特開 2017-93431 脂肪由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の培養方法、及び治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2017-93431(P2017-93431A)

(43)【公開日】2017年6月1日

(54)【発明の名称】脂肪由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の培養方法、及び治療薬

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20170428BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20170428BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20170428BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20170428BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170428BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20170428BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20170428BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20170428BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20170428BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20170428BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0775

   A61K35/28

   A61P37/08

   A61P17/00

   A61P25/00

   A61P9/10

   A61P27/16

   A61P7/00

   A61P19/00

   A61P19/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】150

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2016-224984(P2016-224984)

(22)【出願日】2016年11月18日

(31)【優先権主張番号】特願2015-225886(P2015-225886)

(32)【優先日】2015年11月18日

(33)【優先権主張国】JP

(71)【出願人】

【識別番号】514084923

【氏名又は名称】株式会社ＡＷＳホールディングス

(71)【出願人】

【識別番号】515321119

【氏名又は名称】ファースト・ステムセル・ジャパン株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】515321120

【氏名又は名称】社会医療法人孝仁会

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 孝次

(72)【発明者】

【氏名】大星 茂樹

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065BA22

4B065BB32

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA34

4C087ZA36

4C087ZA51

4C087ZA59

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB11

4C087ZB13

(57)【要約】

【課題】少量の投与量で疾患の治療に有用な脂肪組織由来間葉系幹細胞を提供する。
【解決手段】脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、血清を含む培地で間葉系幹細胞を初代培養し、初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、脂肪組織由来間葉系幹細胞。初代培養の培地に含まれる血清が、脂肪組織を採取した検体由来の血清であってもよい。当該脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性であってもよい。また、当該脂肪組織由来間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有していてもよい。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
脂肪組織由来間葉系幹細胞。

【請求項2】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項１に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞。

【請求項3】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項１又は２に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞。

【請求項4】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項１又は２に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞。

【請求項5】

ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項１から４のいずれか１項に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞。

【請求項6】

骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞。

【請求項7】

脂肪組織から間葉系幹細胞を分離することと、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養することと、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養することと、
を含む、脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法。

【請求項8】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項７に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法。

【請求項9】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項７又は８に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法。

【請求項10】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項７又は８に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法。

【請求項11】

当該培養方法で得られる脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項７から１０のいずれか１項に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法。

【請求項12】

当該培養方法で得られる脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項８から１１のいずれか１項に記載の脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法。

【請求項13】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
アトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項14】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項１３に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項15】

患者に静脈投与される、請求項１３又は１４に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項16】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項１５に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項17】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５千万個以下である、請求項１５に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項18】

患者の患部に局注投与される、請求項１３又は１４に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項19】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５千万個以下である、請求項１８に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項20】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項１３から１９のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項21】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項１３から２０のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項22】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項１３から２０のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項23】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項１３から２２のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項24】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項１３から２３のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎の治療薬。

【請求項25】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む脳挫傷の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
脳挫傷の治療薬。

【請求項26】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項２５に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項27】

患者に静脈投与される、請求項２５又は２６に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項28】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項２７に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項29】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項２５から２８のいずれか１項に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項30】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項２５から２９のいずれか１項に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項31】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項２５から２９のいずれか１項に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項32】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項２５から３１のいずれか１項に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項33】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項２５から３２のいずれか１項に記載の脳挫傷の治療薬。

【請求項34】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む脳梗塞の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
脳梗塞の治療薬。

【請求項35】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項３４に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項36】

患者に静脈投与される、請求項３４又は３５に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項37】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項３６に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項38】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項３４から３７のいずれか１項に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項39】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項３４から３８のいずれか１項に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項40】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項３４から３８のいずれか１項に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項41】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項３４から４０のいずれか１項に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項42】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項３４から４１のいずれか１項に記載の脳梗塞の治療薬。

【請求項43】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む脳出血の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
脳出血の治療薬。

【請求項44】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項４３に記載の脳出血の治療薬。

【請求項45】

患者に静脈投与される、請求項４３又は４４に記載の脳出血の治療薬。

【請求項46】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項４５に記載の脳出血の治療薬。

【請求項47】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項４３から４６のいずれか１項に記載の脳出血の治療薬。

【請求項48】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項４３から４７のいずれか１項に記載の脳出血の治療薬。

【請求項49】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項４３から４７のいずれか１項に記載の脳出血の治療薬。

【請求項50】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項４３から４９のいずれか１項に記載の脳出血の治療薬。

【請求項51】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項４３から５０のいずれか１項に記載の脳出血の治療薬。

【請求項52】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む突発性難聴の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
突発性難聴の治療薬。

【請求項53】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項５２に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項54】

患者に静脈投与される、請求項５２又は５３に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項55】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項５４に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項56】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項５２から５５のいずれか１項に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項57】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項５２から５６のいずれか１項に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項58】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項５２から５６のいずれか１項に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項59】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項５２から５８のいずれか１項に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項60】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項５２から５９のいずれか１項に記載の突発性難聴の治療薬。

【請求項61】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む肩関節周囲炎の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項62】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項６１に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項63】

患者に静脈投与される、請求項６１又は６２に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項64】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項６３に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項65】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項６１から６４のいずれか１項に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項66】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項６１から６５のいずれか１項に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項67】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項６１から６５のいずれか１項に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項68】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項６１から６７のいずれか１項に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項69】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項６１から６８のいずれか１項に記載の肩関節周囲炎の治療薬。

【請求項70】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む結核性脊椎炎の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項71】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項７０に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項72】

患者に静脈投与される、請求項７０又は７１に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項73】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項７２に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項74】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項７０から７３のいずれか１項に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項75】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項７０から７４のいずれか１項に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項76】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項７０から７４のいずれか１項に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項77】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項７０から７６のいずれか１項に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項78】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項７０から７７のいずれか１項に記載の結核性脊椎炎の治療薬。

【請求項79】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項80】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項７９に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項81】

患者に静脈投与される、請求項７９又は８０に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項82】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項８１に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項83】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項７９から８２のいずれか１項に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項84】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項７９から８３のいずれか１項に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項85】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項７９から８３のいずれか１項に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項86】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項７９から８５のいずれか１項に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項87】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項７９から８６のいずれか１項に記載の胸椎黄色靭帯骨化症の治療薬。

【請求項88】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む脊髄損傷の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
脊髄損傷の治療薬。

【請求項89】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項８８に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項90】

患者に静脈投与される、請求項８８又は８９に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項91】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項９０に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項92】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項８８から９１のいずれか１項に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項93】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項８８から９２のいずれか１項に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項94】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項８８から９２のいずれか１項に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項95】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項８８から９４のいずれか１項に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項96】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項８８から９５のいずれか１項に記載の脊髄損傷の治療薬。

【請求項97】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む脊髄梗塞の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
脊髄梗塞の治療薬。

【請求項98】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項９７に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項99】

患者に静脈投与される、請求項９７又は９８に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項100】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項９９に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項101】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項９７から１００のいずれか１項に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項102】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項９７から１０１のいずれか１項に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項103】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項９７から１０１のいずれか１項に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項104】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項９７から１０３のいずれか１項に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項105】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項９７から１０４のいずれか１項に記載の脊髄梗塞の治療薬。

【請求項106】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む頸部脊柱管狭窄症の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項107】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項１０６に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項108】

患者に静脈投与される、請求項１０６又は１０７に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項109】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項１０８に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項110】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項１０６から１０９のいずれか１項に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項111】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項１０６から１１０のいずれか１項に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項112】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項１０６から１１０のいずれか１項に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項113】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項１０６から１１２のいずれか１項に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項114】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項１０６から１１３のいずれか１項に記載の頸部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項115】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む腰部脊柱管狭窄症の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項116】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項１１５に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項117】

患者に静脈投与される、請求項１１５又は１１６に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項118】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項１１７に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項119】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項１１５から１１８のいずれか１項に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項120】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項１１５から１１９のいずれか１項に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項121】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項１１５から１１９のいずれか１項に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項122】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項１１５から１２１のいずれか１項に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項123】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項１１５から１２２のいずれか１項に記載の腰部脊柱管狭窄症の治療薬。

【請求項124】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む腰椎変性側弯症の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項125】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項１２４に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項126】

患者に静脈投与される、請求項１２４又は１２５に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項127】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項１２６に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項128】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項１２４から１２７のいずれか１項に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項129】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項１２４から１２８のいずれか１項に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項130】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項１２４から１２８のいずれか１項に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項131】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項１２４から１３０のいずれか１項に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項132】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項１２４から１３１のいずれか１項に記載の腰椎変性側弯症の治療薬。

【請求項133】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む腰椎症の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
腰椎症の治療薬。

【請求項134】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項１３３に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項135】

患者に静脈投与される、請求項１３３又は１３４に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項136】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項１３５に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項137】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項１３３から１３６のいずれか１項に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項138】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項１３３から１３７のいずれか１項に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項139】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項１３３から１３７のいずれか１項に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項140】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項１３３から１３９のいずれか１項に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項141】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する、請求項１３３から１４０のいずれか１項に記載の腰椎症の治療薬。

【請求項142】

脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む変形性膝関節症の治療薬であって、
前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が
脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、
血清を含む培地で前記間葉系幹細胞を初代培養し、
前記初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、
変形性膝関節症の治療薬。

【請求項143】

前記脂肪組織が患者の自己脂肪組織である、請求項１４２に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【請求項144】

患者の関節内に投与される、請求項１４２又は１４３に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【請求項145】

１回当たり前記患者に投与される前記脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下である、請求項１４４に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【請求項146】

前記初代培養の培地に含まれる血清が、前記脂肪組織を採取した検体由来の血清である、請求項１４２から１４５のいずれか１項に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【請求項147】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下である、請求項１４２から１４６のいずれか１項に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【請求項148】

前記初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下である、請求項１４２から１４６のいずれか１項に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【請求項149】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である、請求項１４２から１４８のいずれか１項に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【請求項150】

前記脂肪組織由来間葉系幹細胞が、軟骨細胞への分化能を有する、請求項１４２から１４９のいずれか１項に記載の変形性膝関節症の治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細胞に関し、脂肪由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の培養方法、及び治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

間葉系幹細胞は、疾患の治療に有用であることが報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１から１２参照。）。脂肪組織から培養、増殖される脂肪由来間葉系幹細胞は、分化により組織再生に参画、あるいは成長因子を分泌して組織再生を促進する。脂肪由来間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、細胞増殖が速い、再生促成因子を多く分泌する、免疫抑制能が高い、という有利な特徴を有する。さらに、脂肪由来間葉系幹細胞は、腹部又は臀部の脂肪組織から得られるため、骨髄を採取する必要のある骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、安全に十分量確保しやすいという有利な特徴も有する。また、患者の自己脂肪組織由来の間葉系幹細胞を患者の治療に用いることは、倫理的な問題がない、免疫拒絶反応がない、感染症等の問題が少ない、静脈投与で治療効果がある等の点で優れている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許５５４１８４５号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ra et al、「Stem cell treatment for patients with autoimmune disease by systemic infusion of culture-expanded autologous adipose tissue derived mesenchymal stem cells」、Journal of Translational Medicine、2011、9:181

【非特許文献2】Jeong Chan Ra et al、「Safety of Intravenous Infusion of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Animals and Humans」、STEM CELLS AND DEVELOPMENT、Volume 20, Number 8、2011

【非特許文献3】Choi HJ, et al、「Establishment of Efficacy and Safety Assessment of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells (hATMSCs) in a Nude Rat Femoral Segmental Defect Model」、J Korean Med Sci 2011; 26: 482-491

【非特許文献4】S. Takikawa et al、「Human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells promote sensory recovery in a spinal cord injury rat model」、Stem Cell Discovery、3、(2013)、155-163

【非特許文献5】Liu et al、「Therapeutic potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of rheumatoid arthritis」、Arthritis Research & Therapy、2010、12:R210

【非特許文献6】Shengchang Zhang et al、「Anti-Aging Effect of Adipose-Derived Stem Cells in a Mouse Model of Skin Aging Induced by D-Galactose」、PLOS ONE、May 2014、Volume 9、Issue 5

【非特許文献7】Mitsuhara et al、「Simulated microgravity facilitates cell migration and neuroprotection after bone marrow stromal cell transplantation in spinal cord injury」、Stem Cell Research & Therapy、2013、4:35

【非特許文献8】Fukuki Saito et al、「Administration of cultured autologous bone marrow stromal cells into cerebrospinal fluid in spinal injury patients: A pilot study」、Restorative Neurology and Neuroscience、30、(2012)、127-136

【非特許文献9】Maarten Albersen, MD et al、「Injections of adipose tissue-derived stem cells and stem cell lysate improve recovery of erectile function in a rat model of cavernous nerve injury」、J Sex Med、2010、October、7(10)

【非特許文献10】Osamu Honmou et al、「Intravenous administration of auto serum-expanded autologous mesenchymal stem cells in stroke」、Brain、2011

【非特許文献11】Jeong-Min Kim et al、「Systemic transplantation of human adipose stem cells attenuated cerebral inflammation and degeneration in a hemorrhagic stroke model」、BRAINRESEARCH、1183、(2007)、43-50

【非特許文献12】Chris Hyunchul Jo, et al、「Intra-Articular Injection of Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Osteoarthritis of the Knee: A Proof-of-Concept Clinical Trial」、STEM CELLS、32、(2014)、1254-1266

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、従来の有血清培地で増殖培養及び拡大培養された脂肪由来間葉系幹細胞は、治療効果を発揮させるためには、患者に多量に投与する必要がある。そこで、本発明は、少量の投与量で疾患の治療に有用な脂肪組織由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の培養方法、及び治療薬を提供することを目的の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の態様によれば、脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、血清を含む培地で間葉系幹細胞を初代培養し、初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、脂肪組織由来間葉系幹細胞が提供される。

【0007】

また、本発明の態様によれば、脂肪組織から間葉系幹細胞を分離することと、血清を含む培地で間葉系幹細胞を初代培養することと、初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養することと、を含む、脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養方法が提供される。

【0008】

初代培養の培地に含まれる血清が、脂肪組織を採取した検体由来の血清であってもよい。初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下であってもよい。初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下であってもよい。

【0009】

上記の脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性であってもよい。上記の脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有していてもよい。

【0010】

さらに、本発明の態様によれば、脂肪組織由来間葉系幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の治療薬であって、脂肪組織由来間葉系幹細胞が、脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、血清を含む培地で間葉系幹細胞を初代培養し、初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、アトピー性皮膚炎の治療薬が提供される。

【0011】

上記のアトピー性皮膚炎の治療薬において、脂肪組織が患者の自己脂肪組織であってもよい。

【0012】

上記のアトピー性皮膚炎の治療薬は、患者に静脈投与されてもよい。この場合、上記のアトピー性皮膚炎の治療薬において、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下、又は５千万個以下であってもよい。

【0013】

上記のアトピー性皮膚炎の治療薬は、患者の患部に局注投与されてもよい。この場合、上記のアトピー性皮膚炎の治療薬において、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５千万個以下であってもよい。

【0014】

上記のアトピー性皮膚炎の治療薬において、初代培養の培地に含まれる血清が、脂肪組織を採取した検体由来の血清であってもよい。初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下であってもよい。初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下であってもよい。

【0015】

上記のアトピー性皮膚炎の治療薬に含まれる脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性であってもよい。脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有してもよい。

【0016】

またさらに、本発明の態様によれば、脳挫傷、脳梗塞、脳出血、突発性難聴、肩関節周囲炎、結核性脊椎炎、胸椎黄色靭帯骨化症、脊髄損傷、脊髄梗塞、頸部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰椎変性側弯症、腰椎症、関節リウマチ、及び変形性膝関節症からなる群から選択される疾患の治療薬であって、脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む治療薬であり、脂肪組織由来間葉系幹細胞が、脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、血清を含む培地で間葉系幹細胞を初代培養し、初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られた、疾患の治療薬が提供される。

【0017】

上記の疾患の治療薬において、脂肪組織が患者の自己脂肪組織であってもよい。

【0018】

上記の疾患の治療薬は、患者に静脈投与されてもよい。この場合、上記の疾患の治療薬において、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１億個以下、又は５千万個以下であってもよい。

【0019】

上記の疾患の治療薬は、患者の患部に局注投与されてもよい。この場合、上記の疾患の治療薬において、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５千万個以下であってもよい。

【0020】

上記の疾患の治療薬において、初代培養の培地に含まれる血清が、脂肪組織を採取した検体由来の血清であってもよい。初代培養の培地に含まれる血清の濃度が０．５体積％以上２０体積％以下であってもよい。初代培養の培地に含まれる血清の濃度が１体積％以上１０体積％以下であってもよい。

【0021】

上記の疾患の治療薬に含まれる脂肪組織由来間葉系幹細胞において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性であってもよい。脂肪組織由来間葉系幹細胞が、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有してもよい。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、少量の投与量で疾患の治療に有用な脂肪組織由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の培養方法、及び治療薬を提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】実施例２に係る脂肪細胞に分化した細胞である。

【図2】実施例３に係る軟骨細胞に分化した細胞である。

【図3】実施例４に係る骨芽細胞に分化した細胞である。

【図4】実施例５に係るフローサイトメトリーの結果を示す表である。

【図5】実施例６に係るＥＡＳＩの結果を示す表である。

【図6】実施例７に係る血液検査の基準値を示す表である。

【図7】実施例７に係るアトピー性皮膚炎の患者に対する治療効果を示す表である。

【図8】実施例８に係るリハビリテストの概要を示す表である。

【図9】実施例８に係るリハビリテストの概要を示す表である。

【図10】実施例８に係るリハビリテストの概要を示す表である。

【図11】実施例８に係る脳挫傷の患者に対する治療効果を示す表である。

【図12】実施例９に係る脳梗塞の患者に対する治療効果を示す表である。

【図13】実施例１０に係る脳梗塞の患者に対する治療効果を示す表である。

【図14】実施例１１に係る脳梗塞及び結核性脊椎炎の患者に対する治療効果を示す表である。

【図15】実施例１２に係る脳出血の患者に対する治療効果を示す表である。

【図16】実施例１３に係る脳出血の患者に対する治療効果を示す表である。

【図17】実施例１４に係る突発性難聴の患者に対する治療効果を示す表である。

【図18】実施例１５に係る肩関節周囲炎の患者に対する治療効果を示す表である。

【図19】実施例１６に係る肩関節周囲炎の患者に対する治療効果を示す表である。

【図20】実施例１７に係る胸椎黄色靭帯骨化症の患者に対する治療効果を示す表である。

【図21】実施例１８に係る脊髄損傷の患者に対する治療効果を示す表である。

【図22】実施例１９に係る脊髄損傷の患者に対する治療効果を示す表である。

【図23】実施例２０に係る脊髄損傷の患者に対する治療効果を示す表である。

【図24】実施例２１に係る脊髄梗塞の患者に対する治療効果を示す表である。

【図25】実施例２２に係る頸部脊柱管狭窄症の患者に対する治療効果を示す表である。

【図26】実施例２３に係る腰部脊柱管狭窄症の患者に対する治療効果を示す表である。

【図27】実施例２４に係る腰椎変性側弯症の患者に対する治療効果を示す表である。

【図28】実施例２５に係る腰椎症の患者に対する治療効果を示す表である。

【図29】実施例２６に係る関節リウマチの患者に対する治療効果を示す表である。

【図30】実施例２７に係る変形性膝関節症の患者に対する治療効果を示す、関節鏡検査で得られた写真である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下に本発明の実施の形態を説明する。ただし、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。したがて、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

【0025】

本発明の実施の形態に係る脂肪組織由来間葉系幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ）は、脂肪組織から間葉系幹細胞を分離し、血清を含む培地で間葉系幹細胞を初代培養し、初代培養から継代された間葉系幹細胞を無血清培地で増殖培養して得られる。

【0026】

脂肪組織は、例えばヒト等のほ乳類から外科的切除されて得られる。外科的切除の際には、局所麻酔をしてもよい。あるいは、脂肪組織は、カテーテルを腹部、大腿部、又は臀部の皮下脂肪組織に挿管することによって、吸引により得られてもよい。得られる脂肪組織の量は、例えば１ｇから１００ｇ、２ｇから５０ｇ、２ｇから４０ｇ、あるいは２ｇから２０ｇであるが、これらに限定されない。

【0027】

得られた脂肪組織は、肉眼試験で、腫瘍性病変がないこと、汚染がないことが確認されることが好ましい。また、脂肪組織は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、及びＴＰＨＡ／ＲＰＲがいずれも陰性であることが確認されることが好ましい。さらに、脂肪組織は、マイコプラズマが１２８倍未満（ＰＡ法）、単純ヘルペスが３２０倍未満（ＣＦ法）であることが確認されることが好ましい。

【0028】

得られた脂肪組織は、例えば生理食塩水で洗浄され、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に０．１％の濃度で希釈されたコラゲナーゼを含む溶液に３７℃で７０分間浸され、分散される。脂肪組織から分散された脂肪組織由来細胞は、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離される。さらに、遠心分離によって得られた間質血管細胞群（ＳＶＦ：ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）を溶液で希釈し、１００μｍのナイロンメッシュで濾過する。濾過された細胞は、ＭＥＭαで洗浄される。

【0029】

遠心分離及び濾過された細胞は、血清を含む培地で無菌的に初代培養される。血清を含む培地としては、例えば、初代間葉系幹細胞用無血清培地ＳＴＫ１（登録商標、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）と、α改変最小必須培地（ＭＥＭα、ライフテクノロジーズ社）と、を混合した後、血清を添加した培地が使用可能である。ＳＴＫ１と、ＭＥＭαと、の混合体積比は、１００：０から１０：９０、あるいは７５：２５から２５：７５、好ましくは５０：５０である。なお、ＭＥＭαの代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、及びＭＥＭ等も使用可能である。ＳＴＫ１に対するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はＭＥＭの体積比は、ＭＥＭαと同様である。血清を含む培地における血清の濃度は、０．５体積％以上２０体積％以下、好ましくは１体積％以上１０体積％以下、より好ましくは１体積％以上２体積％以下である。初代培養の培地に含まれる血清は、脂肪組織を採取した検体由来の血清であってもよいし、脂肪組織を採取した検体以外の検体由来の血清であってもよい。血清は、例えば、検体から３ｍＬ以上の血液を採取することにより用意される。

【0030】

初代培養とは、継代操作を行う前の培養を意味する。初代培養は、例えば、Ｔ−２５フラスコ等の培養容器を用いて、５％二酸化炭素含有空気下、３７℃で行われる。初代培養開始後、３日目に培地を交換し、以後、細胞が７０％から９０％コンフルエトになるまで１日おきに培地を交換する。１０日ほどで細胞が７０％から９０％コンフルエトになったら、細胞剥離剤を用いて、初代培養の培養容器から細胞を剥離する。細胞剥離剤としては、哺乳動物及びバクテリア成分を含まないＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標、ライフテクノロジーズ社等）、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ライフテクノロジーズ社）、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズ社）、及びＴｒｙｐＺｅａｎ（シグマ社）等が使用可能である。以下に説明する継代においても、同様である。

【0031】

初代培養で回収される細胞の総数は、例えば４０万個以上である。細胞の生存率は、７０％以上であることが好ましい。

【0032】

初代培養の培養容器から剥離した細胞は、無血清培地で無菌的に増殖培養される。無血清培地としては、例えば、間葉系幹細胞用無血清培地ＳＴＫ２（登録商標、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）と、α改変最小必須培地（ＭＥＭα、ライフテクノロジーズ社）と、を混合した培地が使用可能である。ＳＴＫ２と、ＭＥＭαと、の混合体積比は、１００：０から１０：９０、あるいは７５：２５から２５：７５、好ましくは５０：５０である。なお、ＭＥＭαの代わりに、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、及びＭＥＭ等も使用可能である。ＳＴＫ２に対するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はＭＥＭの体積比は、ＭＥＭαと同様である。

【0033】

増殖培養は、例えば、Ｔ−７５フラスコ等の培養容器を用いて、５％二酸化炭素含有空気下、３７℃で行われる。継代時、細胞は、例えば約５０００細胞／ｃｍ²から約８０００細胞／ｃｍ²の密度で播種される。増殖培養開始後、細胞がコンフルエトになるまで１日おきに培地を交換する。２週間ほどで細胞がコンフルエトになったら、例えば、Ｔ−１７５フラスコ等のより大きな培養容器に細胞を継代する。Ｔ−１７５フラスコ内で細胞がコンフルエトになったら、例えば、Ｔ−５２５フラスコ等のより大きな培養容器に細胞を継代する。増殖培養中において、培養容器の大きさ以外は、同一の培養条件を用いる。

【0034】

Ｔ−５２５フラスコ内で細胞がコンフルエトになったら、例えば、Ｔ−８７５フラスコ等のより大きな培養容器に細胞を継代し、無菌的に拡大培養を行う。増殖培養で回収される細胞の総数は、例えば２０００万個以上である。細胞の生存率は、７０％以上であることが好ましい。拡大培養の培養条件は、例えば、培地の交換を半量ずつ行うこと以外は、増殖培養の培養条件と同じである。４日から６日ほどで細胞がコンフルエトになったら、細胞剥離剤を用いて、拡大培養の培養容器から細胞を剥離する。これにより、実施の形態に係る脂肪組織由来間葉系幹細胞が得られる。

【0035】

初代培養においても、無血清培地を用いると、脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養は困難とされている。これに対し、初代培養にのみ血清を含む培地を用いると、その後の増殖培養及び拡大培養において無血清培地を用いても、脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養が可能となる。

【0036】

拡大培養で回収される細胞の総数は、例えば４０００万個以上である。細胞の生存率は、７０％以上であることが好ましい。なお、拡大培養終了後、培養液上清を回収し、感染症検査をしてもよい。例えば、微生物限度試験において、コロニーが認められないこと、マイコプラズマ否定試験において、陰性であること、エンドトキシン試験において、０．２５ＥＵ／ｍＬ未満であること、を確認してもよい。

【0037】

実施の形態に係る脂肪組織由来間葉系幹細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４が陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが陰性である。また、実施の形態に係る脂肪組織由来間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞への分化能を有する。また、実施の形態に係る脂肪組織由来間葉系幹細胞は、プラスチックプレートに対して接着性を有する。

【0038】

上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞は、凍結保存液に分散させ、必要になるまで液体窒素を用いて―８０℃で凍結保存してもよい。凍結保存液としては、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標、タカラバイオ株式会社）、バンバンカー（日本ジェネティクス株式会社）、及びラボバンカー（登録商標）２（十慈フィールド株式会社）等が使用可能である。凍結された脂肪組織由来間葉系幹細胞は、必要とされるときに解凍及び洗浄され、例えば水性注射剤等の水性溶液に添加される。解凍時の脂肪組織由来間葉系幹細胞の生存率は、例えば９０％以上、あるいは９５％以上である。水性注射剤としては、ラクテック（登録商標）注（株式会社大塚製薬工場）等の乳酸リンゲル液が使用可能である。他に、水性注射剤としては、ソルラクト（登録商標）輸液（テルモ株式会社）、及びハルトマン液「コバヤシ」（共和クリティケア株式会社）も使用可能である。脂肪組織由来間葉系幹細胞は、水性注射剤に、例えば、１千万個／ｍＬの濃度となるよう、添加される。脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する注射剤は、注射筒に充填され、密閉される。脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する注射剤は、例えば４℃から１０℃で２４時間保存可能である。

【0039】

上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞は、例えば、アトピー性皮膚炎の治療に有用である。

【0040】

本発明の実施の形態に係るアトピー性皮膚炎の治療薬は、上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を有効成分として含む。実施の形態に係るアトピー性皮膚炎の治療薬は、上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を有効成分として含み、当該脂肪組織由来間葉系幹細胞が、水性注射剤等の水性溶液に分散している静脈内投与用注射剤であってもよい。

【0041】

アトピー性皮膚炎の治療薬に含まれる間葉系幹細胞は、例えば、アトピー性皮膚炎の患者の自己脂肪組織由来であってもよいし、他者の脂肪組織由来であってもよい。脂肪組織由来間葉系幹細胞を含むアトピー性皮膚炎の治療薬は、患者に例えば静脈投与される。例えば脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む水性注射剤２５０ｍＬを含む点滴パックが用意される。

【0042】

その後、患者の肘窩皮静脈に２０Ｇ留置針でルートを確保し、脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む水性注射剤を患者に点滴することを開始する。点滴開始後、１０分毎に点滴パックを振盪し、点滴パック内の脂肪組織由来間葉系幹細胞の沈殿を防ぐとよい。例えば、２５０ｍＬの脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む水性注射剤を、１時間かけて滴下する（約８０滴／分）。

【0043】

アトピー性皮膚炎の治療において、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数は、例えば１千万個以上、あるいは２千万個以上であり、かつ、１億個以下、９千万個以下、８千万個以下、７千万個以下、６千万個以下、５千万個以下、４千万個以下、あるいは３千万個以下である。例えば、アトピー性皮膚炎の患者に、脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、１回目の静脈投与の５日後、６日後、１週間後、あるいは１週間から２週間後に、脂肪組織由来間葉系幹細胞の２回目の静脈投与をしてもよい。上記期間内にされる１回目と２回目に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の合計が、１億個以下であってもよい。

【0044】

例えば、アトピー性皮膚炎の患者に、１回目に３５００万から４０００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、５日後、６日後、１週間後、あるいは１週間から２週間後の２回目に、２５００万から３０００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与してもよい。

【0045】

また、アトピー性皮膚炎の治療薬は、アトピー性皮膚炎の患者の患部に局注投与されてもよい。この場合、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数は、例えば１千万個以上であり、かつ、５千万個以下、４千万個以下、３千万個以下、あるいは２千万個以下である。

【0046】

従来、アトピー性皮膚炎の治療において、１回当たり患者に投与される、有血清培地で増殖培養及び拡大培養された間葉系幹細胞の数は、２億個以上である。しかし、多量の幹細胞を静脈投与すると、静脈に細胞が詰まる懸念がある。また、例えば、４億個の幹細胞を投与された患者が、投与後、血栓が肺動脈に詰まる肺塞栓で死亡した事例があり、多量の幹細胞を一度に投与することを躊躇する医師もいる。これに対し、上記の培養方法で培養された脂肪組織由来間葉系幹細胞は、治療効果が高いため、１回当たりの投与数を減らすことが可能となり、ひいては投与時間（点滴時間）を短縮することが可能となる。そのため、治療の安全性を高め、かつ、患者の治療による苦痛を低減することが可能となる。

【0047】

また、アトピー性皮膚炎に対する治療は、これまで外用療法が主体であり、ステロイド外用薬が用いられてきている。ステロイド外用薬は、適切に使用すれば優れた治療効果を得られるが、皮膚萎縮、毛細血管拡張などの局所的副作用に注意が必要である。これに対し、上記の培養方法で培養された脂肪組織由来間葉系幹細胞は、副作用を抑制することが可能となる。

【0048】

また、上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞は、アトピー性皮膚炎以外の、例えば、脳挫傷、脳梗塞、脳出血、突発性難聴、肩関節周囲炎、結核性脊椎炎、胸椎黄色靭帯骨化症、脊髄損傷、脊髄梗塞、頸部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰椎変性側弯症、腰椎症、関節リウマチ、及び変形性膝関節症等の疾患の治療にも有用である。

【0049】

本発明の実施の形態に係る疾患の治療薬は、上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を有効成分として含む。実施の形態に係る疾患の治療薬は、上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を有効成分として含み、当該脂肪組織由来間葉系幹細胞が、水性注射剤等の水性溶液に分散している静脈内投与用注射剤であってもよい。

【0050】

疾患の治療薬に含まれる間葉系幹細胞は、例えば、疾患の患者の自己脂肪組織由来であってもよいし、他者の脂肪組織由来であってもよい。脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む疾患の治療薬は、患者に例えば静脈投与される。例えば脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む水性注射剤２５０ｍＬを含む点滴パックが用意される。

【0051】

その後、患者の肘窩皮静脈に２０Ｇ留置針でルートを確保し、脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む水性注射剤を患者に点滴することを開始する。点滴開始後、１０分毎に点滴パックを振盪し、点滴パック内の脂肪組織由来間葉系幹細胞の沈殿を防ぐとよい。例えば、２５０ｍＬの脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む水性注射剤を、１時間かけて滴下する（約８０滴／分）。

【0052】

疾患の治療において、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数は、例えば１千万個以上、あるいは２千万個以上であり、かつ、１億個以下、９千万個以下、８千万個以下、７千万個以下、６千万個以下、５千万個以下、４千万個以下、あるいは３千万個以下である。例えば、疾患の患者に、脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、１回目の静脈投与の５日後、６日後、１週間後、あるいは１週間から２週間後に、脂肪組織由来間葉系幹細胞の２回目の静脈投与をしてもよい。上記期間内にされる１回目と２回目に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の合計が、１億個以下であってもよい。

【0053】

例えば、疾患の患者に、１回目に３５００万から４０００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、５日後、６日後、１週間後、あるいは１週間から２週間後の２回目に、２５００万から３０００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与してもよい。

【0054】

また、疾患の治療薬は、疾患の患者の患部に局注投与されてもよい。この場合、１回当たり患者に投与される脂肪組織由来間葉系幹細胞の数は、例えば１千万個以上であり、かつ、５千万個以下、４千万個以下、３千万個以下、あるいは２千万個以下である。

【0055】

従来、アトピー性皮膚炎以外の疾患の治療においても、１回当たり患者に投与される、有血清培地で増殖培養及び拡大培養された間葉系幹細胞の数は多い。これに対し、上記の培養方法で培養された脂肪組織由来間葉系幹細胞は、アトピー性皮膚炎以外の疾患に対しても治療効果が高いため、１回当たりの投与数を減らすことが可能となり、ひいては投与時間（点滴時間）を短縮することが可能となる。

【0056】

（実施例１）
アトピー性皮膚炎の患者から、湿重量が５．５８ｇの皮下脂肪組織を、局所麻酔下の手術によって採取した。得られた脂肪組織は、肉眼試験で、腫瘍性病変がないこと、汚染がないことが確認され、目視観察で、体積が２．５ｍＬ以上あることが確認された。また、脂肪組織は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、及びＴＰＨＡ／ＲＰＲがいずれも陰性であることが確認された。さらに、脂肪組織は、マイコプラズマが１２８倍未満（ＰＡ法）、単純ヘルペスが３２０倍未満（ＣＦ法）であることが確認された。

【0057】

得られた脂肪組織は、生理食塩水で洗浄され、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に０．１％の濃度で希釈されたコラゲナーゼを含む溶液に３７℃で７０分間浸され、分散された。脂肪組織から分散された脂肪組織由来細胞は、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。さらに、遠心分離によって得られた間質血管細胞群（ＳＶＦ：ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）を溶液で希釈し、１００μｍのナイロンメッシュで濾過した。濾過された細胞を、ＭＥＭα（ライフテクノロジーズ社）で洗浄した。

【0058】

遠心分離及び濾過された細胞は、血清を含む培地で無菌的に初代培養された。血清を含む培地としては、初代間葉系幹細胞用無血清培地ＳＴＫ１（登録商標、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）と、α改変最小必須培地（ＭＥＭα、ライフテクノロジーズ社）と、を１：１（体積比）で混合した後、血清を添加した培地を使用した。血清を含む培地における血清の濃度は、１体積％であった。血清は、脂肪組織を採取したアトピー性皮膚炎の患者から３ｍＬ以上の血液を採取することにより用意された。

【0059】

初代培養は、Ｔ−２５フラスコを用いて、５％二酸化炭素含有空気下、３７℃で行った。初代培養開始後、３日目に培地を交換し、以後、細胞が約７０％コンフルエトになるまで１日おきに培地を交換した。８日で細胞が７０％コンフルエトになったら、細胞剥離剤を用いて、Ｔ−２５フラスコから細胞を剥離した。細胞剥離剤としては、哺乳動物及びバクテリア成分を含まないＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標、ライフテクノロジーズ社）を用いた。以下に説明する継代においても、同様である。

【0060】

初代培養で回収された細胞の総数は、３８万個であった。細胞の生存率は、１００％であった。

【0061】

初代培養の培養容器から剥離した細胞は、無血清培地で無菌的に増殖培養された。無血清培地としては、間葉系幹細胞用無血清培地ＳＴＫ２（登録商標、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）と、α改変最小必須培地（ＭＥＭα、ライフテクノロジーズ社）と、を１：１（体積比）で混合した培地を使用した。

【0062】

増殖培養は、最初に、Ｔ−７５フラスコを用いて、５％二酸化炭素含有空気下、３７℃で行われた。継代時、細胞は、５０００細胞／ｃｍ²の密度で播種された。増殖培養開始後、細胞がコンフルエトになるまで１日おきに培地を交換した。細胞がコンフルエトになったら、Ｔ−１７５フラスコに細胞を継代した。Ｔ−１７５フラスコ内で細胞がコンフルエトになったら、Ｔ−５２５フラスコに細胞を継代した。増殖培養中において、フラスコの大きさ以外は、同一の培養条件を用いた。

【0063】

Ｔ−５２５フラスコ内で細胞がコンフルエトになったら、Ｔ−８７５フラスコに細胞を継代し、無菌的に拡大培養を行った。拡大培養で回収された細胞の総数は、９４５０万個であった。細胞の生存率は、９８．６％であった。拡大培養の培養条件は、培地の交換を半量ずつ行うこと以外は、増殖培養の培養条件と同じであった。４日で細胞がコンフルエトになったら、細胞剥離剤を用いて、Ｔ−８７５フラスコから細胞を剥離し、脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。培養期間は、合計して２１日間であった。

【0064】

拡大培養で回収される細胞の総数は、約９４５０万個であった。細胞の生存率は、９８．６％であった。なお、拡大培養終了後、培養液上清を回収し、微生物限度試験において、コロニーが認められないこと、マイコプラズマ否定試験において、陰性であること、エンドトキシン試験において、０．２５ＥＵ／ｍＬ未満であること、を確認した。

【0065】

上記の培養方法で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞は、凍結保存液（ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ、登録商標、タカラバイオ株式会社）に分散させ、必要になるまでディープフリーザーを用いて―８０℃で凍結保存した。

【0066】

（実施例２）
実施例１と同じ培養方法を用いて、２名の検体（腰椎症と脊髄損傷の患者）由来の脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、脂肪細胞分化試薬を含む培地（ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、登録商標、ライフテクノロジーズ社）で３７℃、５％ＣＯ₂加空気の気相下で１４日間培養し、脂肪細胞への分化を誘導した。細胞をオイルレッドＯ（シグマ社、カタログナンバー：Ｏ０６２５）で染色したところ、図１に示すように、両方の検体由来の細胞が染色された。さらに、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いたＲＴ−ＰＣＲによる定性試験により、両方の検体由来の細胞において、ＰＰＡＧｇ２遺伝子の発現が上昇していることが確認された。よって、脂肪組織由来間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化したことが確認された。

【0067】

（実施例３）
実施例２で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、軟骨細胞分化試薬を含む培地（ＳｔｅｍＰｒｏ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、登録商標、ライフテクノロジーズ社）で３７℃、５％ＣＯ₂加空気の気相下で２１日間培養し、軟骨細胞への分化を誘導した。細胞をアルシアンブルー（和光純薬工業株式会社）で染色したところ、図２に示すように、両方の検体由来の細胞が染色された。よって、脂肪組織由来間葉系幹細胞が軟骨細胞に分化したことが確認された。

【0068】

（実施例４）
実施例２で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、骨芽細胞分化試薬を含む培地（ＳｔｅｍＰｒｏ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、登録商標、ライフテクノロジーズ社）で３７℃、５％ＣＯ₂加空気の気相下で２１日間培養し、骨芽細胞への分化を誘導した。細胞をアリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で染色したところ、図３に示すように、両方の検体由来の細胞が染色された。さらに、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いたＲＴ−ＰＣＲによる定性試験により、両方の検体由来の細胞において、アルカリフォスファターゼ遺伝子の発現が上昇していることが確認された。よって、脂肪組織由来間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化したことが確認された。

【0069】

（実施例５）
ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社）により、実施例２で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞の細胞表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲ）を解析した。ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４の陽性率は、図４に示すとおりであった。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲの陽性率は、いずれも０．３％であった。表面マーカーの解析結果から、実施例２で得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞には造血系幹細胞が含まれていないことが確認された。

【0070】

（実施例６）
実施例１の患者は、当時３３才の女性であり、幼少期よりアトピー性皮膚炎に苦しんでいた。脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与前において、頭頚部、体幹部、及び下肢に、紅斑、苔癬化、丘疹、及び掻破痕の症状が軽度に出ていた。また、上肢に、紅斑、及び掻破痕の症状が中等度に出ていた。さらに、上肢に、丘疹、及び苔癬化の症状が重度に出ていた。脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与前における実施例１の患者のＥＡＳＩ（Ｅｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）による重症度分類を行った。結果を図５に示す。頭頚部、体幹部、上肢、及び下肢の合計点の総計は２４．８点であった。なお、ＥＡＳＩにおいて、重症度の最高点は７２点となる。

【0071】

実施例１で得られた、凍結された脂肪組織由来間葉系幹細胞を、解凍及び洗浄し、ラクテック（登録商標）注（株式会社大塚製薬工場）に分散させ、３９１０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞が分散されたラクテック（登録商標）注２５０ｍＬを用意した。解凍した脂肪組織由来間葉系幹細胞の生存率は９７．９％であった。その後、実施例１の患者の肘窩皮静脈に２０Ｇ留置針でルートを確保し、脂肪組織由来間葉系幹細胞を含むラクテック（登録商標）注を患者に点滴することを開始した。点滴開始後、１０分毎に点滴パックを振盪し、点滴パック内の脂肪組織由来間葉系幹細胞の沈殿を防いだ。２５０ｍＬの脂肪組織由来間葉系幹細胞を含む水性注射剤を、１時間かけて滴下した（約８０滴／分）。これを１回目の静脈投与とした。実施例１の患者には、１回目の静脈投与後、ステロイド外用薬の塗布等、他の治療手段を併用しなかった。

【0072】

１回目の静脈投与から１週間後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が２９１５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１の患者に２回目の静脈投与を行った。なお、２回目の投与時に解凍した脂肪組織由来間葉系幹細胞の生存率は９７．７％であった。１回目の静脈投与から４ヶ月後、実施例１の患者のＥＡＳＩによる重症度分類を行った。結果を図５に示す。頭頚部、体幹部、上肢、及び下肢の合計点の総計は１４．０点であった。したがって、１回目の静脈投与前と比較して、ＥＡＳＩの点数において４割程度改善していた。

【0073】

また、掻痒感が減少した、頭頚部は苔癬化のみ軽度に残り、紅斑、掻破痕、及び丘疹は消失した、体幹部は丘疹が消失した、下肢は丘疹、及び掻破痕が消失した、上肢は紅斑、丘疹、及び掻破痕の症状が軽度へと改善した、との医師の所見を得た。

【0074】

（実施例７）
実施例６の１回目の投与から７ヶ月後に、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が７２００万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１の患者に３回目の静脈投与を行った。また、同日に、実施例１の患者の右手足に、合計２４００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を局注した。なお、局注した脂肪組織由来間葉系幹細胞も、実施例１で得られた細胞である。

【0075】

実施例６の１回目の投与から８ヶ月後に、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が３６６５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１の患者に４回目の静脈投与を行った。また、同日に、実施例１の患者の右手足に、合計１３３５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を局注した。なお、局注した脂肪組織由来間葉系幹細胞も、実施例１で得られた細胞である。

【0076】

実施例６の１回目の投与前、１回目投与から４ヶ月後、１回目投与から７ヶ月後、１回目投与から８ヶ月後、及び１回目投与から８ヶ月８日後（４回目投与後）に、血液検査等を行った。正常な検体の血液検査の基準値は、図６に示すとおりである。図７に示すように、実施例１の患者は、２００ＩＵ／ｍＬ以上であると高いとされるＩｇＥについて、１回目投与前が３４０１ＩＵ／ｍＬであったのが、１回目投与から４ヶ月後には、３１３６ＩＵ／ｍＬに減少していた。また、湿疹病変の広がり具合の指標となる乳酸脱水酵素（ＬＤＨ）については、１回目投与前が３６１Ｕ／Ｌであったのが、１回目投与から４ヶ月後には、１９３Ｕ／Ｌに減少した。通常２％から５％である、病勢の推移を判断する目安となる好酸球（Ｅｏｓｉｎｏ）については、１４．３％から５．０％に減少した。炎症の強さに比例する傾向にあり、４５０ｐｇ／ｍＬ未満が基準値とされ、７００ｐｇ／ｍＬを超えると中等以上の重症度とされるＴＡＲＣについては、１回目投与前が３４８８ｐｇ／ｍＬであったのが、１回目投与から４ヶ月後には、５３９ｐｇ／ｍＬに減少した。

【0077】

したがって、１回目の投与と、１回目の投与から１週間後の２回目の投与をすれば、１回目の投与から４ヶ月間、投与の効果が持続することが示された。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0078】

（実施例８）
発症から２２年経過している、４４才の男性の脳挫傷の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、２７２０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例８の患者には、１回目の静脈投与後、リハビリ以外は他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から６日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が２７９５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例８の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0079】

１回目の静脈投与から２ヶ月１４日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が４２５２万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例８の患者に３回目の静脈投与を行った。さらに、１回目の静脈投与から３ヶ月１１日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が４８２０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例８の患者に４回目の静脈投与を行った。

【0080】

実施例８の患者には、血液検査等の他、図８、図９、及び図１０に示すようなリハビリテストを施した。結果を図１１に示す。実施例８の患者には、１回目の投与前は、発話が明瞭でない、まっすぐ座れない、及び立位保持ができない等の障害があったが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与により、発話が明瞭になり、歩行器を用いて歩行できるようになった。また、少し発語が多くなり、車椅子移乗もゆっくり行えるようになった。さらに、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0081】

（実施例９）
発症から２年１１ヶ月経過している、３９才の女性の脳梗塞の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、２８４５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例９の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から６日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が２２５０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例９の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0082】

１回目の静脈投与から４ヶ月２７日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が６９８５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例９の患者に３回目の静脈投与を行った。さらに、１回目の静脈投与から５ヶ月３日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が６５７０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例９の患者に４回目の静脈投与を行った。

【0083】

その結果、図１２に示すように、実施例９の患者は、１回目の投与前は、呼吸機能に異常がみられたが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与により、呼吸機能が改善した。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0084】

（実施例１０）
発症から１年５ヶ月経過している、６０才の男性の脳梗塞の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、５９９５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例１０の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から２１日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５００５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１０の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0085】

その結果、図１３に示すように、実施例１０の患者は、１回目の投与前は、上肢にしびれがあり、足の動きに障害があったが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与により、上肢のしびれ及び足の動きに改善がみられた。また、１回目の投与前は、立ち上がって歩くまでに立ちくらみ様の感じがあったが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与により、立ちくらみ様の感じがなくなり、立ち上がって歩くまでがスムーズになった。さらに、１回目の投与前は、歩行２０分で足が重くなったが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与により、１時間の歩行が可能になった。加えて、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0086】

（実施例１１）
発症から１１年９ヶ月経過している、７０才の男性の脳梗塞及び結核性脊椎炎の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、４６２０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例１１の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から６日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が４９００万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１１の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0087】

その結果、図１４に示すように、実施例１１の患者は、１回目の投与前は、車いすへの移乗が不可能であり、左下肢に疼痛があったが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与により、車いすへの移乗が可能になり、左下肢の疼痛に改善がみられた。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0088】

（実施例１２）
発症から７年経過している、６２才の男性の脳出血の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、４３７５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例１２の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から６日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５４６５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１２の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0089】

その結果、図１５に示すように、実施例１２の患者は、１回目の投与前は、歩行障害、腰回りの痛み、及び左上肢の失調症状があったが、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与により、歩行障害、腰回りの痛み、及び左上肢の失調症状に改善がみられ、呼吸機能においてスパイログラムが正常となった。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0090】

（実施例１３）
発症から１年９ヶ月経過している、５５才の男性の脳出血の患者に、サイトリ・セラピューティクス株式会社のセルーション遠心分離器を用いて採取された脂肪組織由来再生細胞を投与した。セルーション遠心分離器を用いて採取された脂肪組織由来再生細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、マクロファージ、及び血球等から構成される、粗精製細胞群であった。さらに、当該患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、粗精製細胞群の投与から１ヶ月４日後、７７６０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例１３の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から７日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５０９０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１３の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0091】

その結果、図１６に示すように、実施例１３の患者は、治療により、リハビリの評価が向上した。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0092】

（実施例１４）
発症から３年ほど経過している、４０才の男性の突発性難聴の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、６７０５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例１４の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から８日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５４１０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１４の患者に２回目の静脈投与を行った。さらに、１回目の静脈投与から３ヶ月１９日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５９９０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１４の患者に３回目の静脈投与を行った。

【0093】

その結果、図１７に示すように、実施例１４の患者は、治療により、ＩＶからＶ波が誘発されるようになった。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0094】

（実施例１５）
発症から３年ほど経過している、７３才の男性の肩関節周囲炎の患者に、セルーション遠心分離器を用いて採取された粗精製細胞群を投与した。さらに、当該患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、粗精製細胞群の投与から１ヶ月３日後、５０００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与した。また、同日に、当該患者に、１３２０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を肩に局注した。実施例１５の患者には、他の治療手段を併用しなかった。

【0095】

その結果、図１８に示すように、実施例１５の患者は、治療により、数値上の変化は特になかったが、痛みが減少、腕が上がるようになった。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0096】

（実施例１６）
発症から１年ほど経過している、７１才の女性の肩関節周囲炎の患者に、セルーション遠心分離器を用いて採取された粗精製細胞群を投与した。さらに、当該患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、粗精製細胞群の投与から２ヶ月３日後、４０００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与した。また、同日に、当該患者に、１５２０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を肩に局注した。実施例１６の患者には、他の治療手段を併用しなかった。

【0097】

その結果、図１９に示すように、実施例１６の患者は、治療により、数値上の変化は特になかったが、痛みが減少、腕が上がるようになった。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0098】

（実施例１７）
発症から４ヶ月経過している、図２０に示す３３才の男性の胸椎黄色靭帯骨化症の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、１３００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与した。実施例１７の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。

【0099】

その結果、実施例１７の患者は、治療により、歩行がスムーズになった。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0100】

（実施例１８）
発症から３年８ヶ月経過している、６８才の男性の脊髄損傷の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、２７８５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例１８の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から１３日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が２４８０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１８の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0101】

１回目の静脈投与から４ヶ月１２日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が４６４５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１８の患者に３回目の静脈投与を行った。さらに、１回目の静脈投与から５ヶ月３日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が４５２０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１８の患者に４回目の静脈投与を行った。

【0102】

その結果、図２１に示すように、実施例１８の患者は、治療により、リハビリの評価が向上し、両足首が動くようになり、右肩疼痛がなくなり、挙上可能となった。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0103】

（実施例１９）
発症から７年経過している、３９才の男性の脊髄損傷の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、８９２０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例１９の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から２１日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が４７５０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例１９の患者に２回目の静脈投与を行った。また、２回目の静脈投与と同日に、１０００万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を右足に局注した。

【0104】

その結果、図２２に示すように、実施例１９の患者には、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0105】

（実施例２０）
発症から４ヶ月経過している、３３才の男性の脊髄損傷の患者に、セルーション遠心分離器を用いて採取された粗精製細胞群を投与した。さらに、当該患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。粗精製細胞群の投与から２ヶ月４日後、実施例６と同様の方法で、当該患者に、５８９０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例２０の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から１３日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５３００万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２０の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0106】

１回目の静脈投与から３ヶ月４日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が７２２０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２０の患者に３回目の静脈投与を行った。さらに、１回目の静脈投与から３ヶ月２１日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５０００万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２０の患者に４回目の静脈投与を行った。また、４回目の静脈投与と同日に、２４３５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を下肢筋に局注した。

【0107】

その結果、図２３に示すように、実施例２０の患者は、治療により、歩行が不可能であったのが、自立して杖で歩けるようになった。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0108】

（実施例２１）
発症から１年経過している、６８才の女性の脊髄梗塞の患者に、セルーション遠心分離器を用いて採取された粗精製細胞群を投与した。さらに、当該患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。粗精製細胞群の投与から１ヶ月２８日後、実施例６と同様の方法で、当該患者に、５４６５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例２１の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から７日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が４１２０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２１の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0109】

１回目の静脈投与から１ヶ月２４日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が６０４０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２１の患者に３回目の静脈投与を行った。さらに、１回目の静脈投与から２ヶ月後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が６５４０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２１の患者に４回目の静脈投与を行った。

【0110】

その結果、図２４に示すように、実施例２１の患者は、治療により、歩行が困難であったのが改善された。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0111】

（実施例２２）
発症から４ヶ月経過している、５４才の男性の頸部脊柱管狭窄症の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、９６９０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例２２の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から１ヶ月日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が８０３５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２２の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0112】

その結果、図２５に示すように、実施例２２の患者は、治療により、リハビリの評価が向上した。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0113】

（実施例２３）
発症から５年経過している、６７才の男性の腰部脊柱管狭窄症の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、４５７０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例２３の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。

【0114】

１回目の静脈投与から７日後、実施例２３の患者にセルーション遠心分離器を用いて採取された粗精製細胞群を投与した。さらに１回目の静脈投与から６ヶ月１５日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が５０００万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２３の患者に２回目の静脈投与を行った。また、２回目の静脈投与の同日に、実施例２３の患者の右上腕、両大腿、背中、及び両鼻粘膜に、合計３３５０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を局注した。

【0115】

その結果、実施例２３の患者は、治療により、耐久力が向上した。また、図２６に示すように、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0116】

（実施例２４）
発症から４月経過している、６８才の女性の腰椎変性側弯症の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、８１８５万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例２４の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。

【0117】

その結果、図２７に示すように、実施例２４の患者は、治療により、立位可能となり、疼痛が改善した。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0118】

（実施例２５）
９１才の女性の腰椎症の患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、６０６０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例２５の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。

【0119】

１回目の静脈投与から５日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が７０３５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２５の患者に２回目の静脈投与を行った。さらに、１回目の静脈投与から２ヶ月２３日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が７１９０万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２５の患者に３回目の静脈投与を行った。

【0120】

その結果、実施例２５の患者は、治療により、痛みが軽減した。また、図２８に示すように、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0121】

（実施例２６）
６５才の男性の関節リウマチの患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。実施例６と同様の方法で、当該患者に、３４８０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を静脈投与し、これを１回目の静脈投与とした。実施例２６の患者には、１回目の静脈投与後、他の治療手段を併用しなかった。１回目の静脈投与から１４日後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の数が１８９５万個である以外は、１回目の静脈投与と同じ条件で、実施例２６の患者に２回目の静脈投与を行った。

【0122】

その結果、図２９に示すように、実施例２６の患者には、脂肪組織由来間葉系幹細胞を投与したことによる副作用は確認されなかった。

【0123】

（実施例２７）
疼痛発症から約５年経過している右変形性膝関節症の５２歳男性患者から、実施例１と同様の方法で脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。当該患者に、全身麻酔を施し、関節鏡視下で、当該患者の右膝関節の損傷して剥離しかかっていた大腿骨内顆部の軟骨片の一部を除去し、露出した軟骨欠損部（軟骨下骨）を２．０ｍｍ径のキルシュナー鋼線を用いて数ヶ所穿孔した。その後、右膝関節内へ６８６０万個の脂肪組織由来間葉系幹細胞を注射投与した。細胞投与前の関節鏡検査で得られた写真を図３０（ａ）に示す。

【0124】

その結果、実施例２７の患者は、ＪＫＯＭ（変形性膝関節症患者機能評価尺度）の評価が、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与前が６９点であったのに対し、投与３カ月後には１７点と改善傾向がみられた。また、膝の痛みのＶＡＳ（Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｓｃａｌｅ）評価が、脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与前が２５ｍｍであったのに対し、投与３カ月後には０ｍｍと疼痛は消失していた。さらに関節鏡検査の結果、図３０（ｂ）に示すように、投与３カ月後には、病変部が新規の軟骨様組織で被覆されている様子が認められた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24-1】

【図24-2】

【図25-1】

【図25-2】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】