特開 2018-11554 小型化家畜ブタ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2018-11554(P2018-11554A)

(43)【公開日】2018年1月25日

(54)【発明の名称】小型化家畜ブタ

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/027 20060101AFI20171222BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20171222BHJP

【ＦＩ】

   A01K67/027ZNA

   C12N15/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2016-143364(P2016-143364)

(22)【出願日】2016年7月21日

(71)【出願人】

【識別番号】000201641

【氏名又は名称】全国農業協同組合連合会

(74)【代理人】

【識別番号】110001656

【氏名又は名称】特許業務法人谷川国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 哲也

(72)【発明者】

【氏名】千代 豊

(72)【発明者】

【氏名】普川 一雄

(72)【発明者】

【氏名】上川 舞

(72)【発明者】

【氏名】田中 元気

(72)【発明者】

【氏名】山下 司朗

(57)【要約】

【課題】小型化された家畜ブタを提供すること。
【解決手段】本発明の小型化家畜ブタは、異常型の成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）タンパク質を生じるＧＨＲ遺伝子の変異をヘテロで有する。ＧＨＲ遺伝子の変異は、例えば、細胞内ドメインにおける欠失変異である。本発明の小型化家畜ブタの生時体重は野生型の家畜ブタよりも明らかに小さく、成長後も小型化された形質は維持される。本発明の小型化家畜ブタは、とりわけ医学領域における実験動物として非常に有用である。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

異常型の成長ホルモン受容体タンパク質を生じる成長ホルモン受容体遺伝子の変異をヘテロで有する、小型化家畜ブタ。

【請求項2】

前記変異が、細胞内ドメインにおける欠失変異である、請求項１記載の小型化家畜ブタ。

【請求項3】

前記欠失変異が、JAK2結合領域の少なくとも一部、又はSTAT5結合領域の少なくとも一部の欠失を含む、請求項２記載の小型化家畜ブタ。

【請求項4】

前記欠失変異が、JAK2結合領域のBox 1配列及びBox 2配列の少なくともいずれかの欠失を含む、請求項２記載の小型化家畜ブタ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、小型化された家畜ブタに関する。

【背景技術】

【0002】

医学領域において、実験動物として家畜ブタが利用されてきている。今後、マウスのようにトランスジェニックブタやノックアウト(KO)ブタが作製され、医学関連研究への更なる利用拡大が期待されている。一方、現在医学関連研究に利用されている家畜ブタは、成体時の大きさの問題から利用領域が限られている状況にある。育種選抜によりサイズの小型化が成されたミニブタやマイクロミニブタも確立されているが、これらは非常に高価であり、加えて繁殖能力が低い現状にある。

【0003】

このような中、ミニブタにおいて成長ホルモン受容体（GHR）遺伝子をホモKOすることにより、体重が同齢ブタの半分になり小型化することが報告された（非特許文献１）。GHR遺伝子の改変による小型化の例としては、他にマウスの例が知られている。JAK2結合領域のBox 1配列を欠失させる変異をホモで導入したマウスは、ミニブタのホモKOと同様に野生型マウスやヘテロ変異マウスと比べて体重が半分程度にまで小型化する（非特許文献２）。ミニブタもマウスも、ヘテロ変異の場合にはそのように顕著な小型化は生じない。

【0004】

しかしながら、家畜ブタにおいてGHR遺伝子をKOした例は報告がなく、GHR遺伝子のKOが家畜ブタに及ぼす影響は不明である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Cui et al , Sci Rep. 5:15603, (2015).

【非特許文献2】Barclay et al., Mol Endocrinol, 24(1):204-217,(2010).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本願発明は、小型化された家畜ブタを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本願発明者らは、上記の非特許文献１、２を参考に、家畜ブタにおいてGHRの細胞外レセプター領域をホモで欠失させたホモKO個体を鋭意に作出したところ、予想外にも、核移植胚の受胚豚より出生した産子は全て重篤な低血糖を示し、生後２日以内には全頭が死亡する結果となった。さらに鋭意検討し、GHRの細胞内領域における欠失変異をヘテロで導入したGHRヘテロ改変家畜ブタを作出したところ、ミニブタやマウスの例とは異なり、体重が野生型の６０％程度にまで小型化し、低血糖もなく正常に生存する家畜ブタ個体を得ることに成功し、本願発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、異常型の成長ホルモン受容体タンパク質を生じる成長ホルモン受容体遺伝子の変異をヘテロで有する、小型化家畜ブタを提供する。

【発明の効果】

【0009】

本発明により、GHR遺伝子の改変により小型化された家畜ブタが初めて提供される。生時体重は野生型の家畜ブタよりも明らかに小さく、成長後も小型化された形質は維持される。本発明の小型化家畜ブタは、とりわけ医学領域における実験動物として非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】成長ホルモン結合領域を欠失させるターゲティングベクターと人工ヌクレアーゼベクターの共導入によるGHR遺伝子ホモノックアウトの概略を示した図である。

【図2】JAK2結合領域を欠失させるターゲティングベクターと人工ヌクレアーゼベクターの共導入によるGHR遺伝子ヘテロ改変の概略を示した図である。

【図3】実施例で作出したJAK2結合領域ヘテロ欠失細胞株について、ゲノムDNAを鋳型としたPCRによりヘテロ改変が生じていることを確認した結果を示す図である。

【図4】実施例で作出したJAK2結合領域ヘテロ欠失家畜ブタの出生時〜１４日齢時までの体重の推移である。

【図5】JAK2結合領域ヘテロ欠失家畜ブタと野生型家畜ブタとの間で生時体重及び１４日齢体重を比較したグラフである。

【図6】JAK2結合領域ヘテロ欠失家畜ブタにおける変異を詳細に説明した図である。

【図7】STAT5結合領域を欠失させるターゲティングベクターと人工ヌクレアーゼベクターの共導入によるGHR遺伝子ヘテロ改変の概略、及び樹立した改変細胞株についてPCRによりヘテロ改変を確認した結果を示す図である。

【図8】JAK2結合領域およびSTAT5結合領域を欠失させるターゲティングベクターと人工ヌクレアーゼベクターの共導入によるGHR遺伝子ヘテロ改変の概略、及び樹立した改変細胞株についてPCRによりヘテロ改変を確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

配列表の配列番号１及び２は、NCBIのGenBankにNM_214254.2で登録されているブタ成長ホルモン受容体（GHR）をコードする塩基配列及びブタGHRのアミノ酸配列である。配列番号２のGHR配列中、1〜18番残基がシグナルペプチド配列であり、19〜638番残基が成熟GHRタンパク質となる。この成熟GHRタンパク質の配列をとりだして配列番号３、４に示す。GHRタンパク質は二量体化して機能的な受容体となり、細胞外レセプター領域に成長ホルモン（GH）が結合すると成長シグナルを細胞内に伝達する。

【0012】

配列番号４の成熟GHR配列中、細胞外ドメインは1〜246番残基（エクソン２〜７によりコード）、細胞膜貫通ドメインは247〜269番残基（エクソン８によりコード）、細胞内ドメインは270〜620番残基（エクソン９〜１０によりコード）である。細胞外ドメインはGH結合領域（レセプター領域）である。細胞内ドメイン中、JAK2結合領域のBox 1配列は276〜287番残基（エクソン９の第５位〜第４０位）、JAK2結合領域のBox 2配列は325〜338番残基（エクソン１０の第82位〜第123位）、STAT5結合部位は469番残基及び516番残基（エクソン１０内）である。JAK2結合領域といった場合、Box 1及びBox 2の少なくともいずれかを含む領域を指す。STAT5結合領域といった場合、上記の２つのSTAT5結合部位を含む部分領域を指す。なお、配列番号３の成熟タンパク質配列をコードするcDNA配列中、822位〜891位がエクソン９、891位以降がエクソン１０の領域である。

【0013】

本発明の小型化家畜ブタは、異常型のGHRタンパク質を生じるGHR遺伝子の変異をヘテロで有する。家畜ブタにおいては、異常型のGHRタンパク質を生じる変異をホモで有すると致死的であるが、いずれか一方のアレルにのみそのような変異を有することで生存可能となり、通常の家畜ブタよりも小型化された体躯を有する個体を得ることができる。小型化家畜ブタは、GHR遺伝子に変異を有しない同じ品種の家畜ブタと比べて、生時体重が６５％程度以下、概ね６０％程度であり、成長後も小型化された形質を維持する。

【0014】

本発明において、家畜ブタは、典型的には中型〜大型のブタであり、デュロック種、ランドレース種、大ヨークシャー種（ラージホワイト種）、中ヨークシャー種、バークシャー種、ハンプシャー種、チェスターホワイト種、ピエトレン種、ポーランドチャイナ種、スポット（スポッテッド）種、ブリティッシュサドルバック種、及びこれらの品種のうちの少なくとも１種を親品種とする交雑種、例えばこれらの品種間の交雑種が包含される。

【0015】

GHR遺伝子の変異は、遺伝子工学的手法及び体細胞核移植技術を用いて家畜ブタに導入しても良いし、そのようにして導入されたGHR遺伝子変異を有するブタを交配に用いて、所望の家畜ブタにGHR遺伝子変異を導入してもよい。

【0016】

異常型のGHRタンパク質とは、GHとの結合により下流にシグナルを伝達する機能を正常に発揮できない変異型のGHRタンパク質をいう。そのような異常型のGHRタンパク質を生じるGHR遺伝子の変異は、細胞外のGH結合領域における欠失変異でもよいし、細胞内ドメインにおける欠失変異でもよいが、本発明においては細胞内ドメインにおける欠失変異が好ましい。もっとも、ヘテロ変異であればGH結合領域における欠失変異であっても致死ではないと考えられるため、細胞内ドメインにおける欠失変異に限定されるものではなく、例えば細胞外GH結合領域の一部を欠失する変異であってもよい。

【0017】

細胞内ドメインにおける欠失変異の例としては、JAK2結合領域の少なくとも一部、又はSTAT5結合領域の少なくとも一部の欠失が挙げられる。JAK2結合領域における欠失変異の具体例としては、Box 1配列及びBox 2配列の少なくともいずれかの欠失が挙げられる。Box 1配列の欠失は、12残基全ての欠失でもよいし、一部の欠失（12残基のうちの半分以上、例えば8残基以上、又は10残基以上の欠失）でもよい。Box 2配列の欠失も、14残基全ての欠失でもよいし、一部の欠失（14残基のうちの半分以上、例えば8残基以上、10残基以上、又は12残基以上の欠失）でもよい。例えば、JAK2結合領域の少なくとも一部の欠失は、特に限定されないが、Box 1の全長又はBox 2の全長を含む領域の欠失であり得る。STAT5結合領域における欠失変異は、例えば、上記した２つのSTAT5結合部位の少なくともいずれか一方、あるいは両者を欠失する変異であり得る。

【0018】

遺伝子工学的手法及び体細胞核移植技術により家畜ブタにGHR遺伝子のヘテロ変異を導入する場合には、まず核ドナーとなるGHR遺伝子ヘテロ改変体細胞を作出し、この細胞の核を除核した卵子に移植して核移植胚を作製し、これを受胚豚の子宮に移植して産子を得ればよい。

【0019】

動物細胞のゲノムを改変する方法は公知であり、例えば、ターゲティングベクターを用いた相同組換えによる手法（Nature, 336, p.348-352, 1988; Science, 244, p.1288-1292, 1989; Proc.Natl.Acad.Sci., 86, p.227-231, 1989; 日薬理誌、129、p.330-336、2007年；Nature, 405, p.1066-1069, 2000; Nat Biotechnol., 20, p.251-255, 2002; Science, 295, p.1089-1092, 2002; Transplantation, 76(6), p.900-902, 2003；Transplantation, 81(5), p.760-766, 2006など）や、ゲノム編集技術を挙げることができる。ゲノム編集技術には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）法（Porteus, M.H. et al. Gene targeting using zinc finger nucleases. Nat. Biotechnol. 23, 967-973 (2005).）、TALEN法（Christian, M. et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 186, 757-761 (2010).）、及びCRISPR/Cas9法（Sander, J.D. et al. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol 32, 347-355 (2014).）などを挙げることができる。ゲノム編集技術とターゲティングベクター法を組み合わせ、ゲノム編集部位により切断した部位にターゲティングベクターのコンストラクトを高い効率でノックインすることもできる。

【0020】

ターゲティングベクターを用いたゲノム改変方法では、欠失させたい領域の上流側及び下流側のゲノム配列を家畜ブタのゲノムDNAからPCRにより増幅して上流側相同領域及び下流側相同領域を調製し、これらの相同領域及びマーカー遺伝子を順次適当なプラスミドベクターに挿入して、上流側相同領域−マーカー遺伝子−下流側相同領域の順に並んだ遺伝子改変用DNAコンストラクトを含むターゲティングベクターを構築し、これをエレクトロポレーション等の常法により家畜ブタ由来の体細胞（線維芽細胞など）に導入すればよい。このようなターゲティングベクターを細胞に導入すると、相同組換えにより遺伝子改変用コンストラクトがゲノム上の所期の位置に導入され、GHR遺伝子の所望の領域が欠失し且つマーカー遺伝子が挿入された変異アレルが生じる。

【0021】

上流側相同領域及び下流側相同領域のサイズは相同組換えの効率に影響する。ブタの遺伝子改変においては相同領域は通常数kb程度のサイズである。一方の相同領域を1〜3kb程度（短腕）、他方の相同領域を5kb程度以上（長腕）とするのが一般的であるが、両者を5kb程度のサイズとしてもよい。JAK2結合領域としてBox 1及びBox 2の両方を欠失させる場合には、例えば配列番号１７に示した短腕及び配列番号２２に示した長腕を、STAT5結合領域を欠失させたい場合には、例えば配列番号１７に示した短腕及び配列番号２９に示した長腕を、JAK2結合領域のBox 1、Box 2、及びSTAT5結合領域を欠失させたい場合には、例えば配列番号１７に示した短腕及び配列番号３１に示した長腕を、それぞれ利用することができる。これらの相同領域の調製方法は下記実施例に記載されている。

【0022】

哺乳動物細胞においては、相同組換えによる遺伝子破壊用コンストラクトのゲノムへの導入頻度は、相同組換えによらないランダムな導入の頻度に比べて非常に低い。そのため、家畜ブタ細胞のGHR遺伝子の改変においては、薬剤耐性を与えるポジティブ選択マーカーと薬剤感受性を与えるネガティブ選択マーカーを併用することが好ましい。上記の遺伝子改変用コンストラクトにおいて、２つの相同領域の間に連結するマーカー遺伝子をポジティブ選択マーカー遺伝子とし、２つの相同領域の外側（上流側相同領域の5'側又は下流側相同領域の3'側）にネガティブ選択マーカー遺伝子を連結しておけばよい。該コンストラクトが相同組換えによりゲノムに導入されていれば、コンストラクトのうち相同領域の外側の領域はゲノムに導入されないので、ネガティブ選択マーカー遺伝子により薬剤感受性が付与されることはない。一方、該コンストラクトが相同組換えによらずにゲノムに導入された場合、ネガティブ選択マーカー遺伝子もゲノムに導入されるため、そのような形質転換細胞には薬剤感受性が付与されることになる。よって、遺伝子改変用コンストラクトを家畜ブタ由来の体細胞に導入後、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーによるスクリーニングを行えば、相同組換えにより適切な位置にコンストラクトが導入され、GHR遺伝子の所望の領域が欠失した細胞を効率よく選抜することができる。

【0023】

一般に使用されるマーカー遺伝子の具体例を挙げると、ポジティブ選択マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、ネガティブ選択マーカーとしてはチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Aフラグメント（DT-A)等が挙げられるが、これらに限定されない。それぞれ適当なプロモーターとの組み合わせで用いられるが、当業者であればマーカー遺伝子の種類に応じて適宜選択することができる。

【0024】

マーカーによるスクリーニングの後、PCRやサザンブロッティングにより遺伝子改変の確認を行ない、GHR遺伝子の一方のアレルが異常型GHRを産生するように改変された細胞を取得する。PCRに使用するプライマーやサザンブロッティングに使用するプローブは、当業者であれば、遺伝子改変用DNAコンストラクトの構造に応じて適宜設計することができる。

【0025】

なお、本発明ではGHR遺伝子をヘテロで改変するが、哺乳動物細胞における相同組換えの頻度は非常に低いことから、適当なゲノム編集装置を併用してターゲティングベクター法を実施しても良い。ターゲティングベクターの２つの相同領域（長腕と短腕）に対応するゲノム領域の間の一部でゲノムを切断することで、相同組換えによるコンストラクトの導入効率を大幅に高めることができる。例えば、Cas9やその変異体Cas9n(D10A)などの人工ヌクレアーゼを利用することができる。ターゲティングベクターと人工ヌクレアーゼベクターを家畜ブタ由来体細胞に共導入すればよい。

【0026】

次いで、GHR遺伝子のヘテロ改変が確認された細胞より、体細胞クローニング技術を用いて、異常型GHRを生じるGHR遺伝子の変異をヘテロで有する家畜ブタ個体を作出する。ブタ等の大動物の体細胞クローニング技術もこの分野において確立した技術となっており（Nature, 385, p.810-813, 1997; Science, 282(5396), p.2095-2098, 1998; Science, 298, p.1188-1190, 2000; Nature, 407, p.86-90, 2000; Nat Biotechnol., 18, P.1055-1059, 2000等参照）、また、ブタ等の大動物においてこれらの技術を用いた遺伝子改変個体が作出されている（Nature, 405, p.1066-1069, 2000; Nat Biotechnol., 20, p.251-255, 2002; Science, 295, p.1089-1092, 2002; Transplantation, 76(6), p.900-902, 2003；Transplantation, 81(5), p.760-766, 2006等参照）。具体的には、ブタの体内成熟卵子又は体外成熟卵子を調製し、該卵子を除核する。除核卵子にGHRヘテロ改変細胞の核を移植し、電気刺激等により移植後の卵子を活性化後、一定期間培養して仮腹親の子宮に移植すればよい。体内成熟卵子及び体外成熟卵子の調製方法は周知である。体内成熟卵子は、春期発動前の雌ブタにホルモン処置し人為的に発情誘導した後、卵管を灌流して体内成熟卵子を回収できるほか、春期発動後の雌ブタの場合には人工流産法、偽妊娠誘起法、離乳法などの方法により体内成熟卵子を採取することができる。体外成熟卵子の調製方法は下記実施例に記載されている。除核、核移植、核移植卵子の活性化、仮腹親への移植の詳細も周知であり、下記実施例にも記載されている。

【実施例】

【0027】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0028】

なお、以下の実施例において、GHR遺伝子の改変に用いたブタ胎仔線維芽細胞は、以下の通りに調製した。

【0029】

デュロック種を交配し、妊娠35日齢のデュロック種ブタ胎仔を回収した。採取した胎仔の頭部・内蔵部分を除去し、ハサミで細断後、300〜500μmメッシュ上で擦り潰して10%のウシ胎児血清(FCS)添加DMEM(ナカライテスク)又はMEMα（インビトロジェン）に懸濁した。ブタ胎仔細胞懸濁液を遠心処理（1000rpm、10分）し、上清を除去した後、再度10%FCS添加DMEMに適当量になるように懸濁して75cm²細胞培養用フラスコに播いた。細胞は37℃・5%CO₂下で培養し増殖させ、コンフルエント後に継代して必要量まで増やし、その後凍結保存した。

【0030】

１．成長ホルモン結合領域をホモで欠失したGHRホモKOブタの作出
図１に示した戦略にて、GHR-KOベクターと人工ヌクレアーゼ共導入によるワンステップホモKO細胞株樹立を試みた。２本の染色体上に有るGHR遺伝子の一方は通常のKOベクターとの相同組み換え反応によりKOし、もう一方は人工ヌクレアーゼによる切断によりKOしてホモKO細胞を得るものである。

【0031】

１−１．ホモKO細胞株の樹立
(１) 細胞外レセプター領域を標的とするターゲティングベクターの構築
細胞外レセプター領域を欠失させるターゲティングベクターpGHR-KObを構築するため、ブタGHR遺伝子の周辺ゲノム領域（1.7kbおよび7.1kb断片:図１）をPCRクローニング法によりクローニングした。ベクターの短腕として使用する1.7kb断片（1.7KS、配列番号７）のPCR増幅には、センスプライマー：CTTAGAATGGACATTATTGTGGAGC（配列番号５）およびアンチセンスプライマー：TTAGGCTTTCCAGAAGAATCTGCCG（配列番号６）を使用した。また、長腕として使用する7.1kb断片（7.1KL、配列番号１０）の増幅にはセンスプライマー：CTGTGATATGATGTCATCCAGGACC（配列番号８）およびアンチセンスプライマー：GAAGTCAGGCCATGCACTCATC（配列番号９）を使用した。短腕、長腕いずれも、ブタの体細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅して得た。

【0032】

pGHR-KObベクターは、GHR遺伝子のエクソン4の一部を含むゲノム領域が選択マーカーであるCAG-bsr(CAGプロモータを持つブラストサイジン耐性遺伝子)に置き換わるようにデザインし構築した。pGHR-KObベクターはCAG-bsrユニットの5’側に短腕1.7KS、そして3’側に長腕7.1KLが位置し、さらに1.7KSの5’側にネガティブ選択用遺伝子マーカーのMC1-TK(MC1プロモータを持つヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子)が位置するかたちに構築した（図１）。具体的には、プラスミドベクターpZErO-2（Invitrogen）のマルチクローニングサイト中、CAG-bsrユニットの5’側に短腕1.7KS、そして3’側に長腕7.1KLが位置するように構築した。このターゲティングベクターを用いると、相同組換えの結果、エクソン4(130bp)内の29位〜130位（配列番号１においては156位〜266位）の111bpを含むゲノム領域が欠失し、この部分に薬剤耐性遺伝子ユニットが挿入された変異型アレルが生じる（図１）。

【0033】

(２) 人工ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9n)発現ベクター構築および切断活性確認
GHR遺伝子切断用の人工ヌクレアーゼ発現ベクターは、SBI社のCas9発現ユニットおよびCas9n（D10A）発現ユニットとDNA2社のgRNA発現ユニットを一体化して構築した。人工ヌクレアーゼによる改変領域の選定はZhang Lab, MITのWeb上で調査し決定した。GHR遺伝子切断におけるgRNAの認識配列はTAGTTCAGGTGAACGGCACT-TGG（GHR9688B:ボトムストランド側、配列番号１１）およびTGGACAGATGGGGTCCGTCA-CGG（GHR9707T:トップストランド側、配列番号１２）を使用した。人工ヌクレアーゼ発現ベクターのゲノム切断活性の確認はGuide-it(商標) Mutation Detection Kit（クロンテック社）を使用し実施した。

【0034】

(３) ブタ胎仔由来線維芽細胞へのターゲティングベクター・人工ヌクレアーゼ発現ベクター共導入および選別培養
ブタ胎子由来線維芽細胞(#T6-16株)を150平方cm培養フラスコ（グライナー社製）中で10％FCS（牛胎児血清）を含むMEMα培地（インビトロジェン社製）中で培養し、コンフルエント状態になった細胞を使用した。

【0035】

ベクターの導入はエレクトロポレーション法により行った。手順は次のとおりである。コンフルエント状態の細胞を、リン酸緩衝塩溶液（PBS）で洗浄後、0.05%トリプシン-EDTA/PBS溶液（インビトロジェン社製）を使用し分散化し、1500回転/分の遠心操作により回収した。7.5x 10⁶細胞/750μl PBSに調整後、2.5μgのpGHR-KObベクター（あらかじめ制限酵素SalI(タカラバイオ社製)消化により直線化する）および10μgの人工ヌクレアーゼ発現ベクター（gRNA(GHR9688B-9707T)）を添加し、氷中に10分間静置した。氷冷したエレクトロポレーション用キュベット（BIO-RAD社製）に細胞・pGHR-KObベクター・人工ヌクレアーゼ発現ベクター混合液を入れ、ジーンパルサー遺伝子導入装置（BIO-RAD社製）で導入操作を実施した（220V, 950 μF）。荷電後、氷中に10分間静置した。続いて、24 mlの培養用培地（10% FCS添加MEM・培地）に細胞をケン濁し、6穴細胞培養プレート(グライナー社製)（２ml/穴）2枚に播種しインキュベーター（サンヨー社製）(37℃、5%, CO₂/95%空気)内で培養した。

【0036】

48時間培養後、細胞(２穴分)をリン酸緩衝塩溶液（PBS）で洗浄し、0.05%トリプシン−EDTA処理（5分）し培養プレートより細胞を剥がし、10 μg/ml(最終濃度) ブラストサイジンS（BS）（InvivoGen社製）＋20 μMガンシクロビル(GCV)（ナカライテスク社)添加培地中にけん濁し、48穴細胞培養プレート（400μl/穴）(グライナー社製)12枚に播き直し選別培養を行った。

【0037】

播き直し後、10日目前後になると増殖した薬剤耐性細胞コロニーが確認できた。顕微鏡下でコロニーの存在する穴(ウェル)を確認し、前述のトリプシン処理により細胞を剥がし48穴細胞培養プレートに二等分して培養を継続した。24〜48時間後、二等分した一方を使用しKO判定のためのPCR解析（後述）を実施した。PCR解析によりKOと判定された細胞株は、細胞増殖に従い、12穴細胞培養プレート（グライナー社製）、25 cm²培養フラスコ（グライナー社製）、75 cm²培養フラスコ（グライナー社製）へとスケールアップ継代し、最終的に細胞を回収し凍結保存した。

【0038】

(４) PCR解析によるGHR遺伝子レセプター部位KO細胞株の判定
KO判定に使用する48穴細胞培養プレートの各穴(ウエル)にDNA抽出バッファー（10 mM Tris-HCl(pH 8.5)、50 mM KCl、2 mM MgCl₂、0.45% NP-40、0.45% Tween-20、100 μg/ml（最終濃度）Proteinase Ｋ(ナカライテクス社製)）を50 μl添加し溶解し、0.2mlマイクロチューブに回収した。その後、55℃で60分間インキュベートし、さらに99℃で10分間インキュベートした。インキュベート終了後、DNAサンプルは４℃で保持し、PCR解析に使用した。

【0039】

PCRは１サンプル当たり、テンプレート(DNA抽出サンプル)5 μl、DNA Polymerase用５×PCR buffer（タカラバイオ社製）5 μl、センスプライマー（10 pmoles/μl）0.25 μl、アンチセンスプライマー(10 pmoles/μl)0.25 μl、dNTP mixture (2 mM each) 2 μl、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (タカラバイオ社製) 0.5 μl、滅菌蒸留水にて計25 μlになるように調整し実施した。

【0040】

KO判定に用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。プライマーP1a：CACACGTTAGCACCGCAACC（配列番号１３）、プライマーP2a：CGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCC（配列番号１４）。また、KO細胞株の詳細なPCR解析には、上記プライマーに加えプライマーP3a：CTTAGAATGGACATTATTGTGGAGC（配列番号５）を使用し実施した。PCRの反応条件は、95℃3分を1回、95℃1分-57℃1分-72℃2分を35回、72℃5分を１回とした。

【0041】

薬剤耐性コロニー102個を解析したところ、19コロニーがKOと判定された（表１）。このKOと判定されたコロニーを詳細にPCR解析およびシークエンス解析した結果、10株がホモKO（欠損あるいは挿入によりフレームシフトが起こり停止コドンが生じる）、2株が変異型GHR（それぞれ10アミノ酸挿入、9アミノ酸欠損により機能不全を呈する可能性あり）、4株がヘテロKO（人工ヌクレアーゼ処理による変異なし）であることが確認できた（表１、表２）。一方残りの3株は他細胞の混入が示唆された。

【0042】

【表1】

【0043】

【表2】

【0044】

１−２．体細胞核移植法によるGH結合領域ホモ欠失ブタの作出
PCR解析によりGHR遺伝子GH結合領域のホモ欠失が確認された細胞株３種（#1-8, #1-23, #1-87）を核ドナーとして使用し、体外成熟卵子への体細胞核移植操作により核移植胚を調製し、受胚豚に移植して産子を得た。具体的な手順を以下に記載する。

【0045】

(１) 卵巣の採取
卵巣の採取にはデュロック種（D）又は大ヨークシャー種（W）の雌ブタを用いた。卵巣の摘出はイソフルラン（アボット）およびソムノペンチル（共立製薬）による全身麻酔下で外科的に行った。採取した卵巣は35℃で保温しておいた抗生物質添加生理食塩水に浸漬させ、試験に供与するまで30℃以上で保温した。卵巣は抗生物質添加生理食塩水で数回洗浄し、卵子の採取に用いた。

【0046】

(２) 未成熟卵子の体外成熟培養
雌豚の卵巣から未成熟卵子を採取し、POE-CM培地（機能性ペプチド研究所）で数回洗浄後、顕微鏡下で検卵し、体外成熟培養に適した卵子を選抜した。選抜した卵子はリプロプレート(機能性ペプチド研究所)に準備したdbcAMP（機能性ペプチド研究所）およびrFSH（Merc, Mol Reprod Dev. 80:549-60. 2013）添加又はdbcAMP、eCG（ピーメックス、エール薬品）およびhCG（プペローゲン、日本全薬工業）添加HP-POM培地（機能性ペプチド研究所）に入れ、インキュベーター（38.5℃、5%CO₂、5%O₂、90%N₂）下で20〜22時間培養した。その後、卵子を無添加のHP-POM培地に移し替え、さらに同条件下で22〜24時間培養した。得られた卵子は0.1%ヒアルロニダーゼ(Sigma)を含むPOE-CM培地で卵丘細胞を裸化し、その後ヒアルロニダーゼを含まないPOE-CMで2〜3回洗浄した。培地で洗浄後、除核操作に供試するまでPZM-3液(Biol Reprod. 66:112-119. 2002)を用いてインキュベーター（38.5℃、5%CO₂、5%O₂、90%N₂）下で保存した。

【0047】

(３) 除核操作
採卵した未受精卵子を5μg/ml濃度のサイトカラシンB(Sigma)を含むPZM-3液に移し、15分以上処理した後、同様のサイトカラシンB添加PZM-3液ドロップ内で除核操作を行った。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた除核用ピペット（外径25μm、先端45度、プライムテック株式会社製）により、第一極体ごと細胞質を1/4〜1/3量程吸引除去した。細胞質吸引後、除核卵子をサイトカラシンB不含のPZM-3液に移し、3回洗浄を行った。その後、ドナー核の注入操作までPZM-3液ドロップに移し、インキュベーター内で培養した。

【0048】

(４) ドナー細胞の準備
前述のPCR解析によりGHR遺伝子のGH結合領域がホモで欠失していると判定された雄ブタ胎仔線維芽細胞コロニー(#1-8, #1-23, #1-87)を核移植のドナー細胞として用いた。培養液には10%FCSを添加したDMEM（ナカライテスク）又はMEMα(インビトロジェン)を用い、継代回数は１〜４回の細胞を用いた。ドナー細胞は、コンフルエント状態から培地交換を行わず2〜8日間放置又は核移植日の2〜3日前に培養液を0.05%FCS添加DMEM又はMEMαに交換し、細胞周期をG1／G0期に同調した。ドナー細胞は培養液を除去した後にPBS（−）で洗浄し、0.05％トリプシン-EDTA/PBS溶液(インビトロジェン)を加えて細胞を剥離した。剥離した細胞に10%FCS添加DMEM又はMEMαを加えて懸濁し、その後遠心処理（1000rpm、5分）を行った。遠心処理後、上清を除去し、PZM-3液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に適量の細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに加えて使用した。

【0049】

(５) ドナー体細胞核の注入操作
ドナー体細胞核の注入操作は除核卵子を含む注入用チャンバーのドロップに適量のドナー細胞を添加して操作した。注入操作には体細胞核注入用ピペット（外径10〜12μm、鈍端、プライムテック株式会社）を用いた。体細胞核注入用ピペットをピエゾマイクロマニピュレーターに取り付ける前に、ピペット後端からフロリナートを充填して使用した。体細胞核注入用ピペットで体細胞を吸引し、数回ピペッティングして細胞膜を破壊後、ホールディングピペットで保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は活性化処理時間までインキュベーター内で培養した。

【0050】

(６) ドナー体細胞核を注入した卵子の活性化処理と体外培養
体細胞核を注入した卵子の活性化には電気活性化装置(NEPAGENE社製)を用いて直流パルス刺激（1.5kV/cm 100μsec×1回）を与えた。チャンバーはステンレスワイヤー電極を用い、電気活性化処理用の溶液には0.05mM CaCl₂、0.1mM MgSO₄、0.02%BSAを含む0.28Mマンニトール溶液を用いた。

【0051】

活性化処理後の卵子は5μg/mlサイトカラシンBを含むPZM-3液で2時間培養し、第2極体の放出抑制処理を行った。その後、PZM-3液2〜3回洗浄し、リプロプレート(機能性ペプチド研究所)に準備したPZM-3培地に移し替え、胚移植に用いるまでインキュベーター内で培養した。体外培養後1〜2日目の核移植胚を胚移植に用いた。

【0052】

(７) 仮腹豚の発情同期化と胚移植
仮腹豚として150日〜195日齢の春期発動前の雌ブタを用いる場合は、eCG（ピーメックス、エール薬品）を1000IU投与し、その72時間後にhCG（プペローゲン、日本全薬工業）を500〜1000IU投与することによって発情の同期化を行なった。また、発情が観察された春期発動後の雌ブタを用いる場合は、発情観察後15〜16日に上記と同様の処置を施し、発情の同期化を行なった。仮腹豚の発情は採卵した雌ブタより1〜2日遅れるように発情同期化処置を行い、hCG投与後１日目に発情が確認された雌ブタのみを仮腹豚として胚移植に供試した。胚移植はイソフルラン（アボット）・ドルミカム（アステラス製薬）・ドミトール（日本全薬工業）麻酔下で外科的に胚移植を行った。胚移植はPPカテーテル（富士平工業）を卵管に挿入して行った。

【0053】

(８) 結果
核移植胚を２頭の受胚豚（Large White種を使用）に移植し、分娩予定日１日前に帝王切開で（Day113）、又は自然分娩（Day122）により産子を得た。２回の試験で20頭の生存産子の作出に成功した。産子のゲノムをPCRで確認したところ、全ての産子でホモKOが確認された（データ省略）。生時体重は、帝王切開で0.21kg〜0.89kg（平均0.47kg）、自然分娩で0.38kg〜0.78kgであり、通常の家畜ブタよりも明らかに生時体重が減少していた。しかしながら、いずれも重篤な低血糖症状を示し、出生後２日以内に全頭死亡した。

【0054】

２．JAK2結合領域の除去によるGHRヘテロ変異ブタの作出
GHRのGH結合領域でのホモKOは致死的であったため、GH結合領域以外でのヘテロ変異導入を検討した。まず、JAK2結合領域を除去したヘテロ変異ブタの作出を試みた。JAK2が結合しなければSTAT5は機能しないため、JAK2結合領域を欠失した変異型GHRがホモ二量体を形成した場合にはGHシグナル伝達が起きない。なお、JAK2結合領域の変異に関してはマウスにおける報告があり、マウスではJAK2結合領域のBox1をホモで欠失させると小型化するが、ヘテロ変異ではほとんど変化がないことが知られている（Johanna L. Barclay et al., Mol Endocrinol, January 2010, 24(1):204-217）。

【0055】

２−１．変異細胞株の樹立
(１) GHR JAK2結合領域を標的とするターゲティングベクターの構築
GHR JAK2結合領域を欠失させるターゲティングベクターpGHR-JAKd-KInを構築するため、ブタGHR遺伝子の周辺ゲノム領域（1.6kbおよび5.9kb断片:図２）をPCRクローニング法によりクローニングした。

【0056】

ベクターの短腕として使用する1.6kb断片（1.6KS、配列番号１７）のPCR増幅には、センスプライマーGHRJ12806(T)：GGAAATAAGCTTCATGGCTGG（配列番号１５）およびアンチセンスプライマーGHRJ14419(B)：CAATCTTTGGAAGAGACCTGCTCC（配列番号１６）を使用した。

【0057】

長腕の5.9kb断片(5.9KL、配列番号２２)は、JAK2結合領域(Box1およびBox2)を欠失するように２つの断片(4.4kb断片および1.5kb断片)を結合し作製した。4.4kb断片の増幅にはセンスプライマーGHRJ5574(T)：CCTTATACCTAAAGCAACTAGAGG（配列番号１８）およびアンチセンスプライマーGHRJ9938S-Sal(B)：GTCGACTCTTAATCCTTGAAAAGG（配列番号１９）を使用し、1.5kb断片の増幅にはセンスプライマーXho-GHRJ10490(T)：CTCGAGAAGGATGACGACTCCGGACG（配列番号２０）およびアンチセンスプライマーGHRJ12002-Sal(B)：GTCGACGATGAGTACATTCCAATACTGTAGG（配列番号２１）を使用した。

【0058】

pGHR-JAKd-KInベクターは、PGK-Neoユニット（PGKプロモータを持つネオマイシン耐性遺伝子）の5’側に長腕5.9KL、そして3’側に短腕1.6KSが位置し、さらに1.6KSの3’側にネガティブ選択用遺伝子マーカーのMC1-TK(MC1プロモータを持つヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子)が位置するかたちに構築した。このターゲティングベクターを用いると、相同組換えの結果、エクソン９（70bp）の第8位〜第70位及びエクソン１０（972bp：停止コドン位置まで）の第１位〜第192位を含むゲノム領域が欠失し（成熟タンパク質の277〜361番残基の配列が失われる）、エクソン１０の下流に隣接するイントロン内に薬剤耐性遺伝子ユニットが挿入された変異型アレルが生じる（図２）。

【0059】

(２) 人工ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9n)発現ベクター構築および切断活性確認
GHR遺伝子切断用の人工ヌクレアーゼ発現ベクターは、SBI社のCas9発現ユニットおよびCas9n（D10A）発現ユニットとDNA2社のgRNA発現ユニットを一体化して構築した。人工ヌクレアーゼによる改変領域の選定はZhang Lab, MITのWeb上で調査し決定した。GHR遺伝子切断におけるgRNAの認識配列はACACTGCGGCCGAGGTTCTA-AGG（GHR12242B:ボトムストランド側、配列番号２３）およびATTTCATATTTACCTAAGAA-AGG（GHR12287T:トップストランド側、配列番号２４）を使用した。人工ヌクレアーゼ発現ベクターのゲノム切断活性の確認はGuide-it(商標) Mutation Detection Kit（クロンテック社）を使用し実施した。

【0060】

(３) ブタ胎仔由来線維芽細胞へのターゲティングベクター・人工ヌクレアーゼ発現ベクター共導入および選別培養
GHR JAK2結合領域改変ターゲティングベクターを2.5μg、人工ヌクレアーゼ発現ベクターを10μg使用し、ブタ胎仔由来線維芽細胞(#T6-16株)にpGHR-JAKd-KIn/人工ヌクレアーゼ共導入を行なった。細胞数は8.5x10⁶細胞とし、共導入後の選別培養には0.4 mg/ml(最終濃度) ネオマイシン（G418:商品名 Geneticin，インビトロジェン社製）＋20 μMガンシクロビル(GCV)（ナカライテスク社)添加培地を用いたほかは、上記１−１．(３)と同様に行なった。ターゲティングベクターはSalIで直線化した。

【0061】

(４) PCR解析によるGHR遺伝子JAK改変細胞株の判定
上記１−１．(４)と同様の方法でJAK2結合領域の改変を判定した（図３）。PCR解析に用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。プライマーP1b(GHRJ14481(B))：AGGAACACATGTTAGCCAACTCC（配列番号２５）、プライマーP2b：GGTCCCTCGAAGAGGTTCACTAG（配列番号２６）。また、KO細胞株の詳細なPCR解析には、上記プライマーに加えプライマーP3b(GHRJ14419(B))：CAATCTTTGGAAGAGACCTGCTCC（配列番号１６）、プライマーP4b（GHR5.9-Xho(B)）：CATCGATAGATCTCGACGATGAG（配列番号３２）、プライマーP5b（GHRJ9539(T)）：TGGTGGCTCTACATGAATTGGC（配列番号３３）、及びプライマーP6b（GHRJ10759S-Sal(B)）：GTCGACTATTGATGAGTTGAGTCAGTTCC（配列番号３４）を使用し実施した。

【0062】

G418/GCV耐性コロニー118個をPCR解析したところ、43コロニーがKI（PGK-neoユニットの挿入あり）と判定された（表３）。このKIと判定されたコロニーのうち8株が良好に増殖し、さらに詳細なPCR解析およびシークエンス解析を行なった結果、4株（#1-6、#1-73、#1-87、#1-95）がJAK2結合領域配列を消失しており（図３）、タンパク質レベルではJAK2結合部のBox1の大部分とBox 2の全長を含む85残基のアミノ酸が失われている（成熟タンパク質の277M→V、278Lから360Gまで欠失、361A→E; この変異型アミノ酸配列を配列番号２７に示す）ことが判明した。４株の細胞増殖性は#1-73＞#1-95＞#1-87＞#1-6であった。細胞増殖性が最も良好な#1-73株では、人工ヌクレアーゼ処理によるゲノムの改変は認められなかった（野生型GHR遺伝子を持つ染色体は無傷）ことから、#1-73株を用いてGHRヘテロ変異ブタを作出した。

【0063】

【表3】

【0064】

２−２．体細胞核移植法によるGHR遺伝子JAK2ヘテロ改変ブタの作出
GHR遺伝子のJAK2結合領域がヘテロで改変されていると判定されたブタ胎仔線維芽細胞#1-73株を核ドナーとし、上記１−２．と同様の手順で体外成熟卵子に核を移植して核移植胚を調製し、仮腹豚（Large White種を使用）に胚移植を行ない、自然分娩によりJAK2結合領域がヘテロで改変された産子を得た。

【0065】

Day122で2016年6月28日に自然分娩した１腹目の産子２頭は、低血糖症状は無く健康状態は良好であった。その後、2016年7月8日に分娩した２腹目の産子４頭も、低血糖症状を示すことなく生存している。１腹目の産子２頭の14日齢までの体重の推移を図４に、通常のデュロック種ブタ産子と比較した生時及び14日齢の体重データを表４及び図５に示す。生時体重は通常のデュロック種ブタ産子の60％程度であり、明らかな小型化が確認された。生後2週間の時点でも通常のデュロック種ブタと比べて明らかに小型であり、小型化形質を維持していた。

【0066】

【表4】

【0067】

GHRタンパク質は２分子が結合して機能的な受容体となる。本ヘテロ改変ブタは、GHR遺伝子の一方のアレルは正常であるため、体内では正常型GHR分子と変異型（異常型）GHR分子が共存する状態となり、３種類の受容体が形成される（図６）。異常型GHRを含む二量体は機能不全となり、成長シグナルの伝達が減少もしくは喪失する。結果として生体内の成長シグナルが完全には失われることなく減弱することになるため、小型化して生存し続ける家畜ブタが得られたものと考えられる。

【0068】

３．STAT5結合領域を除去したGHRヘテロ変異ブタ作出のための細胞株樹立
ヒトにおいては、STAT5結合領域にホモで変異を持った場合に小人症を発症するが、ヘテロで変異を持った場合には有意な形態変化が見られないことが知られている（J Clin Endocrinol Metab. 89(3):1259-1266 (2004)）。しかしながら、JAK2結合領域ヘテロ改変の結果から、家畜ブタにおいてはSTAT5結合領域をヘテロで欠失させた場合にも小型化すると考えられる。そこで、STAT5ヘテロ改変家畜ブタを作出すべく、核ドナーとして用いるヘテロ改変細胞株を作製した。

【0069】

(１) STAT5結合領域を標的とするターゲティングベクターの構築
STAT5結合領域を欠失させるターゲティングベクターpGHR-STATd-KInを構築するため、ブタGHR遺伝子の周辺ゲノム領域（5.15kbおよび1.6kb断片:図７）をPCRクローニング法によりクローニングした。ベクターの短腕として使用する1.6kb断片は、JAK2結合領域を欠失させるベクターと同じ1.6KSを用いた。長腕として使用する5.15kb断片(5.15KL、配列番号２９)のPCR増幅には、センスプライマーGHRJ5574(T)（配列番号１８）およびアンチセンスプライマーGHRJ10720S-Sal(B)：GTCGACTATGGTTTGTTTTCCTCTGCTAGG（配列番号２８）を使用した。短腕、長腕いずれも、ブタの体細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅して得た。

【0070】

pGHR-STATd-KInベクターは、PGK-Neoユニットの5'側に長腕5.15KLおよびポリアデ二レーションシグナル配列（pA）、そして3'側に短腕1.6KSが位置し、さらに1.6KSの3’側にネガティブ選択用遺伝子マーカーのMC1-TKが位置するかたちに構築した。このベクターを用いると、相同組換えの結果、エクソン１０の第424位〜第972位を含むゲノム領域が欠失し（成熟タンパク質の439〜620番残基の配列が失われる）、この部分に薬剤耐性遺伝子ユニットが挿入された変異型アレルが生じる（図７）。

【0071】

(２) 人工ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9n)発現ベクター構築および切断活性確認
GHR遺伝子切断用の人工ヌクレアーゼ発現ベクターは、JAK2結合領域のヘテロ改変で構築したものと同じものを用いた。GHR遺伝子切断におけるgRNAの認識配列は、JAK2結合領域のヘテロ改変と同様にGHR12242B:ボトムストランド側およびGHR12287T:トップストランド側を使用した。人工ヌクレアーゼベクターのゲノム切断活性の確認はGuide-it(商標) Mutation Detection Kit（クロンテック社）を使用し実施した。

【0072】

(３) ブタ胎仔由来線維芽細胞へのターゲティングベクター・人工ヌクレアーゼ発現ベクター共導入および選別培養
上記２−１．(３)と同様の方法で、ターゲティングベクターを2.5μg、人工ヌクレアーゼ発現ベクターを10μg使用し、ブタ胎仔由来線維芽細胞(#T6-16株)にpGHR-STATd-KIn/人工ヌクレアーゼ共導入を行なった。ターゲティングベクターはSalIで直線化した。

【0073】

(４) PCR解析によるGHR遺伝子STAT5改変細胞株の判定
上記１−１．(４)と同様の方法でSTAT5結合領域の改変を判定した。PCRには上記２−１．(４)と同じくプライマーP1b（配列番号２５）、プライマーP2b（配列番号２６）、プライマーP3b（配列番号１６）を使用した。

【0074】

G418/GCV耐性コロニー120個をPCR解析したところ、31コロニーがKI（PGK-neoユニットの挿入あり）と判定された（表５）。さらに詳細な解析の結果、6株でSTAT5結合領域の欠失が確認された（図７）。6株の細胞増殖性は#1-20, #1-76, #1-88＞#1-9, #1-61, #1-64であった。

【0075】

【表5】

【0076】

４．JAK2結合領域及びSTAT5結合領域を除去したGHRヘテロ変異ブタ作出のための細胞株樹立
さらに、JAK2結合領域とSTAT5結合領域の両方を欠失させたGHRヘテロ変異家畜ブタを作出すべく、核ドナーとして用いるヘテロ変異細胞株を作出した。

【0077】

(１) JAK2結合領域及びSTAT5結合領域を標的としたターゲティングベクターの構築
JAK2結合領域及びSTAT5結合領域を欠失させるターゲティングベクターpGHR-JAKSTATd-KInを構築するため、ブタGHR遺伝子の周辺ゲノム領域（4.4kbおよび1.6kb断片:図８）をPCRクローニング法によりクローニングした。ベクターの短腕として使用する1.6kb断片は、JAK2結合領域を欠失させるベクターと同じ1.6KSを用いた。長腕として使用する4.4kb断片(4.4KL、配列番号３１)のPCR増幅には、センスプライマーGHRJ5574(T)：配列番号１８）およびアンチセンスプライマーGHRJ9937-Sal(B)：GTCGACCTTAATCCTTGAAAAGG（配列番号３０）を使用した。短腕、長腕いずれも、ブタの体細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅して得た。

【0078】

pGHR-JAKSTATd-KInベクターは、PGK-Neoユニットの5'側に長腕4.4KLおよびポリアデ二レーションシグナル配列（pA）、そして3'側に短腕1.6KSが位置し、さらに1.6KSの3’側にネガティブ選択用遺伝子マーカーのMC1-TKが位置するかたちに構築した。このベクターを用いると、相同組換えの結果、エクソン９の第8位〜第70位及びエクソン１０の全体を含むゲノム領域が欠失し（成熟タンパク質の277〜620番残基の配列が失われる）、この部分に薬剤耐性遺伝子ユニットが挿入された変異型アレルが生じる（図８）。

【0079】

(２) 人工ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9n)発現ベクター構築および切断活性確認
GHR遺伝子切断用の人工ヌクレアーゼ発現ベクターは、JAK2結合領域のヘテロ改変で構築したものと同じものを用いた。GHR遺伝子切断におけるgRNAの認識配列は、JAK2結合領域のヘテロ改変と同様にGHR12242B:ボトムストランド側およびGHR12287T:トップストランド側を使用した。人工ヌクレアーゼベクターのゲノム切断活性の確認はGuide-it(商標) Mutation Detection Kit（クロンテック社）を使用し実施した。

【0080】

(３) ブタ胎仔由来線維芽細胞へのターゲティングベクター・人工ヌクレアーゼ発現ベクター共導入および選別培養
上記２−１．(３)と同様の方法で、ターゲティングベクターを2.5μg、人工ヌクレアーゼ発現ベクターを10μg使用し、ブタ胎仔由来線維芽細胞(#T6-16株)にpGHR-JAKSTATd-KIn/人工ヌクレアーゼ共導入を行なった。ターゲティングベクターはSalIで直線化した。

【0081】

(４) PCR解析によるGHR遺伝子JAK2-STAT5改変細胞株の判定
上記１−１．(４)と同様の方法でJAK2結合領域およびSTAT5結合領域の改変を判定した。PCRには上記２−１．(４)と同じくプライマーP1b（配列番号２５）、プライマーP2b（配列番号２６）、プライマーP3b（配列番号１６）を使用した。

【0082】

G418/GCV耐性のコロニー76個をPCR解析したところ、8コロニーがKI（PGK-neoユニットの挿入あり）と判定された（表６）。さらに詳細な解析の結果、3株でJAK2結合領域およびSTAT5結合領域の欠失が確認された（#1-21, #1-23および#1-39, 図６右下）。

【0083】

【表6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]