特開 2017-60498 ３次元培養による細胞の再プログラミング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-60498(P2017-60498A)

(43)【公開日】2017年3月30日

(54)【発明の名称】３次元培養による細胞の再プログラミング

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20170310BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20170310BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20170310BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20170310BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170310BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20170310BHJP

   C12M 3/02 20060101ALI20170310BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20170310BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071ZNA

   C12N1/00 B

   C12N5/074

   C12N5/077

   C12N5/10

   C12M1/00 C

   C12M1/00 A

   C12M3/02

   C12M3/00 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2016-223507(P2016-223507)

(22)【出願日】2016年11月16日

(62)【分割の表示】特願2014-561249(P2014-561249)の分割

【原出願日】2012年3月13日

(71)【出願人】

【識別番号】514231309

【氏名又は名称】インスティテュート オブ ジェネティックス アンド ディベロップメンタル バイオロジー，チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシズ

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100105991

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 玲子

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100114465

【弁理士】

【氏名又は名称】北野 健

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】ス，グアンナン

(72)【発明者】

【氏名】ザオ，ヤンナン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ，ジャンシュ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ビン

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，ジフェン

(72)【発明者】

【氏名】ダイ，ジャンウ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC01

4B029DA10

4B029DF10

4B029DG10

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC12

4B065AC20

4B065BC41

4B065BC50

4B065CA46

(57)【要約】      （修正有）

【課題】細胞を再プログラミングするための代替方法を提供する。
【解決手段】３次元細胞凝集体の形成を可能にする条件下で細胞を培養することにより、細胞を再プログラミングする方法。細胞が低接着性基質上で培養される方法。低接着性基質が、細胞付着を低下させる材料を含む方法。材料が、親水性の中性荷電ハイドロゲル層を含む方法。材料が、寒天、アガロース、およびポリ（２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート）から選択される方法。その方法を用いて得られる細胞および細胞凝集体。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞を再プログラミングへと誘導する、３次元細胞凝集体の形成を可能にする条件下で、細胞を培養することを含む、細胞を再プログラミングする方法。

【請求項2】

細胞が低接着性基質上で培養される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

低接着性基質が、細胞付着を低下させる材料を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

材料が、親水性の中性荷電ハイドロゲル層を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

材料が、寒天、アガロース、およびポリ（２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

アガロースが０．２％から５．０％までの範囲の濃度である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

アガロースが培地と混合される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

材料が、低接着性基質の表面にコーティングされる、請求項３に記載の方法。

【請求項9】

材料がポリスチレンを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項10】

低接着性基質が疎水性表面を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項11】

細胞が、支持材料に懸垂している液滴の培地中で懸濁培養される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

液滴が、１ｍｌ以下の体積を有する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

液滴の培地が培養容器の底面に逆さまに懸垂している、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

細胞が、回転状態、振盪状態、または静止状態で培養される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

細胞が、支持材料が培地内に配置されていない状態で、培養される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

細胞が体細胞である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

細胞が幹細胞である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、線維芽細胞、および癌細胞からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

線維芽細胞がマウス胎仔由来線維芽細胞または尾端線維芽細胞である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

３次元細胞凝集体が多細胞性かつ多層性の細胞凝集体である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

３次元細胞凝集体が球状の形を有する、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

３次元細胞凝集体が、少なくとも１０μｍの直径を有する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

細胞が再プログラミングされて、１つまたは複数の幹細胞マーカーをアップレギュレートする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

幹細胞マーカーが、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｒｅｘ１、Ｔｄｇｆ１、Ｌｅｆｔｂ、Ｅｂａｆ、Ｇｒｂ７、Ｐｏｄｘｌ、Ｎｏｄａｌ、Ｆｇｆ４、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｇｄｆ３、Ｄａｘ１、Ｓｌｃ２ａ３、Ｓｏｘ１、Ｏｌｉｇ２、およびＰａｘ６からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

細胞が再プログラミングされて、１つまたは複数の分化転換マーカーをアップレギュレートする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

培地へ誘導剤を導入することをさらに含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

誘導剤が、細胞の再プログラミングを誘導することができるタンパク質である、請求項２３に記載の方法。

【請求項28】

誘導剤が、細胞の再プログラミングを誘導することができるタンパク質をコードする核酸である、請求項２３に記載の方法。

【請求項29】

誘導剤が、細胞の再プログラミングを誘導することができる化合物である、請求項２３に記載の方法。

【請求項30】

細胞がインビトロで培養される、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

請求項１〜３０のいずれかに記載の方法を用いて得られる再プログラミングされた細胞。

【請求項32】

請求項１〜３０のいずれかに記載の方法を用いて得られる再プログラミングされた３次元細胞凝集体。

【請求項33】

低接着性基質および培地を含む、細胞を再プログラミングするためのキット。

【請求項34】

材料が、寒天、アガロース、またはポリ（２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート）である、請求項３３に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

幹細胞は、潜在力を維持しながらの増殖の能力、および特殊化した細胞型への分化能において特徴づけられる。そのような特徴はまた、幹細胞性と呼ばれ、そのことにより、幹細胞が科学的研究および治療的適用に大いに有望であると期待されている。かなりの関心が、細胞幹細胞性に、特に、幹細胞性を獲得するように体細胞を再プログラミングする方法に注がれている。Ｙａｍａｎａｋａらの先の研究は、多能性幹細胞が重要な転写因子の強制的過剰発現を介して体細胞から産生され得ることを実証し、幹細胞性操作についての新しい方法を生み出している（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６）。それ以来、タンパク質（Ｋｉｍら、２００９；Ｚｈｏｕら、２００９）、ＲＮＡ（Ｗａｒｒｅｎら）、ミクロＲＮＡ（Ａｎｏｋｙｅ−Ｄａｎｓｏら）、または規定された化学物質（Ｓｈｉら、２００８；Ｚｈｕら）の利用などの、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）についてのより安全かつより効率的な方法を設計することに多大な努力が費やされている。これらの方法は、細胞の幹細胞性を操作することにおいて効果的であることが証明されているが、効率およびリスク管理はまだなお改善されるべきである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0002】

したがって、細胞を再プログラミングするための代替方法を見出すことに大きな必要性が存在している。

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示の一態様は、細胞を再プログラミングへと誘導する、３次元（３Ｄ）細胞凝集体の形成を可能にする条件下で、細胞を培養することを含む、細胞を再プログラミングする方法に関する。

【0004】

特定の実施形態において、細胞は、３次元細胞凝集体の形成を可能にするために低接着性基質上で培養される。特定の実施形態において、低接着性基質は、親水性の中性荷電ハイドロゲル層を含む。特定の実施形態において、低接着性基質は疎水性表面を含む。

【0005】

特定の実施形態において、細胞は、３次元細胞凝集体の形成を可能にするために、支持材料に懸垂している液滴の培地中で懸濁培養される。

【0006】

特定の実施形態において、３次元細胞凝集体は、多細胞性かつ多層性の細胞凝集体である。特定の実施形態において、３次元細胞凝集体は球状の形を有する。

【0007】

特定の実施形態において、細胞は、再プログラミングされて、１つまたは複数の幹細胞マーカーをアップレギュレートする。特定の実施形態において、細胞は、再プログラミングされて、１つまたは複数の分化転換マーカーをアップレギュレートする。

【0008】

特定の実施形態において、方法は、培養物へ誘導剤を導入することをさらに含む。特定の実施形態において、誘導剤は、細胞の再プログラミングを誘導することができるタンパク質である。特定の実施形態において、誘導剤は、細胞の再プログラミングを誘導することができるタンパク質をコードする核酸である。特定の実施形態において、誘導剤は、細胞の再プログラミングを誘導することができる化合物である。

【0009】

本開示の別の態様は、本開示に提供された方法のいずれかを用いて得られる再プログラミングされた細胞に関する。

【0010】

本開示の別の態様は、本開示に提供された方法のいずれかを用いて得られる再プログラミングされた３次元細胞凝集体に関する。

【0011】

本開示の別の態様は、低接着性基質、および任意で、培地を含む、細胞を再プログラミングするためのキットに関する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＲＴ４細胞の３Ｄ球形成が幹細胞マーカーの発現をもたらすことを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および球培養（右）におけるＲＴ４細胞の位相差画像。スケールバー＝２００μｍ。 Ｂ．単層培養および球培養におけるＲＴ４細胞の幹細胞マーカー遺伝子についての定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析結果。 Ｃ．単層培養および７日目の球培養におけるＲＴ４細胞のＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２発現についてのウェスタンブロッティング結果。テラトーマ細胞系ＰＡ−１を陽性対照として用いた。

【図2】ＲＴ４細胞の３Ｄ球形成が癌幹細胞の特徴を有する細胞を生じることを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および７日目の球培養（右）における遊走した細胞の定量的分析結果。 Ｂ．単層培養および７日目の球培養におけるＲＴ４細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）に関連した遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。 Ｃ．ＲＴ４細胞のヌードマウス腫瘍形成アッセイの結果を要約した表。単層は、単層培養におけるトリプシン処理されたＲＴ４細胞を示す；球は、トリプシン処理されたＲＴ４球細胞を示す。

【図3A-C】３Ｄ球において培養されたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞が胚性幹細胞表現型を部分的に獲得したことを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および球培養（右）におけるＨＥＫ２９３細胞の位相差画像。スケールバー＝２００μｍ。 Ｂ．単層培養および球培養におけるＨＥＫ２９３細胞の幹細胞マーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。 Ｃ．単層培養および１０日目の球培養におけるＨＥＫ２９３細胞のＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２発現についてのウェスタンブロッティング結果。

【図3D】３Ｄ球において培養されたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞が胚性幹細胞表現型を部分的に獲得したことを示す図である。 Ｄ．単層ＨＥＫ２９３細胞および球ＨＥＫ２９３細胞におけるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２／ＯＣＴ４転写活性を示すルシフェラーゼアッセイ（ｎ＝３）。ベクターは対照ルシフェラーゼレポーターを示す。（Ｍ）は単層ＨＥＫ２９３細胞を示し、（Ｓ）は１０日目の球ＨＥＫ２９３細胞を示す。

【図3E-F】３Ｄ球において培養されたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞が胚性幹細胞表現型を部分的に獲得したことを示す図である。 Ｅ．単層培養（上部の行のパネル）および１０日目の球培養（下部の行のパネル）におけるＨＥＫ２９３細胞のＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２の転写制御領域の亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング。開始部位は＋１と指定されている。白丸は、非メチル化シトシングアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を示し、一方、黒丸はメチル化ＣｐＧを示す。 Ｆ．単層培養および球培養におけるＨＥＫ２９３細胞の胚性幹（ＥＳ）細胞マーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図3G-I】３Ｄ球において培養されたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞が胚性幹細胞表現型を部分的に獲得したことを示す図である。 Ｇ．単層培養および１０日目の球培養におけるＨＥＫ２９３細胞の内胚葉、中胚葉、および外胚葉のマーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。 Ｈ．単層培養（左）および１０日目の球培養（右）におけるＨＥＫ２９３細胞についてのアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）染色結果。 Ｉ．ＨＥＫ２９３細胞のヌードマウス腫瘍形成アッセイの結果を要約した表。「Ａ」は、単層培養におけるトリプシン処理されたＨＥＫ２９３細胞を示す；「Ｂ」は、トリプシン処理されたＨＥＫ２９３細胞球を示す；「Ｃ」はトリプシン処理されていないＨＥＫ２９３球を示す。

【図4A-B】後腎間充織および完全に分化した腎臓ユニットにおいて発現した遺伝子のＱ−ＰＣＲ分析結果を示す図である。 Ａ．腎臓ユニットの略図。 Ｂ．単層培養、５日目の球培養、および１０日目の球培養におけるＨＥＫ２９３細胞の後腎間充織（Ｂ）において発現した遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図4C-D】後腎間充織および完全に分化した腎臓ユニットにおいて発現した遺伝子のＱ−ＰＣＲ分析結果を示す図である。単層培養、５日目の球培養、および１０日目の球培養におけるＨＥＫ２９３細胞の糸球体（有足細胞）（Ｃ）、近位尿細管（Ｄ）において発現した遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図4E-F】後腎間充織および完全に分化した腎臓ユニットにおいて発現した遺伝子のＱ−ＰＣＲ分析結果を示す図である。単層培養、５日目の球培養、および１０日目の球培養におけるＨＥＫ２９３細胞のヘンレ係蹄（Ｅ）、遠位尿細管および集合管（Ｆ）において発現した遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図5A-B】マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ）の３Ｄ球形成が部分的胚性幹細胞表現型をもたらすことを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および球培養（右）におけるＭＥＦ細胞の位相差画像。スケールバー＝２００μｍ。 Ｂ．単層培養および７日目の球培養におけるＭＥＦ細胞の幹細胞マーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図5C】マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ）の３Ｄ球形成が部分的胚性幹細胞表現型をもたらすことを示す図である。 Ｃ．単層培養および１２日目の球培養におけるＭＥＦ細胞の幹細胞マーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図5D-E】マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ）の３Ｄ球形成が部分的胚性幹細胞表現型をもたらすことを示す図である。 Ｄ．単層培養および７日目の球培養におけるＭＥＦ細胞のＳｏｘ２発現についてのウェスタンブロッティング分析結果。 Ｅ．単層培養（左）および７日目の球培養（右）におけるＭＥＦ細胞についてのアルカリフォスファターゼ染色結果。

【図6A】ＭＥＦ細胞の３Ｄ球形成がニューロスフェアの表現型をもたらすことを示す図である。 Ａ．単層培養および７日目の球培養におけるＭＥＦ細胞のマーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図6B-C】ＭＥＦ細胞の３Ｄ球形成がニューロスフェアの表現型をもたらすことを示す図である。 Ｂ．単層培養および１２日目の球培養におけるＭＥＦ細胞のマーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。 Ｃ．単層培養および球培養におけるＭＥＦ細胞のＴｕｊ１およびＧｆａｐ発現についてのウェスタンブロッティング。マウスニューロスフェアを陽性対照として用いた。

【図6D-E】ＭＥＦ細胞の３Ｄ球形成がニューロスフェアの表現型をもたらすことを示す図である。単層ＭＥＦおよび７日目の球由来接着性ＭＥＦにおけるＴｕｊ１（Ｄ）、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（Ｅ）について陽性の細胞のパーセンテージ。

【図6F-G】ＭＥＦ細胞の３Ｄ球形成がニューロスフェアの表現型をもたらすことを示す図である。単層ＭＥＦおよび７日目の球由来接着性ＭＥＦにおけるＳ１００（Ｆ）、Ｇｆａｐ（Ｇ）について陽性の細胞のパーセンテージ。

【図6H-I】ＭＥＦ細胞の３Ｄ球形成がニューロスフェアの表現型をもたらすことを示す図である。 Ｈ．単層ＭＥＦおよび７日目の球由来接着性ＭＥＦにおけるＧＡＢＡ（Ｈ）について陽性の細胞のパーセンテージ。 Ｉ．ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）による神経発生分化後のＭＥＦのマーカー遺伝子のＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図7A-B】ＧＦＰと神経マーカーの両方について陽性の、インビボでの移植されたＭＥＦのパーセンテージを示す図である。ＧＦＰと、神経マーカーＴｕｊ１（Ａ）またはＧＦＡＰ（Ｂ）の両方について陽性の、インビボでの移植されたＭＥＦのパーセンテージ。

【図7C-D】ＧＦＰと神経マーカーの両方について陽性の、インビボでの移植されたＭＥＦのパーセンテージを示す図である。ＧＦＰと、神経マーカーＳ１００（Ｃ）またはＮｅｕＮ（Ｄ）の両方について陽性の、インビボでの移植されたＭＥＦのパーセンテージ。

【図7E】ＧＦＰと神経マーカーの両方について陽性の、インビボでの移植されたＭＥＦのパーセンテージを示す図である。ＧＦＰと、神経マーカーＭＡＰ２（Ｅ）の両方について陽性の、インビボでの移植されたＭＥＦのパーセンテージ。

【図8A-C】マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）の３Ｄ球形成が神経細胞の出現をもたらすことを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および球培養（右）におけるＴＴＦの位相差画像。スケールバー＝２００μｍ。 Ｂ．単層培養および７日目の球培養におけるＴＴＦのＳｏｘ２発現についてのウェスタンブロッティング分析結果。 Ｃ．単層培養および７日目の球培養におけるＴＴＦのマーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図8D-E】マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）の３Ｄ球形成が神経細胞の出現をもたらすことを示す図である。 Ｄ〜Ｅ．単層ＴＴＦおよび７日目の球由来接着性ＴＴＦの、Ｔｕｊ１（Ｄ）およびＳ１００（Ｅ）について陽性の細胞のパーセンテージ。

【図9】ＭＣＦ−７細胞の３Ｄ球形成が幹細胞マーカーのアップレギュレートをもたらすことを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および球培養（右）におけるＭＣＦ−７細胞の位相差画像。 Ｂ．単層培養および球培養におけるＭＣＦ−７細胞のマーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図10】ラット骨芽細胞の３Ｄ球形成がいくつかの幹細胞マーカーのアップレギュレートをもたらすことを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および球培養（右）におけるラット骨芽細胞の位相差画像。 Ｂ．単層培養および球培養におけるラット骨芽細胞のマーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図11】ラットニューロン幹細胞の３Ｄ球形成が幹細胞マーカーのアップレギュレートをもたらすことを示す図である。 Ａ．単層培養（左）および球培養（右）におけるラットニューロン幹細胞の位相差画像。 Ｂ．単層培養および球培養におけるラットニューロン幹細胞のマーカー遺伝子についてのＱ−ＰＣＲ分析結果。

【図12A-J】いくつかの幹細胞マーカーの例示的なタンパク質配列を示す図である。

【図13A-R】いくつかの分化転換マーカーの例示的なタンパク質配列を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本開示は、３次元細胞凝集体の形成を可能にし、かつ細胞を再プログラミングへと誘導する条件下で細胞を再プログラミングするための方法を提供する。本開示はまた、本開示の方法を用いて再プログラミングされる細胞を提供する。本開示はさらに、本開示の方法を用いて細胞を再プログラミングするための組成物およびキットを提供する。

【0014】

本開示の一態様は、細胞を再プログラミングへと誘導する、３次元細胞凝集体の形成を可能にする条件下で、細胞を培養することを含む、細胞を再プログラミングする方法に関する。

【0015】

本明細書で用いられる場合、用語「再プログラミングする」または「再プログラミング」は、分化細胞が、幹細胞の１つまたは複数の特徴を生じるように誘導される過程を指す。

【0016】

分化細胞は、特殊化した細胞になることをコミットされている細胞、または特殊化した細胞になっている細胞であり、そのような特殊化した細胞の１つまたは複数の生物学的または機能的特徴を示す。分化細胞は、部分的に分化されていてもよく、その細胞は、特殊化した細胞になる過程を完了しておらず、かつ特殊化した細胞の特徴を全て含有するわけではない。部分的に分化した細胞にはまた、特殊化していない細胞へ戻る過程にあり、かつ特殊化した細胞の特徴の一部を喪失している特殊化した細胞も挙げられてもよい。分化細胞は、高度に分化していてもよく、その細胞は、特殊化した細胞になる過程を完了しており、かつ特殊化した細胞の特徴を全て、含有している。本明細書に用いられる場合、用語「分化細胞」は、部分的に分化した細胞および／または高度に分化した細胞を含む。

【0017】

幹細胞は、様々な特殊化した細胞型へ分化する可能性がある細胞である。幹細胞は、胚性幹細胞などの、多能性、すなわち、たいていの型の特殊化した細胞へ分化する能力があり得る。幹細胞は、骨髄幹細胞または造血幹細胞などの、複能性、すなわち、特定の複数の型の特殊化した細胞へ分化する能力があり得る。幹細胞は、単能性、すなわち、１つの特定の型の特殊化した細胞へ分化する能力があり得る。幹細胞は、全能性、すなわち、受精卵であり得る。本明細書で用いられる場合、用語「幹細胞」は、上記で言及された様々なレベルの可能性を有する、ありとあらゆる型の幹細胞を含む。

【0018】

本開示の方法は、３次元細胞凝集体の形成を可能にする培養条件下で幹細胞の１つまたは複数の生物学的および／または機能的特徴を示すように誘導することができる任意の細胞を再プログラミングするために用いられてもよい。特定の実施形態において、再プログラミングされる本開示の細胞は、接着細胞である。接着細胞は、インビトロでの成長に固体基質への付着を必要とする細胞である（Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｄａｖｉｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ出版、２０１１年、４．２章；Ｊｅｎｎｉｅ Ｐ．Ｍａｔｈｅｒら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版、１９９８年、６４〜６５ページ参照）。接着細胞は、懸濁培養において、成長もしくは生存せず、または不十分にしか成長もしくは生存しない。接着細胞は、通常、固形組織および器官に由来する。接着細胞の例には、非限定的に、内皮細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、および線維芽細胞が挙げられる。

【0019】

特定の実施形態において、接着細胞は、懸濁培養において１５％未満の生存率を有する。特定の実施形態において、接着細胞は、懸濁培養において１０％未満の生存率を有する。特定の実施形態において、接着細胞は、懸濁培養において５％未満の生存率を有する。特定の実施形態において、接着細胞は、懸濁培養において１％未満の生存率を有する。細胞生存率は、細胞培養物における細胞の総数のうちの生細胞の数のパーセンテージとして計算される。細胞生存能は、ヨウ化プロピジウム染色などの知られた方法により測定されてもよい。

【0020】

特定の実施形態において、本開示の方法によって再プログラミングされる本開示の細胞は体細胞である。体細胞の例には、非限定的に、線維芽細胞（例えば、マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）、およびヒト線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬ））、膀胱細胞、（例えば、ヒト膀胱パピローマ（ＲＴ４）細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞）、頸部細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）、筋肉細胞、胚細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞）、肺細胞（例えば、ヒト胎児肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５）、ＭＲＣ−９細胞）、肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２細胞）、上皮細胞（例えば、ＷＰＥ幹細胞）、内皮細胞（例えば、ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞）、脳細胞（例えば、Ｔ９８Ｇ細胞）、骨細胞（例えば、ＫＨＯＳ−２４０Ｓ細胞）が挙げられる。特定の実施形態において、体細胞は非癌細胞である。

【0021】

特定の実施形態において、体細胞は、乳癌細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、またはＳＫ−ＢＲ−３細胞）、結腸癌細胞（例えば、ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１５細胞、Ｔ８４細胞、ＨＣＴ−８細胞）、腎癌細胞（例えば、Ａ−４９８細胞、７６９−Ｐ細胞、Ｇ４０１細胞）、肺癌細胞（例えば、ＮＣＩ−Ｈ２１２６細胞、ＤＭＳ ７９細胞、Ａ５４９細胞）、肝癌細胞（例えば、Ｈｅｐ
Ｇ２細胞）、子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）、グリオーマ細胞（例えば、Ｍ０５９Ｋ細胞、ＬＮ−１８細胞）、神経細胞（例えば、ラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞
、ヒト神経芽細胞腫（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）細胞）、前立腺癌細胞（例えば、ＤＵ１４５細胞、ＬＮＣａＰ細胞）、および骨肉腫細胞（例えば、ＫＨＯＳ／ＮＰ細胞）などの癌細胞である。

【0022】

特定の実施形態において、部分的に分化している細胞は、本開示の方法によって再プログラミングへ誘導される。特定の実施形態において、幹細胞は、本開示の方法によって再プログラミングへ誘導される。

【0023】

特定の実施形態において、本開示は、細胞を再プログラミングへと誘導する、３次元細胞凝集体の形成を可能にする培養条件下で、インビトロで細胞を培養することを含む、細胞を再プログラミングする方法を提供する。特定の実施形態において、培養条件は、低接着性条件である。低接着性条件は、細胞が固体基質に付着せず、または固体基質への細胞付着が低下し、もしくは阻害される培養環境を意味する。特定の実施形態において、低接着性条件において、基質への細胞付着は、通常の接着条件と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、低下する。通常の接着条件は、市販の細胞培養器、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ細胞培養ディッシュ（例えば、カタログＮｏ．４３０５８９ Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｎｏｔ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳ）またはカタログＮｏ．３３５３００２ ＦａｌｃｏｎＴＭ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳ）またはカタログＮｏ．７１５００１ ＮＥＳＴ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ（Ｗｕｘｉ、Ｃｈｉｎａ））によって提供され得る。

【0024】

特定の実施形態において、低接着性条件は、基質の表面上で細胞付着を低下させ、または阻害する低接着性基質によって提供される（Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｄａｖｉｓ、上記、参照）。特定の実施形態において、低接着性基質には、細胞接着を低下させ、または阻害する材料でコーティングされている細胞培養器（例えば、ディッシュ、プレート、丸底チューブ、またはフラスコ）が挙げられる。特定の実施形態において、そのような材料は、親水性の中性荷電ハイドロゲル層を含有する。本明細書で用いられる場合、「ハイドロゲル」は、一定量の水を構成する半流動性組成物であって、ポリマーまたはその混合物が溶解または分散している、半流動性組成物を指す。特定の実施形態において、ハイドロゲルは、ポリスチレンでできている。特定の実施形態において、ポリスチレンは、ポリスチレン−ｂｌｏｃｋ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ｂｌｏｃｋ−ポリスチレン、ポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）（ＳＭＡ）、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）（Ｐ（ＳＴ−ＤＶＢ））、ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳＡ）、ポリ（グリシジルメタクリレート−ｃｏ−α−メチルスチレン）、ポリアニリン−ポリ（スチレンスルホネート）（Ｐａｎ−ＰＳＳ）、ポリ（スチレン−ｂｌｏｃｋ−（メトキシジエチレングリコールアクリレート）−ｂｌｏｃｋ−スチレン）、およびポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）からなる群から選択される。

【0025】

特定の実施形態において、ハイドロゲルは、寒天、アガロースでできている。特定の実施形態において、低接着性基質は、０．２％から５．０％までの範囲の濃度のアガロースでコーティングされている。特定の実施形態において、低接着性基質は、１〜５％の範囲の濃度の寒天でコーティングされている。

【0026】

特定の実施形態において、ハイドロゲルは、ポリ（２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート）でできている。特定の実施形態において、低接着性基質は、４０〜５０％の範囲の濃度のポリ（２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート）でコーティングされている。

【0027】

特定の実施形態において、低接着性基質は、培地（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ
）またはＭｃＣｏｙ’５Ａ培地）と混合されたハイドロゲルでコーティングされている。

【0028】

特定の実施形態において、細胞接着を低下させ、または阻害する材料は、標的細胞の細胞外タンパク質の機能を調節することができ、それにしたがって、細胞の基質への付着を低下させる。細胞外タンパク質の阻害剤の例には、非限定的に、プロテオグリカン（例えば、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６４（１４）：８０１２〜８０１８、１９８９参照）、ヒドロコルチゾンまたはシクロヘキシミドと組み合わされたヘパリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、トリプシンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ディスパーゼ、デキストラン、ポリエチレンオキシド、グリシン−アルギニン−グリシン−アスパルテート−セリン−プロリン、グリシン−アルギニン−グリシン−アスパルテート−セリンなどの合成ペプチド（例えば、Ｗｈａｌｅｎ，Ｇ．Ｆ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、２１０（６）：７５８〜７６４、１９８９）が挙げられる。

【0029】

特定の実施形態において、細胞接着を低下させ、または阻害する材料は、低接着性基質の表面に、層またはフィルムまたは膜としてコーティングされている。特定の実施形態において、細胞接着を低下させ、または阻害する材料は、基質内に包埋されている。

【0030】

特定の実施形態において、低接着性基質は、疎水性表面を含む。特定の実施形態において、疎水性表面は、疎水性成分を有するポリマーおよびコポリマーのフィルムで形成される。特定の実施形態において、疎水性表面は、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＥＯ−ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）で形成される。

【0031】

任意の適切な培地が、本開示の方法に用いられ得る。一般的に用いられる培地の例には、非限定的に、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＤＭＥＭ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）が挙げられる。

【0032】

別の態様において、細胞は、ペトリ皿の底面およびローリングボトルの壁面などの支持材料に懸垂している液滴の培地中で懸濁培養される。特定の実施形態において、液滴の培地は、わずか１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、または５ｍｌの体積を有する。特定の実施形態において、液滴の培地は、ペトリ皿などの培養容器の底面に逆さまに懸垂している。

【0033】

特定の実施形態において、細胞は、回転状態もしくは振盪状態、または静止状態で培養される。

【0034】

特定の実施形態において、細胞を再プログラミングする方法は、支持基質または構造が培地内に懸濁し、浮遊しまたは別な形で配置されていない状態で、細胞を培養することを含む。

【0035】

本明細書で用いられる場合、用語「３次元細胞凝集体」は、細胞単層とは対照的に、３次元（３Ｄ）の形へ成長した細胞を指す。３次元細胞凝集体は、２次元、３次元、または多次元の基質上で成長することができる。特定の実施形態において、本開示の３次元細胞凝集体は、多細胞性かつ多層性の細胞凝集体である。特定の実施形態において、本開示の３次元細胞凝集体は、球状の形をとる。特定の実施形態において、本開示の球状の形をし
た細胞凝集体は、数週間、安定な形態を維持することができる。特定の実施形態において、３次元細胞凝集体は、少なくとも１０μｍ、１５μｍ、または２０μｍの直径を有する。

【0036】

特定の実施形態において、細胞は、再プログラミングされて、１つまたは複数の幹細胞マーカーをアップレギュレートする。幹細胞マーカーは、幹細胞の特徴を示す遺伝子およびタンパク質である。本明細書に記載された方法と共に用いる幹細胞マーカーの例には、非限定的に、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｒｅｘ１、Ｔｄｇｆ１、Ｌｅｆｔｂ、Ｅｂａｆ、Ｇｒｂ７、Ｐｏｄｘｌ、Ｎｏｄａｌ、Ｆｇｆ４、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｇｄｆ３、Ｄａｘ１、Ｎａｔ１、Ｅｓｇ１、Ｓ１ｃ２ａ３、Ｓｏｘ１、Ｏｌｉｇ２、およびＰａｘ６が挙げられる。これらの幹細胞マーカー（ヌクレオチドおよびタンパク質の両方）のＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）参照番号は、下記の表１に示されている。例示的なタンパク質配列もまた、図１２Ａ〜Ｊに示されている。

【0037】

【表1】

【0038】

特定の実施形態において、幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、Ｇｄｆ３、Ｄａｘ１、Ｎａｔ１、Ｅｓｇ１、Ｓ１ｃ２ａ３、Ｔｄｇｆ１、Ｌｅｆｔｂ、Ｅｂａｆ、Ｇｒｂ７、Ｐｏｄｘｌ、およびＦｇｆ４などの胚性幹細胞マーカーであり得る。

【0039】

特定の実施形態において、幹細胞マーカーは、Ｐａｘ２、Ｗｔ１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｌｐｈａ ８、Ｓａｌｌ１、Ｌｉｍ１、Ｎｃａｍ１、Ｓｉｘ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ７、Ａｃｖｒ２ｂ、およびＮｔｒｋ２などの腎臓幹細胞マーカーであり得る。

【0040】

特定の実施形態において、幹細胞マーカーは、Ｓｏｘ２などの神経幹細胞マーカーであり得る（Ｅｐｉｓｋｏｐｏｕ、２００５；ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２）。

【0041】

本開示の方法による細胞の再プログラミングは、幹細胞マーカーの存在もしくは非存在により、または幹細胞マーカーの遺伝子レベルもしくはタンパク質レベルでの増加もしくは減少により、同定され得る。特定の実施形態において、幹細胞マーカーを発現しない細胞は、本開示の方法により再プログラミングへ誘導されて、１つまたは複数の幹細胞マーカーを発現する。特定の実施形態において、１つまたは複数の幹細胞マーカーを発現する細胞は、本開示の方法により再プログラミングへ誘導されて、追加の１つまたは複数の幹細胞マーカーを発現する。特定の実施形態において、本開示の再プログラミングされた細胞は、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの幹細胞マーカーを遺伝子レベルおよび／またはタンパク質レベルで発現する。

【0042】

特定の実施形態において、本開示の再プログラミングされた細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＬｉｎ ２８からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの幹細胞マーカーの遺伝子および／またはタンパク質を増加したレベルで発現する。特定の実施形態において、本開示の再プログラミングされた細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの幹細胞マーカーの遺伝子および／またはタンパク質を増加したレベルで発現する。

【0043】

特定の実施形態において、本明細書に記載された方法を用いる細胞の再プログラミングは、細胞を、幹細胞マーカーＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４を遺伝子レベルでアップレギュレートするようにさせ、同時に幹細胞マーカーＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２をタンパク質レベルでアップレギュレートするようにさせる。

【0044】

別の態様において、本開示の方法はまた、細胞を分化転換することもでき、その場合、部分的に、または高度に分化した細胞が、異なる型の分化細胞へ転換され、または誘導される幹細胞が、誘導前の特殊化した細胞の型とは異なる特殊化した細胞へ転換される。

【0045】

特定の実施形態において、分化転換された細胞は、１つまたは複数の分化転換マーカーによって特徴づけられる。本明細書で用いられる場合の用語「分化転換マーカー」は、細胞の分化転換を同定するために用いることができる特徴的な遺伝子および／またはタンパク質を指す。

【0046】

分化転換マーカーの例には、例えば、Ｆｏｘａ２、Ａｆｐ、Ｓｏｘ１７、およびＰｄｘ−１などの内胚葉マーカー、ＢｒａｎｃｈｙｕｒｙおよびＭｓｘ１などの中胚葉マーカー、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｏｔｘ２、およびＴｐ６３などの外胚葉マーカー、Ｎｐｈｓ１、Ａｃｔｎ４、Ｃｄ２ａｐ、Ｃｄｈ３、Ｐｄｐｎ、およびＰｏｄｘｌなどの腎糸球体マーカー、Ａｑｐ１、Ｃｌｃｎ５、Ｃｕｂｎ、Ｌｒｐ２、およびＳｌｃ５ａ１などの腎近位尿細管マーカー、ＵｍｏｄおよびＰｋｄ２などの腎ヘンレ係蹄マーカー、ならびにＳｃｎｎ１ａおよびＰｋｄ１などの腎遠位尿細管および集合管マーカー、Ｍａｐ２、ＮｅｕＮ、Ｔｕｊ１、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、およびＮＦ−Ｈなどのニューロンマーカー、Ｇｆａｐ、Ｓ１００Ａ
、およびＳ１００Ｂなどのアストロサイトマーカー、ならびにＭｂｐおよびＮｇ２などのオリゴデンドロサイトマーカー、ならびにＰａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｏｔｘ２、Ｚｉｃ１、ＮｅｕｒｏＤ１、およびＯｌｉｇ２などの神経特異的転写因子が挙げられ得る。上記で言及された分化転換マーカーのＮＣＢＩ参照番号は、下記の表２に示されている。例示的なタンパク質配列は、図１３Ａ〜Ｒに示されている。

【0047】

【表2】

【0048】

特定の実施形態において、本開示の方法を用いて再プログラミングされた細胞は、幹細胞マーカーと分化転換マーカーの両方を示す。例えば、本開示の方法は、胚細胞ＨＥＫ２９３を誘導して、特定の幹細胞マーカー（例えば、Ｓｉｘ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７、Ａｃｖｒ２ｂ、およびＮｔｒｋ２）、加えて、特定の分化転換マーカー（例えば、Ｎｐｈｓ１、Ａｃｔｎ４、Ｃｄ２ａｐ、Ｃｄｈ３、Ａｑｐ１、Ｃｌｃｎ５、Ｃｕｂｎ、Ｕｍｏｄ Ｐｋｄ２、Ｓｃｎｎ１ａ、Ｐｋｄ１）をアップレギュレートすることができ、そのことは、そのＨＥＫ２９３細胞が、成熟腎細胞へ分化転換していることを示している。

【0049】

別の態様において、本開示の方法は、分化細胞を誘導して幹細胞へ転換することができる誘導剤を細胞培養物へ導入することをさらに含む。誘導剤は、任意の化学的または生化学的物質であり得、それには、非限定的に、小分子化合物、ヌクレオチド、ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0050】

特定の実施形態において、誘導剤は、細胞の再プログラミングを誘導することができるタンパク質である。そのようなタンパク質の例には、非限定的に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８が挙げられる。そのタンパク質を、適切な宿主細胞において組換えで発現させ、当技術分野において知られた方法（例えば、アフィニティクロマトグラフィ）を用いて精製することができる。そのタンパク質は、当技術分野において知られた方法を用いて、細胞へ送達することができる。例えば、タンパク質は、（原形質膜にポアを形成し、タンパク質送達を可能にする）ストレプトリシンＯによって媒介される可逆性透過化によりサイトゾルへ送達することができる（例えば、
Ｗａｌｅｖ，Ｉ．ら、ＰＮＡＳ、９８（６）：３１８５〜３１９０、２００１；Ｃｈｏ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１１６：３８６〜３９５、２０１０参照）。別の例として、そのタンパク質は、ＨＩＶ ｔａｔおよびポリアルギニンなどの形質導入ドメインへ融合させることができ、そのドメインは、そのタンパク質のサイトゾルへの膜貫通送達を媒介することができる（例えば、Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、４：３８１〜３８４、２００９参照）。

【0051】

特定の実施形態において、誘導剤は、細胞の再プログラミングを誘導することができるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。そのようなポリヌクレオチドの例には、非限定的に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。再プログラミングするために細胞に導入された場合、そのポリヌクレオチドは、発現して、再プログラミングを刺激することができる遺伝子産物を産生することができる。そのポリヌクレオチドは、分子クローニング技術（例えば、ｃＤＮＡ調製、続いてプラスミドベクターへの挿入）を用いて容易に構築することができる、コード配列およびプロモーターを含有する発現カセット、または発現ベクターであり得、（例えば、リポフェクタミン試薬またはリン酸カルシウムを用いる）トランスフェクション方法により細胞へ導入することができる。

【0052】

特定の実施形態において、誘導剤は、細胞の再プログラミングを誘導することができる化合物である。そのような化合物の例には、非限定的に、ＢＩＸ−０１２９４およびＢａｙＫ８６４４（例えば、Ｓｈｉら、ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、３：５６８〜５７４、２００８参照）、バルプロ酸、および５’アザシチジンが挙げられる。

【0053】

別の態様において、本開示は、本開示の方法を用いて得られる再プログラミングされた細胞を提供する。特定の実施形態において、そのような再プログラミングされた細胞は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの幹細胞マーカーのアップレギュレートを示す。特定の実施形態において、そのような再プログラミングされた細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＬｉｎ２８からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの幹細胞マーカーの遺伝子および／またはタンパク質レベルのアップレギュレートを示す。特定の実施形態において、そのような再プログラミングされた細胞は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの幹細胞マーカーのアップレギュレート、および少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの分化転換マーカーのアップレギュレートを示す。

【0054】

別の態様において、本開示は、本開示の方法を用いて得られる再プログラミングされた３次元細胞凝集体を提供する。特定の実施形態において、再プログラミングされた細胞凝集体は、球状の形を有する。特定の実施形態において、再プログラミングされた細胞凝集体は、少なくとも１０μｍ、１５μｍ、または２０μｍの直径を有する。

【0055】

別の態様において、本開示は、低接着性基質および培地を含有する、細胞を再プログラミングするためのキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、使用説明書をさらに含有する。特定の実施形態において、低接着性基質は、アガロースまたはポリ（２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート）を含有する。

【0056】

本開示の再プログラミング方法、および再プログラミングされた細胞または細胞凝集体は、所望の細胞または組織をインビトロまたはインビボで作製するのに有用である。そのような細胞または組織は、創傷治癒、神経再生、組織再生、薬物スクリーニングなどに用いることができる。

【0057】

本明細書に引用された全ての刊行物および特許は、全体として参照により本明細書に組
み入れられている。

【0058】

本発明は、以下の実施例を参照して、より容易に理解されるだろうし、その実施例は、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。下に記載された全ての特定の組成物、材料、および方法は、全部または一部において、本発明の範囲内にある。これらの特定の組成物、材料、および方法は、本発明を限定することを意図されず、単に、本発明の範囲内にある特定の実施形態を例証することを意図されるのみである。当業者は、独創的能力を発揮することなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、等価の組成物、材料、および方法を開発し得る。多くの変形形態を、本発明の範囲内にまだなお留まりながら、本明細書に記載された手順において生じ得ることは理解されるだろう。そのような変形形態が本発明の範囲内に含まれることは本発明者らの意図である。

【実施例1】

【0059】

細胞培養
ＲＴ４およびヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、それぞれ、ＭｃＣＯＹ’５Ａ（ＨＹＣＬＯＮＥ）およびＤＭＥＭ（ＨＹＣＬＯＮＥ）において培養した。

【0060】

マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ）を、Ｅ１３．５日のＩＣＲマウス胎仔から取り出した。海馬移植実験について、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジェニックマウスを用いた。簡単に述べれば、頭部、肢、内臓組織、および脊柱の除去後、単離された胎仔の残りの部分を、小片へ切断し、その後、トリプシン処理した。トリプシン処理された組織の上清から遠心分離により細胞を収集し、その後、新鮮な培地中に再懸濁した。Ｐ０ ＭＥＦ細胞を、継代する前にコンフルエンスまで成長させた。Ｐ２ ＭＥＦ細胞を、さらなる２Ｄおよび３Ｄ培養に用いた。

【0061】

マウス尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）細胞を、２４時間ＩＣＲマウスから単離した。簡単に述べれば、尾の前部１／４〜１／５の部分を小片に切断し、その後、それを、細胞培養ディッシュ上に蒔き、２〜３日間、培養した。その細胞は、約７２時間目においてその小片から外へ遊走し始めた。さらに２〜３日間の培養後、外へ遊走した細胞を継代した。Ｐ３
ＴＴＦ細胞をさらなる２Ｄおよび３Ｄ培養に用いた。

【0062】

３Ｄ培養について、（１％融解アガロースゲルを同量の２×ＤＭＥＭ培地と混合することにより作製された）軟質ゲルで細胞培養ディッシュをコーティングすることにより、低接着性培養ディッシュを調製した。３×１０⁶個のＲＴ４またはＨＥＫ２９３細胞を、６
０ｍｍ低接着性ディッシュへ移した。６×１０⁶個のＭＥＦ細胞またはＴＴＦ細胞を、６
０ｍｍ低接着性ディッシュへ移した。

【0063】

２Ｄ培養について、通常の細胞培養ディッシュを、そのディッシュをいかなる軟質ゲルでもコーティングすることなく、用いた。

【実施例2】

【0064】

ＲＴ４細胞の再プログラミング
ヒト膀胱パピローマ細胞系ＲＴ４細胞を、単層接着培養（２Ｄ）および球培養（３Ｄ）、それぞれにより培養した。本発明者らは、成長因子を追加された無血清培地の代わりに、１０％ウシ胎仔血清を含む完全成長培地を用いた。

【0065】

２．ａ． ＲＴ４細胞の細胞形態
図１Ａ（左）に示されているように、ヒト膀胱パピローマ細胞系ＲＴ４細胞は、通常の付着ディッシュ上での単層接着培養により培養され、上皮形態を示した。対照的に、図１Ａ（右）において、低付着ディッシュ上で培養されたＲＴ４細胞は、プレートから剥離さ
れ、浮遊する３Ｄ球を形成し、その球は数週間、持続した。

【0066】

２．ｂ． ＲＴ４球の幹細胞特徴
幹細胞マーカーの発現レベルを、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて決定した。簡単に述べれば、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離し、その後、逆転写酵素反応混合物（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。Ｑ−ＰＣＲを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。ＧＡＤＰＨを、ｃＤＮＡインプットを標準化するための対照として用いた。結果を、試験細胞培養物における試験マーカーの発現レベルの、２Ｄ培養における発現レベルに対する、倍数変化として示した。データを、平均±標準偏差、Ｎ＝３として示した。スチューデントＴ検定を用いて、３Ｄ培養細胞についての結果が、２Ｄ培養細胞と統計学的に異なるかどうかを決定した。図において、統計的有意性を有する差を、１個のアスタリスク（^*、Ｐ＜０．０５）または２個のアスタリスク（^**、Ｐ＜０．
０１）でマークした。実施例および図における全てのＱ−ＰＣＲ研究を、他に規定がない限り、類似した方法を用いて実施した。

【0067】

遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析結果は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣが、単層培養群と比較して、球培養群においてアップレギュレートされることを示した（図１Ｂ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられるプライマーは、下記の表３に列挙されている）。ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２のタンパク質レベルは、それぞれ、ＮＡＮＯＧ（１：５０００希釈、ａｂｃａｍ）およびＳＯＸ２（１：２００希釈、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する一次抗体、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされた二次抗体を用いるウェスタンブロッティング（図１Ｃ）により実証されているように、ＲＴ４球において有意にアップレギュレートされた。

【0068】

２．ｃ． ＲＴ４細胞の癌幹細胞特徴
幹細胞のパーセンテージを、「サイドポピュレーション（Ｓｉｄｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」（ＳＰ）識別アッセイ（幹細胞の色素流出性質を用いた、幹細胞パーセンテージの検出のためのフローサイトメトリー方法）により検出した。簡単に述べれば、細胞をトリプシン処理し、単独かまたは５０μｇ／ｍｌベラパミル（Ｓｉｇｍａ）と共の５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で９０分間、インキュベートした。細胞を遠沈し、死細胞を排除した後、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフローサイトメトリー細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析に供した。球培養群におけるＳＰ細胞のパーセンテージは、単層培養群における０．３７±０．１２％と比較して、０．８３±０．３２％であった。

【0069】

ＲＴ４細胞の転移能を、ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイによって検出し、遊走した細胞を、クリスタルバイオレットで染色した。簡単に述べれば、２Ｄまたは３Ｄ方法によって培養された細胞を、トリプシン処理する前に２４時間、血清飢餓にし、無血清培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を、８μｍポアを含有する２４ウェルのｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上部の室に蒔き、下部の室を、１０％ＦＢＳを追加した培地で満たした。２４時間後、ＦＢＳに応答して下部の室へ遊走した細胞を、０．１％クリスタルバイオレットで染色し、染色した細胞を顕微鏡下でカウントした。遊走したＲＴ４細胞の定量的分析は、球培養が細胞転移能を促進することを示した（図２Ａ）。４つの確率場を、各実験群についてカウントし、その結果は、平均±標準偏差として示されている。

【0070】

上皮間葉転換（ＥＭＴ）に関連した遺伝子発現を、Ｑ−ＰＣＲによって調べた。その結果は、ＦＯＸＣ２、ＳＮＡＩＬ、およびＺＥＢ２が、単層と比較して、ＲＴ４球において
アップレギュレートされることを実証した（図２Ｂ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。

【0071】

本発明者らは、インビボでのヌードマウス腫瘍形成アッセイを実施した。週齢４〜５週間のヌードマウス（８ ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の背部側腹へ細胞を皮下注射した。図２Ｃに示されているように、１×１０⁶個の単層ＲＴ４細胞は、１４匹のマウスのうち１１匹
において腫瘍を形成したが、１×１０⁶個の球由来のＲＴ４細胞は、１４匹のマウスのう
ち１４匹において腫瘍を形成した。さらに、１×１０⁴個の単層ＲＴ４細胞は、少しの腫
瘍も形成することができなかったが、１×１０⁴個の球由来細胞は、１４匹のマウスのう
ち４匹において腫瘍を形成した（図２Ｃ）。データは、ＲＴ４腫瘍細胞の３Ｄ球培養が、癌幹細胞性質を促進することを示した。

【実施例3】

【0072】

ＨＥＫ２９３細胞の再プログラミング
３．ａ． ＨＥＫ２９３細胞の細胞形態
ＨＥＫ２９３は、もともとヒト胎児由来腎臓細胞に由来した非癌性細胞系である。細胞培養ディッシュに接着したＨＥＫ２９３細胞は、単層上皮形態を示したが（図３Ａ左）、低接着性プレート上で培養されたＨＥＫ２９３は、浮遊３Ｄ球を形成した（図３Ａ右）。

【0073】

３．ｂ． ＨＥＫ２９３細胞の幹細胞特徴
いくつかの幹細胞マーカーの発現を、２Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞および３Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞の両方を用いて、Ｑ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングにより決定した。公知のｉＰＳ誘導因子のＱ−ＰＣＲ分析により、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＬＩＮ２８が、単層培養と比較して、５日目および１０日目で、球培養において全てアップレギュレートされることが示された（図３Ｂ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。ウェスタンブロッティング分析によってもまた、球培養群におけるＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２のタンパク質レベルが、単層群と比較して高いことが示された（図３Ｃ）。一次抗体および二次抗体は、実施例２におけるこれらと同じであった。

【0074】

２Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞および３Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞をまた、幹細胞マーカーの転写活性について、レポーター遺伝子アッセイおよび亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングを用いて比較した。

【0075】

レポーター遺伝子アッセイについて、２Ｄ培養物または３Ｄ培養物由来のＨＥＫ２９３細胞に、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＯＸ２／ＯＣＴ４の結合配列のルシフェラーゼレポーター構築物（すなわち、（ｔｋプロモーターを有するＰＧＬ３ベクターへ６Ｗエンハンサーを挿入することにより構築された）Ｏｃｔ４−Ｌｕｃベクター、（ｐ３７ｔｋ−ルシフェラーゼベクターのＳａｌＩ部位へＮａｎｏｇ結合部位Ｐ５Ｎをライゲーションすることにより構築された）Ｎａｎｏｇ−Ｌｕｃベクター（Ｐａｎ，Ｇ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０：１４０１〜１４０７（２００５）もまた参照）、および（ＰＧＬ３ベクターにおいてＦＧＦ−４プロモーターの上流へＯｃｔ４／Ｓｏｘ２結合オリゴヌクレオチドの６個のコピーを含有する配列をクローニングすることにより構築された）Ｓｏｘ２／Ｏｃｔ４−Ｌｕｃベクター）をトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイを、標準プロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って実行した。本発明者らは、３Ｄ培養細胞におけるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２／ＯＣＴ４タンパク質が、より高い転写活性を有することを見出した（図３Ｄ）。

【0076】

亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングについて、亜硫酸水素塩処理を、Ｅｐｉ−Ｔｅｃｔ亜硫酸水素塩キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて実施し、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳ
ＯＸ２の転写制御領域を、下記の表３に示されたそれぞれのプライマーでのＰＣＲ（Ｈｏｔｓｔａｒ ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ）により増幅した。そのＰＣＲ産物を、ｐＭＤ１８−Ｔベクターへサブクローニングし、各試料の２０個のクローンをランダムに選び出し、シーケンシングした。亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング分析により、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２の転写制御領域におけるシトシングアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）のメチル化状態を評価し、その結果により、ＨＥＫ２９３球におけるメチル化状態が、単層ＨＥＫ２９３細胞におけるメチル化状態よりも低いことが明らかにされた（図３Ｅ）。

【0077】

２Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞および３Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞をさらに試験して、それらが、未分化ＥＳ細胞のいくつかの特徴を示すかどうかを見た。数個の未分化ＥＳ細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現のＱ−ＰＣＲ分析により、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＬＥＦＴＢ、ＥＢＡＦ、ＧＲＢ７、ＰＯＤＸｌ、およびＦＧＦ４が、ＨＥＫ２９３ ３Ｄ細胞においてアップレギュレートされることが示された（図３Ｆ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。ＨＥＫ２９３球の内胚葉、中胚葉、および外胚葉への分化能のＱ−ＰＣＲ分析により、内胚葉マーカー（ＦＯＸＡ２、ＡＦＰ、ＳＯＸ１７、およびＰＤＸ−１）、中胚葉マーカー（ＢＲＡＮＣＨＹＵＲＹおよびＭＳＸ１）、および外胚葉マーカー（ＮＥＳＴＩＮ、ＯＴＸ２、およびＴＰ６３）が、球において全てアップレギュレートされることが示された（図３Ｇ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。アルカリフォスファターゼ発現を、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）染色により検出した。図３Ｈに示されているように、ＡＰ染色は、ＨＥＫ２９３球細胞において陽性であったが、単層細胞においては陰性であった。

【0078】

ＨＥＫ２９３球の腫瘍形成能を、インビボでのヌードマウス腫瘍形成アッセイによって調べた。３×１０⁶個のＨＥＫ２９３単層細胞および球培養における３×１０⁶個のＨＥＫ２９３細胞を、それぞれ、週齢４〜５週間のヌードマウスの背部側腹へ皮下注射した。図３Ｉに示されているように、ＨＥＫ２９３単層細胞が少しの腫瘍も形成することができなかったが、ＨＥＫ２９３球は、７匹のマウスのうちの３匹において皮下組織に腫瘍を形成し、トリプシン処理された球細胞は、７匹のマウスのうちの１匹において腫瘍を形成したことを本発明者らは見出した。内胚葉、中胚葉、および外胚葉の明確な構造は検出されず、これらの腫瘍と、ＥＳＣにより形成されるテラトーマとの間に、特定の本質的な相違が存在する可能性があることが示された。これらの結果により、３Ｄ球として培養されたＨＥＫ２９３細胞が胚性幹細胞表現型を部分的に生じ得ることが実証された。

【実施例4】

【0079】

ＨＥＫ２９３細胞の分化転換
この実施例において、ＨＥＫ２９３細胞を、腎臓幹細胞表現型への再プログラミング活性について、およびまた、腎臓における高度に分化した細胞の別個の型への分化転換再プログラミング活性について試験した。

【0080】

腎臓前駆細胞は、後腎間充織内に存在し、それはさらに、ネフロンへ分化し、そのネフロンは、糸球体（有足細胞）、近位尿細管、ヘンレ係蹄、遠位尿細管、および集合管で構成される（図４Ａ）。

【0081】

２Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞および３Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞を、後腎間充織特異的遺伝子および腎臓前駆細胞マーカーの発現について試験した。後腎間充織特異的遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ分析により、ＰＡＸ２、ＷＴ１、ＩＮＴＥＧＲＩＮ ａｌｐｈａ ８、ＳＡＬＬ１、ＬＩＭ１、およびＮＣＡＭ１がＨＥＫ２９３球においてアップレギュレートされることが示された。腎臓前駆細胞マーカーＳＩＸ２、ＦＲＩＺＺＬＥＤ ２、ＦＲＩＺＺＬＥＤ ７、ＡＣＶＲ２ｂ、およびＮＴＲＫ２もまた、ＨＥＫ２９３球においてアップレギ
ュレートされた（図４Ｂ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。これらの結果により、ＨＥＫ２９３の球形成が、腎臓幹細胞表現型を促進し得ることが実証された。

【0082】

２Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞および３Ｄ培養ＨＥＫ２９３細胞をさらに、ネフロン分化マーカーについて試験した。糸球体、近位尿細管、ヘンレ係蹄、遠位尿細管、および集合管の分化したマーカーのＱ−ＰＣＲ試験により、ＨＥＫ２９３球の糸球体マーカー（ＮＰＨＳ１、ＡＣＴＮ４、ＣＤ２ＡＰ、ＣＤＨ３、ＰＤＰＮ、およびＰＯＤＸｌ）、近位尿細管マーカー（ＡＱＰ１、ＣＬＣＮ５、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、およびＳＬＣ５Ａ１）、ヘンレ係蹄マーカー（ＵＭＯＤおよびＰＫＤ２）、ならびに遠位尿細管および集合管マーカー（ＳＣＮＮ１ａおよびＰＫＤ１）は、それらが５日間および１０日間、培養されたとき、３Ｄ細胞において全て、有意にアップレギュレートされることが示された（図４Ｃ〜Ｆ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。そのデータにより、球培養が、成熟腎臓ユニットへの再分化を伴う腎臓組織特異的脱分化を促進し得ることが示唆された。

【実施例5】

【0083】

ＭＥＦ細胞の再プログラミング
球培養の初代細胞への効果をさらに評価するために、ＭＥＦを球へ培養した。ＭＥＦは、それらが細胞培養プレートに接着している場合、楕円形核の周囲に分枝状細胞質を有する典型的な形態を示したが、低接着性プレート上で培養された場合、それらは３Ｄ球を形成した（図５Ａ）。ｉＰＳ誘導因子および数個の未分化ＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現を、Ｑ−ＰＣＲにより調べた。Ｓｏｘ２、Ｇｄｆ３、Ｄａｘ１、およびＳｌｃ２ａ３の発現は、７日間および１２日間、培養された後、単層ＭＥＦよりＭＥＦ球において高かった（図５Ｂ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＫｌｆ４はＭＥＦ球においてアップレギュレートされなかったが（図５Ｂおよび５Ｃ）、ＭＥＦ球における高レベルのＳｏｘ２タンパク質が、ウェスタンブロッティングにより確認され、それは、テラトーマ細胞系ＰＡ−１におけるレベルに匹敵した。対照的に、単層ＭＥＦにおいてウェスタンブロッティングによりＳｏｘ２の発現は検出されなかった（図５Ｄ）。アルカリフォスファターゼの発現を決定するためにＡＰ染色を実施した。図５Ｅに示されているように、陽性ＡＰ染色が、ＭＥＦ球において見出されたが、単層ＭＥＦにおいて見出されなかった。これらのデータより、ＭＥＦの球培養が、いくつかの胚性幹細胞遺伝子の発現を促進し得ることが明らかにされた。

【実施例6】

【0084】

ＭＥＦおよびＴＴＦ細胞の神経細胞への分化転換
ＭＥＦ球におけるＳｏｘ２の高発現を考慮して、本発明者らは、ＭＥＦ球がニューロスフェア性質を獲得するかどうかを試験した。図６Ａ〜Ｂに示されているように、Ｎｅｓｔｉｎが、７日間および１２日間培養されたＭＥＦ球においてアップレギュレートされた。本発明者らはまた、ＭＥＦ球において、分化したニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに関連した遺伝子の発現を分析した。ニューロンマーカー（Ｍａｐ２、ＮｅｕＮ、Ｔｕｊ１、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、およびＮＦ−Ｈ）、アストロサイトマーカー（Ｇｆａｐ、Ｓ１００Ａ、およびＳ１００Ｂ）、およびオリゴデンドロサイトマーカー（ＭｂｐおよびＮｇ２）は全て、ＭＥＦ球においてアップレギュレートされた（図６Ａ〜Ｂ、データを、平均±標準偏差、Ｎ＝４として示した）。数個の神経特異的転写因子（Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｏｔｘ２、Ｚｉｃ１、ＮｅｕｒｏＤ１、およびＯｌｉｇ２）もまた、ＭＥＦ球においてより高かった（図６Ａ〜Ｂ）。Ｔｕｊ１およびＧｆａｐタンパク質が、１日間、３日間、５日間、および７日間培養されたＭＥＦ球において検出され、時間と共に増加したが、単層ＭＥＦにおいては発現しなかった（図６Ｃ）。

【0085】

ＭＥＦ球が細胞培養ディッシュに再接着した場合、球における細胞は、遊走してディッシュ上へ戻り、単層を形成した。本発明者らは、これらの遊走して戻った細胞を、球由来接着細胞と名付ける。免疫細胞化学染色を実施し、免疫蛍光写真を、単層細胞と球培養細胞の両方について撮影した。各細胞培養物について、４枚の代表的な写真を選び、各写真について、特定のマーカーについて陽性である細胞のパーセンテージを、陽性細胞の数を写真における細胞の総数で割ることにより計算した。その結果により、球由来接着細胞におけるいくつかの細胞は、Ｔｕｊ１（図６Ｄ）、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（図６Ｅ）、Ｓ−１００（図６Ｆ）、およびＧｆａｐ（図６Ｇ）について陽性であるが、単層ＭＥＦは陰性である（図６Ｄ〜Ｇ）ことが示された。加えて、本発明者らは、ＧＡＢＡ（脳におけるニューロンの主に抑制性の神経伝達物質）に対する抗体で標識された、ＭＥＦ球由来細胞におけるいくつかの細胞を見出した（図６Ｈ）。そのデータにより、３Ｄ球培養が、ＭＥＦを再プログラミングして、ニューロスフェア性質を獲得させ得ることが実証された。免疫細胞化学染色を、抗Ｔｕｊ１抗体（１：５００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＧＦＡＰ抗体（１：５００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｌ抗体（１：１０００希釈、Ａｂｃａｍ）、抗Ｓ１００抗体（１：１００希釈、Ｓｉｇｍａ）、抗ＧＡＢＡ抗体（１：３０００希釈、Ｓｉｇｍａ）を含む一次抗体、およびＤｙｌｉｇｈｔ ４８８コンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗マウスＩｇＧ抗体（１：４００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む二次抗体を用いて実施した。

【0086】

次に、本発明者らは、ＭＥＦ球が、神経誘導培地において神経細胞表現型を獲得することができるかどうかを試験した。ＲＡ、ＳＨＨ、Ｎ２（データ未呈示）、およびＢＨＡを含むいくつかの方法を試みたが、ＢＨＡだけが有効であった。１０日間の誘導後、単層ＭＥＦは、明らかな形態変化を示さなかったが、ＭＥＦ球に由来した細胞は、広範な分枝を有する長い神経突起（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ）様形態を示した。Ｑ−ＰＣＲ結果により、ＢＨＡ誘導での単層ＭＥＦのほとんどの神経マーカーが、対照と比較して、変化しないままであり、またはダウンレギュレートされることが示された。対照的に、ＭＥＦ球群においては、ＢＨＡ誘導後、Ｓｏｘ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍａｐ２、Ｇｆａｐ、Ｔｕｊ１、Ｎｆ−Ｌ、Ｓ１００Ｂ、Ｎｇ２、ＮｅｕＮ、ＮｅｕｒｏＤ１、およびＰａｘ６を含むほとんどの神経マーカーがさらにアップレギュレートされた（図６Ｉ、Ｑ−ＰＣＲ分析に用いられたプライマーは下記の表３に列挙されている）。これらのデータは、ＢＨＡが、球ＭＥＦの神経細胞への転換を促進し得ることを実証した。

【0087】

海馬は、神経発生が成人期を通じて起こる、脳における特別な構造である。ＭＥＦ球のニューロスフェア特徴をインビボでさらに評価するために、ＧＦＰ標識単層ＭＥＦおよび球ＭＥＦをラットの海馬へ移植し、生存能力および分化能力を、２週間目および４週間目に分析した。２週間目と比較して、４週間目におけるＧＦＰ陽性細胞の数は単層群において劇的に減少したが、球ＭＥＦの数は、明らかな減少は示さず、球ＭＥＦがより高い生存能を有することが示唆された。図７Ａ〜Ｅにおいて示されているように、ＧＦＰ陽性球ＭＥＦは、移植後２週間目および４週間目に、Ｔｕｊ１、ＧＦＡＰ、Ｓ１００、ＮｅｕＮ、およびＭＡＰ２に対する抗体によって検出されたが、単層ＭＥＦにおけるＧＦＰ陽性細胞は、これらの神経マーカーを発現することができなかった（データを、平均±標準偏差、Ｎ＝４として示した）。これらの結果は、球ＭＥＦがインビボで生存可能な神経細胞を産生し得ることを示した。さらに、球ＭＥＦにおけるＮｅｕＮおよびＭＡＰ２陽性細胞の存在により、成熟ニューロンが移植後、産生し得ることが示唆された。

【0088】

単層ＴＴＦは典型的な線維芽細胞形態を示したが、低接着性プレート上で培養されたＴＴＦは、浮遊３Ｄ球を形成した（図８Ａ）。いくつかの胚性幹細胞特異的遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｇｄｆ３、Ｄａｘ１、Ｎａｔ１、およびＥｓｇ１）は、ＴＴＦ球においてアップレ
ギュレートされなかったが、ＴＴＦ球におけるｓｏｘ２のｍＲＮＡおよびタンパク質発現は、単層ＴＴＦと比較して、ウェスタンブロッティングおよびＱ−ＰＣＲ分析によって有意にアップレギュレートされた（図８Ｂおよび８Ｃ）。Ｑ−ＰＣＲ分析によりまた、ニューロンマーカーＮｆ−Ｌ、アストロサイトマーカーＧｆａｐおよびＳ１００Ｂ、オリゴデンドロサイトマーカーＮｇ２、ならびに数個の神経特異的転写因子Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１、およびＺｉｃ１が、単層ＴＴＦよりＴＴＦ球においてより高く発現することが実証された（図８Ｃ）。免疫細胞化学染色を実施し、陽性に染色された細胞のパーセンテージを、段落［００８５］（［００９９］）に提供されているような類似した方法を用いて計算した。その結果は、ＴＴＦ球由来単層細胞におけるいくつかの細胞が、単層ＴＴＦにおいて陰性であるニューロンマーカーＴｕｊ１およびアストロサイトマーカーＳ１００について陽性であることを示した（図８Ｄ〜Ｅ、データを、平均±標準偏差、Ｎ＝４として示した）。これらのデータにより、マウス出生後線維芽細胞の３Ｄ球が、再プログラミングを促進し得、かつまたニューロスフェア性質を示し得ることが示唆された。

【実施例7】

【0089】

ＭＣＦ−７細胞の再プログラミング
ヒト乳癌細胞系である、ＭＣＦ−７細胞系を、ＤＭＥＭ−高グルコース培地（ＨＹＣＬＯＮＥ）において培養した。

【0090】

３Ｄ培養について、（１％融解アガロースゲルを同量の２×ＤＭＥＭ培地と混合することにより作製された）軟質ゲルで細胞培養ディッシュをコーティングすることにより、低接着性培養ディッシュを調製した。３×１０⁶個のＭＣＦ−７細胞を、６０ｍｍ低接着性
ディッシュへ移した。

【0091】

２、３日後、３Ｄ培養で培養されたＭＣＦ−７細胞は球へ成長したが（図９Ａ右参照）、従来の２Ｄ細胞培養ディッシュで培養されたＭＣＦ−７細胞は単層を形成した（図９Ａ左参照）。

【0092】

数個の幹細胞マーカー遺伝子の発現を、２Ｄ培養において形成されたＭＣＦ−７単層および３Ｄ培養において形成されたＭＣＦ−７球の両方について、Ｑ−ＰＣＲによって調べた。図９Ｂにおいて示されているように、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ ２８、Ｒｅｘ１、Ｆｇｆ４、Ｅｓｇ１、Ｔｄｇｆ１、Ｌｅｆｔｂ、Ｅｂａｆ、Ｇｒｂ７、Ｐｏｄｘ１、およびＮｅｓｔｉｎを含む、試験された幹細胞マーカーの全部が、ＭＣＦ−７球においてアップレギュレートされた。これらのデータにより、ＭＣＦ−７細胞の球培養が、いくつかの胚性幹細胞マーカー遺伝子を含むいくつかの幹細胞マーカー遺伝子の発現を促進することが明らかにされた。

【実施例8】

【0093】

ラット骨芽細胞の再プログラミング
ラット骨芽細胞をＤＭＥＭ−高グルコース培地（ＨＹＣＬＯＮＥ）において培養した。ラット骨芽細胞を、生後１日のラット頭蓋からの一次分離（ｐｒｉｍａｒｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）により取得した。

【0094】

３Ｄ培養について、（１％融解アガロースゲルを同量の２×ＤＭＥＭ培地と混合することにより作製された）軟質ゲルで細胞培養ディッシュをコーティングすることにより、低接着性培養ディッシュを調製した。３×１０⁶個のラット骨芽細胞を、６０ｍｍ低接着性
ディッシュへ移した。

【0095】

２、３日後、３Ｄ培養で培養されたラット骨芽細胞は球へ成長したが（図１０Ａ右参照）、従来の２Ｄ細胞培養ディッシュで培養されたラット骨芽細胞は単層を形成した（図１
０Ａ左参照）。

【0096】

数個の幹細胞マーカー遺伝子の発現を、２Ｄ培養において形成された単層および３Ｄ培養において形成された球の両方について、Ｑ−ＰＣＲによって調べた。図１０Ｂにおいて示されているように、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ ２８、Ｆｇｆ４、Ｎｏｄａｌ、およびＧａｌを含む、試験された幹細胞マーカーの一部が、ラット骨芽細胞球においてアップレギュレートされた。ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、およびＲｅｘ１などのマーカー遺伝子の一部がダウンレギュレートされた。これらのデータにより、球培養がラット骨芽細胞を再プログラミング過程へ誘導し、その結果として、いくつかの胚性幹細胞マーカー遺伝子を含むいくつかの幹細胞マーカー遺伝子のアップレギュレートを生じることが明らかにされた。

【実施例9】

【0097】

ラットニューロン幹細胞の再プログラミング
ラットニューロン幹細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨＹＣＬＯＮＥ）において培養した。ラットニューロン幹細胞を、生後１日のラット脳からの一次分離により取得した。

【0098】

３Ｄ培養について、（１％融解アガロースゲルを同量の２×ＤＭＥＭ培地と混合することにより作製された）軟質ゲルで細胞培養ディッシュをコーティングすることにより、低接着性培養ディッシュを調製した。３×１０⁶個のラットニューロン幹細胞を、６０ｍｍ
低接着性ディッシュへ移した。

【0099】

２、３日後、３Ｄ培養で培養されたラットニューロン幹細胞は球へ成長したが（図１１Ａ右参照）、従来の２Ｄ細胞培養ディッシュで培養されたラットニューロン幹細胞は単層を形成した（図１１Ａ左参照）。

【0100】

数個の幹細胞マーカー遺伝子の発現を、２Ｄ培養において形成された単層および３Ｄ培養において形成された球の両方について、Ｑ−ＰＣＲによって調べた。図１１Ｂにおいて示されているように、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、Ｆｇｆ４、およびＮｏｄａｌを含む、試験された幹細胞マーカーの一部が、ラットニューロン幹細胞球においてアップレギュレートされた。Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＧａ１などのマーカー遺伝子の一部がダウンレギュレートされた。これらのデータにより、球培養がラットニューロン幹細胞を再プログラミング過程へ誘導し、その結果として、いくつかの幹細胞マーカー遺伝子のアップレギュレートを生じることが明らかにされた。

【0101】

【表3】

参考文献
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【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図12G】

【図12H】

【図12I】

【図12J】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D-1】

【図13D-2】

【図13E】

【図13F-1】

【図13F-2】

【図13G】

【図13H】

【図13I】

【図13J】

【図13K】

【図13L】

【図13M】

【図13N-1】

【図13N-2】

【図13O】

【図13P】

【図13Q】

【図13R】

【図1】

【図2】

【図3A-C】

【図3D】

【図3E-F】

【図3G-I】

【図4A-B】

【図4C-D】

【図4E-F】

【図5A-B】

【図5C】

【図5D-E】

【図6A】

【図6B-C】

【図6D-E】

【図6F-G】

【図6H-I】

【図7A-B】

【図7C-D】

【図7E】

【図8A-C】

【図8D-E】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【手続補正書】

【提出日】2016年12月15日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞を再プログラミングへと誘導する、３次元細胞凝集体の形成を可能にする条件下で、細胞を培養することを含む、細胞を再プログラミングする方法。