５−ＡＧ量の変化を図２に示した。血中１，５−ＡＧ量は、投与前は１ｍｇ／ｄｌ以下であったのに対して、投与０．２５ｈで２１．２ｍｇ／ｄｌまで上昇し、投与２時間後には１８３．４ｍｇ／ｄｌとなった。一方、２４時間後には８．２ｍｇ／ｄｌまで下がった。また、２４時間で採尿した尿中の１，５−ＡＧ量は投与量の約３０％となった。これらの結果より、経口投与された１，５−ＡＧはすぐに吸収され、血中に移行するが、すみやかに尿中に排泄されることが分かった。しかしながら、２４時間後でも、血中１，５−ＡＧ量は投与前の濃度には戻らず、体内に残存していることが分かった。

【0030】

実施例３
ＤＨＡとＥＰＡを含有する魚油とビタミンＥを含有する植物油の混合油（ＤＨＡとして３８％ｗ／ｗ、ＥＰＡとして８．２％ｗ／ｗを）３３５部に対して乳鉢を用いて微粉化した結晶１，５−ＡＧを１２．５部を混合して懸濁した。その混合物をゼラチンカプセルに注入した。充填重量は１カプセルあたり３５０ｍｇとした。
カプセル中の１，５−ＡＧは時間とともに１，５−ＡＧ結晶粉末が局在するようになったが、摂取上の問題はない。
このカプセル１粒あたりにＤＨＡが１２７ｍｇ、ＥＰＡが２７ｍｇ、１，５−ＡＧが１２ｍｇとなる。一日に４粒摂取する場合でＤＨＡが５０８ｍｇ、ＥＰＡが１０８ｍｇ、１，５−ＡＧが４８ｍｇ摂取できる。

【0031】

実施例４
ＤＨＡとＥＰＡを含有する魚油とビタミンＥを含有する植物油の混合油（ＤＨＡとして３８％ｗ／ｗ、ＥＰＡとして８．２％ｗ／ｗを）７０７部にコーンスターチ１８９０部、１，５−ＡＧの結晶微粉末を５２０部を混合し粉末化した。この得られた紛体をハードカプセルに、１カプセルあたり２４０ｍｇ充填した。このカプセル１粒あたりにＤＨＡが２０ｍｇ、ＥＰＡが４ｍｇ、１，５−ＡＧが４０ｍｇとなる。一日に４粒摂取する場合でＤＨＡが８０ｍｇ、ＥＰＡが１６ｍｇ、１，５−ＡＧが２００ｍｇ摂取できる。

【0032】

実施例５
お酢３部に砂糖０．５部と塩０．５部を添加し撹拌した。それに植物油６部と醤油１部を混合し良く撹拌した。それにＤＨＡとＥＰＡを含有する魚油とビタミンＥを含有する植物油の混合油（ＤＨＡとして３８％ｗ／ｗ、ＥＰＡとして８．２％ｗ／ｗを）０．６部、結晶１，５−ＡＧを０．０５部添加し良く混合しドレシングを調製した。
このドレッシング１０ｍｌにＤＨＡが約２３０ｍｇ、ＥＰＡが約５０ｍｇ、１，５−ＡＧが５０ｍｇ含まれる。

【図1】

【図2】